بخش Ⅱ: آماده سازی متفورمین و پس از تهویه برای کاهش آسیب خونرسانی مجدد به Lschemia در مدل پرفیوژن دستگاه پرفیوژن نورموترمیک کلیه موش صحرایی Ex Vivo و خوک

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

Tobias M.Huink، Leonie H.Venemal، Rene A.Posma، Nynke J.de Vries، Andrie C.Westerkampl، و همکاران.

مقدمه

پیوند کلیه درمان انتخابی برای بیماران مبتلا به بیماری کلیوی در مرحله نهایی است. متأسفانه، تقاضا از در دسترس بودن اندام ها بیشتر است. 2 این کمبود منجر به افزایش استفاده از اندام های با کیفیت پایین تر از اهداکنندگان پس از مرگ گردش خون (DCD) شده است. که با بروز قابل توجهی بالاتر عملکرد تاخیری پیوند مرتبط است و بر پیامد کوتاه مدت و بلندمدت تأثیر می گذارد. شدت ایسکمی به شدت با نارسایی زودهنگام پیوند کلیه پس از پیوند کلیه ارتباط دارد و به افزایش عوارض کمک می کند. بنابراین، ایسکمی گرم (W) در طول بازیابی اندام و کاشت، و زمان ایسکمی سرد در طول نگهداری، به ترتیب باید به حداقل برسد. استراتژی‌های پرفیوژن ماشینی می‌توانند با تامین اکسیژن در طی مراحل ایسکمیک در اهدای عضو، نقش اساسی در کاهش IRI داشته باشند. Furthermore, it ارائه بستری برای افزودن عوامل محافظتی احتمالی قبل از خونرسانی مجدد (پیش شرطی سازی) یا در حین خونرسانی مجدد (post-conditioning) و روش مناسبی برای ارزیابی عملکرد و آسیب کوتاه مدت کلیه است.{10}}

بیگوانیدمتفورمینپرمصرف ترین داروی خوراکی ضد هیپرگلیسمی برای درمان بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 است. مکانیسم اثر و اثرات پلیوتروپیکمتفورمیندر درجه اول ناشی از مهار کمپلکس 1 در زنجیره تنفسی میتوکندری است.{1}} بنابراین،متفورمینممکن است IRI را فراتر از اقدامات کاهش دهنده گلوکز آن کاهش دهد و به عنوان یک عامل محافظ اندام در شرایطی که IRI رخ می دهد، مانند پیوند پیشنهاد شده است.

هدف از این مطالعه بررسی اثرات سودمند بالقوه پیش شرطی سازی و پس شرطی سازی بامتفورمینبر روی IRI در دو مدل پرفیوژن دستگاه نورموترمیک (NMP) جدا شده با استفاده از کلیه‌های موش و خوک.

کلیه های تغذیه کننده:DRAGON HERB CISTANCHE

مواد و روش ها

مطالعه موش

حیوانات.موش‌های نر لوئیس با وزن 270-300 گرم مورد استفاده قرار گرفتند (Harlan Laboratories, Boxmeer, The Netherlands). کمیته سازمانی مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه گرونینگن پروتکل مطالعه (DEC6708C) را تأیید کرد. حیوانات طبق قانون هلند در مورد آزمایشات حیوانی، با پیروی از اصول مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی مؤسسه ملی بهداشت، مراقبت دریافت کردند.

طراحی آزمایشی، بازیابی اندام، و حفظ.در مجموع 31 موش به 6 گروه (n{2}} در هر گروه؛ شکل 1) تقسیم شدند. آماده سازی با تجویز mg/kg 300 انجام شدمتفورمین(1،1-دی متیل بیگوانید هیدروکلراید؛ سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO) محلول در سالین ({3}}.9 درصد NaCl) یا سالین به تنهایی از طریق گاواژ خوراکی 12 و 2 ساعت قبل از نفرکتومی. سالین 30 میلی گرم در لیترمتفورمینیا 300 میلی گرم در لیترمتفورمینبه عنوان عامل پس شرطی کننده به پرفیوژن اضافه شد. غلظت 300 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن انتخاب شد، زیرا این دوز منجر به سرم شدمتفورمینغلظت هایی که مطابق با غلظت هایی است که در طول نگهداری در انسان یافت می شودمتفورمیندرمان.17

تهیه کلیه ها با تغییرات جزئی در روش DCD، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، انجام شد.18 به طور خلاصه، موش‌ها با 2 تا 5 درصد ایزوفلوران بیهوش شدند و لاپاراتومی از طریق یک برش خط وسط انجام شد. ضد انعقاد، با استفاده از 500 واحد هپارین (Leo Pharma، Ballerup، دانمارک)، از طریق ورید آلت تناسلی پشتی تجویز شد. پس از 15 دقیقه WI، نفرکتومی کلیه چپ انجام شد. شریان کلیوی و حالب کانوله شدند. کلیه در محل با 10 میلی لیتر سالین (37 درجه) و 5 میلی لیتر 4 درجه محلول ذخیره سرد دانشگاه ویسکانسین (UW) (Bridge to Life، کلمبیا، SC) شستشو داده شد. پس از برداشتن، کلیه ها یک بار دیگر با 5 میلی لیتر UW شسته و به مدت 24 ساعت در UW در دمای 4 درجه نگهداری شدند.

پرفیوژن دستگاه نورموترمیک.روش NMP موش قبلاً به طور گسترده توضیح داده شده است. به طور خلاصه، NMP به مدت 90 دقیقه با استفاده از یک پمپ غلتکی (Ismatec ISM404، زوریخ، سوئیس) انجام شد. فشار پرفیوژن روی 102 میلی‌متر جیوه تنظیم شد که در شریان کلیوی کنترل می‌شود. در گروه کنترل، مایع پرفیوژن شامل 100 میلی لیتر ویلیامز مدیوم E همراه با 30 میلی مول در لیتر HEPES، 50 گرم در لیتر آلبومین و 7 میلی مول در لیتر کراتینین (همه سیگما آلدریچ) بود. در گروه های تجربی 30 یا 300 میلی گرم در لیترمتفورمینبه پرفیوژن اضافه شد. مایع پرفیوژن با 95 درصد اکسیژن و 5 درصد دی اکسید کربن با جریان 0.5 لیتر در دقیقه اکسیژن رسانی شد. دمای مایع پرفیوژن با استفاده از حمام آب و مبدل حرارتی (Julabo، Seelbach، آلمان) در 37 درجه حفظ شد. جریان هر 10 دقیقه با استفاده از یک سنسور جریان کالیبره شده (ME1PXN Inline، Transonic Systems، Ithaca، NY) ثبت شد. پس از NMP، بیوپسی از کلیه ها بلافاصله در فرمالدئید 4 درصد غوطه ور شد یا در نیتروژن مایع منجمد شد و متعاقباً در دمای 80- درجه نگهداری شد.

شکل 1نمایش شماتیک گروه های آزمایشی. گروه ها حاوی 5-7 کلیه هستند. HMP، پرفیوژن دستگاه هیپوترمیک؛ NMP، پرفیوژن دستگاه نورموترمیک؛ WIT، زمان ایسکمی گرم.

مطالعه خوک

حیوانات.کلیه‌های خوک‌های ماده نژاد هلندی از یک کشتارگاه جمع‌آوری شدند. حیوانات بر اساس رویه های استاندارد محلی بیهوش شدند و از بین رفتند. در حین تخلیه، تقریباً 1 لیتر خون در ظرفی حاوی 25،{2}} واحد بین‌المللی هپارین شکسته نشده (Leo Pharma) جمع‌آوری شد. از آنجایی که از مواد ضایعات کشتارگاهی استفاده می شد، نیازی به تایید کمیته اخلاق حیوانات نبود.

طراحی آزمایشی، بازیابی اندام، و حفظ.برای ایجاد آسیب ایسکمیک، 30 دقیقه WI استفاده شد. پس از این مدت کلیه با 180 میلی لیتر سالین در دمای 4 درجه شستشو شد. بلافاصله پس از شستشو، بیوپسی قشر مغز (Invivo، Best، هلند) گرفته شد و در فرمالدئید بافر 4 درصد ذخیره شد. برای جابجایی از کشتارگاه به آزمایشگاه و به عنوان یک روش نگهداری، شریان کلیوی کانوله شد و کلیه‌ها به دستگاه پرفیوژن هیپوترمیک کنترل‌شده با فشار ضربانی (HMP) متصل شدند (کلیه‌های کمکی، کمک اعضای بدن، گرونینگن، هلند). ). کلیه ها در دمای 4 درجه با استفاده از محلول پرفیوژن ماشینی 500 میلی لیتری UW به مدت 3 ساعت (Bridge to Life، لندن، انگلستان) با یا بدون افزودن 2 میلی گرم پرفیوژن شدند.متفورمین، با فشار شریانی متوسط ​​25 میلی متر جیوه. اکسیژن (1{3}}0 درصد) به اکسیژن ساز (Hilite LT1000؛ Medos Medizintechnik AG، Stolberg، آلمان) با سرعت جریان ثابت 0.1 L/min عرضه شد.

پرفیوژن دستگاه نورموترمیک.کلیه ها با استفاده از تنظیمات NMP ex vivo به مدت 4 ساعت که قبلاً توضیح داده شد، خونرسانی مجدد شدند. در مطالعه ما، افزایش دوز ازمتفورمینیا سالین با استفاده از پمپ انفوزیون اضافه شد. به طور خلاصه، پس از HMP، شریان کلیوی کانول شده و شستشو شد. حالب برای جمع آوری ادرار کانوله شد. پس از آن، کلیه وزن شد و نمونه برداری گرفته شد و در فرمالدئید بافر 4 درصد برای تجزیه و تحلیل بیشتر نگهداری شد. NMP با 5{4}}0 میلی‌لیتر لکوسیت تخلیه شده (BioR 02 plus; Fresenius Kabi، Bad Homburg، آلمان) خون اتولوگ، اکسیژن دار (کربوژن، جریان 0.5 لیتر در دقیقه) به مدت 4 ساعت با فشار متوسط ​​شریانی انجام شد. 80 میلی متر جیوه سایر ترکیبات اضافه شده به مایع پرفیوژن در جدول S1 ارائه شده است. در گروه آزمایشی،متفورمینحل شده در محلول لاکتات رینگر (20 میلی گرم در میلی لیتر؛ باکستر، اوترخت، هلند) با استفاده از یک پمپ تزریق کنترل شده توسط نرم افزار سفارشی که در آن می توان پروفایل های تزریق را تعریف کرد (Alaris؛ CareFusion، Rolle، سوئیس) تزریق شد. هر 30 دقیقه در طول NMP سرعت انفوزیون طبق یک برنامه از پیش تعیین شده افزایش یافت (جدول S2). این برنامه بر اساس داده های فارماکوکینتیک انسانی بود که نشان می دادمتفورمینکلیرانس چهار برابر بیشتر از کلیرانس کراتینین است. 19 در گروه کنترل، کلیه ها بدون اضافه کردن پرفیوژنمتفورمین. برای هر آزمایش، جریان با استفاده از پروب جریان کلامپون (ME7PXL؛ Transonic Systems)، که به لوله نزدیک به شریان کلیوی متصل شده بود، ثبت شد. این پروب جریان برای لوله مورد استفاده کالیبره شده است. هر 15 دقیقه در طول NMP، ادرار جمع آوری شده و با حجم متناظری از محلول لاکتات رینگر جایگزین می شود که همچنین ثبت می شود. دمای مایع پرفیوژن با استفاده از مبدل حرارتی یکپارچه متصل به حمام آب (جولابو) در 37 درجه نگهداری شد. نمونه‌های خون و ادرار پس از 15 و 60 دقیقه و هر ساعت بعد برای آنالیزهای بیوشیمیایی گرفته شد. هنگامی که NMP به پایان رسید، نمونه‌برداری‌ها گرفته شد و در فرمالدئید بافر 4 درصد یا منجمد فوری و برای تجزیه و تحلیل بیشتر در درجه {7}} ذخیره شد.

بهبود عملکرد کلیه مکمل سیستانچ

هر دو مطالعه

آنالیزهای بیوشیمیایینمونه های پرفیوژن و ادرار (به ترتیب 1300 گرم به مدت 10 دقیقه در مدل موش و 1،{4}} گرم به مدت 12 دقیقه در مدل خوک، هر دو در دمای 4 درجه) سانتریفیوژ شدند و مایع رویی در {{7} ذخیره شد. } درجه . لاکتات دهیدروژناز (LDH)، آسپارتات آمینوترانسفراز (ASAT) و کراتینین به ترتیب در پرفیوژن و کراتینین در ادرار توسط مرکز آزمایشگاهی مرکز پزشکی دانشگاه گرونینگن با استفاده از آنالیزهای بیوشیمیایی استاندارد تعیین شدند. مقدار پروتئین دفع شده در ادرار موش با استفاده از تست Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) اندازه گیری شد، در حالی که غلظت کل پروتئین در ادرار خوک با استفاده از آنالیزهای بیوشیمیایی استاندارد در مرکز آزمایشگاهی اندازه گیری شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی بیدرنگواکنش زنجیره‌ای پلیمراز بیدرنگ (PCR) طبق روش‌های استاندارد روی سیستم Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، انجام شد. کدگذاری برای ET-1؛ اندوتلیال نیتریک اکساید سنتاز (eNOS)؛ و فاکتور 2 کروپل مانند (KLF-2)، فعال سازی اندوتلیال (عامل فون ویلبراند (wWF)؛ مولکول چسبندگی سلول عروقی 1 (VCAM) -1) و IL-6)، و پروتئین شوک حرارتی 70 (HSP{13}}) با مجموعه پرایمرهای فهرست شده در جدول S3 انجام شد. به طور خلاصه، RNA کل از مقاطع کلیه با استفاده از آن استخراج شد. TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). cDNA بدست آمده از موش صحرایی به عنوان یک مرجع داخلی در طی PCR برای آزمایش کارایی پرایمر استفاده شد. بیان ژن با میانگین محتوای mRNA اکتین نرمال شد. نتایج به صورت 2- بیان شد. △ACT، که در آن مقدار CT تفاوت بین مقادیر آستانه چرخه را نشان می دهد.

شکل 2پارامترهای پرفیوژن و عملکرد کلیه در طی و پس از پرفیوژن دستگاه نورموترمیک کلیه موش و خوک ارزیابی شد. کلیرانس کل کراتینین کلیه های موش (a) و خوک (b). تولید کل ادرار (c, d) و کل پروتئین دفع شده در ادرار (e, f) کلیه موش و خوک به ترتیب. داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین ارائه می شوند. گروه ها حاوی 5-7 کلیه هستند. *P < 0.05="" و="" **p=""><>

امتیازدهی مورفولوژیکیبیوپسی های ذخیره شده در فرمالدئید 4 درصد در پارافین جاسازی شده و به برش های 4 میکرومتری بریده شدند. کوپه‌ها متعاقباً با اسید پریودیک شیف رنگ‌آمیزی شدند و روی نکروز سلولی پروگزیمال توبولی (از خفیف تا شدید: 1-5)، ادم (از خفیف تا شدید:1-4) و واکوئولاسیون سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال نمره‌گذاری شدند. از خفیف تا شدید: 1-4).21 ارزیابی هیستوپاتولوژیک توسط دو محقق کور انجام شد. یک آسیب شناس بالینی مستقل با تجربه گسترده در ارزیابی علائم هیستوپاتولوژیک آسیب پس از پرفیوژن دستگاهی اندام های موش و خوک، نمرات را تأیید کرد.

محاسبات.مقاومت عروق داخل کلیوی (IVR) با تقسیم فشار متوسط ​​شریانی بر جریان (بیان شده بر حسب mmHg/mL دقیقه) محاسبه شد. کلیرانس کراتینین برای تخمین میزان فیلتراسیون گلومرولی با استفاده از معادله زیر محاسبه شد: [کراتینین در ادرار]* جریان ادرار/[کراتینین در پرفیوژن].

تحلیل آماری.تمام داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین بیان می شوند. هنگام مقایسه دو گروه در یک نقطه زمانی واحد، تفاوت ها با استفاده از آزمون t-test دانشجوی جفت نشده مورد ارزیابی قرار گرفت. همه آزمون های آماری دو دنباله هستند و P کمتر یا مساوی 05/0 0 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد. SPSS Statistics نسخه 23 (IBM، Armonk، NY) برای همه تجزیه و تحلیل ها استفاده شد. مساحت زیر منحنی (AUC) بر اساس قانون ذوزنقه محاسبه شد و برای تقریب کلیرانس کل کراتینین، مقدار کل پروتئین دفع شده در ادرار، و سطح کل ASAT و LDH در پرفیوژن مورد استفاده قرار گرفت.

توجه: گیاه دارویی سنتی چینی سیستانچ (همچنین به عنوان "گیاه اژدها" و "جنسنگ صحرا" نیز شناخته می شود)، تنها در بیابان های خشک و گرم رشد می کند. به عنوان یکی از 9 گیاه جاودانه، سیستانچ (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/ desertliving cistanche/cistanche salsa) حاوی مواد موثره غنی مانند اکیناکوزید، اکتئوزید، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید کل، فلاونوئیدها، پلی ساکاریدها و غیره است که این مواد اولیه موثر را تشکیل می دهند. گیاهان مغذی و مواد غذایی برای ایمنی افراد، اندام‌های داخلی، سلول‌های مغز و نورون‌ها و غیره. بهبود عملکرد جنسی و عملکرد کلیه؛ ضد خستگی؛ ضد پیری؛ بهبود حافظه؛ ضد بیماری پارکینسون؛ ضد بیماری آلزایمر؛ آنتی اکسیدان؛ سهولت-یبوست؛ ضد التهاب؛ تقویت رشد استخوان، سفید کردن پوست؛ محافظت از کبد؛ و غیره.

برای قسمت Ⅰ اینجا را کلیک کنید