پتانسیل آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد پیری عصاره Kalmia Angustifolia و شناسایی برخی از ترکیبات اصلی قسمت 1

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:پیری پوست مشهودترین عنصر فرآیند پیری است که باعث نگرانی بسیاری برای بسیاری از افراد می شود. گیاهانی از خانواده Ericaceae عموماً دارای خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی هستند که آنها را به مواد فعال ضد پیری بالقوه تبدیل می کند. این مطالعه با هدف ارزیابی ایمنی و اثر ضد پیری عصاره کلمیا آنگوستیفولیا با استفاده از جایگزین‌های بازسازی‌شده پوست انجام شد. ارزیابی ایمنی با استفاده از سنجش 3-(4،5-دی متیل تیازولیل-2)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) انجام شد، در حالی که اثربخشی با ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد التهابی و تجزیه و تحلیل جایگزین های پوست بازسازی شده بر اساس روش خودآرایی با بافت شناسی و رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس (الاستین، کلاژن{11}}، کلاژن-3، آکواپورین{13}}) تعیین می شود. . سنجش بقای سلولی ایمنی عصاره را در غلظت حداکثر 200 میکروگرم در میلی لیتر ثابت کرد. سنجش ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن (ORAC) و یک سنجش مبتنی بر سلول با استفاده از 2'،7'-دی کلروفلورسین-دی استات (DCFH-DA) یک فعالیت آنتی اکسیدانی قوی با مقدار ORAC 16 میکرومول ترولوکس و معادل نیم در متر را نشان داد. حداکثر غلظت مهاری (IC50) 0.02±0.37 میکروگرم در میلی لیتر، در حالی که یک فعالیت ضد التهابی جالب در مهار تولید NO با درصد مهار تولید NO 2±49 درصد در 80 میکروگرم در میلی لیتر یافت شد. جداسازی و خصوصیات عصاره امکان شناسایی ترکیباتی را فراهم کرد که می‌توانند مسئول این فعالیت‌های بیولوژیکی باشند، با دو مورد از آنها برای اولین بار در K.ساقه سیستانچAngustifolia: avicularia و epicatechin-(2 -O-7، 4 -6)-ent-epicatechin. تجزیه و تحلیل بافت شناسی جایگزین های پوستی تحت درمان با عصاره افزایش ضخامت پوستی را در مقایسه با گروه شاهد نشان داد. عصاره K. Angustifolia بیان الاستین و کلاژن{6}} را افزایش داد که معمولاً با پیری پوست کاهش می‌یابد. این نتایج نشان می دهد که K. Angustifolia دارای اثربخشی آنتی اکسیدانی و پتانسیل ضد پیری امیدوارکننده است.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

کلید واژه ها: جایگزین های پوست پیری پوست؛ محصولات طبیعی؛ عناصر فعال؛ لورل گوسفند; فعالیت آنتی اکسیدانی؛ فعالیت ضد التهابی؛ مهندسی بافت

1. مقدمه

پیری پوست یک فرآیند فیزیولوژیکی طبیعی است که برای بسیاری از افراد نگران کننده است. این اولین "نشانه قابل مشاهده افزایش سن و انحطاط پوست است. بنابراین، فرمولاسیون ضد پیری: محصولات آرایشی در چند سال اخیر به دلیل تمایل به محدود کردن این ظاهر پیری اهمیت پیدا کرده اند. پیری پوست با مشخصه های آن مشخص می شود. تغییرات متعدد در سطح بیولوژیکی، که شامل کاهش تکثیر سلولی، در نتیجه آتروفی اپیدرم، و کاهش اجزای پوستی مانند فیبروبلاست ها و الاستین و فیبرهای کلاژن و در نتیجه کاهش ضخامت پوست در افراد مسن است [1،2] جنگل شمالی مملو از منابع ناشناخته با پتانسیل زیاد برای توسعه مواد فعال آرایشی است.مزایا و عوارض جانبی cistanche tubulosaاین گیاه بومی شرق آمریکای شمالی است اما عمدتاً در جنگل‌های شمالی کانادا یافت می‌شود. نشان می دهد که این گیاه دارای خواص ضد التهابی است [4]. گیاهان مختلف از خانواده Ericaceae نیز دارای خواص ضد التهابی و آنتی اکسیدانی هستند که آنها را به مواد فعال آرایشی جالب تبدیل می کند. ترکیب شیمیایی K.angustifolia هنوز به خوبی مستند نشده است. برخی از مطالعات ترکیبات سمی مانند گرایانوتوکسین‌ها را شناسایی کرده‌اند که در صورت بلعیدن برای انسان سمی هستند، اما به ندرت کشنده هستند، و آربوتین (4-hydroxyphenyl -D-glucopyranoside)، یک مهارکننده تیروزیناز که در برگ‌های K. Angustifolia یافت می‌شود. و به عنوان یک عامل رنگدانه استفاده می شود [5-8]. علیرغم این ترکیبات سمی بالقوه موجود در K. Angustifolia، تحقیقات دیگر نیز ثابت کرده است که فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک، تانن ها و ترپن ها به وفور در گیاه یافت می شوند [9-15]. برخی از این ترکیبات دارای فعالیت‌های بیولوژیکی جالبی هستند و بنابراین می‌توانند به K. Angustifolia یک اثر ضد پیری امیدوارکننده مانند سایر گیاهان بدهند.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

حتی اگر نیاز به تولید محصولات آرایشی و پوستی جدید وجود داشته باشد که به جلوگیری از پیری پوست کمک کند، قوانین جدید ممنوعیت یا محدود کردن آزمایش بر روی حیوانات در صنعت آرایشی، انجام این کار را دشوارتر می‌کند. بنابراین، گزینه های دیگری برای آزمایش اثربخشی محصول مورد نیاز است. استفاده از کشت های سلولی آزمایشگاهی یا جایگزین های پوستی، جایگزین خوبی برای غربالگری مواد آرایشی است. چندین مدل توسط مرکز اروپایی اعتبارسنجی روش‌های جایگزین (ECVAM، Ispra، ایتالیا) تایید شده‌اند و به صورت تجاری به شرکت‌های آرایشی فروخته می‌شوند تا آزمایش‌های ایمنی را انجام دهند و از رنج غیرضروری ناشی از استفاده از حیوانات جلوگیری کنند [16،17] . با این حال، اکثر مدل‌های تجاری موجود تنها یک اپیدرم متمایز را نشان می‌دهند و فاقد تعامل بین کراتینوسیت‌ها و فیبروبلاست‌ها هستند [16]. مدل‌های تمام ضخامت جدیدی در چند سال اخیر پدیدار شده‌اند و از جمله، امکان بررسی مسیرهای پیری و ترکیبات ضد پیری را فراهم کرده‌اند و آنها را به ابزارهای مفیدی برای جایگزینی استفاده از حیوانات در زمینه آرایشی تبدیل کرده‌اند [18،19].عصاره cistanche tubulosaهدف از این مطالعه، ابتدا ارزیابی فعالیت بیولوژیکی عصاره K. Angustifolia بر روی تک لایه های سلولی کشت شده و سپس ارزیابی پتانسیل ضد پیری این عصاره با استفاده از جایگزین های پوستی بازسازی شده بر اساس روش خودآرایی بود [20،21]. . نقطه قوت این مدل جایگزین پوست این است که فاقد مواد خارجی است و به توانایی اسید اسکوربیک برای ترویج تولید ماتریکس خارج سلولی توسط فیبروبلاست‌های پوستی تکیه می‌کند و این مدل را کاملاً انسانی می‌سازد.بررسی cistanche tubulosaاین مطالعه یک ماده فعال جدید را ارائه می دهد که می تواند در محصولات آرایشی و بهداشتی استفاده شود و استفاده از مدل های آزمایشگاهی را به عنوان جایگزینی در تحقیقات آرایشی پیشنهاد می کند.

2. مواد و روشها

2.1. تهیه مواد گیاهی و عصاره

K.angustifolia در 2 می015 در منطقه Lac-St-Jean در کبک، کانادا برداشت شد. این گیاه توسط M. Patrick Nadeau شناسایی شد و یک نمونه کوپن (شماره QFA0617265) در هرباریوم لوئیس ماری دانشگاه لاوال، اوبک، کانادا سپرده شد. قسمت های هوایی K.angustifolia (2.1 کیلوگرم) با استفاده از آسیاب برش Fritsch Pulverisette 25 (Fritsch, Laval, QC, Canada) آسیاب شد و تحت رفلاکس با اتانول بی آب (1.5L، سه بار) و EtOH-H2O3:1 استخراج شد. 1.5 لیتر، دو بار). عصاره‌های به‌دست‌آمده پس از اولین استخراج (در EtOH و EtOH-H, O) فیلتر و با هم ترکیب شدند. پس از تبخیر EtOH در خلاء، فاز آبی با دی کلرومتان (DCM، CHCl؛ 300 میلی لیتر، پنج بار) و اتیل استات (EtOAc؛ 300 میلی لیتر، پنج بار) تقسیم شد. فاز EtOAc تحت فشار کاهش یافته تا خشکی تبخیر شد تا عصاره K.angustifolia بدست آید (6/222 گرم، 6/10 درصد). یک روز قبل از تیمارها، عصاره به صورت پودر در دی متیل سولفوکسید (DMSO؛ Sigma، Oakville، ON، کانادا) حل شد تا محلول استوک به دست آید و سپس تا زمان نیاز در درجه {22}} نگهداری شد. غلظت مورد نظر K.angustifolia با رقیق کردن محلول استوک (12.5 یا 25 میلی گرم در میلی لیتر) به طور مستقیم در محیط کشت در روز آزمایش به دست آمد. غلظت نهایی DMSO 0.2 درصد (ofo) به منظور جلوگیری از سمیت حلال بود.

2.2. جداسازی ترکیبات اصلی عصاره K. Angustifolia

از عصاره EtOAc که قبلاً توضیح داده شد، 3{32} گرم توسط کروماتوگرافی روی ستون Diaion (Mitsubishi Chemicals, Charlotte, NC, USA) با استفاده از MeOH/H2O به عنوان شوینده در شرایط گرادیان (4{46}} درصد) جدا شد. 50 درصد، 60 درصد، 70 درصد و 100 درصد)، چهار کسر غنی شده (AD) را به دست می دهد. کسر B (2 گرم) در معرض یک ستون سیلیکاژل (200 گرم) قرار گرفت و با شرایط گرادیان MeOH-DCM از 5 درصد تا 15 درصد شسته شد تا چهار فراکسیون (B{13}} B4) به دست آید. کسر C (6 گرم) نیز در معرض یک ستون سیلیکاژل (300 گرم) قرار گرفت و با شرایط گرادیان MeOH-DCM از 5 درصد تا 25 درصد شسته شد تا هفت فراکسیون (C{20}}C7) بدست آورد. کسر C3 (500 میلی گرم) با کروماتوگرافی فاز معکوس بر روی یک ستون C18 (120 گرم، FLH-R33230B-IS120 SiliaSepTM C18، سیلیسیکل، کبک، QC، کانادا) با استفاده از 0.1 درصد اسید فرمیک در H، O-Me از H، O-Me خالص شد. 40 تا 60 درصد چهار زیربخش به دست آمد: C3A-C3D، با C3B، و C3C با خلوص بالا، حاوی ترکیبات اصلی. کسر C4 (2g) نیز با کروماتوگرافی فاز معکوس بر روی ستون C18 با استفاده از 0.1 درصد اسید فرمیک در H2O-MeOH از 30 درصد به 45 درصد خالص شد. سه بخش فرعی از جداسازی به دست آمد: C4A-C4C، با C4A و C4C با خلوص بالا، حاوی هر یک از یک ترکیب واحد. کسر D (8.7 گرم) تحت ستون های سیلیکاژل (200×2 گرم) قرار گرفت و با شرایط گرادیان CHCl{61}}MeOH (15:1;10:1;5:1) شسته شد تا هشت فراکسیون (D) بدست آید. 1-D8). کسرهای D1 تا D4 هر کدام یک ترکیب اصلی را ارائه کردند.

2.3. تجزیه و تحلیل NMR و GC-MS

طیف‌های تشدید مغناطیسی هسته‌ای (NMR) با طیف‌سنج Bruker Avance 400 (Bruker, Milton, ON, Canada) در 400 مگاهرتز برای هسته‌های H و 100 مگاهرتز برای هسته‌های 13C با استفاده از کلروفرم دوتره (CDCl3ODolanth) ثبت شد. به عنوان حلال تغییرات شیمیایی در ppm نسبت به پیک باقیمانده حلال گزارش شده است. طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (HRMS) بر روی یک طیف‌سنج جرمی Agilent 6224 MS-TOF (Agilent، Saint-Laurent، QC، کانادا) مجهز به منبع الکترواسپری ثبت شد.

2.4.بیوپسی و استخراج سلولی

کراتینوسیت‌ها و فیبروبلاست‌های اولیه از نمونه‌برداری از جراحی‌های کوچک کردن سینه به‌دست آمدند. اهداکنندگان زنان قفقازی با سن 18 تا 52 سال بودند. کراتینوسیت ها و فیبروبلاست ها از بیوپسی ها با استفاده از روش جداسازی که قبلا توضیح داده شد [22،23] استخراج شدند. بیوپسی ها در ترمولیزین در دمای 4 درجه به مدت 16 ساعت انکوبه شدند تا اپیدرم از درم جدا شود. پس از آن، کراتینوسیت ها با استفاده از تریپسین به مدت 30 دقیقه از اپیدرم جدا شدند، در حالی که فیبروبلاست ها با استفاده از کلاژناز به مدت 4 ساعت از درم جدا شدند. سپس سلول ها به پاساژ مورد نظر کشت داده شدند. کراتینوسیت ها در پاساژ 1 و فیبروبلاست ها در پاساژ 4 مورد استفاده قرار گرفتند.

2.5. کشت سلولی

فیبروبلاست‌های اولیه (گذر 4) در 4×103 سلول در سانتی‌متر مربع کاشته شدند و در محیط Eagle Modified Dulbecco (DMEM) همراه با 1{20}} درصد سرم FB Essence (FBI؛ Seradigm، Salt Lake City) کشت شدند. ، UT، ایالات متحده)، 100 UI/ml پنی سیلین G (Sigma، Oakville، ON، کانادا)، و 25ug/ml جنتامایسین (Gemini، West Sacramento، CA، USA). کراتینوسیت‌های اولیه (گذر 1) در 4×103 سلول در سانتی‌متر مربع بر روی یک لایه تغذیه‌کننده از فیبروبلاست‌های موشی تابش‌شده 3T3 کاشته شدند و در ترکیبی از DMEM با Ham's F12 به نسبت 3:1 (DMEMH) و با 5 درصد کلون جنینی کشت شدند. Ⅱ سرم (Hyclone, Scarborough, ON, Canada）, 5 ug/mL انسولین ( Sigma, St. Louis, MO, USA）, 0.4 ug/ml hydrocortisone （Galen-ova, Saint-Hyacinthe, QC, Canada) 0.21 / میلی لیتر ایزوپروترنول هیدروکلراید (ساندوز کانادا، بوچرویل، QC، کانادا)، 10 نانوگرم در میلی لیتر فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (EGF؛ استرالیا بیولوژیکی، سان رامون، CA، ایالات متحده)، 100 UI / میلی لیتر پنی سیلین G (Sigma، Oakville، ON، کانادا) ) و 25 میکروگرم در میلی لیتر جنتامایسین (جمینی، وست ساکرامنتو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا). کشت سلولی در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر 8 درصد دی اکسید کربن (CO2) انکوبه شدند. محیط کشت سلولی هر دو روز یکبار و در مجموع 3 بار در هفته تعویض شد.

2.6. سنجش سمیت سلولی

سمیت عصاره K.angustifolia بر روی کراتینوسیت های اولیه با استفاده از یک {{0}}(4,{2}}دی متیل تیازولیل-2)-2،{{5} ارزیابی شد. سنجش }دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT). سنجش MTT یک سنجش رنگ سنجی است که بر اساس احیای آنزیمی نمک تترازولیوم زرد (MTT) به کریستال های فورمازان بنفش است. این واکنش آنزیمی توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری در سلول های فعال متابولیکی کاتالیز می شود. بنابراین، برای ارزیابی زنده ماندن سلول بر اساس فعالیت متابولیک سلولی استفاده می شود. به طور خلاصه، در روز 0، کراتینوسیت‌های موجود در P3 از اهداکنندگان سالم در 5×103 سلول/چاه در یک صفحه چاهک روی یک لایه تغذیه‌کننده از فیبروبلاست‌های موشی 3T3 تابیده شده قرار گرفتند. در روز 2، درمان اضافه شد. در روز 4، رنگ MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide، Sigma، St. Louis، MO، USA) با غلظت 0.5 میلی گرم بر میلی لیتر در سالین استریل بافر فسفات (PBS)1X به پلیت اضافه شد. سپس پلیت به مدت 3 ساعت (37 درجه، 8 درصد CO) انکوبه شد و فرمازان با محلول تازه ایزوپروپانول و اسید هیدروکلریک (HCl) استخراج شد. جذب در 570 نانومتر با استفاده از یک میکروپلیت خوان (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA) خوانده شد. 2.7. سنجش ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن (ORAC).

به منظور ارزیابی خواص آنتی اکسیدانی عصاره K.angustifolia، یک سنجش ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن (ORAC) همانطور که توسط Ou و همکارانش توضیح داده شد انجام شد. با برخی تغییرات [24]. به طور خلاصه، سنجش در یک 384-چاه صفحه بر روی صفحه خوان Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, USA) انجام شد. غلظت‌های مختلف Trolox (6-هیدروکسی-2، 5،7،8-تترا متیل کرومان-2-کربوکسیلیک اسید؛ آنالوگ ویتامین E) برای ایجاد یک منحنی استاندارد به ترتیب آماده شد. برای مقایسه نمونه های آزمایشی با این کنترل مثبت. آزمایش در دمای 37.5 درجه و نیم 7.4 با نمونه خالی به صورت موازی انجام شد.cistanche انگلستانپس از افزودن دی هیدروکلراید 2،2'-azobis (2-amidino-propane) فلورسانس فلورسین هر 60 ثانیه با فلورومتر ثبت شد. فلورسانس در طول موج تحریک 485 نانومتر و طول موج انتشار 538 نانومتر اندازه‌گیری شد. نتایج با استفاده از تفاوت بین نواحی زیر فروپاشی فلورسین از منحنی خالی و نمونه محاسبه شد. نتایج برای مقادیر ORAC در میکرومول معادل Trolox (TE) در میلی گرم (μmol TE/mg) یا میکرومول TE در هر میکرومول (umol TE/mol) بیان شد.

2.8. ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی با استفاده از روش مبتنی بر سلول

فعالیت آنتی اکسیدانی با یک روش مبتنی بر سلول با استفاده از 2'، 7/-دی کلروفلورسئین-دی استات (DCFH-DA) همانطور که توسط Girard-Lalancete و همکاران با برخی تغییرات [25] توصیف شد، ارزیابی شد. به طور خلاصه، فیبروبلاست‌های WS1 پوست انسان (ATCC⑧ CRL-1502، Manassas، VA، USA) به مدت 60 دقیقه با 100 میکرولیتر 5μM DCFH-DA در محلول نمک متعادل هنکس (HBSS، HyClone، Marlborough، MA، انکوبه شدند) . سپس برای ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره، سلول ها به مدت 60 دقیقه با افزایش غلظت عصاره K.angustifolia و کنترل مثبت (کوئرستین و ترولاکس) انکوبه شدند. برای تنش اکسیداتیو، 100 میکرولیتر از 400 میکرومولار ترت بوتیل هیدروپراکسید (t-BuOOH) اضافه شد تا غلظت نهایی 200 میکرومولار t-BuOOH در چاه ها به دست آید. سپس فلورسانس بلافاصله و پس از 90 دقیقه با استفاده از صفحه‌خوان خودکار Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems, Milford, MA, USA) اندازه‌گیری شد. فلورسانس در طول موج تحریک 485 نانومتر و طول موج انتشار 538 نانومتر ارزیابی شد. فعالیت آنتی اکسیدانی به عنوان درصد مهار اکسیداسیون DCFH بیان شد.

2.9. ارزیابی فعالیت ضد التهابی با کمی سازی نیتریت

فعالیت ضد التهابی با ارزیابی مهار تولید اکسید نیتریک (NO) توسط عصاره K.angustifolia که توسط Legault و همکارانش توضیح داده شده است، ارزیابی شد. [26]. به طور خلاصه، ماکروفاژهای موش RAW 264.7 (ATCC⑧ TIB-71، Manassas، VA، USA) با افزایش غلظت عصاره K. Angustifolia انکوبه شدند و سپس با 100 نانوگرم در میلی لیتر لیپوپلی ساکارید (LPS) تحریک شدند. یک کنترل مثبت، Nw-nitro-L-arginine متیل استر هیدروکلراید (L-NAME)، همچنین در دو غلظت مختلف ∶250 میکرومولار (67 میکروگرم در میلی لیتر) و 1 میلی مولار (270 میکروگرم در میلی لیتر) استفاده شد. سوپرناتانت های بدون سلول 24 ساعت پس از تحریک LPS جمع آوری شدند و غلظت NO بلافاصله با استفاده از واکنش گریس ارزیابی شد. جذب با استفاده از صفحه خوان Multiskan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) در طول موج 540 نانومتر خوانده شد. حضور نیتریت با استفاده از منحنی استاندارد NaNO کمی سازی شد. سلول های غیرفعال (در معرض محیط به تنهایی) به عنوان کنترل منفی و سلول های فعال به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند.

2.10. تولید جایگزین پوست

جایگزین‌های پوست سالم طبق روش خودآرایی تولید شدند که تا حدی با استفاده از 6-صفحات چاه [20،21] اصلاح شدند. به طور خلاصه، فیبروبلاست‌ها در P5 از اهداکنندگان سالم در 105×1.5 سلول در چاه کاشته شدند و به مدت 26 روز در DMEM حاوی 50 میکروگرم در میلی‌لیتر ال-آسکوربات-سدیم (سیگما، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) کشت داده شدند. تا زمانی که صفحات قابل دستکاری را تشکیل دادند. سپس دو ورقه فیبروبلاست جدا شده و روی هم قرار گرفتند تا معادل پوستی تشکیل شود. معادل های پوستی در دمای 37 درجه در اتمسفر 8 درصدی CO به مدت دو روز دیگر انکوبه شدند تا امکان همجوشی ورقه ای فراهم شود و در نتیجه لایه پوستی جدید جایگزین های پوست تشکیل شود. پس از این دوره، کراتینوسیت‌های موجود در P2 از اهداکنندگان سالم بر روی معادل پوستی در سلول‌های 1 × 10 درجه / معادل برای تشکیل لایه اپیدرمی جایگزین‌های پوست کاشته شدند و به مدت هفت روز در DMEMH حاوی 50 میکروگرم در میلی‌لیتر (به علاوه) کشت داده شدند. -سدیم ال-آسکوربات (سیگما، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) برای اجازه تکثیر کراتینوسیت. سپس، جایگزین‌های پوستی برای ارتقای تمایز سلولی به سطح مشترک هوا-مایع منتقل شدند. در فصل مشترک هوا-مایع، جایگزین‌های پوست با محیطی فاقد EGF کشت داده شدند تا یک اپیتلیوم طبقه‌بندی شده از پوست در داخل بدن به دست آید. چهارده روز پس از بالا آمدن به سطح مشترک هوا-مایع، جایگزین های پوستی سه بار در هفته به مدت یک هفته با محلول ذخیره عصاره رقیق شده در محیط کشت (با غلظت نهایی عصاره K. Angustifolia 25 میکروگرم بر میلی لیتر) تیمار شدند. پس از مجموع 56 روز کشت، بیوپسی های جایگزین پوست گرفته شد و با بافت شناسی و رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس آنالیز شد.

2.11. تجزیه و تحلیل بافت شناسی

بیوپسی های جایگزین پوست از هر شرایط در محلول HistoChoice (Amresco، Solon، OH، USA) تثبیت شد و در موم پارافین جاسازی شد. سپس برش هایی با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شد و با استفاده از رنگ های هماتوکسیلین وایگرت، فوشین-پونسئو و آنیلین بلو با ماسون تریکروم رنگ آمیزی شد. ضخامت درم و اپیدرم زنده با نرم افزار ImageJ (موسسه ملی بهداشت (NIH)، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا اندازه گیری شد. برای اندازه‌گیری‌های ضخامت، سه جمعیت سلولی مختلف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و برای هر یک از آنها، دو تصویر نماینده در هر شرایط گرفته شد و 10 اندازه‌گیری در هر عکس برای مجموع 60 اندازه‌گیری در هر شرایط انجام شد.

2.12. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس

نمونه‌برداری‌های جایگزین پوست از هر شرایط در Tissue-Tek OCT Compound (ساکورا فینتک، تورنس، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، در نیتروژن مایع منجمد شد و سپس تا زمانی که مورد نیاز بود در درجه -80 نگهداری شد. بخش های یخ زده از پوست طبیعی انسان به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس غیرمستقیم بر روی برودت‌های ضخیم 6 میکرونی فیکس شده در استون انجام شد. آنتی بادی های اولیه مورد استفاده عبارتند از: خرگوش پلی کلونال آنتی الاستین (gG) (رقت 1:800، Abcam، کمبریج، MA، ایالات متحده)، خرگوش پلی کلونال ضد کلاژن-1 (IgG) (رقت 1:300، Cedarlane، Burlington, ON, Canada), خرگوش پلی کلونال ضد کلاژن-3 (IgG) (رقت 1:200, Cedarlane, Burlington, ON, Canada) و ضد آکواپورین پلی کلونال خرگوش-3(IgG)(رقت 1:500، Abcam، کمبریج، MA، ایالات متحده). آنتی بادی ثانویه مورد استفاده IgG ضد خرگوش الاغ (H به علاوه L) Alexa 488 (رقت 1:1600، Life Technologies، یوجین، OR، ایالات متحده آمریکا) بود. هسته های سلولی پس از آنتی بادی ثانویه با محیط نصب DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech، بیرمنگام، AL، ایالات متحده آمریکا) نشاندار شدند. برای نیمه کمی کردن شدت فلورسانس هر پروتئین، شدت پیکسل رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس با استفاده از نرم افزار ImageJ (موسسه ملی بهداشت (NIH)، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، کل لایه پوست (درم یا اپیدرم زنده) پروتئین مورد مطالعه با اندازه‌گیری میانگین مقدار خاکستری هر ناحیه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. شدت فلورسانس جایگزین‌های پوست تیمار شده با شدت فلورسانس جایگزین‌های پوست کنترل برای ارزیابی تغییر در بیان پروتئین مشاهده‌شده با درمان‌ها مقایسه شد.

2.13. تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. تجزیه و تحلیل آماری سنجش MTI، سنجش مبتنی بر سلول های آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد التهابی با تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی دانت (p-value) انجام شد.<0.05 compared="" to="" control="" at="" 0="" μg/ml）="" or="" a="" bonferroni's="" post="" hoc="" test=""><0.05 compared="" to="" controls).="" thickness="" measurements="" were="" analyzed="" with="" a="" t-test.="" results="" were="" considered="" significant="" when=""><0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" with="" r="" software="" (v3.5.2,="" rcmdr="" v2.5-1,="" r-core="" team="" 2018,="" r="" foundation,="" vienna,="">

این مقاله از Antioxidants 2021, 10, 1373 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/antiox10091373 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants