اثرات حاد محافظ عصبی وابسته به دوز پلی (پرو{1}} استرادیول) در مدل موش آسیب کوفتگی ستون فقرات

چکیده

17 -استرادیول (E2) در مدل‌های بالینی آسیب نخاعی در صورت تجویز سیستمیک، محافظت عصبی ایجاد می‌کند. هدف از این مطالعه اعمال موضعی E2 به نخاع آسیب دیده با استفاده از بیومواد پلی (pro-E2) فیلم برای مدت طولانی بود.

همانطور که مردم بیشتر در مورد آسیب های نخاعی می آموزند، ما شروع به درک تأثیر آن بر سلامت جسمی و روانی افراد می کنیم. اگرچه آسیب های نخاعی می تواند اثرات نامطلوب زیادی ایجاد کند، اما خوشبختانه تأثیر آنها بر حافظه قابل کنترل است.

ابتدا باید روشن کنیم که آسیب نخاعی چیست. طناب نخاعی عصب محافظت شده در ستون فقرات است که وظیفه انتقال دستورالعمل ها از مغز به قسمت های مختلف بدن را بر عهده دارد. اگر نخاع آسیب ببیند، برخی از قسمت‌های بدن ارتباط خوب با مغز را از دست می‌دهند و در نتیجه حرکت اندام، حس و کنترل خودمختار تحت تأثیر قرار می‌گیرد.

آسیب های نخاعی ممکن است تأثیر خاصی بر حافظه افراد بگذارد، به ویژه در مراحل اولیه توانبخشی بیماران مبتلا به ضایعات نخاعی. آسیب های نخاعی ممکن است باعث کاهش توجه، حافظه کاری و توانایی پردازش عاطفی فرد شود که بر توانایی حافظه فرد تأثیر می گذارد.

با این حال، با انجام درمان توانبخشی، این اثرات منفی به تدریج کاهش می یابد. بیماران می توانند حافظه خود را با شرکت در بازی های حافظه و سایر آموزش های شناختی بهبود بخشند. در عین حال، توانبخشی فیزیکی نیز برای بازگرداندن عملکردهای حرکتی و حسی بدن و در نتیجه بهبود عملکردهای عاطفی و شناختی مفید است.

ما باید بیماران مبتلا به ضایعات نخاعی را تشویق کنیم تا فعالانه در درمان توانبخشی شرکت کنند و در آموزش توانبخشی برای بهبود سلامت جسمی و روانی ادامه دهند. لطفا باور داشته باشید که با کمک شناخت صحیح و درمان پس از عمل، بیماران می توانند بر تاثیر آسیب نخاعی بر حافظه غلبه کنند و به زندگی فعال خود ادامه دهند. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانچ می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد زیرا سیستانچ می تواند تعادل انتقال دهنده های عصبی مانند افزایش سطح استیل کولین و فاکتورهای رشد را که برای حافظه و یادگیری بسیار مهم هستند، تنظیم کند. علاوه بر این، سیستانچ همچنین می تواند جریان خون را بهبود بخشد و اکسیژن رسانی را بهبود بخشد، که می تواند اطمینان حاصل کند که مغز تغذیه و انرژی کافی را دریافت می کند و در نتیجه نشاط و استقامت مغز را بهبود می بخشد.

برای بهبود حافظه بر روی مکمل های بدانید کلیک کنید

به دنبال آسیب نخاعی در موش‌های نر بالغ، فیلم‌های پلی (pro-E2) به صورت ساب دورال کاشته شدند و محافظت عصبی با استفاده از ایمونوهیستوشیمی 7 روز پس از آسیب و کاشت ارزیابی شد. در این مطالعات، فیلم‌های پلی (pro-E2) به طور متوسط ​​محافظت عصبی را بدون تأثیر بر پاسخ التهابی بهبود بخشیدند. در مقایسه با گروه شاهد.

برای افزایش دوز آزاد شده E2، فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس با ترکیب E2 غیر متصل در فیلم‌های پلی (proE2) ساخته شدند.

با این حال، در مقایسه با گروه شاهد آسیب دیده، فیلم های پلی (pro-E2) آزاد کننده بولوس به طور قابل توجهی محافظت عصبی را افزایش ندادند یا التهاب را در 7 یا 21 روز پس از آسیب محدود کردند. کار آینده بر روی تولید مواد زیستی پلی (pro-E2) متمرکز خواهد شد که قادر به به طور دقیق تر، دوزهای درمانی E2 را آزاد می کند.

مقدمه

آسیب نخاعی تروماتیک (SCI) یک وضعیت ناتوان کننده است که سالانه بیش از 18،{1}} نفر را در ایالات متحده تحت تاثیر قرار می دهد، در حالی که شیوع جهانی SCI بین 236 تا 1009 در میلیون تخمین زده می شود.

بیماران مبتلا به SCI دچار نقایص عصبی شدید از جمله از دست دادن حس، اختلال در عملکرد روده/مثانه، و فلج می شوند. تأثیر اولیه بر نخاع منجر به مرگ نورون در محل آسیب می شود که توسط چندین آبشار آسیب ثانویه شامل آستروسیت ها و ماکروفاژها تشدید می شود. .

با گذشت زمان، این آستروسیت ها یک اسکار گلیال را تشکیل می دهند که از گسترش آکسون ها به خارج از لبه ضایعه جلوگیری می کند. تا به امروز هیچ داروی محافظت کننده عصبی مورد تایید FDA برای درمان SCI وجود ندارد.

تحقیقات چندین دهه بر روی تجویز سیستمیک مولکول های زیستی برای جلوگیری از از دست دادن نورون ها به دلیل آسیب ثانویه و/یا ترویج بازسازی آکسون متمرکز شده است که در نهایت منجر به بازیابی عملکرد از دست رفته می شود. هورمون جنسی، 17 -استرادیول (E2).

تجویز E2 به طور گسترده برای سیستم عصبی مرکزی با کاهش التهاب مفید است، 7-9 کاهش واکنش سلول های گلیال، 10 محدود کردن استرس اکسیداتیو، 11-14 و کاهش مرگ نورون اکسیتوتوکسیک ناشی از گلوتامات. 15 E2 بهبود عملکردی در مدل های مختلف جوندگان SCI را بهبود می بخشد. 16،17 جالب توجه است، تجویز سیستمیک چند دوز E2 باعث بهبود عملکرد سریعتر می شود.18،19 در مقایسه با حیواناتی که تنها یک دوز دریافت می کنند.

از آنجایی که E2 بهبود عملکردی را به طور مؤثرتری از طریق رژیم‌های دوز چندگانه ترویج می‌کند، هدف ما آزادسازی پایدار E2 به صورت موضعی در محل آسیب (برای جلوگیری از هرگونه اثرات خارج از هدف) برای دور زدن مشکلات ناشی از دوزهای متعدد / تزریق‌های سیستمیک E2 بود.

برای این منظور، ما از یک استراتژی بیومتریال پلی (پیش دارو) استفاده کردیم که در آن داروی بومی (E2) ابتدا با گروه‌های آلیل واکنش‌پذیر عامل‌دار شد و سپس از طریق افزودن رادیکال تیول-ان با نور شروع به کار با دی‌تیول الیگو (اتیلن گلیکول) انعطاف‌پذیر پلیمریزه شد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد. .20 ما زنجیره های پلیمری با وزن مولکولی بالا را به دست آوردیم که از یک پیش داروی E2 به عنوان واحد تکرار شونده در پلیمر تشکیل شده است.

پس از تجزیه هیدرولیکی، پلیمر به تدریج E2 را در محیط اطراف آزاد می کند. تنها محصولات جانبی دیگر از این انتشار دی اکسید کربن و الیگو (اتیلن گلیکول) (oEG) (شکل 1) است. .20

E2 آزاد شده از این داربست های پلی (pro-E2) زیست فعال است و این داربست ها با محافظت از نورون ها در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از پراکسید هیدروژن، نوروتروفیسم و ​​محافظت عصبی را در شرایط آزمایشگاهی ارتقا می دهند. در اینجا، ما فیلم‌های پلی (pro-E2) را در یک مدل موش کوفتگی SCI، بلافاصله پس از آسیب اعمال کردیم و قابلیت محافظت عصبی آنها را در داخل بدن ارزیابی کردیم.

طرح اولیه پلی (pro-E2) ما محافظت عصبی را به طور حاد (7 روز پس از آسیب) در محل آسیب بدون تأثیر بر پاسخ التهابی افزایش داد. از آنجایی که فیلم poly(pro-E2) نانوگرم های E2 را در روز منتشر می کند، ما استراتژی انتشار دیگری را توسعه دادیم که در آن unboundE2 در ماتریس پلی (pro-E2) گنجانده شد. ما فرض کردیم که انتشار بولوس E2 غیرمجاز ممکن است مزایای محافظتی عصبی اضافی را ارائه دهد.

لایه‌های Poly (pro-E2) E2 را به صورت انفجاری منتشر کردند و به دنبال آن آزادسازی پایدار E2 از پلیمر در غلظت‌های پایین‌تر انجام شد. رنگ‌آمیزی ایمونوهیستولوژیک نورون‌ها، آستروسیت‌ها و ماکروفاژها/میکروگلیاهای موجود در محل آسیب را به صورت حاد (7 روز پس از آسیب) و مزمن (21 روز پس از آسیب) پس از SCI در حضور این فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس ارزیابی کرد.

نتایج و بحث

فیلم‌های Poly (pro-E2) E2 را در غلظت‌های نانومولار آزاد می‌کنند، رشد سلول‌های عصبی را از گانگلیون ریشه پشتی تقویت می‌کنند و از نورون‌ها در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از پراکسید هیدروژن در شرایط آزمایشگاهی محافظت می‌کنند. مطالعه ارائه‌شده در اینجا به دنبال تعیین توانایی پلی (pro-E2) است. فیلم هایی برای ارائه محافظت عصبی در داخل بدن با استفاده از مدل موشی کوفتگی SCI.

SCI کوفتگی متوسط ​​در موش های نر بالغ ایجاد شد و بلافاصله پس از آسیب، فیلم های پلی (pro-E2) مستقیماً بالای آسیب قرار داده شد (شکل 2A). برای اطمینان از باقی ماندن فیلم های پلی (pro-E2) پس از کاشت، فیلم های پلی (pro-E2) با رودامین B در نخاع حیوانات آسیب دیده کاشته شد. هفت روز پس از کاشت، طناب نخاعی جمع آوری و با استفاده از میکروسکوپ نوری تصویربرداری شد (شکل 2B). در همه حیوانات، فیلم‌های پلی (pro-E2) بارگذاری‌شده با رودامین B کاشته‌شده در تأیید مکان پروتکل کاشت باقی ماندند.

برای آزمایش توانایی لایه‌های پلی (pro-E2) در ارائه محافظت عصبی و کاهش التهاب، فیلم‌های پلی (pro-E2) (بدون رودامین B) به دنبال آسیب کوفتگی نخاعی کاشته شدند و طناب‌های نخاعی 7 روز پس از آسیب و کاشت جمع‌آوری شدند. بخش‌های طولی (ضخامت 10 میکرومتر) بریده شد، در اطراف مرکز آسیب متمرکز شد و برای تجسم نورون‌ها و ماکروفاژها در نخاع علامت‌گذاری شد (شکل 3).

بخش‌ها برای ارزیابی حضور نورون‌ها برای NeuN برچسب‌گذاری شدند و تجزیه و تحلیل کمی رنگ‌آمیزی نشان داد که لایه‌های poly (pro-E2) به طور قابل‌توجهی ناحیه مثبت NeuN را در اطراف مرکز آسیب در مقایسه با کنترل‌های آسیب‌دیده که ایمپلنت فیلم دریافت نکردند، افزایش دادند (شکل 3A؛ p.=0.0002). رنگ آمیزی اضافی برای آکسون ها با استفاده از NFH (زنجیره سنگین نوروفیلامنت) همچنین اثر محافظت کننده عصبی حاد فیلم های پلی (pro-E2) کاشته شده را نشان داد (شکل 3B؛ p=0.0017).

ما مشاهده کردیم که این تغییر در محافظت عصبی به دلیل تغییر در آپوپتوز (کاسپاز 3) در محل آسیب نیست (تصویر پشتیبانی کننده S1؛ p=0.9966). رنگ آمیزی برای ماکروفاژهای فعال شده (CD68) نیز هیچ موردی را نشان نداد. تفاوت قابل توجهی بین حیوانات تحت درمان با پلی (pro-E2) و حیوانات درمان نشده (شکل 3C؛ p{9}}.7207).

در مجموع، فیلم‌های پلی (pro-E2) به طور متوسط ​​محافظت عصبی را بدون تغییر پاسخ التهابی افزایش می‌دهند. فیلم‌های Poly (pro-E2) تراکم عصبی را تقریباً 20٪ افزایش می‌دهند، اما این فیلم‌ها اثرات ضد التهابی آشکاری نداشتند (بر اساس کمیت منطقه اشغال شده توسط ماکروفاژهای فعال شده) (شکل 3).

این عدم کاهش التهاب ممکن است نشان دهد که دوزهای ضد التهابی و محافظت کننده عصبی E2 متمایز هستند و هر دو با فرمول فیلم فعلی به دست نیامده اند.20 ما فرض کردیم که افزایش انتشار E2 از فیلم های poly(pro-E2) به طور حاد ممکن است التهاب را کاهش دهد. و پاسخ محافظت عصبی قوی تر را فعال می کند.

برای افزایش دوز E2 آزاد شده به طور حاد، فیلم های پلی (pro-E2) اصلاح شدند تا انتشار بولوس E2 بلافاصله پس از کاشت اتفاق بیفتد. پس از انتشار بولوس E2، تخریب پلیمر به انتشار E2 در همان غلظت قبلی ادامه می یابد. آزمایشی که در بالا توضیح داده شد با استفاده از این فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس تکرار شد و محافظت عصبی و التهاب در 7 روز پس از آسیب (dpi) ارزیابی شد.

با این حال، به جای یک مزیت اضافی، فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس، ناحیه مثبت NeuN را به طور قابل‌توجهی در مقایسه با گروه شاهد آسیب‌دیده و درمان‌نشده افزایش ندادند (شکل 4A؛ p=0.6770). فیلم های پلی (proE2) آزاد کننده بولوس بیان CD68 را افزایش دادند، اما این افزایش از نظر آماری متفاوت نبود (p{8}}.1780).

روند افزایشی در واکنش‌پذیری گلیال و التهاب میکروگلیال نیز در حضور فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس به دلیل افزایش بیان GFAP (آستروسیت‌ها) و Iba1 (میکروگلیا) مشاهده شد. با این حال، این افزایش ها از نظر آماری بیشتر از آنچه در افراد آسیب دیده، شاهد درمان نشده مشاهده شد، بیشتر نبود (به ترتیب 3053.30. در مجموع، فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس، محافظت عصبی را افزایش ندادند، و واکنش‌پذیری آستروسیت‌ها و حضور ماکروفاژ/میکروگلیا همانطور که در ابتدا فرض شد کاهش پیدا نکرد.

از آنجایی که تفاوت بین حیوانات آسیب دیده، درمان نشده و حیوانات آسیب دیده با فیلم پلی (proE2) آزاد کننده بولوس در نقطه زمانی حاد 7 dpi مشاهده نشد، یک نقطه زمانی مزمن برای بررسی بیشتر از فیلم های پلی (pro-E2) انتخاب شد. می تواند E2 را به مدت طولانی آزاد کند. 20 آزمایشی که در بالا توضیح داده شد با فیلم های بولوس آزاد کننده پلی (pro-E2) تکرار شد، اما حیوانات به طور مزمن در dpi 21 ارزیابی شدند (شکل 5).

طناب نخاعی برای همان نوع سلولی که قبلاً ذکر شد برچسب گذاری شد. پس از تجزیه و تحلیل، تمایل به افزایش در کسر ناحیه NeuN در حیوانات کاشته شده با فیلم پلی (pro-E2) آزاد کننده بولوس در مقایسه با حیوانات آسیب دیده و درمان نشده وجود داشت (شکل 5A؛ p=0.0897). علاوه بر این، روندهایی مشاهده شد که در آن فیلم‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس، کسر ناحیه بیان CD68 و GFAP را در مقایسه با داده‌های کنترل‌های حیوان آسیب دیده درمان‌نشده کاهش دادند (شکل 5B, C؛ p{12}}.0859 و p.=0.2780).

با این حال، هیچ یک از روندها از نظر آماری متفاوت نبود. از سوی دیگر، بخش‌های بافتی برچسب‌گذاری‌شده با Iba1 از حیوانات تحت درمان با پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس، بیان بیشتری را در مقایسه با داده‌های کنترل‌های آسیب‌دیده و درمان‌نشده نشان دادند (0001/0 < {{4}). کار قبلی ما نشان می‌دهد که poly(pro -E2) فیلم‌های ریخته‌شده بر روی ورقه‌های پوششی 15 میلی‌متر × 15 میلی‌متر، حدود 266 نانوگرم E2 در روز آزاد می‌کنند، که معادل 2 نانوگرم E2 در روز از فیلم‌های (1 میلی‌متر × 1.8 میلی‌متر) مورد استفاده در اینجا است. لایه‌های پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس، 40 میکروگرم اضافی E2 غیرمجاز را پس از کاشت به طور حاد آزاد می‌کنند.

تحقیقات با تمرکز بر روی استفاده از E2 در مدل‌های SCI جوندگان نشان می‌دهد که استروژن با دوز پایین (10 میکروگرم بر کیلوگرم) به‌صورت داخل وریدی تجویز می‌شود گلیوز واکنشی را کاهش می‌دهد و محافظت عصبی را در حین تضعیف رویدادهای التهابی، مهار آپوپتوز و افزایش رگ‌زایی ایجاد می‌کند. عوارض جانبی که شامل افزایش نرخ ترومبوز ورید عمقی و سرطان 22،23 و ایجاد صفات فیزیکی زنانه در مردان است. این نکته قابل توجه است زیرا بیشتر تحقیقات E2 بر انتقال E2 به صورت سیستمیک به صورت داخل وریدی یا داخل صفاقی متمرکز شده است.

با توجه به نگرانی های ایمنی در مورد استفاده سیستمیک از دوزهای بالای E2، بهینه سازی غلظت E2 برای تحویل موضعی به نخاع آسیب دیده برای جلوگیری از عوارض جانبی مهم است. تا به امروز، تنها یک مطالعه E2 را از یک ماده زیستی با استفاده از نانوذرات برای انتقال کانونی E2 (2.5 ug یا 25 ug) تحویل داده است. رها شدن از نانوذرات به سرعت التهاب را در یک مدل موش کوفتگی SCI کاهش داد. فقدان پاسخ آماری معنی‌دار در داده‌های ما (شکل‌های 4 و 5) ممکن است به دلیل عدم تعادل در مقدار E2 باشد که به صورت موضعی به نخاع می‌رسانیم. Toomuch E2 (40 ug) به طور حاد منتشر می شود در حالی که مقدار بسیار کمی (2 نانوگرم) به صورت مزمن منتشر می شود.

اگرچه آنچه ما از این داده‌ها مشاهده می‌کنیم روندهای متوسطی هستند، این مطالعه اهمیت دوز E2 را برای ارتقای محافظت عصبی در داخل بدن نشان می‌دهد. کاهش دوز اولیه E2 و تنظیم سینتیک تخریب ماده زیستی پلی (pro-E2) می تواند به کاهش این مشکل کمک کند و به طور بالقوه نتایج محافظت عصبی بهتری را ارائه دهد.

اگرچه این مطالعه صرفاً در مردان انجام شد، ارزیابی تأثیر این فیلم‌های پلی (pro-E2) در هر دو جنس برای ایجاد پتانسیل ترجمه معتبر برای این بیوماد ضروری است. تحقیقات نشان داده است که به دنبال SCI، افزایش سطح استروژن در زنان ممکن است تا حدی مسئول نتایج عملکردی بهبود یافته در مقایسه با مردان باشد. بر این اساس سینتیک را آزاد کنید تا اطمینان حاصل شود که دوز تحویلی برای مردان و زنان یکسان باقی می ماند.

روش ها

ساخت فیلم های پلی (طرفدار E2).

پلیمر پلی (pro-E2) P1 سنتز شد و همانطور که قبلاً به تفصیل توضیح داده شد، مشخص شد. فیلم‌های پلی (pro-E2) با حل کردن پلیمر در کلروفرم (5 درصد وزنی، پلیمر/کلروفرم)، ریخته‌گری محلول بر روی ورقه‌های شیشه‌ای 15 میلی‌متر × 15 میلی‌متر (100 میکرولیتر محلول در هر ورقه پوششی)، و ترک آن‌ها ساخته شدند. برای خشک شدن یک شبه در خلاء (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
برای ایجاد لایه‌های پلی (pro-E2) با E2 بدون اتصال، فیلم‌ها با افزودن E2 غیرمجاز (Abcam, Cambridge, MA) به محلول پلیمری (0.0625 wt %/wt؛ E2/chloroform) قبل از ریخته‌گری ساخته شدند. محلول روی ورقه های پوششی قبل از کاشت، ورقه های پوششی با فیلم با استفاده از اشعه ماوراء بنفش (UV) به مدت 30 دقیقه استریل شدند و فیلم ها از روکش ها در یک کابینت ایمنی زیستی استریل جدا شدند. فیلم های پلی (pro-E2) سپس به قطعات 1 میلی متر × 1.8 میلی متر برش داده شدند که برای کاشت در موش بالغ به شرح زیر مناسب است.

کوفتگی آسیب نخاعی و کاشت فیلم های پلی (pro-E2).

تمام روش‌های مراقبت‌های جراحی و بعد از عمل توسط موسسه پلی‌تکنیک Rensselaer و کمیته‌های مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه ایالتی اوهایو (IACUC) تایید شده‌اند. برای القای کوفتگی نخاعی، موش‌های نر بالغ C57BL/6 (10- تا 12- هفته‌ای)، که از آزمایشگاه جکسون (شماره انبار 000664؛ Bar Harbor، ME) خریداری شده بودند، با تزریق داخل صفاقی بی‌هوش شدند. کتامین (80 میلی گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی گرم بر کیلوگرم). پشت حیوانات تراشیده و با استفاده از اتانول 70 درصد و بتادین به صورت آسپتیک تهیه شد.

پس از قرار دادن حیوان بر روی یک پد حرارتی که در دمای 37 درجه نگهداری می شد، لایه های پوست و عضله برای نمایان شدن ستون مهره ها باز شد و لامینکتومی پشتی بر روی مهره نهم قفسه سینه (T9) برای نمایان شدن نخاع انجام شد. یک کوفتگی متوسط ​​(75 kdyn) SCI در این سطح با استفاده از ضربه‌گیر افق بی‌نهایت (سیستم‌های دقیق و ابزار دقیق، لکسینگتون، KY) القا شد.

پس از رسیدن به هموستاز، سخت‌شکم باز شد (شکل 2) و فیلم پلی (pro-E2) یا یک فیلم پلی (pro-E2) آزادکننده بولوس (1 میلی‌متر × 1.8 میلی‌متر) در زیر سخت‌شکم و بالای طناب نخاعی قرار داده شد و پوشش داده شد. محل آسیب در حیوانات شاهد، دورا باز شد اما فیلم های پلی (pro-E2) کاشته نشدند. لایه‌های ماهیچه‌ای با استفاده از نخ‌های استریل بسته شدند و پوست با استفاده از گیره‌های فلزی استریل بسته شد.

موش ها 2 میلی لیتر سالین استریل را به صورت زیر جلدی دریافت کردند و به قفس خود بازگردانده شدند و یک شبه روی لام گرمگر 37 درجه قرار گرفتند. برای اطمینان از هیدراتاسیون مناسب و جلوگیری از عفونت، به موش‌ها روزانه 1 تا 2 میلی‌لیتر سالین استریل و جنتوسین (1 میلی‌گرم/کیلوگرم) برای 5 روز اول پس از آسیب (dpi) به صورت زیر جلدی تزریق شد. مثانه ها دو بار در روز در طول مدت آزمایش به صورت دستی بیان می شدند. همه حیوانات تحت شرایط معمولی در یک چرخه نور تا تاریکی 12-ساعته با دسترسی آزادانه به غذا و آب در خانه بودند.

برداشت بافت.

در نقاط پایانی تعیین‌شده 7 یا 21 dpi، به موش‌ها یک دوز کشنده کتامین/گزیلازین (دوز جراحی 1.5×) تزریق شد و به صورت ترانس‌کاردیال با محلول سالین بافر بافر مفسفات (PBS؛ pH 7.4) 0 پرفیوژن شد. به دنبال آن 4% پارافورمالدئید (PFA؛ pH 7.4) قرار گرفت. طناب‌های نخاعی برداشته شدند، به مدت 2 ساعت در 4% PFA ثابت شدند و سپس به مدت یک شب به بافر فسفات 0.2M (PB؛ pH 7.4) منتقل شدند.

طناب‌های نخاعی در ساکارز 30 درصد به مدت 48 ساعت در دمای 4 درجه انجماد محافظت شدند و سپس در بخش‌های 10 میلی‌متری در مرکز محل آسیب با ستون‌های پشتی رو به بالا مسدود شدند. این مقاطع در محیط دمای برش بهینه Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) جاسازی شدند و به سرعت روی یخ خشک منجمد شدند. تمام نخاع ها در 10 میکرومتر بر روی یک کرایوستات Microm HM505E برش داده شدند که روی اسلایدهایColorFrost Plus Scientificsher, Ther Waltham، MA)، و سپس در دمای 20- درجه نگهداری می شود تا برای رنگ آمیزی ایمنی استفاده شود.

ایمونوهیستوشیمی و کمی سازی

اسلایدها به مدت 1 ساعت روی لام گرمگر ذوب شدند و سپس 3 بار در 0.1 MPBS شستشو داده شدند. فعالیت پراکسیداز درون زا با انکوبه کردن لام ها در 6% H2O2 رقیق شده در متانول به مدت 15 دقیقه در RT خاموش شد. پس از شستشوی 3 بار در 0.1 M PBS، بخش ها با 4% BSA و 0.1% Triton X-100 در 0}.1 M PBS برای 1 انکوبه شدند. ساعت پس از آن انکوباسیون یک شبه آنتی بادی های اولیه در 4 درجه یا RT (جدول 1).

اسلایدها با آنتی بادی های ثانویه بیوتینیله مناسب (1:1000؛ Vector Laboratories, Burlingame, CA) در RT به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. برای تجسم آنتی بادی متصل، اسلایدها به مدت 1 ساعت با Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) انکوبه شدند و با ImmPACT3،3'-diaminobenzidine (DAB) یا بستر Vector SG (Vector Laboratories) به مدت 10 دقیقه توسعه یافتند.

این برش ها از طریق جوجه کشی متوالی 2×2 دقیقه در اتانول 70 درصد و 90 درصد، 2×3 دقیقه در اتانول 100 درصد، پس از آن 3×3 دقیقه در هیستوکلر خشک شدند و در نهایت با Permount (ThermoFisher Scientific) پوشانده شدند. شش بخش در هر حیوان، با فاصله 100 میکرومتر از یکدیگر در نخاع آسیب دیده، برای تجزیه و تحلیل کمی استفاده شد.

مقاطع دارای برچسب ایمنی با استفاده از یک میکروسکوپ تصویربرداری Axioplan 2 مجهز به دوربین AxioCamdigital و نرم افزار AxioVision نسخه 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany) و یک شیئ 5× تصویربرداری شدند.

تعداد پیکسل های مثبت در هر یک از بخش ها با استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل تصویر MIPAR (MIPAR، Worthington، OH) برای محاسبه درصد کسر سطح مثبت در هر بخش، شمارش شد. میانگین درصد مساحت مثبت شش بخش به ازای هر حیوان برای هر یک از لکه ها محاسبه و گزارش شد.

تجزیه و تحلیل آماری.

همه داده ها به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد گزارش می شوند. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار آماری GraphPad Prism 9 (نرم افزار GraphPad, San Diego, CA) انجام شد. در تمام آزمایش‌ها، 5 تا 6 حیوان در هر گروه مورد استفاده قرار گرفتند که از حداقل دو لات‌های مختلف جانوری سرچشمه می‌گرفتند. برای آزمون تفاوت بین گروه فیلم کنترل و پلی (pro-E2)، از آزمون t-test دانشجویی (شکل های 3، 4 و 5) استفاده شد. معنی‌داری در p کمتر یا برابر با 0.05 تعیین شد.

مواد تکمیلی

برای مطالب تکمیلی به نسخه وب در PubMed Central مراجعه کنید.

قدردانی

نویسندگان از ونمین لای برای کمک او در جراحی های موش تشکر می کنند.

تامین مالی

این کار از کمک هزینه تحصیلی بنیاد کریگ اچ. نیلسن (Grant 468116) و کمک هزینه تحصیلی کهنه سربازان فلج آمریکا (Grant 3171) به MKG و از NIH R01 (Grant NS092754) و کمک هزینه نخاعی ایالت نیویورک به انجمن حمایت از آسیب نخاعی ایالت نیویورک دریافت کرد. تمام کارهای حیوانی با کمک بخش جراحی مغز و اعصاب دانشگاه ایالتی اوهایو با پشتیبانی NINDS Grant P30NS104177 انجام شد.

مراجع

(1). مرکز ملی آمار ضایعات نخاعی. (2020) حقایق و ارقام آسیب نخاعی در یک نگاه، دانشگاه آلاباما در بیرمنگام، بیرمنگام، AL.

(2). Cripps RA، Lee BB، Wing P، Weerts E، MacKay J و Brown D (2011) یک نقشه جهانی برای اپیدمیولوژی آسیب نخاعی تروماتیک: به سوی یک مخزن داده زنده برای پیشگیری از آسیب. نخاع. 49، 493-501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) آسیب نخاعی - گذشته، حال و آینده. مجله Spinal Cord Medicine 30، 85-100.

(4). Pickelsimer E، Shiroma EJ و Wilson DA (2010) بررسی سراسری شرایط بهداشتی نامطلوب پزشکی در افراد مبتلا به آسیب نخاعی. J. Spinal Cord Med. 33 (3)، 221-231. [PubMed: 20737795]

(5). سیلور جی و میلر جی اچ (2004) بازسازی فراتر از اسکار گلیال. نات. کشیش نوروسی. 5 (2)، 146-156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK، Das A، Wallace G، Barry J، Vertegel AA، Ray SK و Banik NL (2013) آسیب نخاعی: مروری بر درمان فعلی، درمان‌های آینده، و مرزهای علوم پایه. Neurochem. Res. 38، 895-905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M, and Beyer C (2018) استروژن بیان و فعال شدن التهاب موضعی را پس از آسیب نخاعی کاهش می دهد. مول. نوروبیول. 55 (2)، 1364-1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY، Choi HY، Ju BG و Yune TY (2018) استروژن با مهار میکروگلیا و فعال شدن آستروسیت، درد نوروپاتیک ناشی از آسیب نخاعی را کاهش می‌دهد. بیوشیم. بیوفیز. اکتا، مول. پایه دیس. 1864 (7)، 2472-2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A, and Banik N (2015) نانوذرات استروژن در آسیب نخاع موش باعث اثرات ضد التهابی سریع در پلاسما، مایع مغزی نخاعی و بافت می شود. Neurotrauma 32 (18)، 1413-1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA، Samantaray S، Das A، Smith J، Matzelle DD، Ray SK و Banik NL (2010) درمان استروژن پس از جراحت آسیب مزمن نخاع عملکرد حرکتی را در موش‌ها بهبود می‌بخشد. J. Neurosci. Res. 88 (8)، 1738-1750. [PubMed: 20091771]

(11). هوندا K، Shimohama S، Sawada H، Kihara T، Nakamizo T، Shibasaki H، و Akaike A (2001) انتقال سیگنال ضد آپوپتوز غیر ژنومیک توسط استروژن در نورون های قشر مغز کشت شده. J.Neurosci. Res. 64 (5)، 466-475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA، Wingrave JM، Matzelle DD، Ray SK و Banik NL (2003) استروژن به عنوان یک عامل محافظت کننده عصبی در درمان آسیب نخاعی. ان آکادمی نیویورک علمی 993،125-133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com