سلول‌های کلیه همستر بچه چسبنده و معلق دارای اسکلت سلولی و گیرنده سطحی متفاوتی هستند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

ورونیکا دیل¹فلوریان پفاف¹, Aline ZimmerID²مارتین بیر¹، Michael EschbaumerID^1*

خلاصه

کشت سلولی حیوانی با تک سلولی در حال رشدتعلیقبه طور ایده آل در یک محیط شیمیایی تعریف شده، پایه اصلی تولید بیودارویی است. محیط مصنوعی فاقد فاکتورهای رشد برون زا است و معمولاً نیاز به یک فرآیند سازگاری زمان‌بر برای انتخاب کلون‌های سلولی دارد که در آن تکثیر می‌شوند.تعلیقبه تعداد سلول های بالا مکانیسم‌های مولکولی که سازگاری را تسهیل می‌کنند و در داخل سلول اتفاق می‌افتند تا حد زیادی ناشناخته هستند. به خصوص برای رده های سلولی که برای تولید آنتی ژن ویروسی مانند سلول های کلیه بچه همستر (BHK) استفاده می شود، محدودیت رشد ویروس از طریق تکامل ویژگی های سلولی نامطلوب بسیار ناخواسته است. مقایسه بین سلول‌های BHK در حال رشد چسبنده و سلول‌های سوسپانسیون با متفاوتحساسیتبه ویروس تب برفکی تفاوت هایی در بیان گیرنده های سلولی مانند اینتگرین ها و سولفات های هپاران و در سازمان اسکلت سلولی اکتین نشان داد. تجزیه و تحلیل رونوشت و رشدسینتیکتنوع رده های سلولی BHK را نشان داد و اهمیت کلون های سلولی والدین و غربالگری آگاهانه را تأیید کرد تا اطمینان حاصل شود که ویژگی های سلولی ضروری در طول سازگاری از بین نمی روند.

Cistanche tubulosa از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

فناوری کشت سلولی حیوانی ابتدا برای تولید آنتی ژن ویروس در تولید واکسن مورد استفاده قرار گرفت، اما اخیراً پلتفرم‌های تولید باکتری یا مخمر برای پروتئین‌های نوترکیب به سیستم‌های سلولی پستانداران نیز تغییر یافته است [1، 2]. سلول‌های کلیه بچه همستر (BHK) که از همستر طلایی سوری (Mesocricetus auratus) مشتق شده‌اند، در هر دو زمینه مهم هستند. در اصل، سلول‌های BHK یک رده سلولی پستانداران وابسته به لنگر با الگوی رشد فیبروبلاست در شرایط استاندارد کشت سلولی از جمله سرم جنین گاوی (FBS) بودند [3، 4]. سازگاری سلول های BHK چسبنده بهتعلیقرشد در محیط های بدون سرم همراه با شرایط کشت در مقیاس بزرگ، یک داستان موفقیت آمیز برای تولید پروتئین های نوترکیب (به عنوان مثال، فاکتور VIII) با بازده بالا است [1، 2]. علاوه بر این، سلول های BHK به طیف وسیعی از ویروس ها، از جمله ویروس تب برفکی (FMD) حساس هستند [5]. برای پاسخگویی به تقاضای فزاینده برای واکسن‌های FMD در بسیاری از نقاط جهان، مقادیر زیادی آنتی ژن باید تا حد امکان ارزان‌تر تولید شود، که با افزایش تراکم سلولی زنده در سمت سلولی و کاهش هزینه از طریق ساده‌سازی پردازش بالا و پایین دستی می‌شود. آنتی ژن در سمت تولید [6]. رسانه‌های بدون اجزای حیوانی (ACFM) خطر آلودگی توسط عوامل ناخواسته را کاهش می‌دهند و علاوه بر این فرآیند را در زمانی که نیازی به مکمل‌سازی سرمی نیست، ساده می‌کنند [6، 7]. با این حال، سازگاری سلول ها برای رشد در حالت تعلیق بدون سرم و در ACFM یک فرآیند زمان بر و تدریجی است [6، 8]. سلول‌های BHK به راحتی به تراکم سلولی 3.5×106 سلول در میلی‌لیتر در حالت تعلیق می‌رسند، اما سازگاری همیشه خطر تکامل ویژگی‌های سلولی نامطلوب در مقایسه با جمعیت اولیه را به همراه دارد که می‌تواند منجر به عملکرد ضعیف رشد، بازده اختصاصی سلول ناکافی یا دارایی‌های تومورزا شود. [5، 7]. به نوبه خود، تغییرات در سلول ها می تواند منجر به انواع غیرمنتظره ویروس در طول فرآیند سازگاری فرهنگی شود. به خصوص برای تولید آنتی ژن واکسن، تغییر در ویژگی های ویروس و آنتی ژنی بسیار نامطلوب است. سلول های BHK در حال حاضر از نظر حساسیت و امکان انتشار گونه های ویروسی خاص FMDV متفاوت هستند [9]. بدیهی است که تغییر از رشد فیبروبلاست وابسته به لنگر از طریق تجمع و تشکیل کروی ها به سلول هایی که به طور مستقل در حالت تعلیق رشد می کنند با تغییرات قابل توجهی در خود سلول همراه خواهد بود [4، 6]. از دست دادن سیگنال دهی اینتگرین به دلیل قطع تماس ماتریکس خارج سلولی با سلول منجر به تغییر در بیان پروتئین غشایی و در سازماندهی اسکلت سلولی اکتین می شود که گیرنده مهم سیگنال دهی با واسطه اینتگرین است [6، 10]. در عین حال، این اینتگرین ها نقش مهمی در عفونت FMDV دارند زیرا گیرنده FMDV در میزبان طبیعی و گیرنده اولیه در کشت سلولی هستند [11].

درک عمیق تر از تفاوت های سلولی بین سلول های HK در حال رشد و سلول ها درتعلیقفرصت های جدیدی را برای مهندسی سلولی ایجاد می کند و انتخاب کلون های سلولی مناسب برای تولید آنتی ژن واکسن را ساده می کند.

در این مطالعه، سلول‌های BHK با رشد چسبنده و ACFM سازگار شدندتعلیقسلول‌های BHK با توجه به بیان گیرنده‌های سلولی مانند اینتگرین و سولفات‌های هپاران (HS)، توانایی آن‌ها در ارائه پروتئین‌ها در سطح سلول، و سازماندهی اسکلت اکتین سلولی مورد بررسی قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل رونوشت و سینتیک رشد اطلاعاتی در مورد تنوع رده های سلولی BHK آزمایش شده ارائه می دهد.

سیستانچ می تواند کلیه ها را تغذیه کرده و عملکرد کلیه را بهبود بخشد

2. مواد و روشها

2.1 رده های سلولی و کشت سلولی

رده‌های سلولی اصلی مورد استفاده، دو مشتق کلون 13 BHK{0}} بودند (از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی [ATCC] CCL-10، که به‌عنوان CCLV-RIE 164 و 179 در مجموعه خطوط سلولی در دامپزشکی نگهداری می‌شوند. ، موسسه فردریش لوفلر، گریفسوالد، آلمان؛ به طور خلاصه: BHK164 یا BHK179) وتعلیقخطوط سلولی BHK21C13-2P (BHK-2P) ارائه شده توسط مجموعه اروپایی فرهنگ های سلولی تأیید شده (ECACC; 84111301) و BHK-InVitrus (BHK-InV، همچنین به عنوان "خط #8" شناخته می شود. همانطور که در انتشار قبلی ما [12]؛ سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا).

برای سینتیک رشد، از رده‌های سلولی زیر نیز استفاده شد: BHK{0}}P یا در محیط حداقل ضروری گلاسکو (GMEM) با 10 درصد FBS ("خط #2") یا سازگار با ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA، دارمشتات، آلمان) در دو فرآیند مختلف (خط 4 و 5)، به علاوه چهار فرآیند دیگرتعلیقرده های سلولی: BHK21C13 سازگار با رشد درتعلیقبا حذف تدریجی سرم (خط 3)، BHK21-C (خط شماره 6)، BHK{3}}هکتور (خط شماره 7) و تولید BHK (خط شماره 9) [12]. تمام این سلول ها توسط Merck KGaA ارائه شده است.

تمام سلول‌های BHK-21 مورد استفاده در این مطالعه در نهایت از رده سلولی BHK-21 کلون 13 مکفرسون و استوکر [13] مشتق شده‌اند. اصطلاح "خط سلول" به طور آزاد استفاده می شود. همه یازده خط BHK{4}} شرح داده شده در مطالعه حاضر، به جای مشتقات کشت شده در شرایط مختلف، خطوط سلولی واقعاً متمایز نیستند. برای ارجاع آسان تر، شماره گذاری خطوط با شماره گذاری در نشریه قبلی ما مطابقت دارد [12].

خط سلولی شماره 1 از انتشار قبلی در مطالعه حاضر گنجانده نشده است و بنابراین از این تعداد استفاده نمی شود. درعوض، هر ارجاعی به سلول‌های BHK-2 که شماره‌های خط #2، #4 یا #5 را ذکر نمی‌کند، مربوط به اصلی است.تعلیقخط سلولی BHK21C13-2P (ECACC84111301) در ابتدای این بخش معرفی شد.

رده های سلولی تخمدان همستر چینی (Cricetulus griseus) (CHO) CHO-K1 (ATCCCCL{2}}، که به عنوان CCLV-RIE 134 نگهداری می شود) و CHO677 (CRL 2244، به عنوان CCLV-RIE 1524 نگهداری می شود) و همچنین IB-RS سلول‌های -2 (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no{12}}، به‌عنوان CCLV-RIE 103 نگهداری می‌شوند) و سلول‌های کلیه گاوی مدین-داربی (به طور خلاصه: MDBK، نگهداری شده به عنوان CCLV-RIE261) استفاده شد به عنوان کنترل در آزمایشات فلوسیتومتری.

شرایط کشت 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2 و برایتعلیقسلول 320 دور در دقیقه در بیوراکتورهای TubeSpin (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) در رطوبت نسبی 80 درصد. تمام رده های سلولی چسبنده در حداقل محیط ضروری عقاب (MEM) همراه با نمک های هنکس و ارل (سیگما-آلدریچ) با 10 درصد FBS کشت داده شدند. تمام رده های سلولی سوسپانسیون برای رشد در محیط کشت Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA) سازگار شدند، به جز رده سلولی #2، که همانطور که در بالا توضیح داده شد کشت داده شد.

اندازه گیری تراکم و زنده ماندن سلولی با استفاده از تریپان بلو (Bio-Rad، Hercules، CA، USA) و شمارنده سلولی خودکار (مدل TC20، Bio-Rad) انجام شد.

2.2 تجزیه و تحلیل منحنی رشد سلول های تعلیق

تجزیه و تحلیل منحنی رشد به‌عنوان آزمایش‌های دسته‌ای انجام شد، در دو تکرار، دو بار به‌صورت جداگانه، با تراکم بذر 106×6.6 سلول در میلی‌لیتر 0. تراکم سلول زنده (VCD) و درصد زنده ماندن روزانه تا شش روز پس از تلقیح سلول اندازه گیری شد.

محاسبات اختصاصی سلول با توجه به معادلات ارائه شده توسط [14] انجام شد:

X: VCD (در هر میلی لیتر)؛ t: نقاط زمانی نمونه برداری (ساعت)؛ n و n-1: دو نقطه نمونه برداری متوالی.

شماره تقسیم سلولی (cd):

2.3 فلوسیتومتری

آنالیزهای فلوسایتومتری با استفاده از ابزار فلوسیتومتری FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK) انجام شد. بقایای سلولی بر اساس الگوهای پراکندگی رو به جلو و جانبی خارج شدند. برای رنگ آمیزی اکتین، شدت فلورسانس متوسط ​​در کانال Alexa 488 به طور مستقیم اندازه گیری شد. برای تمام رنگ‌های آنتی‌بادی، درصد الکسا 488 یا سلول‌های PE مثبت با یک گیت بازه‌ای تعیین شد که مرز پایینی آن بر اساس کنترل ایزوتیپ تعیین شد. تمام آزمایش ها سه بار به طور مستقل انجام شد.

2.3.1 رنگ آمیزی آنتی بادی گیرنده های سطح سلولی.

سطح سلول های MDBK به عنوان یک کنترل مثبت برای بیان v 3، سلول های IB-RS{2}} به عنوان یک کنترل مثبت برای بیان v 8، و سلول های CHO-K1 به عنوان یک کنترل مثبت برای بیان HS عمل کردند. . سلول‌های CHO677 هیچ یک از اینتگرین‌های آزمایش‌شده و HS را بیان نمی‌کنند و بنابراین به عنوان یک کنترل منفی در تمام آزمایش‌ها عمل می‌کنند. آنتی بادی های زیر مورد استفاده قرار گرفت: برای v 3، کلون PE کونژوگه LM609 (رقت 1:20) (mAb1976H، Merck KGaA). برای v 8، آنتی بادی اولیه 11E8، کلون 68، IgG2a موش (رقت 1:100) (با مهربانی توسط دکتر استفن نیشیمورا ارائه شده است) با آنتی بادی ثانویه بز ضد موش IgG2a (رقت 1:1000) کونژوگه با Alexa Fluor 488The Scientific ) برای HS، کلون 10E4، IgM موش (رقت 1:200) (Amsbio، Abingdon، UK) با آنتی بادی ثانویه بز ضد موش IgM زنجیره مو (رقت 1:2000) کونژوگه با Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Camb) . در هر آزمایش فقط یک آنتی بادی اولیه استفاده شد.

سلول های سوسپانسیون با سالین بافر فسفات (PBS) شسته شدند. سلول های چسبنده با استفاده از 1{13}} میلی مولار EDTA در PBS جدا شدند و سپس با PBS شسته شدند. پس از شستشو، سلول‌ها از طریق یک صافی سلولی (مشبک نایلونی، قطر منافذ 7{15}} میکرومتر، VWR، Radnor، ایالات متحده آمریکا) فیلتر شدند تا توده‌های سلولی حذف شوند و قبل از مصرف ۱ میکرولیتر LIVE/ به ۱×۱۰۶ سلول در میلی‌لیتر تنظیم شدند. رنگ سلول مرده بنفش DEAD FixableViolet (Thermo Fisher Scientific) به مدت 30 دقیقه به 1 میلی لیتر سوسپانسیون سلولی اضافه شد. این مرحله و تمامی مراحل زیر در محافظت از نور و در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. آنتی بادی اولیه به مدت 30 دقیقه و آنتی بادی ثانویه برای 20-30 دقیقه انکوبه شد. یک مرحله شستشو با 2 میلی لیتر بافر FACS (PBS، 0.1 درصد آزید سدیم، 0.1 درصد BSA) و سانتریفیوژ در 300 × گرم، 5 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد پس از تمام مراحل انجام شد. در نهایت، سلول های رنگ آمیزی شده در بافر 300 میکرولیتری FACS معلق شدند.

2.3.2 رنگ آمیزی اکتین.

رنگ آمیزی اکتین رشته ای با استفاده از معرف فالویدین-iFluor 488 (ab176753، Abcam) تهیه شده بر اساس داده ها انجام شد. سلول‌های BHK179، BHK-2 و BHK-InV همانطور که در بالا توضیح داده شد، جدا شدند و با فرمالدئید 4 درصد به مدت 2{10}} دقیقه در دمای اتاق (RT) ثابت شدند. سلول ها دو بار با PBS شسته شدند و 1×106 سلول ثابت با 0.1 درصد تریتون ایکس{12}} (سیگما-آلدریچ) در PBS نفوذ پذیر شدند و سپس انکوباسیون در RT به مدت 3 دقیقه انجام شد. سلول ها دو بار با PBS (سانتریفیوژ در 300 × گرم، 5 دقیقه) قبل از افزودن محلول استوک فالویدین آماده شده، رقیق 1:1000 در بافر FACS، و 20 دقیقه در atRT انکوبه شدند. در نهایت، سلول ها دو بار با بافر FACS شسته شدند و در یک بافر 300 میکرولیتری FACS معلق شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی مستقیماً با میکروسکوپ فلورسانس آنالیز شدند و برای آنالیز FACS مورد استفاده قرار گرفتند.

2.3.3 آزمایش های ترانسفکشن.

سلول های BHK164 و BHK{1}} با EGFP-N1، یک پلاسمید بیان کننده پروتئین فلورسنت سبز افزایش یافته (EGFP) (Clontech)، یا در یک سری آزمایشات دیگر با pVSV-G، یک پلاسمید بیان کننده پروتئین G تاولی ترانسفکت شدند. ویروس استوماتیت ایندیانا (VSV)، با استفاده از لیپوفکتامین 3000 (Thermo Fisher Scientific) طبق دستورالعمل سازنده. به طور خلاصه، 2 میکروگرم از DNA پلاسمید و 1.875 میکرولیتر یا 3.75 μLof لیپوفکتامین رقیق شده در محیط Cellvento™ BHK200 مخلوط شدند و در RT به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند تا امکان تشکیل کمپلکس فراهم شود. پس از آن، این مخلوط‌ها در صفحات چاهک (تقریباً 4×105 سلول در میلی‌لیتر) به سلول‌ها منتقل شدند و محیط تا 200 میکرولیتر اضافه شد. سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند.

برای تجزیه و تحلیل FACS، کل محتوای چاه پس از 24 ساعت برداشت شد. سلول‌های ترانسفکت‌شده با pEGFP سه بار با PBS شسته شدند و در بافر 3{4}}0 میکرولیتری FACS معلق شدند. یک تکرار از سلول‌های ترانسفکت‌شده با pVSV-G با PBS با 0.1 درصد (v/v) TritonX{6}} به مدت 5 دقیقه در RT قبل از رنگ‌آمیزی آنتی‌بادی نفوذپذیر شد، در حالی که دیگری نفوذناپذیر باقی ماند. رنگ آمیزی آنتی بادی همانطور که در بالا توضیح داده شد با سرم پلی کلونال خرگوش VSV 274/E (رقت 1:500، با مهربانی توسط دکتر استفان فینک ارائه شد) و آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش بز (H به علاوه L) کونژوگه با Alexa Fluor 488 (رقت 1: 1000؛ ترمو فیشر علمی).

2.4 تجزیه و تحلیل آماری

داده ها با استفاده از GraphPad Prism نسخه 07.04 برای ویندوز (نرم افزار GraphPad، La Jolla، ایالات متحده آمریکا) تجزیه و تحلیل شد. آنالیز واریانس یک طرفه معمولی با آزمون پس داغ توکی برای ارزیابی تفاوت بین گروه‌های درمان انجام شد. آستانه معناداری آماری در p-value 0.001 تعیین شد.

2.5 تجزیه و تحلیل رونوشت

2.5.1 استخراج RNA، آماده سازی کتابخانه، و توالی یابی.

سه دسته مستقل از هر یک از رده های سلولی چسبنده BHK179 و رده های سلولی تعلیق BHK-2 و BHK-InV برای تجزیه و تحلیل رونوشت استفاده شد. به طور متوسط، 8.3×1{15}}5 سلول BHK179، 1.6×107 BHK{10}}Pcells، و 1.4×107 سلول BHK-InV در TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific) لیز شدند. پس از افزودن 0.2 حجم تری کلرومتان به لیزات سلولی، انکوباسیون و سانتریفیوژ، فاز آبی جمع آوری و با یک حجم اتانول 100 درصد مخلوط شد. از این، RNA کل با استفاده از کیت کوچک RNeasy (Qiagen، Hilden، آلمان) با هضم DNase روی ستون با مجموعه DNase بدون RNase (Qiagen) به دنبال دستورالعمل‌های سازنده استخراج شد. ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) اضافه شد و به عنوان یک کنترل داخلی برای تمام مراحل زیر استفاده شد. سپس، mRNA پلی آدنیله شده از 1 تا 3 میکروگرم RNA کل با کیفیت بالا با استفاده از کیت Dynabeads mRNA DIRECT Micro (ThermoFisher Scientific) جدا شد. متعاقباً mRNA قطعه قطعه شد و برای سنتز cDNA و تهیه کتابخانه با استفاده از TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina، San Diego، USA) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. توالی یابی با استفاده از تجهیزات NextSeq 500 (2x75bp) و HiSeq 4000 (1x50bp) (Illumina) در موسسه Heinrich-Pette-Hamburg انجام شد.

2.5.2 تجزیه و تحلیل آماری بیان ژن افتراقی.

بررسی کیفیت خواندنهای خام از هر کتابخانه توالی با استفاده از FastQC (نسخه {{0}}.11.9؛ موسسه بابراهام، کمبریج، انگلستان) با تأکید بر توزیع طول خواندن و آلودگی آداپتور قبل و بعد از آداپتور انجام شد. پیرایش با استفاده از Trim Galore (نسخه 0.6.4_dev، موسسه Babraham) و Cutadapt (نسخه 2.10) [15]. سپس با استفاده از ماهی قزل آلا [16]، قرائت های خام بریده شده به ژنوم همستر طلایی سوریه شبه نقشه برداری شدند.

به طور خلاصه، ارجاعات ژنومی و رونوشت GCF{{0}}.1_MesAur1.0 از مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) به دست آمد و با توالی های مرجع ERCC spike- ترکیب شد. در کنترل ها یک شاخص رونویسی آگاه از طعمه [17] به منظور امکان تراز انتخابی با ماهی قزل آلا ساخته شد. برای تعیین کمیت، ده تکرار بوت استرپ استفاده شد و جبران سوگیری‌های خاص توالی، بایاس‌های GC، و بایاس موقعیتی 5 یا 3 فعال شد.

متعاقباً، داده‌های کمی برای کنترل‌های سنبله ERCC با غلظت نظری آن‌ها در ارتباط بود تا مشکلات در طول آماده‌سازی نمونه شناسایی شود.

علاوه بر این، داده‌های کمی‌سازی اختصاصی ژن در ابتدا فیلتر شدند (فقط ژن‌هایی که در بیش از یک تکرار با بیش از 15 شمارش ظاهر می‌شوند)، با استفاده از تبدیل log منظم شده (rlog) نرمال شدند و برای تجزیه و تحلیل داده‌های اکتشافی، به عنوان مثال با PCA استفاده شدند. ژن‌های بیان شده متفاوت شناسایی شدند و متعاقباً برای تجزیه و تحلیل مسیر با استفاده از DESeq2 استفاده شدند [18]. داده‌های بیان برای ژن‌های بیان‌شده با تفاوت معنی‌دار بین جفت‌های رده سلولی BHK-2P و BHK179، BHK-InV و BHK-2P، و BHK-InV و BHK179 تجزیه و تحلیل شد. متعاقباً، تغییر برابر لگاریتمی باینری (log2) حاصل با استفاده از توابع "lfcShrink" و "apglm" در DESeq2 به منظور جبران تعداد خواندن کم یا متغیر که ممکن است منجر به تخمین بیش از حد واریانس شود، تنظیم شد [19].

معیارهای یک ژن با بیان متفاوت به میزان قابل توجهی بر روی حداکثر مقدار تنظیم شده {{0}} تنظیم شد. برای یک ژن متفاوت بیان شده به حداکثر مقدار تنظیم شده 0.05 و حداقل مقدار مطلق تغییر برابر log2 کوچک شده 1 تنظیم شد. تجزیه و تحلیل مسیر و غنی سازی با استفاده از تابع "enrich" در پروفایل خوشه (نسخه 3.16.0) انجام شد.

سیستانچ می تواند کلیه ها را تغذیه کرده و عملکرد کلیه را بهبود بخشد

3. نتایج

3.1 حساسیت یک رده سلولی برای FMDV مستقل از سرعت رشد فردی و تعداد تقسیم سلولی آن است.

آزمایشات دسته ای با نه رده سلولی مختلف تعلیق BHK در یک دوره شش روزه انجام شد و تراکم سلول زنده (VCD) و زنده ماندن روزانه اندازه گیری شد. بر اساس مشاهدات قبلی مبنی بر اینکه رده های سلولی در حساسیت آنها به سروتیپ FMDV آسیا متفاوت است{0}} [12]، بررسی شد که آیا افزایش متابولیسم سلولی و سرعت رشد با کاهش حساسیت به عفونت با این بیماری مرتبط است یا خیر. ویروس (جدول 1). دو رده از سه رده سلولی حساس به تعلیق BHK، سلول هایی با تعداد تقسیم سلولی کوچک (cd) 0.60 (#3) و 0.70 (#9) به آرامی در حال رشد هستند، در حالی که سومین رده سلولی حساس (#8) دارای بالاترین نرخ رشد و cd (μ=0.035, cd=1.62) در بین تمام رده های سلولی آزمایش شده.

قطع سرم و سازگاری با رشد در ACFM تأثیری بر حساسیت به FMDV در مجموعه رده‌های سلولی مورد بررسی ما نداشت. رده سلولی شماره 2 پیش‌ساز آهسته رشد و وابسته به سرم رده‌های سلولی BHK-2P است که با GMEM با سرم جنین گاوی در حالت تعلیق نگهداری می‌شود. در طول انطباق با رشد در ACFM، سلول‌ها برای VCD بالا انتخاب شدند که به نرخ رشد بالا و cd مرتبط بودند. مانند رده سلولی اصلی BHK{3}}P مورد استفاده برای مطالعه، خطوط سلولی #4 و #5 نیز از خط سلولی #2 مشتق شده‌اند، اما در نحوه سازگاری با ACFM متفاوت هستند. تمام رده های سلولی BHK{7}P نگهداری شده در ACFM نمایه رشد بسیار مشابهی را نشان دادند. حساسیت به FMDV سروتیپ آسیا-1 توسط هیچ یک از این سلول‌ها در طول سازگاری با ACFM بدست نیامد، احتمالاً به این دلیل که خط اصلی شماره 2 قبلاً مقاوم بوده است. به طور مشابه، هیچ تغییری در حساسیت برای رده سلولی تعلیق شماره 3 مشاهده نشد. هنگامی که به طور چسبنده رشد می کردند (ر.ک. خط سلولی #1 در [12])، سلول ها به FMDV آسیا حساس بودند{13}} و آنها این ویژگی را در طول سازگاری با رشد در حالت تعلیق حفظ کردند. در همان زمان، آنها مشخصات رشد سریع سایر سلول های تعلیق را به دست نیاوردند.

3.2 سلول های معلق گیرنده های اولیه کمتر اما گیرنده های ثانویه بیشتری برای FMDV در سطح خود نسبت به سلول های BHK چسبنده دارند.

اولین گام برای اینکه ویروس با موفقیت یک سلول را آلوده کند، اتصال ذره ویروسی به مولکول‌های گیرنده روی سطح سلول است. برای تجزیه و تحلیل تفاوت‌های بین سلول‌های BHK در حال رشد و سلول‌های BHK در سوسپانسیون، آنتی‌بادی‌های گیرنده‌های سلولی درگیر در تعامل ماتریکس خارج سلولی و نقش مهمی در عفونت FMDV مورد آزمایش قرار گرفتند. اینتگرین های v 3 و v 8 به عنوان گیرنده های سلولی نماینده ای که موتیف اتصال RGD (Arg-Gly-Asp) را تشخیص می دهند و با اجزای سرم و ماتریکس خارج سلولی تعامل دارند مورد بررسی قرار گرفتند، اما همچنین توسط FMDV به عنوان گیرنده های اولیه طبیعی آن استفاده می شود. هیچ یک از رده های سلولی سوسپانسیون آزمایش شده (BHK-InV و BHK{5}}P) اینتگرین v 3 یا v 8 را روی سطح سلول بیان نکردند. در حالی که تفاوت بین BHK چسبنده و سوسپانسیون BHK برای اینتگرین v 8 معنی‌دار نبود (شکل 1b)، درصد بیشتری از BHK179 چسبنده اینتگرین v 3 را در مقایسه با رده‌های سلولی تعلیق BHK-InV و BHK{13}}P ( شکل 1a).

مقادیر بالایی از HS بر روی سطح هر دو رده سلولی تعلیق ارائه شد. بیان HS بین کشت‌های تکراری سلول‌های BHK179 بسیار متفاوت بود. در مقایسه با رده‌های سلولی سوسپانسیون، سلول‌های کمتری در کشت‌های BHK179 HS مثبت بودند، حتی اگر این تفاوت در سطح اهمیت از پیش تعیین‌شده معنی‌دار نبود (شکل 2).

رنگ آمیزی و تجزیه و تحلیل میکروسکوپی تفاوت های زیادی را در آرایش اسکلت سلولی اکتین بین سلول های چسبنده و سوسپانسیون نشان داد (شکل 3). رشته های اکتین در سلول های چسبنده BHK179 به طور یکنواخت در کل سلول در یک الگوی شبکه ای ظریف توزیع شده اند (شکل 3a)، در حالی که سلول هایی که در حالت تعلیق رشد می کنند دارای رنگ آمیزی منتشر اکتین هستند (شکل 3b). جالب توجه است که مقدار اکتین رشته ای بین رده های سلولی سوسپانسیون BHK-InV و BHK-2 متفاوت بود. شدت فلورسنت متوسط ​​(MFI) پس از رنگ‌آمیزی فالویدین در سلول‌های BHK-InV در مقایسه با BHK{7}}P به طور قابل‌توجهی بالاتر بود، که نشان‌دهنده محتوای اکتین رشته‌ای بالاتر در این سلول‌ها است (شکل 3c).

3.3 سلول های سوسپانسیون از نظر کارایی ترانسفکشن متفاوت هستند اما در توانایی آنها برای نمایش پروتئین های سطحی تفاوت ندارند.

به دلیل تفاوت در ترکیب اکتین بین سلول‌های چسبنده و سوسپانسیون، سلول‌ها با توجه به قابلیت انتقال و توانایی ارائه پروتئین بر روی سطح خود مورد بررسی قرار گرفتند. به طور کلی، کارایی ترانسفکشن که با بیان EGFP اندازه گیری می شود، در سلول های سوسپانسیون کاهش می یابد (شکل 4a). هنگام استفاده از دوز پایین معرف ترانسفکشن، درصد بیشتری از سلول‌های چسبنده EGFP را در مقایسه با سلول‌های سوسپانسیون بیان کردند. هنگامی که دوز بالایی از معرف ترانسفکشن استفاده شد، درصد بیشتری از سلول‌های سوسپانسیون با موفقیت ترانسفکت شدند، اگرچه تفاوت بین دوزهای بالا و پایین معنی‌دار نبود. برای پاسخ به این سوال که آیا سلول های سوسپانسیون هنوز هم قادر به ارائه پروتئین هایی مانند گیرنده های سلولی در سطح خود هستند، سلول ها با یک پلاسمید کد کننده پروتئین VSV G ترانسفکت شدند (شکل 4b). یک سری از سلول‌ها قبل از رنگ‌آمیزی نفوذپذیر شدند تا احتمال بیان پروتئین G در سطح سلولی را در نظر بگیرند. تفاوت معنی داری در توانایی بیان و ارائه پروتئین VSV G بین سلول های چسبنده و سوسپانسیون وجود نداشت، نه در هنگام استفاده از دوز کم یا زیاد از معرف ترانسفکشن.

3.4 تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم تفاوت هایی را در بیان ژن های مربوط به ماتریکس خارج سلولی بین سلول های تعلیق نشان می دهد.

تجزیه و تحلیل رونوشت برای بررسی بیشتر تفاوت‌های بین سلول‌های BHK در حال رشد و سلول‌های BHK در سوسپانسیون و مشخص کردن اینکه چرا سلول‌های سوسپانسیون در حساسیت خود به FMDV متفاوت هستند، انجام شد. یک رده سلولی چسبنده BHK (BHK179) در MEM تکمیل شده با FBS و همچنین یک رده سلولی حساس به FMDV با رشد سریع (BHK-InV) و یک رده سلولی مقاوم به رشد سریع (BHK-2) کشت داده شده است. سازگار با ACFM، برای تجزیه و تحلیل انتخاب شدند.

تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) رابطه نزدیک بین تکرارهای بیولوژیکی رده های سلولی منفرد را برجسته کرد (شکل 5a). تمام تکرارهای یک رده سلولی با نشانه اندکی از اثرات دسته به دسته، نزدیک به هم در طرح قرار دارند. اولین مؤلفه اصلی (که 81 درصد از واریانس در مجموعه داده نرمال شده را به خود اختصاص می دهد) به عنوان تفاوت رونویسی بین سلول هایی که در حالت تعلیق رشد می کنند و سلول های در حال رشد در پایبندی تفسیر شد، در حالی که مؤلفه اصلی دوم (15 درصد واریانس) نشان دهنده تفاوت بین رده های سلولی تعلیق BHK-2 و BHK-InV، احتمالاً با حساسیت به عفونت FMDV مرتبط هستند. با هم، دو مؤلفه اصلی اول توانستند 96 درصد از واریانس موجود در مجموعه داده را توضیح دهند، که نشان می دهد تجزیه و تحلیل رونوشت تفاوت های مربوطه را بین سه رده سلولی شناسایی می کند.

کمترین تعداد ژن‌های بیان‌شده متفاوت در مقایسه BHK-InV با BHK{1}}P (590 با تنظیم بالا؛ 304 با تنظیم پایین) یافت شد. اعداد مشابهی در مقایسه BHK-2P یا BHK-InV به صورت جداگانه با BHK179 مشاهده شد (به ترتیب 1527 و 1519 تنظیم شده؛ 1308 و 943 با تنظیم پایین) (شکل 5b). هنگامی که دو رده سلولی تعلیق (BHK-InV و BHK{17}}P) با هم ترکیب شدند و با رده سلولی چسبنده BHK179 مقایسه شدند، 1814 ژن به طور متفاوت بیان شد. در حالی که در مقایسه BHK179 با BHK-InV، 411 ژن منحصراً متفاوت بیان می‌شوند، تقریباً دو برابر (701 ژن) به طور انحصاری بین BHK179 و BHK بیان می‌شوند{25}}P. بین دو رده سلولی تعلیق، تنها 104 ژن منحصراً متفاوت بیان شدند.

هنگام مقایسه مجموعه ای از ژن های متفاوت بیان شده رده های سلولی حساس به FMDV BHK179 و BHK-InV با رده سلولی مقاوم به FMDV BHK{4}}P، زیرمجموعه ای از 553 ژن به طور متفاوت در هر دو مقایسه بیان شدند. شکل 5 ج). از آنجایی که این ژن‌ها ممکن است در حساسیت FMDV دخیل باشند، یک تجزیه و تحلیل غنی‌سازی اصطلاح GO انجام شد و نشان داد که بسیاری از این ژن‌ها به اجزای سلولی ماتریکس خارج سلولی (ECM)، غشای سلولی و اتصالات سلول به سلول مرتبط هستند (شکل 5d). .

از آنجایی که ما تفاوت‌هایی را بین رده‌های سلولی مربوط به برهمکنش‌های ECM مشاهده کردیم، رونوشت با تمرکز بر بیان اینتگرین‌های v 1، v 3، v 6، v 8، و همچنین اکتین، که همگی به طور بالقوه برای حساسیت به عفونت FMDV مرتبط هستند، مجدداً آنالیز شد. (شکل 5e). به استثنای ACTA2، تفاوت معنی‌داری در بیان ژن‌های مرتبط با اکتین بین سلول‌های BHK-InV و BHK{8}} در سطح mRNA وجود نداشت. تعداد ژن های نرمال شده برای همه ژن های مربوط به اکتین بررسی شده در رده سلولی چسبنده BHK179 به طور قابل توجهی بیشتر از رده های سلولی تعلیق بود (شکل S1).

هر سه رده سلولی مقادیر مشابهی از رونوشت‌های ITGAV را بیان می‌کنند که زیرواحد اینتگرین v را کد می‌کنند، اما بیان متفاوتی را برای زیر واحدهای اینتگرین نشان می‌دهند. به طور مفصل، خطوط سلولی تعلیق BHK-2P و BHK-InV به طور قابل توجهی ITGB1، ITGB3، و ITGB6 را در مقایسه با رده سلولی چسبنده BHK179 بیان کردند. ITGB3 و ITGB8 به طور قابل توجهی بین خطوط سلولی تعلیق BHK{8}} و BHK-InV بیان شدند. جالب اینجاست که ITGB8 تنها ژن کدکننده زیرواحد اینتگرین بود که در هر دو رده سلولی حساس به FMDV BHK179 و BHK-InV در مقایسه با رده سلولی مقاوم به FMDV BHK{15}}P (شکل 5e) به شدت بیان شد.

سیستانچ می تواند کلیه ها را تغذیه کرده و عملکرد کلیه را بهبود بخشد

4. بحث

سازگاری سلول ها برای رشد در سوسپانسیون و در محیط های بدون سرم یک فرآیند زمان بر و تدریجی اما ضروری در بیوتکنولوژی برای تولید رده های سلولی با بازده بالا است که برای تولید آنتی بادی ها، آنتی ژن های واکسن، یا سایر پروتئین ها استفاده می شود [1، 8]. ]. در واقع، این فرآیند همیشه مملو از این خطر است که سلول‌ها در مقایسه با مواد سلولی اولیه، خواص نامطلوبی پیدا کنند [7]. در مورد تولید آنتی ژن واکسن، حساسیت رده سلولی برای ویروس هدف از اهمیت زیادی برخوردار است. برای ویروس تب برفکی (FMDV)، این یک پدیده شناخته شده است که رده های سلولی خاص BHK در برابر عفونت مقاوم هستند یا حساسیت خود را در طی زیرکشت مکرر از دست می دهند [20-22]. علاوه بر این، خواص آنتی ژنی ویروس بسته به سلول میزبان می تواند متغیر باشد [9].

سلول‌های تعلیق مستقل از یک سطح رشد می‌کنند و توسط مواد مغذی غنی از اکسیژن غرق می‌شوند و به آنها اجازه رشد سریع می‌دهد. تکثیر سریع سلول ها یکی از ویژگی های مورد نیاز برای افزایش مقیاس کشت به حجم زیاد به راحتی و در زمان کوتاه است. حذف سرم از محیط برای کاهش هزینه ها، خطر آلودگی و ساده کردن فرآیندهای کاهش مقیاس ضروری است [23، 24].

تجزیه و تحلیل رشد دسته ای رده های سلولی مختلف تعلیق BHK برای تعیین اینکه آیا انتخاب به سمت یک جمعیت سلولی با رشد سریع در شرایط بدون سرم برای انتشار FMDV مضر است یا خیر در نظر گرفته شده است. در واقع، دو رده از سه رده سلولی حساس به کندی رشد کردند، اما مشخص شد که حساسیت آنها به FMDV مستقل از متابولیسم رشد آنها است. به احتمال زیاد حساسیت FMDV در طول سازگاری اولیه با رشد در حالت تعلیق از بین رفته (یا حفظ شده است). جدا شدن سلول ها از سطح و خروج سرم در مراحل بعدی سازگاری با رشد سوسپانسیون منجر به تغییر در سطح بیان پروتئین های سطحی و پروتئین های درگیر در اسکلت سلولی می شود [7].

اینتگرین ها خانواده مهمی از گیرنده های سطح سلولی هستند که در غشای سلولی ادغام می شوند و پیام رسانی سلول به سلول و همچنین ارتباط قوی بین سلول و سطح را از طریق اتصال اجزای ماتریکس خارج سلولی (ECM) انجام می دهند [10، 25]. ]. تنظیم چرخه سلولی، سازماندهی اسکلت سلولی و انتقال مولکول های گیرنده نوپا به غشای سلولی به اینتگرین ها بستگی دارد [25]. برای بسیاری از اینتگرین ها، اتصال ECM، و همچنین اتصال لیگاندهایی که از طریق افزودن سرم به محیط کشت به سلول ها ارائه می شود، توسط موتیف RGD انجام می شود [6، 25] و احتمالاً زمانی که سلول از رشد چسبنده به رشد معلق تغییر می کند. تشخیص موتیف RGD توسط اینتگرین ها نیز توسط FMDV برای شروع اندوسیتوز ذره ویروس با واسطه گیرنده استفاده می شود [26]. موتیف RGD در VP1 FMDV بسیار حفظ شده است [27] و اینتگرین های v 1، v 3، v 6 و v 8 گیرنده های شناخته شده ای هستند که توسط FMDV در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی استفاده می شوند [28-31]. از آنجایی که تفاوت های مشکوک در پروتئوم سطح سلولی بین سلول های چسبنده و سوسپانسیون نیز ممکن است برای تفاوت در حساسیت به عفونت FMDV بسیار مهم باشد، آنتی بادی های متصل به اینتگرین v 3 و v 8 برای رنگ آمیزی یک رده سلولی چسبنده BHK و همچنین یک رده سلولی چسبنده استفاده شد. رده سلولی BHK معلق حساس و مقاوم. هیچ رنگ آمیزی v6 انجام نشد زیرا قبلاً نشان داده شده بود که این اینتگرین در سطح سلول های BHK بیان نمی شود [32]، حتی اگر mRNA ITGB6 قابل تشخیص است. به طور مشابه، با وجود سطح بالای بیان mRNA ITGB8 شناسایی شده در سلول های BHK179 و BHK-InV، به نظر نمی رسد اینتگرین v8 به طور کلی روی سطح سلول های BHK ارائه شود. اینتگرین v 3 به میزان جزئی در رده سلولی چسبنده یافت شد، اما نه در رده های سلولی تعلیق.

جدا از اینتگرین، اتصال لیگاند، رویدادهای درونی سازی و سیگنال دهی درون سلولی می تواند توسط پروتئوگلیکان های سولفات هپاران (HS) [33] واسطه شود و کسب HS به عنوان یک گیرنده ثانویه اغلب پس از عبور مکرر FMDV در فرهنگ مشاهده می شود [34]. رنگ آمیزی آنتی بادی خاص HS فراوان را در هر دو رده سلولی تعلیق و به میزان کمتری روی سلول های BHK چسبنده نشان داد. جهش در ژنوم FMDV، که منجر به تغییراتی در پروتئین‌های کپسید ویروسی می‌شود تا امکان استفاده از HS به عنوان یک گیرنده را فراهم کند، ویروس را در میزبان طبیعی ضعیف می‌کند [35]. بنابراین در دسترس بودن HS ممکن است یک عامل مهم برای تغییر آنتی ژنی بودن استقلال FMDV رده سلولی باشد که ویروس با آن سازگار شده است.

از آنجایی که جداشدگی سلولی با تغییرات در مکانیسم انقباضی اکتین-میوزین [7] مرتبط است و کشت سلول ها در حالت تعلیق نیازمندی های متفاوتی را برای بقا به همراه دارد، به عنوان مثال مقاومت در برابر تنش برشی بالا به دلیل هم زدن مایع کشت [6]، اسکلت اکتین شده است. مورد توجه عمده در این مطالعه. تجزیه و تحلیل میکروسکوپی یک بازآرایی ساختاری اسکلت سلولی را از یک توزیع مشبک در سلول‌های در حال رشد چسبنده به یک ساختار کروی متراکم در شرایط تعلیق نشان داد. این ممکن است یک مکانیسم تنظیمی برای تنش برشی بالا ذکر شده در بالا باشد و همچنین شناخته شده است که در سلول‌های CHO در شرایط یکسان رخ می‌دهد [6]. اما این نکته نیز قابل توجه است که در حالی که تفاوت معنی‌داری در بیان بیشتر ژن‌های اکتین بین سلول‌های BHK-InV و BHK{6}} در سطح mRNA وجود نداشت، پروتئین اکتین رشته‌ای به‌طور معنی‌داری در BHK حساس به FMDV شناسایی شد. -InV نسبت به BHK مقاوم در برابر FMDV-2P. این ممکن است به نرخ های مختلف پلیمریزاسیون اکتین کروی به اکتین رشته ای مرتبط باشد.

حداقل در سلول های چسبنده، ورود FMDV به دینامیک اکتین بستگی دارد. ورود ویروس باعث ایجاد رفل اکتین می شود و اختلال در شبکه رشته ای اکتین از طریق تبدیل اکتین رشته ای به اکتین کروی در مراحل اولیه عفونت شرح داده شده است [36-38]. با قضاوت از روی اثر سیتوپاتیک (CPE) که در سلول‌های BHK چسبنده دیده می‌شود، هنگامی که با FMDV آلوده می‌شوند، اسکلت سلولی در بسیاری از اجزای خود بازآرایی‌های شدیدی را پشت سر می‌گذارد [38]. چنین CPE در سلول‌های سوسپانسیون به دلیل شکل کروی آن‌ها دیده نمی‌شود، اما محتوای اکتین بالا ممکن است مزیتی به ویروس بدهد. به دلیل تفاوت‌های موجود در اسکلت سلولی اکتین، آزمایش‌های ترانسفکشن برای مقایسه کارایی ترانسفکشن بین سوسپانسیون و BHK چسبنده و تعیین اینکه آیا اسکلت سلولی متراکم سلول‌های تعلیق مانع از ارائه پروتئین‌ها در سطح سلولی می‌شود، انجام شد. این دانش عمومی است که انتقال خطوط سلولی معلق بسیار دشوار است، که ناشی از کاهش اتصال کمپلکس ترانسفکشن به غشای سلولی و متعاقبا کاهش جذب بار DNA است [39]. این را آزمایشات ما نیز تایید کرد. اما اگرچه راندمان ترانسفکشن در سلول‌های BHK{4}} در مقایسه با رده سلولی چسبنده BHK کاهش یافت، هیچ تفاوتی در توانایی نمایش پروتئین VSV G ترانسفکت‌شده روی سطح سلولی وجود نداشت. تفاوت در درصد سلول های رنگ آمیزی شده بین پلاسمیدهای بیان pEGFP-N1 و pVSV-G در سلول های BHK{8}} مشاهده شد. این مورد بیشتر مورد بررسی قرار نگرفت، اما ممکن است ناشی از محدودیت تشخیص متفاوت بین رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس مورد استفاده برای تجسم VSV-G و فلورسانس ذاتی EGFP باشد.

در نهایت، تجزیه و تحلیل رونوشت برای ارائه اطلاعات بیشتر در مورد تفاوت های رونویسی بین سلول های BHK چسبنده و سوسپانسیون از یک طرف و بین رده های سلولی BHK حساس به FMDV و مقاوم به FMDV از سوی دیگر انجام شد. نتایج ما با سایر مطالعات تغییرات رونوشت در سلول‌های CHO، MDCK یا HEK در طول تغییر از رشد چسبنده به سوسپانسیون مطابقت دارد. به طور کلی، بیشتر تغییرات مربوط به ساختار اسکلت سلولی، متابولیسم سلولی و برهمکنش‌های اجزای ECM است و برای سلول‌های تعلیق تنظیم می‌شود [7، 40، 41]. با کمال تعجب، سلول تعلیق BHK{6}}P مقاوم به FMDV، تنظیم منفی این مجموعه‌های ژنی را نشان داد، که ممکن است کاهش سطح اکتین در BHK-2P را در مقایسه با سلول‌های BHK-InV نیز توضیح دهد. تجزیه و تحلیل خاص بیان زیرواحد اینتگرین سطوح مشابهی از رونوشت‌های زیرواحد V اینتگرین را در هر سه رده سلولی نشان داد. بالاترین بیان در تمام رده های سلولی برای زیرواحد اینتگرین 1 یافت شد. توجه به این نکته مهم است که اینتگرین 1 می تواند هترودیمرهایی با ده زنجیره مختلف تشکیل دهد و به طور اساسی توسط اکثر سلول های پستانداران بیان می شود [6، 42]. به طور مشابه، زیرواحد V قادر به تشکیل یک هترودایمر با پنج زنجیره مختلف است، اما 6 و 8 تنها در سطح سلول در ترکیب با V ارائه می شوند [42]. این به طور دقیق توسط فراوانی مشاهده شده رونوشت های زیر واحد اینتگرین منعکس می شود. رونویسی بالا از 3 در سلول های چسبنده نیز به خوبی با سیگنال بالاتر برای اینتگرین v 3 در آزمایش های رنگ آمیزی آنتی بادی ارتباط دارد. از سوی دیگر، تفاوت‌های مشاهده‌شده در سطوح mRNA ITGB3 و ITGB8 بین BHK{20}}P و BHK-InV در رنگ‌آمیزی سطح منعکس نشد. ما قادر به حل این موضوع نبودیم که آیا این صرفاً به دلیل حساسیت غیرمشابه بین روش‌های کمی‌سازی mRNA و پروتئین است یا نشان‌دهنده بلوک بیان پروتئین یا نمایش سطحی پس از رونویسی است [43]. به طور کلی، رده‌های سلولی تعلیق BHK-2P و BHK-InV mRNA ژن ITGB1، ITGB3 و ITGB6 را در مقایسه با رده سلولی چسبنده به‌طور معنی‌داری کمتر بیان کردند.

5. نتیجه گیری در

در نتیجه، در تهیه سلول‌های تعلیق، استفاده از یک کلون سلولی والدین با ویژگی‌های شناخته شده و غربالگری جمعیت سلولی حاصله در طول فرآیند سازگاری برای اطمینان از حفظ ویژگی‌های ضروری، در این مورد، اهمیت حیاتی دارد. ، حساسیت به FMDV. علاوه بر این، روش‌های مدرن مانند آنالیز FACS و رونوشت‌شناسی باید برای شناسایی بیشتر خطوط سلولی تولیدی استفاده شود.

سیستانچ می تواند کلیه ها را تغذیه کرده و عملکرد کلیه را بهبود بخشد

قدردانی

ما از پاتریک زیتزو به خاطر پشتیبانی فنی عالی اش تشکر می کنیم.

مشارکت های نویسنده

مفهوم سازی:ورونیکا دیل، مایکل اشباومر.

تحلیل رسمی:ورونیکا دیل، فلوریان فاف.

جذب سرمایه:آلین زیمر، مارتین بیر.

تحقیق و بررسی:ورونیکا دیل.

روش شناسی:ورونیکا دیل، فلوریان فاف، مایکل اشبامر.

مدیریت پروژه:مارتین بیر.منابع: Aline Zimmer.

نظارت:مایکل اشباومر

تجسم:ورونیکا دیل، فلوریان فاف، مایکل اشبامر.

نوشتن – پیش نویس اصلی:ورونیکا دیل.

نگارش – بررسی و ویرایش:ورونیکا دیل، فلوریان فاف، آلین زیمر، مارتین بیر، مایکل اشباومر.

منابع

1. مرتن او. پیشرفت در کشت سلولی: وابستگی به لنگرگاه. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. پروتئین های درمانی نوترکیب: بسترهای تولید و چالش ها. بیوتکنول J.2008; 3 (1): 90-7.

3. هرناندز آر، براون دی تی. رشد و نگهداری سلول های کلیه بچه همستر (BHK). Curr ProtocMicrobiol. 2010; فصل 4: ضمیمه 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. کروز HJ، Moreira JL، Stacey G، Dias EM، Hayes K، Looby D، و همکاران. سازگاری سلول های BHK که پروتئین نوترکیب تولید می کنند به محیط های بدون سرم و محیط های بدون پروتئین. سیتوتکنولوژی. 1998; 26 (1): 59-64.

5. Guskey LE، Jenkin HM. سازگاری سلول های BHK-21 با رشد در کشت شیکر و چالش بعدی توسط ویروس آنسفالیت ژاپنی. میکروبیول اپل. 1975; 30 (3): 433-8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.{11}}.1975 PMID: 1237269

6. والتر سی جی، ویتفیلد آر، جیمز دی سی. اهمیت تعامل بین اینتگرین و اسکلت سلولی اکتین در سازگاری سوسپانسیون سلول‌های CHO. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178 (7): 1286-302.

7. Kluge S، Benndorf D، Genzel Y، Scharfenberg K، Rapp E، Reichl U. نظارت بر تغییرات در پروتئوم در طول سازگاری گام به گام یک رده سلولی MDCK از پایبندی به رشد در سوسپانسیون. واکسن 2015; 33 (35): 4269-80.

8. Costa AR، Withers J، Rodrigues ME، McLoughlin N، Henriques M، Oliveira R، و همکاران. تاثیر سازگاری سلولی با شرایط بدون سرم بر پروفایل گلیکوزیلاسیون یک آنتی بادی مونوکلونال تولید شده توسط سلول های تخمدان همستر چینی. N بیوتکنول. 2013; 30 (5): 563-72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID: 23247406

9. Bolwell C، Brown AL، Barnett PV، Campbell RO، Clarke BE، Parry NR، و همکاران. انتخاب سلول میزبان انواع آنتی ژنی ویروس تب برفکی جی ژنر ویرول. 1989; 70 (بند 1): 45-57.

10. Wiesner S، Legate KR، Fassler R. تعاملات اینتگرین-اکتین. Cell Mol Life Sci. 2005; 62 (10): 1081-99.

11. O'Donnell V، Pacheco JM، Gregg D، Baxt B. تجزیه و تحلیل بیان گیرنده اینتگرین ویروس بیماری پا و دهان در بافت های گاو ساده و آلوده. J Comp Pathol. 2009; 141 (2-3): 98-112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. انطباق FMDV Asia-1 با کشت تعلیق: مقاومت سلولی با تغییرات کپسید ویروس غلبه می‌کند. ویروس ها 2017; 9 (8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I، Stoker M. تبدیل پلیومای کلون های سلول همستر - بررسی عوامل ژنتیکی مؤثر بر شایستگی سلول. ویروس شناسی 1962; 16:147-51.

14. Rourou S، van der Ark A، van der Velden T، Kallel H. یک فرآیند کشت سلولی ریزحامل برای تکثیر ویروس هاری در سلول‌های Vero که در یک بیوراکتور همزده تحت شرایط کاملاً بدون اجزای حیوانی رشد کرده‌اند. واکسن 2007; 25 (19): 3879-89.

15. Martin M. Cutadapt توالی های آداپتور را از خواندن توالی با توان بالا حذف می کند. EMBnetjournal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon کمیت سریع و آگاهانه از تعصب بیان رونوشت را فراهم می کند. روش‌های Nat 2017; 14 (4): 417-9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. روش تراز و نقشه برداری بر برآورد فراوانی رونوشت تأثیر می گذارد. ژنوم بیول. 2020; 21 (1): 239.

18. Love MI، Huber W، Anders S. تخمین تعدیل شده تغییر برابر و پراکندگی برای داده های RNA-seq با DESeq2. ژنوم بیول. 2014; 15 (12): 550.

19. زو آ، ابراهیم جی جی، لاو MI. توزیع‌های قبلی سنگین برای داده‌های شمارش توالی: حذف نویز و حفظ تفاوت‌های بزرگ. بیوانفورماتیک. 2019; 35 (12): 2084-92.

20. کلارک جی بی، اسپایر RE. تنوع در حساسیت جمعیت های BHK و رده های سلولی شبیه سازی شده به سه سویه ویروس تب برفکی. آرک ویرول. 1980; 63 (1): 1-9.