نانو نوار آنتی اکسیدانی اکسید گرافن به عنوان یک عامل سفید کننده جدید مکانیسم ملانوژنز را مهار می کند.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

هسین یو چو، هوی مین دیوید وانگ،* چیا هنگ کو، پی هسوان لو، لین وانگ، ونی کانگ و چیا لیانگ سان*

چکیده:در فرآیند سنتز ملانین، واکنش های اکسیداتیو نقش اساسی دارند و این یک استراتژی خوب برای مهار تولید ملانین با کاهش استرس اکسیداتیو است. فولرن و مشتقات آن یا کمپلکس‌ها به‌عنوان جاذب‌کننده قوی رادیکال‌های آزاد در نظر گرفته شدند و ما بیشتر از نانوکربن‌های چندلایه sp2 برای کشف استفاده کردیم.ملانینمکانیسم های بازدارنده سنتز در مطالعه حاضر، ما از نانومواد جدید، مانند نانولوله‌های کربنی چند دیواره (MWCNTs)، MWCNT‌های نوع کوتاه، نانوروبان‌های اکسید گرافن (GONRs)، و GONR‌های نوع کوتاه، به عنوان عوامل ضد اکسیداتیو برای تنظیم تولید ملانین استفاده کردیم. نتایج نشان داد که GONR ها قابلیت آنتی اکسیداتیو بهتری در پلت فرم های آنالیز استرس اکسیداتیو درون سلولی و خارج سلولی نسبت به سایرین داشتند. ما پیشنهاد کردیم که GONR ها دارای گروه های عملکردی حاوی اکسیژن هستند. در سنجش 2'،7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate، متوجه شدیم که GONR می‌تواند یون‌های فلزی را برای از بین بردن گونه‌های فعال اکسیژن کلات کند. در دیدگاه بینش مولکولی، ما مشاهده کردیم که این نانومواد با کاهش بیان ژن مربوط به فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا، سنتز ملانین را کاهش دادند و پیامدهای مشابهی در بیان پروتئین وجود داشت. به طور خلاصه، GONR ها یک عامل بالقوه به عنوان یک آنتی اکسیدان جدید و مواد آرایشی سفید کننده پوست هستند.

سیستانچ نیز هستیک عامل بالقوه به عنوان یک رمانآنتی اکسیدانو سفید شدن پوستمواد آرایشی.

1. مقدمه

پوست عضوی است که سطح بیرونی بدن انسان را می پوشاند. از آنجایی که رابط با محیط در تماس است، لایه پوست نقش مهمی در محافظت از بدن در برابر عوامل بیماری زا، جلوگیری از اتلاف بیش از حد آب، تنظیم دمای بدن و غیره دارد. ملانوسیت ها در غشای پایه اپیدرم پوست رشد می کنند و 5 تا 10 درصد از محتوای سلولی را تشکیل می دهند. آنها به عنوان "غدد" تک سلولی با دندریت های نازک، بلند، جریان مانند و منشعب شناخته شده اند. ملانوسیت ها از طریق سلول های اپیدرمی در مجاورت آنها حرکت می کنند و مجموعه ای از سلول های اپیدرمی را در اطراف هر ملانوسیت ایجاد می کنند. علل داخلی و خارجی زیادی برای پیری پوست وجود دارد و یکی از این عوامل تابش اشعه ماوراء بنفش (UV) از نور خورشید است.1 در طول قرار گرفتن در معرض UV، سطح گونه های فعال اکسیژن (ROS) در پوست به طور چشمگیری افزایش می یابد که به عنوان استرس اکسیداتیو شناخته می شود. چندین عامل سمیت محیطی نیز استرس اکسیداتیو را به پوست افزایش می دهند، مانند آفت کش ها، تتراکلرید کربن، فلزات سنگین، آمین های معطر، و ذرات معطر 2.5 (PM2.5). 2 در مکانیسم بیوشیمیایی، اکسیدان های داخل سلولی از غیر تولید می شوند. سیستم آنزیمی، تبدیل آنها به ROS برای راه اندازی مسیر ملانوژنز

علاوه بر ROS، عوامل زیادی نیز وجود دارد که بر آن تأثیر می گذاردتولید ملانیناز جمله بیان ژن، التهاب، تغییرات غدد درون ریز و جذب رنگدانه.1 در اولین مراحل تولید ملانین، تیروزیناز در کاتالیز کردن تیروزین به فنوملانین و اوملانین نقش دارد. هر دو مکانیسم تولید رنگدانه مشابه هستند، که شامل هیدروکسیل شدن L-تیروزین به 3،{3}}دی هیدروکسی-L- فنیل آلانین (L-DOPA) و اکسیداسیون L-DOPA به دوپاکینون است. در مرحله بعدی، دوپامین توسط پروتئین 1 مربوط به تیروزیناز (TRP{10}}) و پروتئین مربوط به تیروزیناز 2 (TRP{13}}) در ملانوزوم اکسید می شود که توسط فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا تنظیم می شود. MITF) برای تشکیل ملانین. در نهایت، ملانین بالغ شده و در لایه شاخی رسوب می‌کند. 4،5 اینها به کراتینوسیت‌های همسایه لایه پایه نفوذ می‌کنند و DNA آن‌ها را از هرگونه جهش یا تغییرات ناشی از UV محافظت می‌کنند. ملانین بالغ در ملانوزوم ها به کراتینوسیت های 6-9 منتقل می شود و در نهایت منجر به رنگدانه طولانی مدت می شود. عدس، کک و مک و لکه های قهوه ای/سیاه گاهی باعث ایجاد مشکلات اجتماعی در مردان و زنان می شود. مسدود کردن استرس اکسیداتیو یا سرکوب فعالیت تیروزیناز یکی از راهبردهای کاهش سندرم پرپیگمانتاسیون و اختلالات پوستی است. آنتی اکسیدان ها بیش از حد رنگدانه و آسیب سلولی ناشی از ROS را التیام می بخشند. بنابراین، ترکیبات آنتی اکسیدانی سنتز شده کاربردهای زیستی بسیاری در کاربردهای مراقبت از پوست دارند.

فولرن (C60)، نانولوله کربنی (CNT)، گرافن، و نانوروبان گرافن (GNR) چهار نوع نانو کربن sp2 هستند که به طور گسترده در سراسر جهان مورد تحقیق قرار گرفته‌اند.12 فولرن و مشتقات یا مجتمع‌های آن قوی در نظر گرفته شده‌اند.پاک کننده های رادیکال آزادبرای مدت طولانی یوده و همکاران از C60 محلول در آب به عنوان یک عامل محافظ در برابر انحطاط ناشی از استرس کاتابولیک استفاده کرد. تزریق و همکاران به این نتیجه رسیدند که C60(OH)24 زمانی که استرس اکسیداتیو خیلی زیاد باشد یک ترکیب آنتی اکسیدانی قوی است. اوکودا و همکاران پیشنهاد کرد که کمپلکس های C60 می توانند از آسیب سلولی با واسطه NO جلوگیری کنند. 13،14 تانگ و همکاران. نشان داد که کمپلکس‌های C60 ممکن است نامزدهای امیدوارکننده‌ای برای درمان بیماری‌های مرتبط با مغز ناشی از افزایش سطح سوپراکسید باشند. در واقع، یک شرکت ژاپنی در سال 2006 فولرن ها را با فعالیت آنتی اکسیدانی قوی برای استفاده در لوازم آرایشی شناسایی کرد. Lucente- Schultz et al. نشان داد که توانایی مهار رادیکال اکسیژن نانولوله های کربنی تک جداره عامل دار (SWCNTs) تقریباً 40 برابر بیشتر از دندریتیک C60.15-19 Fenoglio و همکاران است. مشاهده کرد که CNT های چند دیواره (MWCNTs) دارای ظرفیت مهار رادیکال قابل توجهی در تماس با منبع خارجی رادیکال های هیدروکسیل یا سوپراکسید هستند. محاسبات تئوری تابعی چگالی همچنین مدلی از SWCNT ها را به عنوان جاذب کننده های رادیکال آزاد نشان داد. در سال 2004، Novoselov و همکاران. ابتدا نشان دادند که گرافن یک اثر الکتریکی دوقطبی قوی از خود نشان می‌دهد و می‌تواند برای کاربردهای الکترونیکی امیدوارکننده باشد. به دنبال آن، آنها همچنان به نشان دادن این نکته ادامه دادند که گرافن دارای خواص الکترونیکی است که برای گاز دوبعدی ذرات تشریح شده توسط معادله دیراک متمایز است. این دو مقاله پیشگامانه، توجه بیشتر و بیشتری به تحقیقات مبتنی بر گرافن معطوف شده است. برای مثال، Qiu و همکاران. در سال 2014 نشان داد که اکسید گرافن و گرافن چند لایه فعالیت آنتی اکسیدانی قابل توجهی از خود نشان می دهند و می توانند مولکول های زیست مولکولی مختلف را در برابر اکسیداسیون محافظت کنند.31 Han et al. به طور تجربی در سال 2007 نشان داد که شکاف انرژی GNR ها را می توان در طول فرآیند لیتوگرافی با تغییر پهنای نوار کنترل کرد. در بین چهار نانوکربن، GNR ها کمترین توجه را به خود جلب کرده اند. با توجه به دانش ما، تحقیقات کمی در مورد خواص آنتی اکسیدانی نانوروبان های اکسید گرافن (GONRs) وجود دارد. از این رو، در این مطالعه، ما با دقت MWCNT، MWCNT های کوتاه، GONR، و GONR های کوتاه را تهیه کردیم و هدف آن مقایسه خواص آنتی اکسیدانی آنها بودیم. نتایج مرتبط به طور سیستماتیک

2. نتایج و بحث

2.1. مورفولوژی MWCNT و GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 میکرومتر تا ۲-۳ میکرومتر. به طور همزمان، مشاهده شد که تیمار اسید نیتریک سطوح لوله صاف را زبر می کند. برخی از بریدگی ها و اشکال نامنظم در تصویر با بزرگنمایی بالا نمایش داده می شوند. علاوه بر این، با استفاده از MWCNT و MWCNT های کوتاه از طریق واکنش های مایکروویو به ترتیب GONR و GONR کوتاه بدست می آید. ما همچنین تصاویر TEM با بزرگنمایی کم و زیاد GONR و GONR کوتاه را نشان دادیم. با توجه به باز کردن زیپ طولی اصلی و برش افقی جزئی، به نظر می رسد که GONR ها کوتاه تر از MWCNT ها هستند. از سوی دیگر، تصاویر با بزرگنمایی بالا قطرهای بزرگتر، یعنی 0.11-0.18 میکرومتر GONR را نسبت به MWCNTها نشان دادند، که نشان می‌دهد فرآیند باز کردن زیپ موفقیت‌آمیز بود. به طور مشابه، GONR های کوتاه طول کوتاه تر و قطر بزرگتر از MWCNT های کوتاه نشان دادند. در کمپرسور هوای فرآیند باز کردن زیپ جدید ما، ساختارهای لایه نازک GONRها کمتر از چیزی بود که در گزارش اولیه برای همان توان مایکروویو 250 وات به دست آوردیم و در عین حال MWCNT مرکزی ضخیم‌تر را حفظ کردیم. ساختار ناهمگن /GONR به احتمال زیاد به جای ساختار نانوروبان کاملاً بازشده از طریق تمام توان های مایکروویو در فرآیند جدید ظاهر می شود. برای مقایسه با GONR کوتاه در مطالعات قبلی 34، قدرت مایکروویو بالاتر بریدگی های بیشتری را در کنار نوارها ایجاد کرد و لبه های روبانی صاف و خوبی را تشکیل نداد. توجه داشته باشید که ما از دو نوع مختلف شبکه مس در شکل 1a استفاده کردیم. برای MWCNT و GONR با طول کافی، از شبکه Gu با فرمور توری تثبیت شده با کربن (محصول شماره 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) استفاده شد. سوراخ های باز در یک لایه کربن توری مانع از همپوشانی تصویر انتقال بین نانوکربن ها و لایه کربنی شد. شبکه های خاکستری تیره متعلق به فیلم کربن توری هستند. با این حال، شبکه Gu با فرموار تثبیت شده با کربن (محصول شماره 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) برای MWCNT کوتاه و GONR کوتاه مورد نیاز بود. این به این دلیل بود که سوراخ های بزرگ در لایه کربن توری باعث ایجاد مشکلاتی برای نگه داشتن کارآمد MWCNT کوتاه و GONR کوتاه می شد. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، کنتراست خاکستری روشن در زیر MWCNT های کوتاه و GONR های کوتاه یک لایه سبک از کربن است. این لایه کربنی از طریق خواص رسانایی گرما و الکتریکی، فیلم فرموار را که در معرض پرتو الکترونی قرار می‌گیرد، تثبیت می‌کند.

2.2. پیکربندی اتصال MWCNT و GONR.

طیف رامان چهار نانوکربن در شکل 1b ارائه شده است. باند D از GONR ها بعد از فرآیند باز کردن زیپ بالاتر از MWCNT ها بود. این به سطح اکسیداسیون بالاتر و تعداد بیشتر ساختارهای لبه GONR در مقایسه با MWCNT ها نسبت داده شد. این پدیده همچنین مشابه چیزی است که در 2011.12 مشاهده کردیم، به دلیل سطح گرافیتی شدن بالا، باند G MWCNTها دارای کمترین تعداد عرض کامل در نیمه حداکثر است. نسبت ID/IG چهار نانوکربن به ترتیب {{1{12}}}} بود.076، 0.502، 0.483، و 0.700. به طور خلاصه، کاهش طول و اکسیداسیون سطح باعث افزایش سطح نقص و در نتیجه افزایش نسبت ID/IG شد. قله D در همه گرافن‌های معیوب وجود دارد و به عنوان معیاری برای کیفیت در نظر گرفته می‌شود. همانطور که در شکل 1b نشان داده شده است، قله‌های D' در چهار طیف پس از فرآیند برش یا باز کردن زیپ برجسته‌تر می‌شوند و نشان می‌دهد که آنها مخرب هستند. فرآیندهایی که نقص های زیادی را ایجاد می کنند. شکل 1c,d طیف طیف سنجی فوتوالکترون پرتو ایکس چهار نانوکربن را نشان می دهد. ظاهراً قله D برای GONR های کوتاه واضح ترین است. همانطور که در شکل 1c نشان داده شده است، به دلیل توانایی اکسیداسیون قوی KMnO4 در یک محیط اسیدی، سطح O به طور قابل توجهی از 7.6 درصد (MWCNTs) به 19.9 درصد (GONRs) افزایش یافته است. از سوی دیگر، سطح O اندکی 0.8 درصد از MWCNT به MWCNT های کوتاه افزایش یافت. نکته مهم این است که بالاترین سطح O برای GONR کوتاه 38.3 درصد است که به این معنی است که انتهای نانوروبان‌ها راحت‌تر از سطوح مسطح sp2 می‌توانند گروه‌های عاملی اکسیژن را متصل کنند. عدد بزرگتر با عرض کامل به نصف ماکزیمم و انتقال به انرژی اتصال بالا C 1s پس از فرآیند باز کردن زیپ MWCNT ها و MWCNT های کوتاه در شکل 1d نشان داده شده است. برای اکسیدهای گرافن، پیک‌های پیچیده‌شده در سمت پرانرژی اتصال را می‌توان به پیوندهای C-C(CC)، C-O، CO و COOH نسبت داد. ما GONR (200 W) را در سال 2013 مشخص کردیم. 37 و نتایج مشابه نتایج این مطالعه بود. این مطالعه پدیده‌های طیف رامان را نتیجه‌گیری کرد، به این معنی که گروه‌های عاملی حاوی اکسیژن بیشتری در طول تبدیل لوله به روبان تولید شدند (شکل 2).

2.3. خواص آنتی اکسیدانی MWCNT ها و GONR ها

2.3.1. تعیین 1،1-دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل سنجش فعالیت مهار رادیکال آزاد.

1،1- دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل (DPPH) فعالیت مهار رادیکال آزاد یک پلت فرم آنتی اکسیدانی است که برای تشخیص ظرفیت آنتی اکسیدانی استفاده می شود. نتایج برای چهار نانوکربن در جدول 2 توضیح داده شده است. در سنجش DPPH، ویتامین C در غلظت 1{14}}0 میکرومولار به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. برای آزمایش فعالیت های آنتی اکسیدانی MWCNT ها، MWCNT های کوتاه، GONR و GONR های کوتاه، دوزهای ۱، ۵ و ۱0 میلی گرم در لیتر در محلول واکنش برای اندازه گیری خواص انکوبه شدند. MWCNTها، MWCNTهای کوتاه، GONRها، و GONRهای کوتاه دارای تواناییهای بازدارندگی متوسط ​​در 10 mg/L (19.2 ± 0.3، 12.1 ± 0.3، 26.8 ± 0.3، و 0.4 ± 30.0 درصد)، در حالی که ویتامین C وضعیت مشابهی در 100 میکرومولار (0.1 ± 93.4 درصد) برای سرکوب داشت.

2.3.2. سنجش فعالیت یون کیلیت.

در شرایط استرس اکسیداتیو، فروزین می تواند یک کمپلکس با Fe2 پلاس ایجاد کند تا به صورت کمی اندازه گیری شود. در حضور واسطه‌های کیلیت، کمپلکس شکسته می‌شود و باعث کاهش یون‌های آهن از رنگ قرمز تیره کمپلکس Fe2 پلاس می‌شود. ما از EDTA به عنوان کنترل مثبت استفاده کردیم. جدول 2 نشان می دهد که MWCNT ها، MWCNT های کوتاه، GONR ها، و GONR های کوتاه دارای فعالیت کیلیت در 10 میلی گرم در لیتر (29.2 ± {{10}}.8، 28.7 ± 0 بودند. 0.7، 69.7 ± 0.6، و 68.9 ± 0.3 درصد)، در حالی که کنترل مثبت شرایط مشابه در 100 میکرومولار (93.4 ± 0.1 درصد) داشت.

2.3.3. اندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده آهن

سنجش پتانسیل کاهش آهن یک آزمایش ساده و قابل اعتماد است که برای تعیین کمیت سنتز کمپلکس Fe(III)-ferricyanide استفاده می شود. در این سنجش، قدرت کاهشی چهار نانوکربن تولید کننده کمپلکس آهنی Fe(III)-TPTZ با تغییر رنگ محلول از زرد به سبز و آبی شناسایی شد. جدول 2 نشان می دهد که توان کاهشی MWCNT، MWCNT کوتاه، GONR، و GONR کوتاه، چگالی نوری (OD) 1.11، 1.13، 1.15، و 1.11 در 10 میلی گرم در لیتر بود.

2.3.4. MWCNT ها و GONR ها تجمع ROS داخل سلولی را مهار می کنند.

بسیاری از گزارش‌ها نشان داده‌اند که ROS یکپارچگی ساختاری غشای سلولی، از جمله غشای سلولی و غشای هسته‌ای را از بین می‌برد تا منجر به آسیب سلولی و از دست دادن عملکرد طبیعی شود. ملانین و مهار تولید ROS یک استراتژی خوب برای کاهش سنتز ملانین است. در این مطالعه، ما از روش رنگ‌آمیزی 2'،7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) برای تجزیه و تحلیل سطح استرس اکسیداتیو درون سلولی در سلول‌های تیمار MWCNT و GONR استفاده کردیم. فوربول 12-میریستات 13-استات (PMA) تحریکات اکسیداتیو را در گروه های MWCNT و GONR القاء کرد و به عنوان کنترل منفی استفاده شد.41 هنگامی که غلظت PMA 20 نانوگرم در میلی لیتر بود، استرس اکسیداتیو را القا کرد و افزایش داد. مقدار به 38 درصد ; پس از درمان GONR و MWCNT، سطوح ROS به سطح نرمال کاهش یافت. داده ها نشان داد که هر دو ماده سطوح استرس اکسیداتیو را مهار می کنند و اثر ضد اکسیداتیو GONR ها بیشتر از MWCNT ها بود (شکل 3). جدول 1 فهرست پیامدهای مشابهی را نشان می دهد. ما مدعی شدیم که سه دلیل برای یافته های جدید ما وجود دارد: اول، ترتیب حلالیت این مواد به شرح زیر است: GONRs کوتاه > GONRs > MWCNT های کوتاه > MWCNT، به این معنی که ناحیه تماس GONR های کوتاه بزرگترین بود، بنابراین برای پاکسازی ROS برتر است. دوم، GONRها و MWCNTها ساختارهای کربنی sp{13} بودند که می‌توانستند الکتریسیته ROS را از طریق تشکیل ترکیب اضافی یا انتقال الکترون از بین ببرند. انتقال الکترون آسان تر از نانولوله ها در نهایت، در شکل 1b، مشاهده می‌کنیم که سایت کربن GONR sp{16} حاوی گروه‌های عاملی اکسیژن بیشتری نسبت به MWCNT‌ها بود، گروه‌های اسید کربوکسیلیک می‌توانند یون‌های فلزی را کیلیت کنند، و گروه‌های هیدروکسیل می‌توانند یک اهداکننده H برای از بین بردن ROS و تولید ملانین را مهار می کند.

2.4. سمیت سلولی MWCNT ها و GONR های درمان شده در سلول های فیبروبلاست پوستی انسان.

برای ارزیابی خواص سیتوتوکسیک GONR ها روی سلول های Hs68 (شکل 3) و سلول ها در دوزهای مختلف 1، 5 و 10 میکروگرم بر میلی لیتر کشت داده شدند. ما بررسی کردیم که قابلیت زنده ماندن سلولی MWCNT به ترتیب 7/3 ± 7/100، 9/4 ± 8/99 و 7/4 ± 1/94 درصد در غلظت‌های 1، 5 و 10 میلی‌گرم در لیتر بود. قابلیت زنده ماندن برای MWCNT کوتاه به همان ترتیب محاسبه شد و 2.2 ± 93.9، 3.0 ± 4. 86 و 2.1 ± 98.9 درصد یافت شد. ما مشاهده کردیم که سلول‌های B16-F10 در غلظت‌های بالا انکوبه شدند و بقای سلولی سلول‌های Hs68 بیش از 80 درصد بود، که نشان می‌دهد MWCNT و MWCNT کوتاه هیچ اثر سمی روی سلول‌های فیبروبلاست پوستی انسان ندارند. قابلیت زنده ماندن سلولی GONR و GONR کوتاه 86}.24 ± 2.1، 90.87 ± 3.5، 88.58 ± 2.5، 89.03 ± 3.6، 90.71 ± 2.8 و 90.64 ± .2 درصد بود. همچنین در شکل 4a اشاره شده است که GONR و GONR کوتاه اثر سیتوتوکسیک قابل تشخیصی روی سلول های HS68 ندارند. در گزارش‌های قبلی، استفاده از نانومواد آزمایش‌نشده برای مقاصد زیبایی می‌تواند مشکوک تلقی شود، و معمولاً به دلیل حمله DNA پس از ورود نانوذرات به سلول‌ها بود. پس از آزمایش سمیت سلولی، متوجه شدیم که مواد ما برای سلول‌های طبیعی پوست سمی ایجاد نمی‌کنند. ما به این نتیجه رسیدیم که پس از ورود نانومواد به سلول‌ها، نانومواد فقط با کاهش استرس اکسیداتیو و یون‌های فلزی کیلیت تولید ملانین را مهار می‌کنند و به میتوکندری یا DNA آسیب نمی‌رسانند، به این معنی که MWCNT و GONR برای استفاده بی‌خطر بودند.

2.5. دو نوع MWCNT و GONR در فعالیت تیروزیناز سلولی B16-F10 و محتوای ملانین.

در مسیر سنتز ملانین، تیروزیناز نقش مهمی ایفا می کند. تیروزیناز از طریق یک سری واکنش های بیوشیمیایی اکسید می شود و یوملانین و فئوملانین را تشکیل می دهد. به منظور تعیین اینکه آیا GONR ها و MWCNT ها فعالیت های تیروزیناز را مهار می کنند و باعث کاهش تولید ملانین می شوند، ما فعالیت تیروزیناز را در سلول های B16-F10 تجزیه و تحلیل کردیم. ما دریافتیم که MWCNT ها و MWCNT های کوتاه فعالیت تیروزیناز را تقریباً 17.1 درصد و 23 درصد در 10 میلی گرم در لیتر مهار می کنند. GONRها و GONRهای کوتاه اثرات بهتری در سرکوب فعالیت تیروزیناز در همان غلظت نسبت به GONR دیگر داشتند. آنها همچنین به صورت وابسته به دوز بودند و 49.8 درصد و 44.7 درصد از فعالیت تیروزیناز را مهار کردند، همانطور که در شکل 4b نشان داده شده است.

ملانین یک رنگدانه ضروری در بدن انسان است، اما بیان بیش از حد ملانین اغلب باعث ایجاد یک سری بیماری ها می شود. در مطالعات قبلی، شیائو و همکاران. از یک ماده مشابه، رادیکال اسفنج، یک نانوذره فولرن، به عنوان یک عامل ضد ملانین استفاده کرد. نتایج خوبی به دست آمد. حدود 2{11}} درصد از تولید ملانین را می توان مهار کرد. به منظور بهبود کارایی آن، ماده آزمایشی را برای اندازه‌گیری میزان مهار ملانین و مکانیسم مولکولی آن، همانطور که در شکل‌های 4c و 5 نشان داده شده است، بیشتر بهبود دادیم. 16}}.2 درصد در mg/L 10 و به صورت وابسته به دوز. GONR ها و GONR های کوتاه به شدت مقادیر را به 2.3 ± 32.0 و 3.4 ± 35.3 درصد در 10 میلی گرم در لیتر کاهش دادند. نتایج تجربی نشان داد که هر چهار نوع می توانند سنتز ملانین را مهار کنند و GONR ها تأثیر قوی تری داشتند. از سوی دیگر، ما همچنین مشاهده کردیم که GONR کوتاه اثر بهتری در مهار تولید ملانین دارد. نتیجه می گیریم که GONR های کوتاه گروه های عملکردی بیشتری دارند و می توانند به طور موثری از تیروزیناز کاتالیز شده توسط یون های فلزی جلوگیری کنند و تولید ملانین را بیشتر مهار کنند (شکل 2). در جدول 1 مشاهده می کنیم که تلاش نوع کوتاه یونی-کلات کننده فلزی بیشتر از نوع معمولی است. این بدان معنی است که این GONR های کوتاه می توانند به طور بالقوه در زمینه آرایشی به عنوان عوامل مراقبت از پوست استفاده شوند.

2.6. مکانیسم MWCNT ها و GONR ها محتوای ملانین سلولی B16-F10 را مهار کرد.

سلول ها با تنظیم بیان پروتئین به استرس اکسیداتیو خارجی پاسخ می دهند. سلول های B16-F10 بیان ژن c-myc و AMPK تنظیم شده را برای کاهش سطوح اکسیداتیو افزایش می دهند، و در این کار، MITF یک فاکتور رونویسی خاص تیروزیناز برای تنظیم مسیر سیگنال سنتز ملانین مولکولی است. 5a، MWCNTها و GONRها با کاهش استرس اکسیداتیو، فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا را کاهش می‌دهند، و سپس، ژن‌های پایین‌دستی TRP{10}} و TRP{11}} نیز کاهش یافتند. برای سطح پروتئین، پدیده مشابهی پیدا شد که به موجب آن MWCNTs و GONRs مسیر ملانوژنز مرتبط با MITF را کاهش دادند و سپس در نهایت محتوای ملانین را کاهش دادند (شکل 5b).

3. مواد و روش های تجربی

3.1. تهیه MWCNT و GONR.

فرآیند مربوطه برای ساخت GONR در مقاله قبلی گزارش شده بود. 12 MWCNT (0.05 گرم) در 9:1 H2SO4/H3PO4 معلق شد و با یک راکتور مایکروویو (CEM-Discover) تیمار شد. با توان تنظیم شده روی 250 وات به مدت 2 دقیقه. پس از افزودن KMnO4 (0.25 گرم) به محلول‌ها، محلول‌ها با همان قدرت مایکروویو در دمای 65 درجه به مدت 4 دقیقه تحت درمان قرار گرفتند. در اینجا از کمپرسور هوا برای کنترل دمای راکتور مایکروویو در طول فرآیند استفاده می شود. توان مایکروویو در آزمایش های اولیه روی 250 وات تنظیم شد.

3.2. تهیه MWCNT های کوتاه و GONR های کوتاه.

فرآیند مربوطه برای ساختن GONRهای کوتاه در مقاله قبلی ما گزارش شده بود. زمان تیمار اسیدی 8 ساعت انتخاب شد. قدرت مایکروویو روی 250 وات تنظیم شده بود که همان قدرت دریافت GONR است.

3.3. فعالیت پاکسازی رادیکال DPPH.

DPPH اغلب برای تعیین ظرفیت مهار نمونه ها و خواص آنتی اکسیدانی استفاده می شد. 50 DPPH یک معرف بنفش است که در صورت انتقال رادیکال آزاد به آنالیت رنگ را از بنفش به زرد تغییر می دهد. نمونه های آنتی اکسیدانی مثبت با غلظت های مناسب به محلول اضافه شد و نمونه ها در طول موج 517 نانومتر به مدت 30 دقیقه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ما از درصد DPPH باقیمانده در کنار نمونه های آزمایشی برای اندازه گیری مقدار آنتی اکسیدان مورد نیاز برای کاهش رادیکال های DPPH قبلی استفاده کردیم. ویتامین C در غلظت 100 میکرومولار به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. فعالیت مهار (درصد) به عنوان اندازه گیری شد

ظرفیت پاکسازی (درصد )=(نمونه - آبلانک) / (کنترل - آبلانک) × 100 درصد (1)

3.4. فعالیت کیلاسیون فلزی.

یون فلزی عاملی است که باعث اکسیداسیون بیش از حد لیپید می شود و Fe2 پلاس یکی از تاثیرگذارترین یون ها است. (10 میکرولیتر)، و سپس در فروزین (5 میلی‌مولار، 20 میکرولیتر) بارگیری شد. این مخلوط به طور کامل با 69 میکرولیتر منتول مخلوط شد و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس محلول واکنش نمونه در طول موج 562 نانومتر مشاهده شد. EDTA به عنوان یک کنترل مثبت در 100 میکرومولار استفاده شد و فرمول محاسبه فعالیت کیلیت فلز بر اساس معادله 1 بود.

3.5. کاهش قدرت.

محاسبه توان کاهشی بر اساس یک مطالعه قبلی است.50 ابتدا، 2.5 میکرولیتر مواد گرافن با بافر PBS (67 میلی‌مولار، pH 6.8) و K3Fe (CN)6 (2.5 میکرولیتر، 20 درصد) مخلوط شد و سپس در دمای 50 درجه انکوبه شد. به مدت 20 دقیقه سپس، 10 درصد تری کلرو استیک اسید (160 میکرولیتر) با معرف ها در 300 گرم به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. طول جذب پس از مخلوط شدن با 25 میکرولیتر FeCl3 (2 درصد) در 700 نانومتر تعیین شد. هیدروکسی آنیزول بوتیله (BHA) در 100 میکرومولار استفاده شد.

3.6. آزمایشات تکثیر سلولی

خط سلولی فیبروبلاست پوستی انسان HS68 برای تجزیه و تحلیل نسبت تکثیر سلولی استفاده شد. HS68 در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو و 1 درصد پنی سیلین و استرپتومایسین مخلوط شده انکوبه شد. 8000 سلول در پلیت‌های چاهک کاشته شدند و به مدت 24 ساعت با نمونه‌ها تیمار شدند. محلول رویی خارج شد و از محلول MTT برای کشت به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه استفاده کردیم. پس از انکوباسیون، محیط حاوی MTT را برداشته و با دی متیل سولفوکسید (DMSO) حل کردیم. محلول در OD 590 نانومتر خوانده شد و سرعت با معادله 1 محاسبه شد.

3.7. ارزیابی محتوای ملانین سلولی.

ما از روشی با تغییرات جزئی بر اساس روش قبلی استفاده کردیم. 52،53 گلوله سلولی B16-F10 از مرکز تحقیقات و مجموعه منابع زیستی (BCRC، CRL 6323، Hsinchu، تایوان) در مخلوطی از 2.0 حل شد. N NaOH و 10 درصد DMSO. نمونه متعاقباً به مدت 1 ساعت در دمای 90 درجه حرارت داده شد و در 10،{11}}گرم به مدت 10 دقیقه دیگر سانتریفیوژ شد تا مایع رویی شفاف به دست آید. شمارش ملانین با نظارت بر OD مایع رویی در طول موج 475 نانومتر تعیین شد.

3.8. فعالیت تیروزیناز سلولی B16-F10.

برای فعالیت تیروزیناز سلولی B16-F10، به کار قبلی با برخی تغییرات اشاره کردیم. 50 سلول در 12-صفحه چاهک در هر چاهک 105 سلول کشت داده شدند. پس از تیمار با نمونه‌ها، سلول‌ها در 1 درصد Triton X{6}}/PBS و 2 میلی‌مولار ال-تیروزین (50 میکرولیتر) به مدت 3 ساعت لیز شدند. پس از انکوباسیون، محیط را برداشتیم و جذب را در OD 590 نانومتر خواندیم. فرمول فعالیت تیروزیناز با معادله 1 محاسبه شد.

سیستانچ یک مهارکننده تیروزیناز است.

3.9. تشخیص ROS با رنگ آمیزی DCFDA.

با اشاره به مطالعه قبلی،54 1.2 1. 105 سلول B16-F10 در 6-صفحه‌های چاهی کاشته شدند و با غلظت‌های مختلف نمونه‌ها تیمار شدند. سلول ها در PBS معلق شدند و سپس با DCFDA (5 میکرومولار) در DMEM قرمز غیر فنل به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه بارگذاری شدند. فلوسایتومتر (Guava، Merck، آلمان) برای تشخیص سیگنال فلورسنت DCFDA استفاده شد. طول موج تحریک و انتشار DCFDA به ترتیب 488 و 535 نانومتر بود.

3.10. واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان واقعی.

ما از روش های لین و همکاران پیروی کردیم. (2018). 1 واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی در زمان واقعی (qRT-PCR) از یک پروب پرایمر انحصاری برای تولید فلورسانس تشکیل شده است. از یک تکنیک تشخیص فلورسانس استفاده کرد که هر چرخه را با استفاده از یک سیستم qRT-PCR 7500 (Applied Biosystems، ایالات متحده آمریکا) حس می کند. این چرخه را بر اساس مقدار فلورسانس آزاد شده تشخیص داد و سپس حاصل ضرب هر چرخه برای محتوای تولید شده محاسبه شد که منجر به دستیابی به اهداف کمی در زمان واقعی شد. تریزول (Invitrogen، ایالات متحده آمریکا) برای استخراج یک RNA کامل از بافت ریه، مطابق با جهت داده شده توسط سازنده استفاده شد. پس از آن، یک کیت رونویسی معکوس (Takara، ژاپن) برای تولید DNA استفاده شد. در qRT-PCR با استفاده از پرایمرهای فهرست شده در جدول 1، ابتدا نمونه حرارت داده شد تا یک رشته DNA تشکیل شود. سپس اتصال پرایمر برای تشکیل یک DNA دو رشته ای (dsDNA) انجام شد، پس از آن dsDNA سبز SYBR ترکیب شد، که برای آن کیت معرف سبز پلاس SYBR (روش، بازل، سوئیس) استفاده شد، که منجر به آزاد شدن فلورسانس شد. حاصل از یک سیستم تشخیص فلورسانس عبور داده شد. تشخیص سیگنال‌های فلورسنت در طول مرحله ازدیاد طول یا بازپخت هر چرخه صورت گرفت. پس از تشخیص، محتویات نمونه با شدت فلورسانس شناسایی شده به عقب فشار داده شد. سطوح بیان ژن های هدف با استفاده از روش 2-ΔΔCt به سطوح توبولین نرمال شد.

میریستین

3.11. تست وسترن بلات

سلول های B16-F10 در 4 درجه یک شبه با یک بافر سنجش رادیو ایمونوپسیتیشن (شرکت علمی Thermo، ایالات متحده آمریکا)، که حاوی مهارکننده های پروتئاز است، لیز شدند. کیت سنجش پروتئین بیسینکونیک اسید (BCA، Sigma-Aldrich Corp.، USA) برای تعیین کمیت مقدار پروتئین استفاده شد. پروتئین های نمونه روی ژل 10 درصد سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید جدا شده و به غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA) منتقل شدند. غشاء PVDF با یک بافر مسدود کننده (Thermo Scientific) به مدت 1 ساعت مسدود شد و با آنتی بادی اولیه اختصاصی یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شد. در مرحله بعد، غشاء با بافر سالین بافر Tris-Tween 20 دو بار شسته شد و با آنتی بادی های ثانویه به مدت 1.5 ساعت انکوبه شد. پس از آن، غشاء در معرف‌های تشخیص نورتابی شیمیایی (Thermo Scientific) غوطه‌ور شد و توسط یک تصویرساز MiniChemi Chemiluminescence (علم خلقت پکن سیج، چین) آنالیز شد. منابع آنتی بادی شامل خرگوش ضد MITF، خرگوش ضد TRP-1، خرگوش anti-TRP-2، و -اکتین (Thermo Scientific).

3.12. تجزیه و تحلیل مواد.

TEM (JEOL JEM-1230، 100 kV) برای مشاهده مورفولوژی نانوکربن‌ها استفاده شد. یک طیف‌سنج میکرو رامان (PTT، RAMaker) برای بررسی حالت‌های تشدید نانوکربن‌ها استفاده شد. اندازه‌گیری‌های طیف‌سنجی فوتوالکترون پرتو ایکس (XPS، Kratos Axis Ultra DLD) نیز برای تعیین آنالیز ترکیبی انجام شد. 12،34

3.13. تحلیل آماری.

تمام نمونه ها و آزمایش های استاندارد حداقل سه بار تکرار شدند. برای مقایسه و بیان میانگین مقادیر میانگین ± انحراف معیار آماری از آزمون t Student استفاده کردیم.

4. نتیجه گیری

به طور خلاصه، مشاهده کردیم که GONR کوتاه به دلیل خواص زیست عملکردی متعدد، ماده بالقوه ای برای محصولات مراقبت از پوست است (شکل 6). نتایج نشان داد که نانوکربن ها به عنوان یک آنتی اکسیدان خارج سلولی و درون سلولی نقش دارند. در همین حال، نانوکربن فعالیت تیروزیناز و محتوای ملانین را مهار کرد و آسیب جدی به سلول‌های رنگدانه وارد نکرد. این کار عملکرد ضد ملانوژنز چهار نوع نانوکربن را مشخص کرد. مطالعات آینده مکانیسم این ترکیبات را بر روی بیان ژن و پروتئین خاص مربوط به بلوغ، حمل و نقل و تجمع ملانین بررسی خواهد کرد.

سیستانچ سفید شدن را بهبود می بخشد.

لطفا روی عکس کلیک کنید و جزئیات بیشتر را دریافت کنید.