فعال سازی گیرنده هیدروکربنی آریل توسط 6-formylindolo[3,2-b]carbazole آسیب حاد کلیه را با سرکوب التهاب و آپوپتوز کاهش داد

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه:حادآسیب کلیه(AKI) یک بیماری چند عاملی با علل مختلف است. گیرنده هیدروکربنی آریل (AhR) یک فاکتور رونویسی فعال شده با لیگاند است که به لیگاندها برای القا یا سرکوب بیان ژن پاسخ می دهد و در نتیجه طیف متنوعی از اثرات بیولوژیکی یا پاتوفیزیولوژیک را تنظیم می کند. با این حال، اثر AhR بر AKI ناشناخته باقی مانده است. یک تزریق داخل صفاقی 50 درصد گلیسرول برای القای رابدومیولیز در موش‌های C57BL/6J انجام شد. دوطرفهکلیهساقه ها به مدت 30 دقیقه مسدود و سپس برای تحریک برداشته شدندکلیهآسیب I/R. 6-formylindolo[3،2-b]car-bazole (FICZ)، یک محصول اکسیداسیون نوری تریپتوفان با میل ترکیبی بالا برای AhR، استفاده شد. مطالعه آزمایشگاهی بر روی سلول‌های HK-2 انجام شد. فروس میوگلوبین و FICZ در محیط در گروه های مختلف سلولی حل شد. درمان با آگونیست AhR FICZ به طور قابل توجهی افزایش کراتینین و اوره سرم را در AKI کاهش داد. AKI ناشی از مدل سازیآسیب کلیویتوسط FICZ ضعیف شد. AhR عمدتاً در سلول های لوله پروگزیمال بیان می شود و می تواند با تجویز FICZ فعال شود. در همین حال، AKI باعث تولید سیتوکین های پیش التهابی در مصدوم شدکلیه ها، در حالی که FICZ عبارات آنها را مهار کرد. علاوه بر این، FICZ به طور موثر آپوپتوز سلولی را در مدل‌های AKI معکوس کرد. از نظر مکانیکی، AKI فعال شدن مسیرهای NF-kB و JNK را در بدن تحریک کردکلیه ها، در حالی که FICZ به طور قابل توجهی این عبارات پروتئین مربوطه را سرکوب کرد. برای مطالعه آزمایشگاهی، FICZ همچنین التهاب و آپوپتوز را در میوگلوبین یا سلول‌های HK{1}} تحریک‌شده با H/R مهار کرد. به طور خلاصه، آگونیسم AhR توسط FICZ رابدومیولیز و AKI ناشی از I/R را کاهش داد. FICZ با سرکوب مسیرهای NF-kB و JNK در سلول‌های لوله پروگزیمال، التهاب و آپوپتوز را مهار کرد.

کلید واژه ها:آسیب حاد کلیه، آپوپتوز، گیرنده هیدروکربنی آریل، التهاب، سلول های اپیتلیال لوله های کلیوی

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

مقدمهحادآسیب کلیه(AKI) به کاهش سریع اشاره داردعملکرد کلیهدر عرض چند ساعت تا چند روز به دلیلکلیهنارسایی پرفیوژن، داروها یا سموم نفروتوکسیک، انسداد مجاری ادراری و علل دیگر. علل بالینی AKI عمدتاً شامل آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد، مواد نفروتوکسیک (مانند داروها، عوامل انقباضی و محتویات سلول عضلانی آزاد شده توسط رابدومیولیز) و سپسیس است. سالانه حدود 13.3 میلیون نفر در جهان از AKI رنج می برند. 2 AKI با مرگ و میر و هزینه های بالا، بار سنگینی را به همراه دارد. 3 مکانیسم های پاتوفیزیولوژیکی اصلی شامل آسیب بهکلیهسیستم عروقی، استرس شبکه آندوپلاسمی 4،5، آسیب میتوکندریایی 6،7، آپوپتوز، 9 استرس اکسیداتیو، و التهاب. AKI شایع ترین عارضه است. ایسکمی خونرسانی مجدد (I/R) یکی از پاتوفیزیولوژی های اصلی AKI است که 60 درصد از علل AKI را به خود اختصاص می دهد.12 در حال حاضر، هیچ درمان موثری برای AKI ناشی از هر دو دلیل فوق الذکر وجود ندارد، به جز حذف اتیولوژی، حمایتی. درمان، وکلیهدرمان جایگزین

گیرنده هیدروکربنی آریل (AhR) رونویسی و از ژن AHR ترجمه شده است. در انسان، AhR در اندام های مختلف از جمله ریه، تیموس،کلیه،کبد، روده، و غیره. 13 AhR غیر لیگاند شده در سیتوزول در یک مجتمع پروتئینی وجود دارد که همچنین شامل یک دایمر پروتئین شوک حرارتی 90 (HSP90) و همتایان AIP و p23.14 پس از اتصال به لیگاند، AhR فعال شده و وارد می شود. هسته، جایی که به انتقال دهنده هسته ای AhR (ARNT) متصل می شود و رونویسی بسیاری از ژن های مختلف پایین دست را ترویج می کند. لیگاندهای AhR بسیار متنوع هستند و می توانند به عنوان اگزوژن یا درون زا طبقه بندی شوند. لیگاندهایی با منابع و ساختارهای مختلف با قرابت‌های متفاوتی به AhR متصل می‌شوند و می‌توانند اثرات فیزیولوژیکی یا پاتولوژیک متفاوتی ایجاد کنند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که AhR با مسیرهای پایین‌دست خود دارای عملکردهای ضد التهابی، 17 ضد آپوپتوز، 18 تنظیم کننده چرخه‌های سلولی و تنظیم کننده است. ایمنی، 20 که اجزای مهم پاتوژنز AKI هستند. لیگاندهای درون زا برای AhR عمدتا از متابولیسم تریپتوفان هستند. 6-formylindolo[3,2-b]carbazole (FICZ)، یک محصول اکسیداسیون نوری تریپتوفان، میل ترکیبی بالایی با AhR دارد. قبلاً، FICZ اثرات محافظتی در مدل‌های مختلف بیماری از خود نشان می‌داد.{{ 19}} اگرچه محققان دریافتند که AhR فعال شده توسط سموم اورمیک اثرات نامطلوبی در بیماران مبتلا به مزمن دارد.بیماری های کلیوی(CKD)، 25 هیچ مطالعه ای تغییرات بیان آن را در AKI اندازه گیری نکرد. همچنین مشخص نیست که آیا FICZ دارای aکلیهاثر محافظتی در رابدومیولیز و AKI ناشی از I/R، زیرا AhR می‌تواند اثرات پایین‌دستی کاملاً متفاوتی را فعال کند.

آزمایشات روی حیواناتهمه پروتکل‌های آزمایشی و رویه‌های حیوانی مطابق با اصول اخلاقی در آزمایش‌های حیوانی که توسط دانشگاه آزمایشی سیچوان پذیرفته شده و توسط کمیته اخلاق مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه سیچوان تأیید شده است، انجام شد. موش های نر C57BL/6 (10-12 هفته، وزن بین 25 تا 27 گرم) از مرکز آزمایشگاه حیوانات دانشگاه سیچوان (چنگدو، چین) خریداری شدند. موش ها در دمای ثابت (2±23 درجه) و شرایط نور/تاریکی (12/12 ساعت) با دسترسی آزاد به آب و غذا نگهداری شدند. موش ها قبل از تحقیقات بیشتر به مدت 1 هفته با این محیط سازگار شدند. در مدل رابدومیولیز، موش‌ها به طور تصادفی به چهار گروه کنترل (n {{0}})، FICZ (n=3)، گلیسرول (n=6) و گلیسرول تقسیم شدند. به علاوه FICZ (n=6). به موش‌های گروه گلیسرول، 50 درصد گلیسرول محلول در 0.9 درصد نرمال سالین (9 میکرولیتر بر گرم وزن بدن) به صورت دو طرفه به اندام‌های پشتی تزریق شد تا باعث تحریک رابدومیولیز در AKI کاهش یافته شود. در همین حال، موش‌های گروه کنترل همان حجم سالین را با تزریق عضلانی دریافت کردند. در مورد گروه گلیسرول به علاوه FICZ، FICZ در 2.5 درصد PEG400 حل شد و در 0.9 درصد نرمال سالین رقیق شد تا به صورت داخل صفاقی با دوز 100 میکروگرم بر کیلوگرم در روز برای چهار روز متوالی قبل از تزریق گلیسرول تجویز شود. موش‌های گروه FICZ به‌صورت داخل صفاقی همان دوزهای FICZ را برای چهار روز متوالی بدون تزریق گلیسرول تجویز کردند.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

در مدل ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه، موش ها به طور تصادفی به چهار گروه کنترل (n=6)، FICZ (n=3)، I/R (n=6) و I تقسیم شدند. /R به علاوه FICZ (n=10). آسیب در گروه I/R با بستن پدیکول های کلیوی با گیره های میکروواسکولار غیر ضربه ای به مدت 30 دقیقه و به دنبال آن 24 ساعت خونرسانی مجدد پس از برداشتن گیره ایجاد شد. انسداد و خونرسانی مجدد با تغییرات رنگی تایید شدکلیه ها. موش‌های گروه کنترل به جز بستن ساقه‌ها، تحت عمل جراحی مشابهی قرار گرفتند. از نظر گروه I/R به علاوه FICZ، FICZ همانطور که در بالا ذکر شد برای چهار روز متوالی قبل از مدل سازی I/R تجویز شد. به طور مشابه، موش‌های گروه FICZ دوزهای یکسانی از FICZ را برای چهار روز متوالی دریافت کردند و تمام مراحل جراحی را به عنوان گروه کنترل تجربه کردند. دو دسته از موش ها به ترتیب با تزریق پنتوباربیتال سدیم (50 میلی گرم بر کیلوگرم، درون صفاقی) کشته شدند و 24 ساعت پس از مدل سازی قربانی شدند. سرم وکلیهنمونه ها جمع آوری و در دمای 80- درجه برای تجزیه و تحلیل بیشتر ذخیره شدند.

سنجش بیوشیمی سرمنمونه های خون بلافاصله در 1509.3 گرم به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند تا سرم برای آزمایش جدا شود. سطوح سرمی کراتینین (sCr)، اوره و کراتین کیناز (CK) توسط یک آنالایزر بیوشیمیایی خودکار (Mindray BS{3}}) شناسایی شد. سطوح sCr گروه‌های مدل‌سازی که تا دو برابر مقادیر کنترل آن‌ها افزایش یافت نشان‌دهنده مدل‌سازی موفق AKI بود.

ارزیابی بافت شناسیبافت کلیه در فرمالین بافر خنثی 10 درصد تثبیت شد، در پارافین جاسازی شد و با ضخامت 4 میکرومتر برش داده شد. مقاطع پس از پارافینیزاسیون و آبگیری مجدد با اسید پریودیک شیف (PAS) رنگ آمیزی شدند. مقاطع رنگ آمیزی شده با PAS در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 200 × یا 400 × بررسی شدند. 10 میدان به طور تصادفی با بزرگنمایی 200× از هر بخش و دو بخش به طور تصادفی از هر نمونه حداقل سه نفری در هر گروه برای تجزیه و تحلیل نیمه کمی انتخاب شدند. تغییرات هیستوپاتولوژیک با درصد مجروح/ آسیب دیده ارزیابی شدکلیهلوله ها، همانطور که با اتساع لوله، لیز، اختلال و تشکیل گچ نشان داده می شود. آسیب بافتی در مقیاس {{0}} با 0، 1، 2، 3 و 4 مربوط به 0 درصد نمره گذاری شد.<25%, 26%-50%,="" 51%-75%="" and="">76 درصد مجروحان / آسیب دیده اندکلیهلوله ها به ترتیب.26

رنگ آمیزی ایمونوفلورسانسموش یخ زدکلیهبافت‌های تعبیه‌شده در OCT، به بخش‌هایی به ضخامت 4- میکرومتر بر روی یک کرایوستات بریده شدند و تا زمان رنگ‌آمیزی در دمای ۸۰- درجه نگهداری شدند. سالین بافر فسفات (PBS) حاوی 5 درصد سرم اسب به مدت 1 ساعت در دمای اتاق استفاده شد تا محل های اتصال غیر اختصاصی را مسدود کند. سپس مقاطع با آنتی بادی های اولیه در یک محفظه مرطوب در دمای 4 درجه یک شب انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، آنتی بادی ثانویه مربوطه به مدت 1 ساعت بدون نور استفاده شد. نمونه ها سپس توسط PBS شسته شدند، با DAPI (D8200، Solarbio) رنگ آمیزی شدند و در نهایت با روکش ها نصب شدند. آنتی بادی های اولیه در گروه کنترل منفی با PBS جایگزین شدند. آنتی‌بادی‌های ثانویه (رقت 1:500؛ جکسون ایمونوسرچ) همسان با آنتی‌بادی‌های اولیه برای صادرات سیگنال‌های فلورسنت اعمال شد. تصاویر توسط نرم افزار میکروسکوپ ZEN 2012 (نسخه آبی) گرفته و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

ایمونوهیستوشیمیبافت‌های کلیه با فرمالین تثبیت شدند، آب‌گیری شدند، در پارا فین جاسازی شدند، با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند و سپس بر روی لام‌های شیشه‌ای نصب شدند. سپس اسلایدها توسط سرم طبیعی بز 5/2 درصد مسدود و با آنتی بادی های اولیه در دمای 4 درجه انکوبه شدند. لام ها سه بار در PBS شسته شدند و برای رنگ آمیزی از کیت VECTASTAIN ABC (Vector) استفاده کردیم. تصاویر با استفاده از نرم افزار میکروسکوپ ZEN 2012 (نسخه آبی) گرفته شده است.

رنگ آمیزی TUNELبافت کلیه با فرمالین تثبیت شد، در پارافین جاسازی شد و با ضخامت 4 میکرومتر برش داده شد. رنگ‌آمیزی پایانه‌ای با واسطه دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز dUTP nick end labeling (TUNEL) با استفاده از DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (G3250، Promega) انجام شد. برای رنگ‌آمیزی هسته‌ای، مقاطع با DAPI (D8200، Solarbio) در رقت 1:500 انکوبه شدند. تصاویر با میکروسکوپ فلورسانس در بزرگنمایی 400× ارائه شد. ما سلول های مثبت را شمارش کردیم و حداقل 10 میدان را در هر بخش در هر نمونه بررسی کردیم.

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

تجزیه و تحلیل وسترن بلاترابافت کلیهسلول‌های s یا HK{{0}} با بافر لیز رسوب ایمنی رادیویی (RIPA) (P{26}}013B، Beyotime Biotechnology) حاوی بازدارنده‌های پروتئیناز 1‰ (Keygen Biotech) همگن شدند. پس از سانتریفیوژ ({3}}.2 گرم، در دمای 4 درجه) به مدت 15 دقیقه، مایع رویی جمع آوری شد و غلظت پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین بیسینکونیک اسید (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) مطابق دستورالعمل سازنده تعیین شد. لیز پروتئین با مقادیر مساوی با 10 درصد - 12 درصد SDS-PAGE جدا شد و سپس به غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید (Bio-Rad) منتقل شد. غشاها با 5 درصد شیر خشک بدون چربی (w/v) در سالین بافر Tris با 0.1 درصد Tween{16}} (TBS-T) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق مسدود شدند و سپس با آنتی بادی های اولیه مربوطه انکوبه شدند. یک شب در 4 درجه پس از شستشوی سه بار با TBS-T در فواصل 5- دقیقه، غشاها با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با HRP در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. لکه های پروتئینی روی غشاها توسط بستر Immobilon Western Chemiluminescent HRP (شرکت Millipore) با Bio-Rad Chemi Doc MP مشاهده شد. آنالیز تراکم سنجی با استفاده از نرم افزار ImageJ 6.0 (موسسه ملی بهداشت) و از اکتین به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد.

تجزیه و تحلیل کمی PCR زمان واقعیRNA کل منجمد شدهکلیهنمونه ها با کیت جداسازی RNA کل حیوانات (فورژن) جداسازی شدند. غلظت mRNA جدا شده با استفاده از تعیین کننده ScanDrop 100 (Analytik Jena) و cDNA با استفاده از کیت معرف PrimeScript™ RT (Takara Bio) سنتز شد. PCR زمان واقعی کمی با استفاده از iTaq™ Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) در یک سیستم PCR (CFX Connect؛ Bio-Rad) پس از رونویسی معکوس انجام شد. توالی پرایمر در جدول S1 فهرست شده است. مقادیر نسبی ژن با روش 2−∆∆Ct در مقایسه با سطوح بیانی -اکتین محاسبه شد.

کشت و درمان سلولیرده سلولی لوله‌ای پروگزیمال کلیه انسان (سلول HK-2) هدیه‌ای مهربان از طرف پروفسور Xueqing Yu (بیمارستان مردمی استان گوانگدونگ) بود و در محیط (DMEM)/F12 (SH30023. 01B، Hyclone) حاوی 10 درصد کشت داده شد. سرم جنین گاوی (SH30084. 03، Hyclone)، در دمای 37 درجه تحت اتمسفر مرطوب 5 درصد CO2 و 95 درصد هوا در مدل میوگلوبین، سلول ها در حالت رشد نمایی به چهار گروه تقسیم شدند: گروه FICZ، انکوبه شده با 100 nmol/L FICZ به مدت 24 ساعت؛ گروه میوگلوبین، با 200 میکرومول در لیتر فروس میوگلوبین به مدت 24 ساعت انکوبه شد. گروه Mb به علاوه FICZ، با FICZ در 100 نانومول در لیتر با تجویز درمان میوگلوبین انکوبه شد. و در گروه کنترل، سلول ها با محیط کامل به تنهایی در گروه کنترل انکوبه شدند. فروس میوگلوبین همانطور که قبلاً توضیح داده شد تهیه شد. 26،27 در مدل هیپوکسی/ اکسیژن‌رسانی مجدد (H/R)، سلول‌های HK{18}} را به سه گروه تقسیم کردیم. سلول های گروه H/R تحت شرایط هیپوکسیک (1 درصد O2، 94 درصد N2 و 5 درصد CO2) در محیط بدون سرم به مدت 12 ساعت برای القای هیپوکسی کشت داده شدند. سپس سلول ها به مدت 6 ساعت برای اکسیژن رسانی مجدد به محیط کشت معمولی با اکسیژن منتقل شدند. سلول های کنترل در محیط کشت کامل در انکوباتور معمولی انکوبه شدند. تجویز FICZ (100 نانومول در لیتر) در گروه H/R به علاوه FICZ درست قبل از عمل H/R داده شد.

سنجش یدید انکسین V-FITC/پروپیدیومما از کیت آنالیز آپوپتوز Annexin V-FITC (AO2001- 02PH، SUNGENE) استفاده کردیم. سلول های HK{3}} در پلیت های شش چاهی کاشته شدند. پس از 24 ساعت قرار گرفتن در محیط های مختلف، سلول های چسبیده توسط تریپسین جدا شدند. سپس، سلول ها در یک بافر اتصال مجدد معلق شدند و با 5 میکرولیتر Annexin V-FITC و 5 میکرولیتر پروپیدیوم یدید (دمای اتاق، 15 دقیقه، اجتناب از تاریکی) رنگ آمیزی شدند. سلول های آپوپتوز توسط فلوسایتومتر شناسایی شدند.

تحلیل آماریداده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار داده شد. مقادير آماري مقايسه‌هاي چند گروهي با استفاده از آناليز واريانس يك طرفه و مقايسه زوجي با آزمون SNK انجام شد. تمامی تجزیه و تحلیل های آماری در SPSS 21 انجام شد.{2}}. P < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

آگونیست AhR FICZ AKI را ضعیف کردبرای بررسی اینکه آیا FICZ یک اثر محافظت کننده از نو ایجاد می کند، ما مدل های AKI ناشی از رابدومیولیز و ایسکمی/پرفیوژن مجدد (I/R) را ایجاد کردیم. سپس عملکرد کلیه و تغییرات پاتولوژیک در بافت کلیه مورد ارزیابی قرار گرفت. هیچ اختلال قابل توجهی در سطوح سرمی کراتینین، اوره، CK، فعالیت های متابولیکی آنزیم های کبدی وجود ندارد.

در گروه FICZ مشاهده شد (شکل 1A-C؛ جدول S3). همانطور که در شکل 1A-B نشان داده شده است، تجویز FICZ به طور قابل توجهی افزایش قابل توجه سطح کراتینین و اوره سرم را در 24 ساعت پس از تزریق گلیسرول یا جراحی I/R کاهش داد، بدون اینکه بر سطح CK سرم در موش های رابدومیولیز تأثیر بگذارد (شکل 1C). در همین حال، رنگ‌آمیزی‌های PAS نشان داد که FICZ به طور موثر آسیب پاتولوژیک را کاهش می‌دهد که با اتساع لوله‌ای، تورم، تشکیل گچ‌گیری و از دست دادن مرز قلم مو در مقایسه با مدل‌های AKI در هر دو مدل مشخص می‌شود (شکل 1D-E). رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس و نتایج PCR بلادرنگ نشان داد که استفاده از FICZ به طور قابل توجهی بیان و رونویسی لیپوکالین مرتبط با نوتروفیل ژلاتیناز (NGAL)، یک نشانگر زیستی آسیب کلیوی را در مصدوم کاهش می دهد.کلیه ها(شکل 2A-D). به طور مشابه، FICZ همچنین سطح mRNA ناشی از گلیسرول را مهار کردآسیب کلیهمولکول 1 (KIM1) پس از تزریق گلیسرول (شکل 2A).

ما رونویسی و بیان AhR را بیشتر بررسی کردیمکلیهبافت ها در شکل 3، نتایج rt-PCR، وسترن بلات، ایمونوهیستوشیمی و رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس نشان داد که سطح mRNA و پروتئین AhR به طور قابل توجهی در هر دو گروه مدل‌سازی AKI کاهش یافت. تزریق داخل صفاقی FICZ به طور قابل توجهی رونویسی و بیان آن را در گروه های گلیسرول به اضافه FICZ و I/R به علاوه FICZ تحریک کرد. از آنجایی که سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیوی نقش حیاتی در AKI دارند، ما آزمایش کردیم که آیا AhR می‌تواند در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای بیان شود یا خیر. نتایج ایمونوشیمی نشان داد که AhR عمدتاً در لوله های کلیوی بیان می شود (شکل 3C-D). علاوه بر این، مقاطع بافت کلیه با لکتین، نشانگر سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال، AhR و DAPI برای هسته رنگ آمیزی شدند. همانطور که در شکل 3E-F نشان داده شده است، AhR با لکتین ادغام شد، بنابراین نشان می دهد که AhR عمدتا در سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال بیان می شود. روی هم رفته، FICZ در برابر رابدومیولیز و AKI ناشی از I/R از طریق فعال‌سازی AhR در مصدوم محافظت می‌کند.کلیه ها.

FICZ تولید سیتوکین های پیش التهابی را در کلیه موش های AKI کاهش دادبرای ارزیابی اینکه آیا FICZ قادر به چرخش التهاب ناشی از AKI است، از q-PCR برای تشخیص سطوح رونویسی فاکتورهای پیش التهابی در کلیه ها استفاده شد. سطوح mRNA IL-1، IL{3}} و TNF- در بافت های کلیوی به طور قابل ملاحظه ای با تزریق گلیسرول یا آسیب I/R افزایش یافت، در حالی که تجویز FICZ به طور قابل توجهی این رونویسی های ژن را کاهش داد (شکل 4A). به طور مداوم، مدل سازی AKI افزایش IL-1، IL-6 و TNF- را به طور موثر با درمان FICZ کاهش داد (شکل 4B-C). این نتایج نشان داد که FICZ می تواند التهاب کلیه را در مدل سازی AKI کاهش دهد.

FICZ آپوپتوز سلولی را در کلیه موش های AKI کاهش دادعلاوه بر التهاب، آپوپتوز سلولی یکی دیگر از ویژگی های مهم در پاتوژنز AKI است. ما از رنگ‌آمیزی TUNEL برای بررسی اثر FICZ بر آپوپتوز کلیه در موش‌های I/R-القا شده استفاده کردیم. همانطور که در شکل 5B نشان داده شده است، FICZ به طور قابل توجهی تعداد سلول های TUNEL مثبت را کاهش داد.کلیه هااز موش های I/R. علاوه بر

نتایج رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی نشان داد که بیان کاسپاز بریده شده{0}}، یک جلاد حیاتی که پروتئین‌های مرتبط با آپوپتوز را اصلاح می‌کند، به طور قابل‌توجهی با تجویز FICZ در مدل رابدومیولیز کاهش یافت (شکل 5A). در همین حال، FICZ می‌تواند سطوح mRNA کاسپاز{3}} را در هر دو مدل رابدومیولیز و AKI ناشی از I/R کاهش دهد. علاوه بر این، نتایج وسترن بلات نشان داد که FICZ می‌تواند بیان کاسپاز شکافته شده-3 و Bax را کاهش دهد و سطح Bcl-2 را افزایش دهد.کلیه هاموش های AKI (شکل 5C). به طور خلاصه، این یافته‌ها نشان داد که FICZ اثرات ضد آپوپتوزی را در بدن نشان دادکلیه هاموش های AKI

FICZ سیگنالینگ NF-kB و JNK را در کلیه موش های AKI سرکوب کرد

فعال شدن مسیرهای سیگنالینگ بیشتر با تجزیه و تحلیل وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت تا مکانیسم ضد التهابی و ضد آپوپتوز FICZ درکلیه هاموش های AKI همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، سطوح فسفوریلاسیون IκB و P65 در کلیه موش های AKI آشکارا بیشتر از گروه های تحت درمان با FICZ بود. علاوه بر این، مطالعات قبلی روشن کردند که سیگنال دهی JNK می تواند آپوپتوز را تعدیل کند و با سیگنال دهی NF-kB تعامل داشته باشد. ما دریافتیم که فسفوریلاسیون JNK در مقایسه با گروه های کنترل مربوطه به طور قابل توجهی بالاتر بود، در حالی که درمان FICZ به طور موثر آنها را معکوس کرد. در بالا، این نتایج نشان داد که مسیرهای NF-kB و JNK به فعالیت ضد التهابی و ضد آپوپتوز FICZ در کلیه موش‌های AKI کمک می‌کنند.

FICZ با مهار التهاب و آپوپتوز، از سلول‌های HK{0}} در برابر تحریک میوگلوبین و آسیب H/R محافظت کرد.ما شهادت دادیم که آیا فعال‌سازی AhR توسط FICZ می‌تواند التهاب و آپوپتوز را در سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال انسانی (HK{1}}) تحریک‌شده با میوگلوبین سرکوب کند. اولاً، ما تأیید کردیم که بیان AhR در شرایط آزمایشگاهی در سلول‌های آسیب‌دیده با میوگلوبین یا H/R به طور قابل‌توجهی کاهش یافت، در حالی که آنها توسط FICZ معکوس شدند (شکل 7B-D). میزان آپوپتوز سلولی هر گروه در مدل میوگلوبین با فلوسیتومتری تشخیص داده شد (شکل 7A). در مقایسه با گروه کنترل، هیچ افزایشی در آپوپتوز و نکروز سلول‌های HK-2 در گروه FICZ مشاهده نشد. در مقابل، پس از تحریک میوگلوبین، سلول‌های HK{8}} تعداد زیادی سلول آپوپتوتیک را نشان دادند که 12.3 درصد را تشکیل می‌داد. در حالی که گروه Mb به علاوه FICZ سلول های آپوپتوز کمتری را نشان دادند. علاوه بر این، FICZ بیان کاسپازهای بریده شده{12}} و Bax را در سلول‌های HK{14}} تحریک‌شده با میوگلوبین یا H/R آسیب‌دیده کاهش داد (شکل 7BD). علاوه بر این، افزایش میوگلوبین یا H/R ناشی از عوامل پیش التهابی به طور قابل توجهی توسط FICZ معکوس شد (شکل 7B-D). به طور مداوم، سطوح فسفوریلاسیون P65 و JNK پس از تحریک میوگلوبین یا آسیب H/R به طور قابل توجهی بالاتر بود، در حالی که درمان FICZ به طور موثر آنها را کاهش داد (شکل 7B-D). بنابراین، آن نتایج نشان داد که آگونیست AhR FICZ از سلول‌های HK{23}} در برابر میوگلوبین و H/R از طریق مهار التهاب و آپوپتوز محافظت می‌کند.

بحث

در مطالعه حاضر، ما دریافتیم که آگونیسم AhR توسط FICZ می تواند کاهش یابدآسیب کلیهدر رابدومیولیز و AKI ناشی از ایسکمی/پرفیوژن مجدد AhR عمدتاً در سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال وجود داشت، در حالی که آگونیست AhR FICZ می توانست با تنظیم التهاب و آپوپتوز سلولی از طریق مسیرهای سیگنالینگ NF-kB و JNK از سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال در برابر AKI محافظت کند. مطالعات قبلی نشان داد که سموم اورمیک، مانند ایندوکسیل سولفات، آگونیست های AhR30 هستند. بیماران مبتلا به CKD در معرض آن سموم اورمیک قرار گرفتند، بنابراین AhR هم بیماران بستری و هم موش های مبتلا به CKD را فعال کرده است. یا متابولیسم اورمیک می‌تواند AhR33،34 را در کلیه‌های موش‌های CKD و موش‌ها فعال کند، که روندهای متفاوتی با یافته‌های ما در موش‌های AKI نشان دادند. با این حال، لیگاندهای متمایز برای AhR می‌توانند مسیرهای سیگنالینگ پایین‌دستی مختلف را تحت تأثیر قرار دهند. علاوه بر این، تحقیقات قبلی روی AKI نشان داد که لفلونوماید می‌تواند AhR را در AKI ناشی از I/R فعال کند و آسیب پاتولوژیک کلیه را از طریق تنظیم ایمنی و مهار التهاب بهبود بخشد.36 MiR{{ 11}}b AhR را از طریق مهار کننده AhR فعال کرد و از کلیه در برابر آسیب ناشی از سیس پلاتین محافظت کرد.آسیب کلیهاز طریق القای CYP1A1/2 وابسته به AhR در کبد. نتایج ما با این یافته های قبلی در مورد AKI مطابقت داشت. علاوه بر این، آگونیست AhR FICZ اثرات محافظتی در مدل های مختلف بیماری مانند سندرم متابولیک، 39 یووئیت خودایمنی، 22 کولیت، 23 پسوریاز، 24 و غیره اعمال کرد.

با توجه به نتایج اخیر Huang و همکاران، 22 مدل‌سازی یووئیت خودایمنی تجربی، مسیرهای NF-kB و STAT1/3 را فعال کرده و بیان عوامل پیش‌التهابی پایین‌دستی IL{6}}، IL{7}} و TNF را افزایش داد. - . در همین حال، آپوپتوز سلولی افزایش یافت. با درمان آگونیست AhR، کاهش بیان سیتوکین های پیش التهابی و مهار مسیر NF-kB یافت شد. فعال شدن AhR همچنین منجر به مهار آپوپتوز سلولی شد. این نتایج با آزمایش ما مطابقت داشت. آنها همچنین دریافتند که فعال سازی AhR قطبش ماکروفاژها را از M1 به M2 تغییر می دهد. این نشان داد که AhR ممکن است در تنظیم ایمنی شرکت کند، که توضیح احتمالی دیگری برای تنظیم سایتوکین های پیش التهابی پایین دست است. چندین گزارش از همبستگی منفی بین AhR و زیرواحد RelA (P65) بیان NF-κB در سلول‌های مختلف وجود دارد. رسوب همزمان با عصاره سلولی سلول های Hepa1c1c7 انجام شد. از آنجایی که هم AhR و هم NF-kB ممکن است تحت جابجایی هسته ای وابسته به سیگنال قرار گیرند، و ARNT با P65 مرتبط نیست، بنابراین فرض شد که ارتباط AhR و P65 عمدتاً در بخش سیتوپلاسمی است. AhR و NF-κB توسط فعال کننده های رونویسی مدوله می شوند. همانطور که قبلاً گزارش شده بود، همپوشانی نسبی بین فعال کننده های آنها وجود داشت. در نتیجه، می توان تصور کرد که ممکن است رقابت برای اتصال کواکتیواتور وجود داشته باشد، به طوری که وقتی یک مسیر فعال می شود، مسیر دیگر از طریق رقابت برای در دسترس بودن کواکتیواتور سرکوب می شود.41 همبستگی منفی دوباره توسط تحقیقات اپی ژنتیک تأیید شد. -κB بر JNK، احتمالاً از طریق گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) تأثیر می‌گذارد. ROS میتوکندری می‌تواند فعال‌سازی NF-kB را تقویت کند، و JNK به تولید ROS کمک می‌کند، که به نوبه خود فعال‌سازی JNK را تحریک می‌کند. اگرچه مکانیسم دقیق نیاز به بررسی بیشتر دارد، می توان فرض کرد که یک همبستگی مثبت بین مسیرهای NF-κB و JNK وجود دارد.

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

تحقیقات قبلی 43،44 نشان داد که در رابدومیولیز و AKI ناشی از I/R، التهاب و آپوپتوز سلولی در گروه‌های مدل‌سازی به طور قابل‌توجهی افزایش یافت، در عین حال مسیرهای NF-kB و JNK فعال شدند. این یافته ها با نتایج ما سازگار بود. مکانیسم های اصلی AKI شامل هیپوکسی، پاسخ استرس اکسیداتیو و التهاب بود. آنها می توانند باعث مرگ سلولی (آپوپتوز، اتوفاژی، نکروز) یا بازسازی بافت شوند. آسیب سلولی یا مرگ موادی با الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب (DAMPs) و الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPs) آزاد کرد که التهاب را بیشتر تشدید کرد. در ضمن مرگ سلولی از جمله آپوپتوز نیز در پاتوژنز AKI نقش داشت. عبارات خانواده کاسپازها تنظیم می شوند و تنظیم کننده های ضد آپوپتوز و پروآپوپتوز چندگانه مرتبط با میتوکندری در طول AKI تغییر می کنند. روی هم رفته، التهاب و آپوپتوز سلولی یکدیگر را ارتقا می دهند و هر دو نقش حیاتی در AKI دارند. ما دریافتیم که فعال‌سازی AhR توسط FICZ التهاب و آپوپتوز را از طریق مهار مسیرهای NF-kB و JNK کاهش می‌دهد.

با این حال، چندین مشکل باقی مانده است که باید بررسی شود. مطالعه ما عمدتاً به بررسی اثرات محافظت مجدد از فعال‌سازی AhR توسط FICZ و مکانیسم احتمالی آن در رابدومیولیز و AKI ناشی از I/R پرداخته است. علاوه بر این، ما از تجویز پیشگیرانه FICZ به موش‌ها قبل از مدل‌سازی AKI استفاده کردیم. اگرچه روش تجویز به طور گسترده در مطالعات قبلی مورد استفاده قرار می گرفت،49-51 اختلافاتی بین آزمایشات حیوانی و عملکرد بالینی وجود داشت. در آینده، چگونگی تغییر بیان AhR بر توسعه AKI و به طور خاص محلی سازی درون سلولی AhR به بررسی بیشتر نیاز دارد. در حالی که کاهش فسفوریلاسیون NF-kB و JNK تحت عمل FICZ واضح است، آزمایش‌های بیشتری در مورد عوامل مسدودکننده مربوطه مورد نیاز است. علاوه بر این، برای توضیح بهتر مکانیسم، موش های حذفی AhR و بیان بیش از حد برای مطالعه in vivo مورد نیاز هستند، در حالی که بیان بیش از حد و سکوت AhR برای مطالعه آزمایشگاهی مورد نیاز است. علاوه بر این، چگونگی تاثیر لیگاندهای مختلف بر مسیرهای سیگنال دهی مختلف AhR نیاز به کاوش بسیار بیشتری دارد.