اثرات ضد آلرژیک و ضد التهابی نفرین بر روی RBL{2}}H3 Cell Plus

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

3. بحث

پاتوژنز درماتیت آتوپیک (AD) به طور کامل شناخته نشده است، اما این بیماری توسط یک پاسخ ایمنی غیرطبیعی گلوبولین ایمنی E (IgE) در اختلال عملکرد سد پوستی ایجاد می شود. در میان آنها، ماست سل ها (MC) می توانند باعث بیماری های آلرژیک با واسطه IgE، از جمله AD شوند. هنگامی که ماست سل ها فعال می شوند، ذرات سیتوپلاسمی متصل به غشاء خود را آزاد می کنند که منجر به آزاد شدن انواع مولکول ها می شود. این مولکول ها نقش مهمی در پاتوژنز AD و دفاع میزبان دارند [27]. از آنجایی که مهار فعال سازی یا گرانولاسیون ماست سل به تنظیم واکنش های حساسیت مفرط مختلف با واسطه IgE کمک می کند، ماست سل ها یکی از اهداف ایده آل برای کشف داروهای ضد حساسیت هستند. در مطالعه ما، ماست سل ها در پاسخ به ترکیب 48/80 و یونوفور کلسیم A23187 و ضد DNP/IgE به علاوه DNP/HSA گرانوله می شوند. ما دریافتیم که مرجع به طور موثری اثر دگرانولاسیون ماست سل ها را مهار می کند و واکنش ضد آلرژیک آن را نشان می دهد. علاوه بر این، افزایش کلسیم داخل سلولی و فعال شدن MAPK توسط مرجع مهار شد. علاوه بر این، نفوذ ماست سل پوست ناشی از DNCB و رفتار خراش ناشی از ترکیب 48/80 نیز کاهش یافت. بنابراین مکانیسم درماتیت ضد آتوپیک نفرین اثر چند برابری بر روی کراتینوسیت ها و ماست سل ها دارد.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo، pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) و در ناکارآمدی پوست پوست. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan، liberan sus particulas citoplásmicas unidas a la membrana، lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogenesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda یک متغیر منظم واکنش‌های حساسیتی رسانه‌ای برای IgE، los mastocitos son uno de los objetivos ideales برای کاوش در زمینه‌های ضد آلرژیک. En nuestro estudio، los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187، y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referenceia inhibió efectivamente el efecto desgranulación de los mastocitos، mostrando su reacción antialérgica. Además، el aumento de calcio intracellular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referenceia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto، el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

سیتوپلاسم ماست سل های موجود در بافت ها با ذرات بزرگ و متراکم واسطه های التهابی از پیش ساخته شده پر شده است[28]. فرآیند آزادسازی این واسطه ها از گرانول های ترشحی در ماست سل ها را دگرانولاسیون می گویند. از آنجایی که مهار دگرانولاسیون ماست سل می تواند واکنش های حساسیت مفرط مختلف با واسطه IgE را تنظیم کند، ماست سل ها یکی از اهداف ایده آل برای کشف داروهای ضد حساسیت هستند [29،30]. نتایج ما نشان می‌دهد که مرجع بدون توجه به استفاده از آنتی‌ژن، محرک گیرنده یا یونوفور، تأثیر بسیار خوبی بر دگرانولاسیون ماست سل‌ها دارد. این نشان می دهد که مرجع یک عامل بالقوه ضد آلرژی است (شکل 2).

همه گرانول های از پیش ذخیره شده، واسطه های تازه سنتز شده و حتی گرانول ها و اجزای آنها می توانند به عنوان شاخص فعال سازی MC استفاده شوند [31]. علاوه بر این، روش استاندارد اندازه گیری غلظت Ca4t درون سلولی است. بسیاری از ترشح کننده های MC (مثلا آنتی ژن، ترکیب 80/48) که به طور کلی در آزمایشگاه استفاده شده اند باعث افزایش غلظت Ca2 داخل سلولی می شوند. در واقع، افزایش غلظت کلسیم داخل سلولی به علاوه می‌تواند باعث دگرانولاسیون MC شود. معمولاً افزایش Ca4t درون سلولی با فعال کردن MC با ترکیباتی مانند پمپ‌های تاپسیگارگین (به‌ویژه بلوک سارکو/آندوپلاسمی Ca2 به اضافه ATPase، SERCA) و یونوفورها (یعنی یونومایسین و A23187) القا می‌شود [32،33]. بنابراین، در فعال‌سازی MC وابسته به Ca2t، اندازه‌گیری هجوم Ca2t نیز روشی برای تعیین شرایط فعال‌سازی MC در نظر گرفته می‌شود. در تحقیقات MC، Fura{15}} به طور گسترده برای تعیین تغییرات Ca2 داخل سلولی بعلاوه استفاده می‌شود. در آزمایش‌های خود، متوجه شدیم که شدت فلورسانس ماست سل‌های فعال شده پس از درمان با مرجع به طور قابل‌توجهی سرکوب شد (شکل 3). گزارش های قبلی نشان داد که افزایش غلظت Ca4t درون سلولی مطابق با آزادسازی هیستامین بود [34]. بنابراین، ما استنباط می کنیم که آزادسازی هیستامین نیز با درمان مرجع مهار می شود. آزمایشات بیشتر برای تأیید این فرضیه ضروری است.

ماست سل ها خروجی های عملکردی متفاوتی دارند.دوز cistanche redditاینها شامل دگرانولاسیون، تشکیل پیش سازهای اسید آراشیدونیک، کموتاکسی و تولید سیتوکین است و همه بدون توجه به محرک ها تا حدی به سیگنال های کلسیم وابسته هستند. 35]. تولید سیتوکین ها توسط ماست سل های فعال شده نتیجه القای رونویسی ژن سیتوکین در این سلول ها است. تحریک ماست سل ها منجر به فعال شدن NF-kB و AP{3}} و تولید بسیاری از سیتوکین ها می شود [36]. مسیرهای سیگنالینگ آبشاری MAPK نقش اساسی در تنظیم بیان سیتوکین ها دارند. فعال شدن این مسیرها از طریق فعال سازی PKC توسط PI منجر به فعال شدن ژن های مختلف از جمله ژن های سیتوکین های التهابی مانند IL-1، IL{7}} و TNF می شود [37]. مطالعات اخیر ما نشان داده است که مرجع می تواند سیتوکین های آزاد شده توسط فعال شدن کراتینوسیت ها را مهار کند. در همان زمان، ما همچنین دریافتیم که فعال‌سازی مسیر MAPK نیز با درمان مرجع مهار می‌شود [18]. در مطالعه فعلی ما نشان دادیم که مرجع ممکن است بیان سایتوکین ها را از طریق مهار فعال سازی MAPK در ماست سل ها کاهش دهد (شکل 4 و 5). فعال شدن NFkB نیز به دلیل مهار فعال سازی MAPK کاهش می یابد (شکل 6).

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

تعدادی از مطالعات گزارش کرده‌اند که انواع سیتوکین‌ها در بیماران مبتلا به AD افزایش می‌یابد که منجر به اختلال عملکرد سد پوستی می‌شود، از جمله سیتوکین‌های ترشح شده توسط کراتینوسیت‌ها و سیتوکین‌های مشتق از Th{0} [38،39]. علاوه بر این، گزارش شده است که این سیتوکین‌های ترشح شده همچنین می‌توانند بیان پروتئین‌های اتصال محکم (T]) و ژن‌های تمایز انتهایی، از جمله فیلاگرین (FLG)، لوریکین (LOR) و اینولوکرین (IVL) را کاهش دهند [39،40] ]بیان (Pro)فیلاگرین در AD کاهش می یابد و به طور معکوس با MC تریپتاز و IL در ارتباط است{6}}[41]. IL{8}} واسطه التهاب مزمن در موش‌های دارای سد پوستی مختل می‌شود [35]. در مطالعه قبلی، گزارش شد که بیان FLG، IVL، و LOR پس از استفاده از DNCB بر روی پوست پشتی موش‌های NC/Nga کاهش یافت[42،43]. در مطالعه حاضر، بیان FLG، IVL و LOR به طور قابل توجهی در پوست پشتی گروه کنترل کاهش یافت که نشان داد سد اپیدرمی مختل شده است. تجویز مرجع به طور قابل توجهی باعث کاهش بیان FLG، IVL و LOR پس از درمان DNCB شد، در حالی که تجویز مرجع کمی بیان IVL و LOR را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد (شکل 8). مشخص شده است که ترکیب 48/80 یک فعال کننده موثر ماست سل های پوست است. پاسخ پوست تحریک شده توسط ترکیب 48/80 ممکن است با آزاد کردن هیستامین از ماست سل ها، رفتار خاراندنی را القا کند [44]. هیستامین آزاد شده از ماست سل های فعال شده نقش مهمی در افزایش نفوذپذیری عروق ناشی از ترکیب 48/80 ایفا می کند. در هنگام خارش انسان، هیستامین آزاد شده از ماست سل ها از طریق محرک های مختلف نیز مورد توجه قرار می گیرد. به عنوان یک میانجی مهم بنابراین، مهار دگرانولاسیون ماست سل ها گام مهمی در تنظیم ترشح هیستامین در حین رفتار خاراندن است. در این ترکیب مطالعه 80/48 باعث فعال سازی موثر ماست سل های پوستی شد. با این حال، پیش تیمار با مرجع به طور قابل توجهی سطح دگرانولاسیون ماست سل ها را کاهش داد (شکل 2).فواید عصاره سیستانچاین نتایج نشان می دهد که اثر رفتاری ضد خراش مرجع ممکن است به دلیل کاهش نفوذپذیری عروقی با تنظیم دگرانولاسیون ماست سل ها باشد (شکل 9).

به طور کلی ثابت شده است که بیماران مبتلا به AD از اختلال عملکرد سد پوستی، التهاب پوست یا هر دو رنج می برند، بنابراین یافتن روش های درمانی مناسب دشوار است. بنابراین معمولاً درمان ترکیبی توصیه می شود. تحقیقات اخیر ما ثابت کرده است که هرگز عملکرد تعدیل کننده سیستم ایمنی و توانایی ترمیم سد ندارد. بنابراین، یک ویژگی مهم مرجع در درمان AD در آینده، حفظ عملکرد پوست و بهبود آبرسانی پوست و ترمیم سد است. مرجع همچنین می تواند رفتار خاراندن ناشی از آلرژن ها و محرک ها را کاهش دهد. علاوه بر این، مارش آتوپیک یک بیماری مرتبط با پدیده است که گام به گام رخ می دهد و پیشرفت می کند. درماتیت آتوپیک اغلب در دوران نوزادی دیده می شود. آلرژی غذایی اغلب پس از 1-2سالگی رخ می دهد. رینیت آلرژیک اغلب می تواند قبل و بعد از مدرسه شروع شود. علائم آسم در زمان های مختلف ظاهر می شود، اما بیشتر آنها بعد از رینیت آلرژیک است. پس از دوران کودکی، درماتیت آتوپیک و برخی آلرژی های غذایی ممکن است بهبود یا ناپدید شوند. رینیت آلرژیک و آسم به راحتی قابل درمان نیستند [45،46]. بنابراین، آنها پدیده های همبود در بیماری ها هستند. محصولات طبیعی از جمله منابع دارای پتانسیل درمانی همبودی هستند و اثربخشی آنها در بیماری های مرتبط ارزش مطالعه در آینده را دارد.

4. مواد و روش ها

4.1. سلول های لوسمی بازوفیل موش صحرایی

سلول های لوسمی بازوفیل موش (RBL-2H3) هدیه ای از TLHwang، دانشگاه چانگ گونگ، تائویوان، تایوان بود. سلول‌های RBL{2}}H3 ماست سل‌های مخاطی هستند که برای مطالعه گرانولاسیون ناشی از آنتی ژن یا یونوفور کلسیم، Ca4t درون سلولی و انتقال سیگنال استفاده می‌شوند [29]. سلول ها در EMEM حاوی 10 درصد FBS، با پنی سیلین و استرپتومایسین در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 کشت داده شدند. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) و سرم جنین گاوی (FBS) از Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM، نیویورک، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

4.2.MTT Assay

برای اندازه گیری از روش 3-(4,5-دی متیل تیازول-2-یل)-2،5-دی فنیل-2H-tetrazolium bromide (MTT) استفاده می شود. فعالیت متابولیک سلول ها سلول‌های RBL{8}}H3 در یک صفحه کشت چاهی با ابعاد 5 × 10 بعلاوه /چاه کاشته شدند. پس از 24 ساعت درمان دارویی، 30 میکرولیتر MTI به هر چاهک اضافه شد و به مدت {16} ساعت در انکوباتور سلولی 37 درجه قرار گرفت، سپس کریستال‌های فورمازان بنفش با DMSO حل شدند. برای اندازه گیری شدت جذب در طول موج 550 نانومتر به عنوان تست زنده ماندن سلول از دستگاه الایزا ریدر استفاده شد.

4.3. اندازه گیری سطح Ca2 داخل سلولی

[Ca2t] من با فورا-2 همانطور که قبلاً توضیح داده شد اندازه‌گیری شد[47]. سلول‌های RBL{3}}H3 در IMDM حاوی 5 uM Fura 2-AM و 1.2 میلی‌مولار CaClz در دمای 37 درجه مجدداً معلق شدند. 30 دقیقه. پس از بارگذاری Fura{11}}، کراتینوسیت ها پلت شده و در DMEM تازه معلق شدند. مقدار کمی (2 میلی‌لیتر) به یک کووت همزن حاوی 1.2 میلی‌مولار CaClz منتقل شد. فورا{15}}فلورسانس کلسیم در طول موج‌های تحریک 340 و 380 نانومتر (طول موج انتشار، 505 نانومتر در هر کین‌متر{19 LS) مورد سنجش قرار گرفت. }} اسپکتروفلورومتر (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). داده ها در فواصل 5 ثانیه ثبت شد[47].

4.4. واکنش زنجیره ای پلیمری کمی (qPCR)

سلول‌های RBL{{{0}}}در یک ظرف کشت 3.5 سانتی‌متری کاشته شدند. پس از رشد 90 درصدی سلول ها، سلول ها به مدت 24 ساعت در حالت ایستا رشد کردند. پس از اینکه سلول ها به مدت 20 دقیقه با مرجع پیش تیمار شدند، به ترتیب با TNF-a/IFN-y برای 1 یا 24 ساعت تحریک شدند. سلول ها خراشیده شدند، سانتریفیوژ شدند (16،{12}}×g، 10 دقیقه، 4 درجه)، و مایع رویی استخراج شد. RNA با استفاده از کیت جداسازی RNA کل (GeneDirex@، Vegas، NV، ایالات متحده آمریکا) خالص شد. با توجه به روش کار کیت سنتز cDNA اسکریپت (BIO-RAD)، معرف ها به ترتیب اضافه شدند و مطابق با شرایط مشخص شده برای تبدیل RNA به cDNA عمل کردند. علاوه بر این، از PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) استفاده شد. در مجموع 7.5 uL ddH20،2 uL cDNA، 0.25 μLof پرایمرهای جلو و معکوس، و 10 UL SYBR GREEN اضافه شده و به طور یکنواخت مخلوط شدند. توالی پرایمر در جداول 1 و 2 نشان داده شده است. سپس RNA با استفاده از سیستم Real-time PCR ABI StepOnePlus TM اندازه گیری شد.

4.5. تست وسترن بلات

وسترن بلات برای تجزیه و تحلیل تغییرات پروتئین های مختلف در سلول ها استفاده می شود. سلول‌های RBL{{0}}}}}H3 در یک ظرف کشت 3.5 سانتی‌متری کاشته شدند. پس از اینکه سلول ها به 90 درصد پر شدند و به مدت 24 ساعت گرسنه ماندند، آنها به مدت 20 دقیقه با مرجع پیش تیمار شدند و سپس با TNF-a یا IFN-y به ترتیب به مدت 30 دقیقه یا 1 ساعت تحریک شدند. پس از خراش دادن، آنها توسط اولتراسوند پودر شده و سانتریفیوژ شدند (13200 دور در دقیقه، 10 دقیقه، 4 درجه). پس از سانتریفیوژ، مایع رویی گرفته شد و پروتئین با کیت سنجش پروتئین پیرس (Pierce, Rockford, IL, USA) اندازه‌گیری شد. بر روی ژل SDS-پلی آکریل آمید 10 درصد الکتروفورز شد و سپس با غشاء PVDF الکتروپوره شد. پس از تکمیل انتقال، غشای PVDF در محلول TBS-T (Tris-buffered saline/0.05% tween 20) حاوی 5 درصد پودر شیر بدون چربی قرار داده شد و برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی به مدت 1 ساعت تکان داده شد. سپس از TBS-T برای شستشو 3 بار و هر بار 10 دقیقه استفاده شد. سپس آنتی بادی های اولیه (رقت 1:1000) اضافه شده و در دمای 4 درجه یک شب قرار داده شد و سپس هر 10 دقیقه 3 بار با TBS-T شسته شد. پس از افزودن آنتی بادی های ثانویه (رقیق شده 1:1000) به مدت 1 ساعت، غشاء PVDF 3 بار با TBS-T به مدت 10 دقیقه هر بار شستشو شد. در نهایت، توسعه دهنده اضافه شد و غشاء در یک سیستم استخراج لومینسانس شیمیایی (BIOSTEP Celvin") برای عکسبرداری قرار گرفت.

4.6. Dinitrochlorobenzene(2,{3}}Dinitrochloroben2ene, DNCB) التهاب پوستی شبیه درماتیت آتوپیک ناشی از در موش

ابتدا موش ها به چهار گروه تقسیم شدند: گروه کنترل، گروه DNCB (گروه منفی)، مرجع (3 میلی گرم بر کیلوگرم و 1{2}} میلی گرم بر کیلوگرم) با گروه DNCB، و دگزامتازون (0.2 میلی گرم بر کیلوگرم) با گروه DNCB (گروه مثبت). دگزامتازون یک هورمون کورتیکواستروئیدی است که می تواند تورم و واکنش های آلرژیک را کاهش دهد. در این آزمایش in vivo، هم مرجع و هم دگزامتازون در DMSO حل شدند، در حالی که DNCB در اتانول 75 درصد با شوک اولتراسونیک حل شد. اولی با تزریق داخل صفاقی و برای دومی 100 میکرولیتر روی پوست پشت و 20 میکرولیتر به گوش راست اعمال شد. سه روز قبل از آزمایش، موش ها بیهوش شدند و موهای پشت آن برداشته شد و یک آهنربای اندازه گیری کوچک (SCT-MAG-TF) در پشت پای پشتی موش تعبیه شد.سیستانچ چنگیز خانپس از سه روز استراحت، تایید شد که موش‌ها در وضعیت جسمانی خوبی قرار داشتند و پوست ناحیه اپیلاسیون پشتی نرمال بود و آزمایش شروع شد. در طول آزمایش، عکس هایی برای ثبت تغییرات ظاهری پوست گرفته شد. مرحله اول ({0}} روز) دوره درماتیت آتوپیک آلرژیک بود. پس از اندازه‌گیری مقادیر پایه موش‌های گروه DNCB، گروه آزمایشی مرجع (3 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و DNCB، و دگزامتازون 0.2 میلی‌گرم بر کیلوگرم و گروه آزمایشی DNCB، 1 درصد DNCB به طور یکنواخت روی پوست پشت اعمال شد. گوش راست. در روز پنجم، داروی مرجع و دگزامتازون به صورت داخل صفاقی تزریق شد. مرحله دوم (روز 5 تا 14) القای مجدد درماتیت آتوپیک بود.افزایش عمر cistancheدر 3 گروه تجربی، 5/5 درصد DNCB به طور یکنواخت روی پوست پشت و گوش راست موش آغشته شد. روز بعد، مقادیر فیزیولوژیکی پوست و تصاویر گرفته شد و ثبت شد. پس از اینکه موش ها با دی اکسید کربن بیش از حد (CO2) در روز پانزدهم معدوم شدند، بافت پوست پشتی برای تجزیه و تحلیل تجربی بعدی برداشته شد.

4.7. ترکیب 48/80-رفتار خراشیدن القا شده در موش‌های BALB/c

موهای پوست پشت موش بریده شد و 20 میکرولیتر محلول ترکیب 48/80 به صورت داخل جلدی تزریق شد. موش های کنترل به جای آن تزریق سالین دریافت کردند. بلافاصله پس از تزریق، حیوان در یک قفس مشاهده (قطر 11 سانتی متر، MicroAct، Neuroscience، توکیو، ژاپن) قرار گرفت و رفتار خراش دادن موش به طور خودکار و عینی شناسایی و ارزیابی شد. رفتار خراش برای 60 دقیقه اندازه‌گیری شد. MicroAct از پارامترهای تجزیه و تحلیل زیر برای تشخیص امواج مربوط به رفتار خراش مداوم موش ها استفاده می کند: آستانه، 0.05 ولت. فاصله رویداد، 0.05 ثانیه; حداقل مدت زمان، 0.25 ثانیه; حداکثر فرکانس، 30 هرتز؛ حداقل فرکانس، 5 هرتز 4.8. تجزیه و تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار Sigma-Plot (نسخه 1{2}}.0) استفاده شد.cistanche nzداده ها به صورت میانگین ± SEM، با (*) و (#) به عنوان یادداشت بیان می شوند. معنی‌داری آماری داده‌ها با استفاده از آزمون‌های t-test بدون جفت و دو دنباله Student مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقادیر p کمتر از 0. 5 و 0.01 معنی‌دار در نظر گرفته شد.

5. نتیجه گیری ها

در این مطالعه، ما تعیین کردیم که مرجع به طور موثری از دگرانولاسیون ماست سل ها جلوگیری می کند و بیان سایتوکاین های پیش التهابی را کاهش می دهد، که می تواند علائم مشابه درماتیت آتوپیک را کاهش دهد، سد پوستی را بازیابی کند و خراش پوست را کاهش دهد. ما همچنین ثابت کرده‌ایم که مرجع نه تنها می‌تواند روی کراتینوسیت‌های پوست تأثیر بگذارد، بلکه بر فعال شدن ماست سل‌ها نیز تأثیر می‌گذارد. پتانسیل بیشتری برای کاربرد در بیماری های پوستی آلرژیک و التهابی دارد.

این مقاله از Int استخراج شده است. جی. مول. علمی 2021، 22، 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms