رمان، مدل موش آتاکسیک آتاکسی تلانژکتازی ناشی از یک جهش مزخرف مرتبط بالینی (قسمت 1)

برای کسب اطلاعات بیشتر لطفا تماس بگیریدdavid.wan@wecistanche.com

خلاصه

آتاکسی تلانژکتازی (AT) و آتاکسی با آپراکسی چشمی نوع 1 (AOA1) اختلالات عصبی ویرانگر ناشی از جهش های پوچ در ژن های پایداری ژنوم، AT mutated (ATM) و آپراتاکسین (APTX) هستند. درک مکانیکی و کارنامه درمانی ما برای درمان این اختلالات به شدت کمبود دارد، که تا حد زیادی به دلیل شکست مدل‌های حیوانی قبلی با جهش‌های پوچ مشابه در بازنویسی از دست دادن مشخصه هماهنگی حرکتی (یعنی آتاکسی) و نقایص مخچه مرتبط است. با افزایشژنوتوکسیکاسترس از طریق درج جهش های پوچ در هر دو ژن Atm (بی معنی) و Aptx (ناکاوت) در یک حیوان، ما یک مدل موش جدید ایجاد کرده ایم که برای اولین بار یک فنوتیپ آتاکسیک شدید مرتبط با آتروفی مولکولی مخچه ایجاد می کند. لایه. ما متوجه شدیم که خواص بیوفیزیکی نورون‌های پورکنژ مخچه به طور قابل‌توجهی مختل شده است (به عنوان مثال، کاهش ظرفیت غشایی، آستانه‌های پتانسیل عمل پایین‌تر، و غیره)، در حالی که ویژگی‌های ورودی‌های سیناپسی تا حد زیادی بدون تغییر باقی می‌مانند. اینهاآشفتگی هابه طور قابل توجهی فعالیت عصبی نورون پورکینی را تغییر می دهد، از جمله کاهش پیشرونده در شلیک پتانسیل عمل خود به خودی

فراوانی که با آتروفی مخچه و آتاکسی در سال اول زندگی حیوان مرتبط است. موش‌های جهش یافته دوگانه نیز مستعد ابتلا به سرطان (تیموما) و ناهنجاری‌های ایمنی (اختلال در رشد اولیه تیموسیت‌ها و بلوغ سلول‌های T) هستند، علائم مشخصه AT. در نهایت، با درج یک جهش پوچ از نظر بالینی مرتبط در Atm، ما نشان می‌دهیم که ترکیبات خوانده شده با مولکول کوچک (SMRT) می‌توانند تولید ATM را بازیابی کنند، که نشان‌دهنده پتانسیل آنها به عنوان یک درمان AT در آینده است.

برای اطلاعات بیشتر در مورد Cistanche اینجا را کلیک کنید

1.{1}} مقدمه

آتاکسی تلانژکتازی (AT) نادر است (1 در 100،{3}}) (سوئیفت و همکاران 1986)، یک اختلال ژنتیکی اتوزومال مغلوب که با استعداد سرطان، نقص ایمنی، و آتاکسی پیشرونده و شدید بسیار نافذ مرتبط است. به آتروفی مخچه (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Boder and Sedgwick 1958; Levy and Lang 2018). بیماران AT معمولاً در دهه دوم یا سوم زندگی خود می میرند (کرافورد و همکاران 2006) به دلیل سرطان های لنفاوی، عفونت های تنفسی یا عوارض آتاکسی - متأسفانه، بقا از دهه 1950 به طور چشمگیری تغییر نکرده است (Micol et al. اویات و همکاران 2016). در حالی که پیشرفت بیماری و علت مرگ به طور گسترده در بین بیماران متفاوت است، کاهش پیشرونده بسیار نافذ در هماهنگی حرکتی بیشترین تأثیر منفی را بر کیفیت زندگی بیمار دارد (Jackson et al.2016). مراقبت عموماً تسکینی است و برای کاهش، محدود کردن یا از بین بردن سرطان ها یا عفونت ها انجام می شود. هیچ درمان طولانی مدتی برای درمان آتاکسی و اختلال عملکرد مخچه و آتروفی مرتبط وجود ندارد. AT ناشی از کمبود یا اختلال عملکرد ATM استAT جهش یافته است) پروتئین (Savitsky et al. 1995). کدون ختم زودرس (PTC) که باعث جهش های بی معنی می شود تا نیمی از موارد شناخته شده را تشکیل می دهد و جهش های نادرست و حذف نیز در این امر نقش دارند (Concannon and Gatti 1997; Sandoval et al. 1999). ATM یک کیناز خانواده سرین/ترئونین PIKK است که نقش کلیدی در پاسخ آسیب DNA (DDR) ایفا می کند و از سلول ها در برابر ده ها هزار ضایعه DNA که هر روز ایجاد می شود محافظت می کند (لیندال و بارنز 2000؛ Kastan and Bartek 2004؛ Shiloh و Ziv. 2013). در شکل مونومر فعال، ATM چندین پروتئین کلیدی را فسفریله می کند که تولید DNA جدید (توقف چرخه سلولی) را متوقف می کند (آندو و همکاران 2012)، و سپس، بسته به شدت آسیب، ترمیم DNA یا سلول برنامه ریزی شده را آغاز می کند. مرگ (یعنی آپوپتوز) (آندو و همکاران 2012؛ راشی الکلس و همکاران 2006). چندین هدف پایین دستی مسیر DDR ATM شناسایی شده است، از جمله p53، CHK2، BRCA1، SMC1، و NBS1 (Matsuoka و همکاران. 2007). به نوترکیبی از پیوند طبیعی DNA که در طول بازآرایی ژن در بلوغ لنفوسیت های T و B رخ می دهد (چائو، یانگ و زو 2000؛ ماتی، گویدوس و دانسکا 2006؛ واچیو و همکاران 2007؛ شوبرت، رایچنباخ، و زیلن. ). اگرچه نقش های آن هنوز در حال ظهور است، ATM نیز در هموستاز استرس اکسیداتیو (Guo et al. 2010) و میتوفاژی (Valentin-Vega and Kastan 2012؛ Pizzamiglio، Focchi و Antonucci 2020) نقش دارد. مشخص نیست که چرا کمبود ATM باعث آتاکسی می شود، اما این تنها پروتئین DDR مرتبط با آتاکسی نیست، زیرا آپراتاکسین (Aprataxin).APTX) (Aicardi et al.1988)، نوترکیبی Meiotic 11 همولوگ 1 (MRE11) (Sedghi et al.2018)، Nibrin (NBS1) (van der Burgt et al.1996)، Senataxin (SETX) (Moreira et al.2004) و Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (TDP1) (Takashima et al. 2002) در صورت عدم وجود یا ناکارآمدی می تواند باعث آتاکسی مخچه شود. این نشان می‌دهد که ویژگی‌های عصبی سندرم‌های بی‌ثباتی ژنوم یک علت اساسی مشترک دارند، اگرچه این هنوز به طور مکانیکی نشان داده نشده است (McKinnon 2009؛ Rass, Ahel, and West 2007). یکی از عوامل اصلی محدود کننده توانایی ما در تعریف اینکه چرا از دست دادن پروتئین های DDR، مانند ATM، به طور انتخابی بر مخچه تأثیر می گذارد و باعث آتاکسی پیشرونده می شود، فقدان یک مدل حیوانی است که این علائم عصبی را خلاصه می کند (لاوین 2013). چندین مدل جونده AT در چندین سال گذشته با قرار دادن جهش‌های ژنی ایجاد شده است که باعث اختلال عملکرد پروتئین (فقدان فعالیت کیناز) یا کمبود کامل می‌شود (Herzog et al.1998; Xu and Baltimore 1996; Elson et al.1996; Spring et al. 2001؛ Campbell et al.2015؛ Quek et al.2016؛ Tal et al. 2018؛ Lavin 2013). اخیراً یک خوک کوچک نیز گزارش شده است (برالدی و همکاران 2017). با این حال، هیچ یک به آتاکسی آشکار و پیشرونده همراه با اختلال عملکرد مخچه و آتروفی که بیماری انسان را خلاصه می کند، مبتلا نمی شود، حتی اگر سایر جنبه های این اختلال مانند سرطان های تیروئید، ناباروری و ناهنجاری های ایمنی ایجاد شوند. هنوز مشخص نیست که چرا این مدل های حیوانی قبلی نتوانستند فنوتیپ آتاکسیک پیشرونده را نشان دهند (لاوین 2013). این امکان وجود دارد که جبران‌های مولکولی خاص گونه‌ها در موش‌ها، افزونگی‌ها یا مسیرهای جایگزین را فراهم کند که اثرات کمبود ATM در مغز را به حداقل می‌رساند (El-Brolosy and Stainier 2017). همچنین ممکن است کوتاه شدن طول عمر مدل‌های قبلی (بارلو و همکاران 1996) برای مکانیسم‌های تصادفی که باعث ایجاد اختلال در عملکرد مخچه و آتروفی می‌شوند و بر رفتار حرکتی انباشته شده و تأثیر می‌گذارد بسیار کوتاه باشد. چالش‌های دیگر شامل دستکاری‌های ژنتیکی بالقوه نشتی است که منجر به سطوح پایین پروتئین ATM یا قطعات فعال با فعالیت کیناز باقی‌مانده می‌شود، بنابراین آسیب‌شناسی عصبی را محدود می‌کند (Li et al. 2011). تأثیر از دست دادن چنین مدل حیوانی حیاتی دارد

قابل توجه بوده و مطالعات تجربی را به شدت محدود می کند تا مکانیسم های سلولی و مولکولی را شناسایی کند و مانع توسعه و آزمایش پیش بالینی درمان های بسیار مورد نیاز شود. ما در اینجا آزمایش می‌کنیم که آیا افزایش استرس ژنوتوکسیک، با قرار دادن جهش‌های پوچ نه تنها در ژن Atm، بلکه در ژن Aptx مرتبط، منجر به مدل موش نماینده‌تری می‌شود که اختلال عملکرد مخچه، آتروفی و ​​ایجاد آتاکسی پیشرونده را نشان می‌دهد. ما تصمیم گرفتیم Aptx را حذف کنیم زیرا کمبود آن باعث ایجاد اختلالی شبیه AT در انسان به نام آتاکسی با آپراکسی چشمی نوع 1 می شود.AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) در ژن Atm مشترک در خانواده بزرگی از بیماران AT آفریقای شمالی (Gilad, Bar-Shira, et al.1996). این جهش منجر به یک کدون ختم زودرس (PTC) در چیزی که معمولاً اسید آمینه 35 است و از دست دادن ترجمه ATM می شود. در اینجا، آزمایش‌های اثبات اصل را گزارش می‌کنیم که نشان می‌دهد جهش‌های ژنتیکی مرتبط بالینی که در مدل موش AT گنجانده شده‌اند، قابل خواندن از طریق ترکیبات هستند و بنابراین برای آزمایش‌های بالینی ترکیبات SMRT مناسب هستند.

2.{1}} نتایج

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>جهش T منجر به PTC های مختلف در ژن انسان در مقایسه با Atm موش می شودژن - TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>جهش T کدون CAG کدکننده گلوتامین (Q) را به کدون توقف TAG تبدیل می کند و Atm235× (رسما Atmm1.103c) زمان نشان داده می شود. وجود PTC منجر به از دست دادن بیان ATM می شود که یا در هتروزیگوت به نصف کاهش می یابد که یک کپی معمولی از موش را بیان می کند.

یا Atm Q35v35×) (شکل یا Atm 835×)، یا به طور کامل در هموزیگوت (ژن Atm?35×R35×Atm (Atm35× به علاوه 1C).

Atm35x7R35×; موش‌های Aptx^ (جهش‌یافته دوگانه) با اولین تلاقی موش‌های AtmF3xR3x تک جهش یافته (همزاد در پس‌زمینه C57BL/6J) و Aptx' (مخلوط C57BL/6J و 129 پس‌زمینه) به موش‌های Aptx* ایجاد شدند. F{10}} Atm همزاد»؛ موش‌های Aptx* سپس برای تولید Atm هتروزیگوت در لاشبرگ‌ها تلاقی داده شدند تا تعداد کافی ژنوتیپ آزمایشی و کنترلی مورد نظر ایجاد شود تا مشخص شود که چگونه از دست دادن مقادیر مختلف ATM و APTX بر فنوتیپ حیوان تأثیر می‌گذارد. شکل 1D).

مانند مدل‌های قبلی موش‌های AT با کمبود ATM، کمبود ATM یا APTX به تنهایی منجر به آتاکسی موش‌ها نشد (ویدئو 1 و 2). با این حال، کمبود در هر دو پروتئین (Atm35k35x؛ Aptx') منجر به ایجاد یک فنوتیپ شدید و تدریجی آتاکسیک می شود (شکل 1E، ویدئو 3 و 4).

2.2 موش‌های دارای کمبود ATM توانایی بقای خود را کاهش داده و شیوع بالای تیموما را کاهش داده‌اند.

ما سلامت عمومی و توسعه موش‌های کنترل و آزمایشی را که سطوح مختلف ATM و APTX را بیان می‌کردند، ارزیابی کردیم (شکل 2). ما دریافتیم که Atm735xR35×; موش‌های Aptx ~ 55 درصد کندتر رشد کردند و به وزن فلات تخمینی رسیدند که 35 درصد کمتر از ژنوتیپ‌های شاهد بود (log-rank, n=21 تا 40, p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0.4 برای همه مقایسه‌های زوجی. شکل2-شکل S1B]. به طور کلی، یک سوم از موش های مبتلا به کمبود ATM به دلیل عوارض مربوط به سرطان های بزرگ تیموس (تیموما) که در حفره قفسه سینه یافت می شود جان خود را از دست دادند (شکل 2C). وجود یا عدم وجود APTX بر شیوع سرطان تأثیری نداشت و موش‌هایی که حداقل یک نسخه Atm داشتند تا حداقل P400 عاری از سرطان بودند. به طور کلی، کمبود ATM اما نه APTX اثرات شدیدی بر سلامت و بقای موش‌ها داشت.

2.3 هر دو کمبود ATM و APTX برای ایجاد اختلال حرکتی پیشرونده ضروری هستند

توسعه تدریجی آتاکسی شدید یکی از مشخصه های بارز AT است که در ATM خلاصه می شود؟ 35/R35x; موش‌های Aptx اما هیچ یک از ژنوتیپ‌های دیگر کنترلی که ما آزمایش کردیم. به طور کلی، متوجه شدیم که نقص هماهنگی حرکتی بین 210 و 400 روز پس از تولد در Atm735Xk3x ظاهر می‌شود. Aptxmice و هیچ مدرکی دال بر آتاکسی در موش های دارای حداقل یک کپی از ژن Atm یا Aptx پیدا نکردند (شکل 3A، B). برای تست قطب عمودی، Atm735xR3x×. موش‌های Aptx دو برابر بیشتر از Atm*;Aptx*,Atm*; Aptx'، Atm735xR35×؛ Aptx* یا Atm35×*؛ موش‌های Aptx [نر: 29.1±0.9s(n{18}}) در مقابل 0.4±7.5s(n{23}})، 12.5±2.5s(n=9)،9.2±0.9s (n=10)، 8.6±0.9s(n=11)،1-way ANOVA،F4.40=19.9،p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 خواص غشایی و سیناپسی در نورون های پورکنژ دارای کمبود ATM و APTX مختل شده است.

نورون های پورکنژ (PN) یک زیرگروه عصبی کلیدی هستند که در قشر مخچه قرار دارند. آنها تحریک پذیری ذاتی قابل توجهی را نشان می دهند و پتانسیل های عمل را به طور خود به خود با سرعت هایی به طور قابل توجهی بالاتر از بسیاری از نورون های دیگر در مغز شلیک می کنند (50 تا 100 هرتز بیشتر در بسیاری از موارد). فعالیت آنها برون ده مخچه را از طریق مهار تونیک نورون های هسته مخچه شکل می دهد که به مراکز هماهنگی حرکتی در جلوی مغز، ساقه مغز و نخاع می پردازد. اختلال عملکرد PN مخچه با چندین اشکال آتاکسی مرتبط است و در AT دخیل است (Hoxha et al.2018: Cook. Fields. and Watt 2021: Shiloh Aptx*-X/R35X.2020). بنابراین، ما بررسی کردیم که آیا خواص الکتروفیزیولوژیکی PNs در مخچه Atm غیرطبیعی است یا خیر. از آنجایی که فعالیت پایه PN و پاسخگویی به ورودی توسط مجموعه ای از ویژگی های غشای فعال و غیرفعال واسطه می شود (شکل 4)، ما مستقیماً ویژگی های غشایی PN ها را در بخش های حاد مخچه برداشت شده از Atm35XR35× ثبت و مقایسه کردیم. Aptx* و Atm*؛ موش Aptx* (P350 تا 400). PN های ضبط شده از Atm35xR35×. موش‌های Aptx غشاهای بسیار محکم‌تری داشتند و مقاومت‌های ورودی غشایی (Rm) بالاتری نسبت به موش‌های ATM داشتند. موش Aptx* [47.7±5.6 (n{19}}) در مقابل.

30.2±1.47(n=23)MQ، t-test،p-0.008; Fig.4B] و ثابت زمان غشایی سریعتر () [3.6±0.4(n=15) vs.5.1±0.3(n{18}})ms، t-test، p{20}} را نشان داد. 009;شکل 4B]. این نتایج نشان می‌دهد که ظرفیت کل غشاء (Cm=t/Rm) Atm35x/35x;Aptx^PNs به طور قابل‌توجهی کاهش می‌یابد [98.25±19.23(n{30}}) در مقابل 12.67±175.6 (n =23)pF,t-test,p=0.0025;شکل 4B]. در سطح سلولی، این نشان می‌دهد که PN‌های فاقد ATM و APTX کمتر (یعنی مساحت کمتری دارند) یا غشاهای نازک تر

نسبت به PN های نوع وحشی، نتیجه ای حاکی از نقص رشد یا فرآیند تخریب عصبی است. Aptx/-and (DellOrco et al.2015). ما بعد تحریک پذیری ذاتی PN ها را در AtmR35xR3x ارزیابی کردیم.

موش‌های Atm*;Aptx* با بررسی تولید و پویایی پتانسیل عمل PN (AP). نقایص قابل توجهی در توانایی PN ها برای شلیک مداوم در پاسخ به تزریق جریان در موش های Atm?35×3x;Aptx^ مشاهده شد (شکل 4C). این کمبودها با اختلالات قابل توجهی در دامنه، آستانه، و ناحیه پتانسیل‌های کنش برانگیخته مرتبط بود [دامنه: 66.2± 0.7 (n=14) در مقابل. 72.1±1.4 (n=13)AmV،t-test،p{14}}. 61±1.9 mV,t-test,p{25}}.0196; مساحت: 0.6±17.96 در مقابل.

20.63± 1.0 mV*ms, t-test, p{5}}.048; شکل 4C]. این آزمایش‌ها با هم، آشفتگی‌های قابل‌توجهی در خواص فیزیولوژیکی PN را نشان می‌دهند که احتمالاً توانایی آن‌ها را برای عملکرد طبیعی در مخچه At/mR35×R35× مختل می‌کند. موش های Aptx.

ما بعداً آزمایش کردیم که آیا ویژگی‌های PN بیرونی و/یا سیناپسی نیز در AtmR35xR3sx تأثیر گذاشته است. موش های Aptx*. ما ابتدا جریان‌های پس سیناپسی تحریکی خود به خودی (iPSC) تولید شده توسط سیناپس‌های سلول به PN گرانول (یعنی ورودی‌های فیبر موازی) را بررسی کردیم. هیچ تفاوتی در اندازه UPSC تشخیص داده نشد، که نشان می‌دهد عملکرد پایانه‌های آکسون سلول گرانول (یعنی الیاف موازی) در AtmR35KR35X، Aptx' مخچه [18.92±1.3(n{{{1{31}}}) نسبتا طبیعی بود. 23.4±3.3(n=11)pA,t-test,p{17}}.477;Fig.4D](Yamasaki, Hashimoto, and Kano 20{{5{{58} }}}6). با این حال، مشخص شد که فرکانس sEPSC به طور قابل توجهی افزایش یافته است، پدیده ای که می تواند به افزایش تعداد کل سیناپس ها، افزایش اندازه مخزن وزیکول های سیناپسی به راحتی آزاد شوند یا افزایش احتمال انتقال دهنده های عصبی نسبت داده شود. انتشار در PN های fAtmR35XR35X. Aptx'mice [18.75±2.8Hz(n=11) در مقابل 11.4±1.0Hz(n=11)، t-test،p=0.{{ 69}}47; شکل 4D]. ما در مرحله بعد، آزادسازی سیناپسی برانگیخته و پلاستیسیته کوتاه‌مدت را با ضبط همزمان از PNها و تحریک الکتریکی سلول‌های گرانول (یعنی الیاف موازی) یا آکسون‌های زیتونی تحتانی (یعنی فیبر بالارونده) با انفجار پالس زوجی ({39}) بررسی کردیم. پالس‌ها، با فاصله 5{73}} ms). مشخص شد که ویژگی‌های سیناپسی الیاف موازی طبیعی است، و هیچ تفاوت معنی‌داری در تسهیل کوتاه‌مدت مورد انتظار (Atluri و Regehr 1996) یا نیمه عرض و ثابت زمان فروپاشی EPSC برانگیخته نشان نمی‌دهد [PPR: 1.3±0. 03 (n=10) در مقابل 1.4±{{90}}.{{1{{1{{1{114}}6}}5}}1 }}5(n=13),t-test,p=0.162;halfwidth:3.9±0.6 vs.4.9±0.4ms,t -test,p=0.175;ثابت زمانی: 3.5±0.5 vs.4.7±0.4ms,t-test,p=0.054;شکل. 4E]. در مقایسه، ما پاسخ‌های سیناپسی فیبر به PN را یافتیم که معمولاً افسردگی زوج پالس را نشان می‌دهند (هانسل و لیندن 2000)، در قدرهای قابل‌توجهی بیشتر در موش‌های Atm/3338/R35X؛ Aptx' فرو می‌روند [PPR: 0.03±0.6 (n=6) در مقابل 0.02±0.7 (n=9)، t-test، p=0.03;شکل 4F]. عرض کلی و ثابت زمانی فروپاشی برانگیختگی جریان‌ها نیز کوچک‌تر بودند [نیمه پهنا: 2.3±0.6(n =6).3.0±0.2(n{108}})ms، t-test، p{110}}.004;ثابت زمانی (سریع) :1.1±0.14 vs.2.9±0.4ms,t-test, p{121}}.001]. در حالی که این نتایج می‌تواند ناشی از نقص پیش‌سیناپسی باشد، مانند کاهش ذخایر وزیکول در پایانه آکسون فیبر بالا رونده، قدر اولیه بی‌تأثیر EPSC [2.4±0.4(n{127}}) در مقابل. 0.2 ± 1.9 nA (n{132}})، t-test، p{134}}.3] به کمبود ذاتی بیشتری اشاره می کند، مانند کاهش هجوم Ca2* از شبکه آندوپلاسمی، که می تواند به طور قابل توجهی تأثیر طولانی داشته باشد. پلاستیسیته سیناپسی برای عملکرد مخچه حیاتی است (Hoxha et al. 2018; Kano and Watanabe 2017). به طور کلی، اختلالات مربوط به ویژگی‌های PN غیرفعال و فعال که در اینجا مشاهده می‌کنیم احتمالاً منجر به اختلال عملکرد مخچه قابل توجهی در AtmR35X/R35X می‌شود. موش های Aptx.

2.5 کمبود ATM و APTX باعث اختلال پیشرونده فعالیت عصبی PN می شود که با دندریتیک مرتبط است.کوچک شدن و آتروفی کلی مخچه Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0.3 در همه مقایسه‌های زوجی. شکل 4-شکل. S3). مطالعات قبلی در چندین مدل موش از آتاکسی ارثی، از جمله آتاکسی اپیزودیک و چندین نوع آتاکسی نخاعی، نشان می دهد که اختلال فیزیولوژیکی در شلیک PN نه تنها فرکانس آن را تغییر می دهد، بلکه نظم آن را نیز تغییر می دهد (Kasumu and Bezprozvanny 2012؛ Jayabal et al. 2016; و همکاران 2020؛ کوک، فیلدز و وات 2021). ما هر دو ضریب تغییرات (CV) و تنوع در فواصل مجاور (CV2) بین AtmR35X/R35X مقایسه کردیم. موش‌های Aptx/ و کنترل (شکل 4-شکل S4، S5). هیچ تفاوتی در این پارامترها در جنس، سن یا ژنوتیپ مشاهده نشد. مطابق با نتایج رفتاری، اختلال عملکرد مخچه تنها در AtmR35XR35X یافت شد. موش‌های Aptx' که دچار آتاکسی شدند و در موش‌هایی با بیان جزئی یا کامل ATM یا APTX مشاهده نشد.

2.5 کمبود ATM و APTX باعث آتروفی مخچه می شود

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0.3 برای هر 4 ژنوتیپ در P460، n=10 تا 20]. علاوه بر این، متوجه شدیم که اندازه مخچه بین نرها و موش‌های ماده 22 درصد کوچک‌تر در ژنوتیپ‌ها در این سن تفاوتی ندارد [2-way ANOVA, F(2. 153){10}}.9, p. =0.2]. بنابراین، تخریب عصبی مخچه در Atm35XR35×. موش‌های Aptx* که بعد از P120 شروع می‌شود، با کمبود ATM و APTX مرتبط است. ما دریافتیم که آتروفی مخچه با کاهش انتخابی در عرض لایه مولکولی که در آن دندریت‌های PN قرار دارند مرتبط است (شکل 5B). مطابق با تغییرات زمانی در اندازه ناخالص مخچه، فرکانس شلیک PN و رفتار، عرض ML در Atm35×R35X. موش‌های Aptx* در موش‌های جوان‌تر نرمال بود، اما با افزایش شدت آتاکسی، عرض آنها به تدریج کاهش یافت. {31}}way ANOVA,Fu42=45.04,p<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

عفونت های سینوسی ریوی مزمن مرتبط با نقص ایمنی یکی از علل اصلی مرگ و میر در بیماران AT است (مورل، کرومارتی و سویفت 1986؛ بات و بوش 2014). نقص ایمنی با نقص در تولید لنفوسیت های B و T مرتبط است که با نقص در فرآیندهای بازآرایی ژن گیرنده آنتی ژن در طی تولید این سلول ها در مغز استخوان و تیموس به ترتیب مرتبط است (Staples et al. 2008). نقص های حاصل در تعداد لنفوسیت های بالغ شامل کاهش سلول های T کمک کننده CD4t و سلول های CD8*T کشنده است (Schubert, Reichenbach, and Zielen 2002). بنابراین، درصد سلول‌های T را در خون محیطی و زیرجمعیت‌های مختلف در تیموس Atm35xR35× بررسی کردیم. موش Aptx*' با استفاده از گیرنده آنتی ژن سلول T (TCR) و بیان گیرنده مشترک CD4/CD8. در خون محیطی، ما کاهش قابل توجهی را در کسر کل سلول های CD3*T در موش هایی با کاهش یا عدم بیان ATM در مقایسه با موش های نوع وحشی مشاهده کردیم (شکل 6). این کاهش با کمبود همزمان APTX بیشتر شد. کمبود ATM و APTX باعث کاهش بیش از 65 درصد سلول های T در خون محیطی در مقایسه با گروه کنترل وحشی شد. اثر کمبود APTX به کمبود ATM افزوده شد و مکانیسم عمل متفاوتی را برای هر یک از این دو پروتئین بر روی تولید سلول‌های T نشان داد. کاهش درصد سلول های T در خون محیطی بیشتر با کاهش جمعیت سلول های T کمکی CD4 همراه بود (شکل 6B). از علاقه، نسبت CD8 به علاوه سلول های T تنها در AtmR35X / R35 × افزایش یافته است. موش Aptx* (شکل 6B). مجدداً، ما یک اثر افتراقی از کمبودهای ATM و APTX را مشاهده کردیم که برای اثرات این جهش‌ها بر کل کسر T-cel مشاهده شد. با توجه به کاهش جمعیت سلول های T در خون، ما در مرحله بعدی رشد سلول های T را در تیموس ارزیابی کردیم. در این اندام، پیش سازهای سلول T مشتق از مغز استخوان تحت بازآرایی ژن TCR و به دنبال آن انتخاب مثبت برای محدودیت MHC و انتخاب منفی کلون های خود واکنشی قرار می گیرند. مراحل رشد تیموسیت را می توان با نظارت بر بیان CD4 و CD8 در تیموسیت ها دنبال کرد. پیشرفت این برنامه رشدی از تیموسیت‌های دوگانه منفی (CD4CD8) به تیموسیت‌های دو مثبت (CD4*CD8) و سپس به تیموسیت‌های تک مثبت (CD4*یا CD8*) می‌رود. علاوه بر این، در مرحله دو منفی، چهار زیرجمعیت مختلف را می توان بر اساس بیان CD25 و CD44 شناسایی کرد که به نام‌های DN1(CD44*CD25)، DN2 (CD44*CD25*)، DN3 (CD44 CD25*) و DN4 (CD44 درجه CD25) (Germain 2002). بازآرایی ژن در طول رشد تیموسیت دو بار اتفاق می افتد - یک بار در مرحله تیموسیت دوگانه منفی در مرحله CD25 * CD44 (Krangel 2009) و سپس دوباره در مرحله تیموسیت دو مثبت قبل از پیشرفت به جمعیت های جداگانه CD4* و CD8t منفرد مثبت (لیواک و همکاران 1999). کمبود ATM با نقص در هر دو دوره بازآرایی در موش ها مرتبط است (Vachio 2007، Hathcock 2013). بنابراین، ما نسبت سلول‌های تیموس را که این نشانگرهای سطح سلولی رشدی متفاوت را بیان می‌کنند، در موش‌های دارای کمبود ATM و موش‌های کنترل مقایسه کردیم (شکل 7). AtmR35xR35×; Aptx و Atm35×؛ Aptx^ اما نه AtmR35XR35. موش‌های Aptx* نسبت سلول‌های CD44*CD25، CD44*CD25t و CD44CD25* به طور قابل‌توجهی نسبت به نوع وحشی (شکل 7A) افزایش یافته بودند. به عنوان کسری از سلول های CD44CD25 از Atm735xR35×. Aptx'and Atm35× plus; موش‌های Aptx به‌طور قابل‌توجهی کمتر از نوع وحشی هستند (شکل 7A). جالب اینجاست که کمبود APTX به خودی خود بیشترین تأثیر را بر از بین رفتن سلول‌های DN4 داشت، که نشان می‌دهد کمبود APTX، به جای کمبود ATM، مسئول این اثر است. طبق دانش ما، این یافته برای اولین بار APTX را در بازآرایی ژن در طول فرآیند نوترکیبی TCR دخیل می کند. در مرحله بعد، ما به نسبت تیموسیت‌های CD4*CD8t در مقایسه با CD4tCD8 و CD4CD8 به‌علاوه تیموسیت‌های تک مثبت در این چهار سویه مختلف نگاه کردیم. در توافق با نتایج ما در خون و مطالعات قبلی، ما دریافتیم که موش‌های دارای کمبود ATM، اما موش‌های کنترل، کاهش بیان تیموسیت‌های منفرد مثبت CD4*CD8 و CD4CD8* را نشان دادند (شکل 7B). این نتایج از نقش ATM در بازآرایی ژن TCR a/δ در طول توسعه تیموسیت (Bredemeyer et al.2006) حمایت می کند، نقشی که مستقل از نقش APTX در بلوغ اولیه تیموسیت است.

2.7 مولکول های خواندنی بر PTC غلبه می کنند تا بیان ATM را بازیابی کنند

دلیل اصلی ما برای درج یک جهش مزخرف مرتبط بالینی در ژن Atm، تولید موشی بود که بتواند آزمایش‌های حیاتی پیش بالینی مجموعه جدیدی از ترکیبات SMRT را انجام دهد. ما قبلاً نشان دادیم که ترکیبات SMRT تولید پروتئین ATM را در رده‌های سلولی لنفوبلاستوئید مشتق از بیمار AT با غلبه بر کدون‌های خاتمه زودرس (PTC) ناشی از جهش‌های بی‌معنی بازیابی می‌کنند (Du et al. 2013). برای نشان دادن مناسب بودن این مدل حیوانی جدید AT برای آزمایش ترکیب SMRT، ما تصمیم گرفتیم به طور مستقیم توانایی آنها را برای بازیابی بیان ATM با استفاده از یک رویکرد ریزنمونه ای که چالش های مربوط به تحویل درون تنی (مانند فراهمی زیستی، مسیر تحویل و غیره) را دور می زند، بررسی کنیم. بیان ATM در نمونه هایی از طحال، جایی که ATM به طور معمول در سطوح بالا بیان می شود، و مخچه، بافت هدف کلیدی برای این اختلال، اندازه گیری شد. آیا ما این بافت‌های ریزنمونه‌ای را که از هموزیگوت Atm?35× و Atm برداشت شده‌اند، در معرض دید قرار دادیم؟ 35 موش با یک ترکیب نامزد SMRT (GJ103) یا یک آمینوگلیکوزید که قبلاً دارای خواص خواندنی (G418) شناخته شده بود و سپس بیان ATM را با ایمونوبلات برای ارزیابی ترمیم اندازه‌گیری کردند. در هر دو نوع موش با کمبود ATM، بیان ATM به طور مداوم در طحال و مخچه توسط G418 و GJ103 بازیابی شد (شکل 8). این نتایج نشان می‌دهد که ترکیبات SMRT ما می‌توانند خواندن حداقل 2 جهش از 3 جهش مزخرف ممکن را که باعث PTC‌ها می‌شوند، فعال کنند و منطقی برای آزمایش اثربخشی in vivo در مطالعات بعدی فراهم کنند.