یک واکسن دو ظرفیتی زنده ضعیف شده ویروس آنفلوانزا در برابر جدا شده بالینی H1N2 و H3N2 در خوکی محافظت می‌کند.

خلاصه:

ویروس های آنفولانزای A (IAVs) می توانند یک بیماری تنفسی بسیار مسری را برای بسیاری از گونه های پستانداران ایجاد کنند. در خوک‌ها، IAVها باعث بروز عوارض بالا و بیماری مرگ‌ومیر پایین در جمعیت‌های حساس می‌شوند که می‌تواند اثرات مالی و تولیدی قابل‌توجهی داشته باشد. آنها همچنین می‌توانند فرصت‌هایی برای جهش‌ها و دسته‌بندی مجدد ژن‌ها، تولید سویه‌های آنفولانزا با پتانسیل همه‌گیری ایجاد کنند.

آنفولانزای A یک بیماری تنفسی بسیار مسری است که تهدیدی جدی برای سلامت عمومی جهانی است. مطالعات مربوط به ایمنی نشان داده است که یک سیستم ایمنی قوی می تواند باعث شود افراد در هنگام آلوده شدن به ویروس آنفولانزا بهتر بتوانند با ویروس مبارزه کنند و در نتیجه میزان بروز و شدت بیماری را کاهش دهد.

ایمنی توانایی سیستم ایمنی ما برای مبارزه با بیماری است. سیستم ایمنی بدن انسان از دو بخش تشکیل شده است: ایمنی ذاتی و ایمنی اکتسابی. سیستم ایمنی ذاتی چیزی است که ما با آن متولد می شویم و توانایی کل بدن برای دفاع در برابر بیماری ها را دارد. سیستم ایمنی اکتسابی ایمنی است که ما به تدریج در زندگی خود داریم، عمدتاً شامل ایمنی هومورال متشکل از سلول های ایمنی و آنتی بادی ها، و ایمنی سلولی متشکل از سلول های T و سلول های ایمنی است.

مطالعات نشان داده اند که با حفظ سبک زندگی و رژیم غذایی سالم، ورزش و دریافت ویتامین ها و سایر مواد مغذی کافی، می توانید سیستم ایمنی بدن خود را بهبود ببخشید. علاوه بر این، این واکسن همچنین می‌تواند ایمنی بدن را در برابر ویروس‌های آنفلوانزا افزایش داده و بروز بیماری را کاهش دهد.

ویروس های آنفولانزای A بین انسان ها و حیوانات مشترک است، بنابراین اغلب جهش می یابند. به خصوص در فصل پاییز و زمستان، ایمنی افراد پایین است و ویروس آنفولانزای A با استفاده از این فرصت به راحتی می تواند حمله کند. اما اگر بر ایجاد یک سبک زندگی سالم، تقویت ورزش و واکسیناسیون فعال اصرار داشته باشیم، می‌توانیم ایمنی خود را بهبود بخشیم و بهتر با تهاجم ویروس آنفولانزای A مقابله کنیم. علاوه بر این، اگر متوجه شدید که علائمی شبیه آنفولانزا دارید، باید به دنبال درمان پزشکی باشید و به موقع تحت درمان قرار بگیرید تا بدن شما به سرعت بهبود یابد.

به طور خلاصه، بین ویروس آنفولانزای A و ایمنی تأثیر متقابل وجود دارد. تقویت سیستم ایمنی، حفظ سبک زندگی و رژیم غذایی سالم و به ویژه پذیرش واکسیناسیون، همگی از اقدامات موثر برای پیشگیری و مبارزه با ویروس آنفولانزای A هستند. بیایید مثبت اندیش باشیم و از نظر پیشگیری از ویروس آنفولانزای A به سمت یک سبک زندگی سالم حرکت کنیم! می توان دید که ما باید ایمنی را تقویت کنیم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد، زیرا خاکستر گوشت حاوی انواع مواد فعال بیولوژیکی مانند پلی ساکاریدها، دو قارچ، هوانگ لی و غیره است. این مواد می توانند سیستم های ایمنی مختلف را تحریک کنند. سلول های سلول مانند، فعالیت ایمنی خود را افزایش می دهد.

روی مزایای cistanche tubulosa کلیک کنید

بنابراین، پیشگیری و کنترل عفونت آنفلوانزا در خوک ها بسیار مهم است و راه اصلی برای انجام این کار از طریق واکسیناسیون است. زیرگروه های IAV که در خوک ها در سرتاسر جهان شایع است عبارتند از H1N1، H1N2 و H3N2. با این حال، تنوع ژنتیکی این ویروس ها می تواند تا حد زیادی بر اساس منطقه متفاوت باشد. ما قبلاً یک واکسن زنده ضعیف شده دو ظرفیتی وابسته به الاستاز را با استفاده از دو ایزوله ویروس آنفولانزای خوکی کانادایی A (swIAV)، A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] و A/Swine/Saskatchewan/SD0191/2016 (SD0191/2016) توسعه دادیم. ) [SD69]، که در برابر سویه های همولوگ محافظت می کند.

در این مطالعه، ما نشان می‌دهیم که این واکسن حفاظت را در خوک‌ها به سویه‌های H1N2 و H3N2 غیرهمولوگ فعلی، رانش‌شده، A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] و A/Swine/AB/SD0435/ گسترش می‌دهد. 2019 (H3N2) [SD435].

این واکسن یک پاسخ ایمنی قوی در سرم و ریه ایجاد کرد و تکثیر ویروس و همچنین آسیب شناسی ریه مرتبط با این سویه ها را کاهش داد. بنابراین، این واکسن دو ظرفیتی یک نامزد قوی است که برای بازار واکسن آنفلوانزای خوکی در آمریکای شمالی مفید است.

کلید واژه ها:

آنفولانزا؛ واکسن؛ گراز.

1. معرفی

ویروس های آنفولانزای A (IAV) یک پاتوژن مهم برای بسیاری از گونه ها از جمله خوکی هستند. عفونت می تواند باعث بیماری تنفسی بسیار مسری در خوک ها شود [1]. عفونت آنفولانزا در خوکی منجر به بیماری خفیف با مرگ و میر بسیار کم می شود، اما نرخ عوارض در گله می تواند به 100 درصد برسد [2]. این منجر به زیان اقتصادی برای کشاورزان به دلیل کاهش افزایش وزن در خوک‌های آلوده، کاهش عملکرد تولید و نارسایی تولید مثل در خروس‌ها می‌شود [3،4].

عفونت همزمان آنفولانزا با سایر پاتوژن های تنفسی خوکی نیز می تواند منجر به ایجاد کمپلکس بیماری تنفسی خوک و در نتیجه افزایش مرگ و میر و خسارات اقتصادی شود [5].
علاوه بر این، خوک ها به دلیل وجود پیوندهای گالاکتوز سیالیک اسید سیالیک پرندگان و پستانداران در دستگاه تنفسی خود، مستعد عفونت با IAV پرندگان و انسان و همچنین IAV خوکی (swIAV) هستند [6]. این امر باعث می‌شود که در صورت آلوده شدن همزمان با سویه‌های متعدد، دسته‌بندی مجدد رخ دهد که می‌تواند منجر به تولید سویه‌های جدید با پتانسیل همه‌گیری شود [4،7].

از آنجایی که انسان ها توزیع پیوند گالاکتوز اسید سیالیک مشابهی در سراسر دستگاه تنفسی دارند، رویدادهای سرریز دو طرفه بین انسان و خوکی امکان پذیر است. اولین رخداد شناخته شده آن در طول همه گیری آنفولانزای 1918 بود که IAV از انسان به خوک معرفی شد [8]. این دودمان تا دهه 1990 در جمعیت‌های خوک پایدار ماند، زمانی که سویه‌های H3N2 انسانی و پرندگان با دودمان H1N1 در گردش برای تولید سویه‌های دوگانه و سه‌گانه از زیرگروه‌های H1N1، H1N2 و H3N2 ترکیب شدند [8،9].

نوار کاست ژن سه گانه (TRIG) که به تازگی ایجاد شده است منجر به دوره ای از تنوع سریع IAV در خوکی های آمریکای شمالی شد [10]. این کاست TRIG بسیار پایدار است و جایگزینی ترکیبات مختلف HA و NA را تسهیل می کند [5]. از سال 2005، بسیاری از سویه‌ها با این کاست TRIG داخلی که با ژن‌های HA و NA انسانی جفت شده‌اند، در گله‌های خوک در ایالات متحده پخش شدند [9].

رویداد قابل توجه بعدی در سال 2009 رخ داد، زمانی که یک سویه H1N1 با منشاء خوکی (H1N1pdm2009) به انسان سرایت کرد و منجر به همه‌گیری آنفلوانزا در سال 2009 شد [11]. انتقال انسان به خوکی (زوونوز معکوس) همه‌گیری انسانی H1N1 IAV (H1pdm) چندین بار در خوک‌های آمریکای شمالی ثبت شد که منجر به ایجاد دودمان جدید و swIAVs جدید جدید شد [8،10،12].

در مجموع، هفت کلاد H1 از نظر آنتی ژنی متمایز و چهار کلاد مجزا از ویروس های H3 در خوکی آمریکای شمالی ثبت شده است [5]. اخیراً، یک برنامه نظارتی swIAV در آسیا، ویروس ژنوتیپ 4 (G4) غالب شبیه پرندگان اوراسیا (EA) را با H1pdm و ژن‌های داخلی سه‌گانه شناسایی کرد.

این ویروس G4 در 10.4 درصد از کارگران خوکی آزمایش‌شده اندازه‌گیری شد و نشانگرهایی از پتانسیل همه‌گیری را با توانایی انتقال به انسان و آنتی‌ژنی متفاوت از ویروس‌های انسانی در حال گردش نشان می‌دهد [7]. بنابراین پیشگیری و کنترل عفونت آنفلوانزا در خوک ها از نظر صنعت خوکی و بهداشت عمومی بسیار مهم است و راه اصلی برای انجام این کار از طریق واکسیناسیون است [4].

در ایالات متحده آمریکا، رایج‌ترین نوع واکسن، ویروس کامل غیرفعال (WIV) است، اما واکسن ناقل RNA بیان‌کننده HA و یک واکسن NS{0}}ویروس زنده ضعیف شده آنفلوانزا (LAIV) نیز تأیید شده است [4] . زیرگروه های IAV که در خوک ها در سراسر جهان از جمله آمریکای شمالی شایع است، H1N1، H1N2 و H3N2 هستند [13].

با این حال، تنوع ژنتیکی این ویروس‌ها می‌تواند تا حد زیادی برحسب منطقه متفاوت باشد، و تفاوت‌هایی در تکامل ژنتیکی swIAV در کانادا و ایالات متحده، به ویژه در ویروس‌های زیرگروه H1 وجود دارد [12]. نظارت در کانادا بین سال‌های 2009 و 2016 نشان داد که کلادهای ژنتیکی H1 که در ایالات متحده غالب بودند، H1g (1A.3.3.3) و H1d{11}} (1B.2.2)، در کانادا شناسایی نشدند، و ویروس های H1 در کانادا بسیار متفاوت از ویروس های ایالات متحده بود [12].

یک کلاد جدید H1 (H1a-3) در کانادا شناسایی شد که از مانیتوبا شروع شد و قبل از انتشار در سراسر کشور و ایالات متحده، رشد سریعی را تجربه کرد. با توجه به ویروس‌های H3، شش دودمان H3 در خوک‌های آمریکایی (IV-A تا IV-F) ثبت شد و از این تعداد، سه اصل در خوکی‌های کانادایی (IV-B، IV-C و IV-E) یافت شد [12] ].

این امر اهمیت نظارت منطقه‌ای و آگاهی از سویه‌های در گردش را برای اطلاع‌رسانی به برنامه‌های واکسن مؤثر نشان می‌دهد و نشان می‌دهد که واکسن‌هایی که بر اساس IAV در گردش در خوکی آمریکایی طراحی شده‌اند ممکن است از خوک‌های کانادایی محافظت نکنند [12].

پیش از این، یک واکسن دو ظرفیتی با استفاده از دو ایزوله swIAV کانادایی، A/ Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] و A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2) ساخته شده بود که نمایندگان H{{{{{ 9}} گروه آنتی ژنیک و یک گروه آنتی ژنی جدید H3 از غرب کانادا (خوک خوشه IV-E) [14]. این واکسن جدید یک واکسن ویروس ضعیف شده زنده است که با استفاده از اشکال وابسته به الاستاز SD191 و SD69، SD191-R342V و SD{18}}K345V ساخته شده است. مطالعات نشان داد که در برابر SD191 و SD69، و همچنین یک سویه H1N2 هترولوگ A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2) که از غرب کانادا نیز جدا شده بود، محافظت می‌کند [14].

از آن زمان، سویه های swIAV در گردش به حرکت خود ادامه دادند. جدایه‌های بالینی جدیدتر از خوک در غرب کانادا جمع‌آوری و از نمونه‌های مزرعه‌ای در کالج وسترن دامپزشکی، دانشگاه ساسکاچوان، ساسکاتون، SK، کانادا جدا شد. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] عضوی از گروه آنتی ژنی H -3 است اما دارای پنج جایگزینی اسید آمینه از 54 محل کلیدی آنتی ژنی H1 در مقایسه با SD191 است [10،15، 16].

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] عضوی از خوشه IV-E است، اما به سمت دو جایگزینی اسید آمینه از شش محل کلیدی آنتی ژنی H3 رفته است [17].

در این مطالعه، ارزیابی کردیم که آیا LAIV وابسته به الاستاز دو ظرفیتی در برابر ایزوله‌های بالینی جدید مقاومت می‌کند یا خیر، و می‌توانیم گزارش دهیم که در هنگام چالش با سویه‌های swIAV در حال گردش SD467 (H1N2) و SD435 (H3N2) از خوکی محافظت می‌کند.

2. مواد و روشها

2.1. سلول ها و ویروس ها

سلول های کلیه سگ مدین داربی (MDCK) (ATCC, #CRL{1}}) در محیط حداقل ضروری (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, USA) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی نگهداری شدند. (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada 16000-044) و در انکوباتور 5 درصد CO2 مرطوب شده در دمای 37 ◦C نگهداری شدند. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] و A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV از نمونه‌های صحرایی در کالج دامپزشکی غربی، دانشگاه ساسکاتونش، جدا شدند. , SK, کانادا

ویروس های واکسن SD191-R342V و SD{2}} K345V همانطور که قبلاً توضیح داده شد نجات یافتند [14]. همه ویروس ها در سلول های MDCK در حضور 0.2 درصد آلبومین سرم گاوی (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) با 1 میکروگرم در میلی لیتر L-[(تولوئن{) رشد کردند. {11}}سولفونامید)-2-فنیل] اتیل کلرومتیل کتون (TPCK) - تریپسین (ویروس‌های WT) یا 0.5 میکروگرم در میلی‌لیتر نوتروفیل الاستاز انسانی (ویروس‌های وابسته به الاستاز) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. طراحی آزمایش حیوانات

بیست و چهار خوک چهار هفته‌ای swIAV منفی از مرکز خوکی پریری شرکت (ساسکاتون، SK، کانادا) به دست آمد. این خوک ها به طور تصادفی انتخاب و به چهار گروه با هفت خوک در هر گروه واکسینه شده و پنج خوک در هر گروه واکسینه ساختگی تقسیم شدند.

تخصیص گروه در شکل 1A توضیح داده شده است. این گروه‌ها بر اساس گروه‌های واکسیناسیون در اتاق‌های جداگانه قرار گرفتند (گروه‌های A به علاوه B و C به علاوه D که در کنار هم قرار دارند) و اجازه داده شد تا هفت روز قبل از آلودگی با هم سازگار شوند.

در سن پنج هفتگی (روز 0) و همچنین در سن هشت هفتگی (روز 21)، خوک‌های گروه A و B به صورت ساختگی داخل تراشه با 4 میلی‌لیتر MEM واکسینه شدند، در حالی که گروه‌های C و D واکسینه شدند. با یک واکسن دو ظرفیتی حاوی 1 × 106 PFU از هر SD191-R342V و SD{7}}K345V در 4 میلی لیتر MEM. ده روز بعد (روز 31)، خوک ها با MEM (ساختگی) یا 1 × 106 PFU SD{13}}WT (H3N2) یا SD{16}}WT (H1N2) به چالش کشیده شدند.

خوک ها به مدت پنج روز پس از چالش تحت نظر قرار گرفتند، دمای مقعد روزانه گرفته شد و سواب بینی از هر دو سوراخ بینی در روزهای 1، 3 و 5 گرفته شد. سرم پس از واکسیناسیون اول (روز 20) و دوم (روز 30) جمع آوری شد. سنجش خنثی سازی ویروس سرم (SVN) و سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA).

در روز 5 پس از چالش، همه خوک‌ها به صورت انسانی کشته شدند، و ریه‌ها استخراج و برای حضور ضایعات ناخالص swIAV مشخصه مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه های بافت ریه نیز برای جداسازی ویروس جمع آوری شد (شکل 1B).

2.3. بیانیه اخلاق

تمام روش های حیوانی توسط کمیته مراقبت از حیوانات دانشگاه (UACC) و هیئت اخلاق تحقیقات حیوانات (AREB) دانشگاه ساسکاچوان تایید شد. این پروتکل در 12 نوامبر 2021 (پروتکل استفاده از حیوانات شماره 20190064) تصویب شد. تمام مراحل طبق استانداردهای مورد نیاز شورای مراقبت از حیوانات کانادا (CCAC) در سازمان واکسن و بیماری‌های عفونی (VIDO)، دانشگاه ساسکاچوان، ساسکاتون، SK، کانادا انجام شد.

2.4. نمونه برداری

سواب های بینی از هر سوراخ بینی در 1 میلی لیتر MEM حاوی 1× آنتی بیوتیک آنتی بیوتیک (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada, 15240-062) قرار داده شد و تا زمانی که qRT-PCR انجام شد در دمای 80- درجه سانتیگراد منجمد شد. همه خوک‌ها با تجویز داخل وریدی اتانول (240 میلی‌گرم در میلی‌لیتر سدیم پنتوباربیتال؛ 2 میلی‌لیتر به ازای هر 4.5 کیلوگرم) به طور انسانی کشته شدند. پس از اتانازی، ریه ها به طور کامل برداشته شدند تا هم درصد ضایعات بنفش قرمز و سفت و هم ذات الریه مشخص شود.

درصدها بر اساس وزن لوب ریه و همچنین کل حجم ریه تعیین شد [18]. نمونه‌های ریه نیز از لوب آپیکال، قلب و دیافراگم سمت راست برای تیتراسیون ویروس گرفته شد. این نمونه‌های ریه در حجم‌های مساوی 10 درصد w/v MEM حاوی 1× آنتی‌بیوتیک-ضد قارچ برای تیتراسیون مخلوط شدند.

شکل 1. گروه بندی خوک ها و طراحی آزمایشی برای ارزیابی اثر حفاظتی LAIV دو ظرفیتی در برابر ایزوله های بالینی جدید. خوک‌ها (n=5 برای گروه‌های MEM/MEM و n=7 برای گروه‌های دو ظرفیتی/دو ظرفیتی) به صورت داخل تراشه با 4 میلی‌لیتر MEM یا واکسن دو ظرفیتی متشکل از 1×1{10}}6 PFU واکسینه شدند. از هر SD191-R342V و SD{8}}K345V در روزهای 0 و 21. در روز 31، خوک ها به صورت داخل تراشه با MEM یا 1 × 106 PFU SD435 (H3N2) یا SD467 (H1N2) به چالش کشیده شدند. (آ)

برنامه ایمن سازی، چالش و نمونه برداری برای این آزمایش حیوانی. به بیست و چهار خوک چهار هفته‌ای که دارای swIAV منفی بودند، اجازه داده شد تا هفت روز قبل از عفونت، خود را عادت دهند. در سن پنج هفتگی (روز 0) و همچنین در سن هشت هفتگی (روز 21)، خوک‌های گروه A و B به صورت مصنوعی با 4 میلی‌لیتر MEM واکسینه شدند، در حالی که گروه‌های C و D واکسینه شدند. با یک واکسن دو ظرفیتی حاوی 1 × 106 PFU از هر SD191-R342V و SD{11}}K345V در 4 میلی لیتر MEM.

ده روز بعد (روز 31)، خوک ها با MEM (ساختگی) یا 1 × 106 PFU SD{3}}WT (H3N2) یا SD{6}}WT (H1N2) به چالش کشیده شدند. خوک ها به مدت پنج روز پس از چالش تحت نظر قرار گرفتند، با دمای رکتوم روزانه و سواب بینی از هر دو سوراخ بینی در روزهای 1، 3 و 5. سرم پس از واکسیناسیون اول (روز 20) و دوم (روز 30) جمع آوری شد. در روز 5 پس از چالش (روز 36) همه خوک‌ها به صورت انسانی کشته شدند و ریه‌ها برای ارزیابی استخراج شدند. (ب) ایجاد شده با BioRender.com.

2.5. سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

برای ساخت آنتی ژن های پوششی، SD435 و SD467 در سلول های MDCK تکثیر و با استفاده از اولتراسانتریفیوژ با گرادیان ساکارز خالص سازی شدند. غیرفعال شدن ویروس ها با افزودن 97 درصد پروپیولاکتون به ویروس در غلظت 1:1000 (v/v) رخ داد (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). این مخلوط یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد تکان داده شد، به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد تا هیدرولیز -پروپیولاکتون تسهیل شود، سپس تا زمان استفاده در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

برای اندازه گیری سطوح IgG اختصاصی swIAV ناشی از واکسیناسیون و چالش، سرم خوک پس از واکسیناسیون اول (روز 20) و دوم (روز 30) و قبل از کالبدگشایی (روز 36) گرفته شد.

ویروس‌های غیرفعال شده با پروپیولاکتون خالص SD435 (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) و SD467 (2 میکروگرم در میلی‌لیتر)، رقیق‌شده در بافر پوشش کربنات/بی کربنات، (pH 9.6) روی صفحات چاه Immulon در دمای 1 استفاده شدند. 12}}0 µL/چاه (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Canada, 3655) و یک شب در دمای 4◦C انکوبه شد. پس از انکوباسیون یک شبه، صفحات پوشش داده شده چهار بار با TBST (0.1 M Tris، 0.17 M NaCl و 0.05 درصد Tween 20) شسته شدند، که رقت‌های سریال چهار برابری سرم یا BALF به آن اضافه شد. بشقاب را در دو نسخه، به دنبال انکوباسیون دو ساعته در دمای اتاق. سرم با رقت اولیه 1:10 اضافه شد و BALF رقیق نشده اضافه شد.

نمونه‌هایی از سرم‌های کنترل مثبت قبلاً تعریف شده و کنترل‌های منفی مناسب، سرم و BALF از خوک‌های واکسینه نشده در مطالعه قبلی روی هر صفحه اجرا شد [14]. صفحات چهار بار با TBST شسته شدند، پس از آن آنتی بادی خالص شده با میل ترکیبی نشاندار شده با فسفاتاز ضد IgG بز (H به علاوه L) (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) یا IgA ضد خوک موش (Serotec, MCA658) 1:300) رقیق شده در TBST اضافه شد و به مدت یک ساعت در دمای اتاق انکوبه شد.

ELISA های IgA با افزودن آنتی بادی های ضد موش IgG (H به علاوه L) بز بیوتینیله (CALTAG، Burlingame، CA، USA، M3{8}}015) و محلول آلکالین فسفاتاز استرپتاویدین (Jackson ImmunoResearch، West Grove، PA) هر دو به مدت یک ساعت در دمای اتاق. پس از انکوباسیون، هر دو صفحه IgG و IgA چهار بار با TBST شسته شدند، که به آن سوبسترای p-nitrophenyl فسفات (PNPP) [10 mg/ml p-nitrophenylphosphate di(tris) نمک کریستالی (Sigma-Aldrich)، 1 درصد دی اتانولامین ( Sigma-Aldrich)، 0.5 mg/mL MgCl2 و pH 9.8] (1 mg/ml) اضافه شد و به مدت دو ساعت در دمای اتاق انکوبه شد.

واکنش با افزودن 0.3 مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) متوقف شد و صفحات در یک اسپکتروفتومتر در 405 نانومتر با مرجع 490 نانومتر خوانده شدند. تیتر نمونه به عنوان بالاترین رقت تعریف شد که در آن OD آن نمونه بالاتر از برش تعریف شده بود (میانگین OD یک نمونه منفی شناخته شده به اضافه دو برابر انحراف استاندارد).

2.6. سنجش خنثی سازی ویروس (VN).

سلول های MDCK (3.5 × 104) در صفحات {3} چاهک قرار گرفتند. سرم و BALF به مدت 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانتیگراد غیرفعال شدند. رقت‌های دو برابری سرم و BALF در چهار برابر به صفحه اضافه شد و 60 میکرولیتر سرم رقیق شده یا BALF با حجم مساوی SD435 یا SD456 حاوی 100 TCID50 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت انکوبه شد.

سپس 100 میکرولیتر از مخلوط به سلول‌های MDCK اضافه شد و اثر سیتوپاتوژنیک (CPE) در 48 ساعت و 72 ساعت پس از عفونت (pi) ثبت شد. تیتر آنتی‌بادی خنثی‌سازی، بالاترین رقت هر نمونه سرم بود که سلول‌ها را در حداقل 2 از 4 چاهک کاملاً از CPE محافظت می‌کرد.

2.7. تعیین ویروسی

پس از جمع آوری، نمونه های ریه بلافاصله روی یخ قرار گرفتند و تا زمان پردازش در دمای 80- درجه سانتیگراد منجمد شدند. برای پردازش، هر بافت ریه وزن شد و غلظت 10 درصد (w/v) MEM همراه با 1× آنتی‌بیوتیک-ضد قارچ (Thermo Fisher Scientific, 15240-062) اضافه شد. بافت ریه در TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Germany) در فرکانس 30 هرتز به مدت 5 دقیقه همگن شد و به دنبال آن سانتریفیوژ در 5000 × گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4◦C انجام شد. مایع رویی هموژنیزه شده جمع آوری و در دمای 80- درجه سانتیگراد تا تجزیه و تحلیل بیشتر نگهداری شد.

سواب های بینی به مدت 15 ثانیه ورتکس شدند و در دمای 1600× گرم به مدت 25 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. مواد رویی جمع آوری و تا تجزیه و تحلیل بیشتر در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. تیترهای ویروسی با روش TCID50 برای ریه و RT-PCR کمی برای سواب بینی تعیین شد.

2.8. استخراج RNA و RT-PCR کمی (qRT-PCR)
برای تعیین سطوح RNA ویروسی SD467 و SD435 در سواب بینی پس از چالش، qRT-PCR انجام شد. یک منحنی استاندارد با استفاده از RNA استخراج شده از SD435 و SD467 از یک تیتر شناخته شده ساخته شد. به طور خلاصه، کیت کوچک RNeasy Plus (Qiagen, Toronto, ON, Canada, 74136) برای استخراج vRNA از 200 میکرولیتر شستشوی بینی استفاده شد.

RNA با استفاده از پرایمر جهانی آنفلوانزا Uni12 و SuperScript III Transcriptase (Invitrogen، Burlington، ON، کانادا) به cDNA تبدیل شد [19]. qPCR در سه تکرار بر روی یک سیستم PCR بلادرنگ StepOnePlusTM (Applied Biosystems، CA، USA) با Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)، 5 µL cDNA و 1 µL پرایمرهای جلو و معکوس 10 میکرومولار انجام شد. واکنش های PCR در دمای بازپخت 58 درجه سانتیگراد به مدت 40 سیکل اجرا شد. تمام توالی پرایمرهای qPCR در صورت درخواست در دسترس هستند.

2.9. تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 8 انجام شد. از آزمون های ناپارامتریک من ویتنی و کروسکال والیس استفاده شد. تفاوت های قابل توجه با * (p < 0.05)، ** (p < 0.{10}}1)، *** (p <0.001) نشان داده می شود. ، یا **** (p < 0.0001). ns=قابل توجه نیست.

For more information:1950477648nn@gmail.com