آپوسینین آسیب بیضه ناشی از گلوتامات مونو سدیم را با اختلال در سد خونی بیضه و پارامترهای استرس اکسیداتیو بهبود می بخشد.

خلاصه:

زمینه و هدف: این مطالعه با هدف بررسی اثرات آپوسینین (APO) بر سطوح هورمونی، سد خونی بیضه و نشانگرهای زیستی اکسیداتیو در دژنراسیون بیضه ناشی از مونوسدیم گلوتامات (MSG) انجام شد. روش‌ها: موش‌های صحرایی نر نژاد Sprague Dawley (150-200 گرم؛ n=32) به طور تصادفی به چهار گروه کنترل، APO، MSG و MSG به اضافه APO تقسیم شدند. گروه های MSG و MSG به علاوه APO به مدت 28 روز MSG (120 میلی گرم بر کیلوگرم) تجویز شدند.

برای تستوسترون گیاه دارویی سیستانچ را کلیک کنید

علاوه بر این، گروه های APO و MSG به علاوه APO APO (25 میلی گرم بر کیلوگرم) را طی پنج روز آخر آزمایش دریافت کردند. تمام تجویزها از طریق گاواژ خوراکی بود. در نهایت، آنالیزهای بیوشیمیایی بر اساس تعیین تستوسترون، هورمون محرک فولیکول (FSH)، هورمون لوتئینه کننده (LH)، مالون دی آلدئید (MDA)، گلوتاتیون (GSH) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و همچنین نور و انتقال انجام شد. بررسی‌های میکروسکوپی الکترونی، ارزیابی پارامترهای اسپرم، ZO{2}}، اکلودین، NOX{3}} و ایمونوهیستوشیمی TUNEL مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته‌ها: MSG باعث افزایش سطح استرس اکسیداتیو و آپوپتوز، کاهش تکثیر سلولی و ایجاد انحطاط در مورفولوژی بیضه از جمله در سد خونی بیضه شد. تجویز آپوسینین تمام پارامترهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی را در گروه MSG به علاوه APO معکوس کرد. نتیجه‌گیری: آپوسینین با حفظ یکپارچگی سد خونی بیضه با سطح متعادل هورمونی و اکسیدان/آنتی‌اکسیدانی، از دژنراسیون بیضه جلوگیری می‌کند.

کلمات کلیدی: مونوسدیم گلوتامات. آپوسینین NOX-2; سد خونی بیضه؛ فراساختار

1. معرفی

اسید ال-گلوتامیک که به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد، به عنوان یک افزودنی، به طور طبیعی در انواع غذاها وجود دارد و منبع تقویت کننده طعم، مونو سدیم گلوتامات (MSG) است [1]. بسیاری از غذاهای فرآوری شده حاوی MSG به عنوان یک افزودنی هستند، با میانگین مصرف روزانه در کشورهای صنعتی اروپایی 0.3 تا 1.0 گرم. [2]. اگرچه مصرف MSG توسط سازمان‌های ایمنی مواد غذایی ایمن در نظر گرفته می‌شود، اما هنوز در چندین مطالعه بالینی و بالینی، به‌ویژه قرار گرفتن در معرض طولانی‌مدت آن، مورد تردید است. از جمله عملکردهای فیزیولوژیکی گلوتامات، خاصیت انتقال دهنده عصبی آن در سیستم عصبی مرکزی، به عنوان پیش ساز متابولیت هایی مانند گلوتاتیون است [1].

مصرف طولانی مدت MSG اثرات منفی بر سیستم تولید مثل مردان نشان داده است. مطالعات نشان داده است که مصرف طولانی مدت MSG باعث کاهش تعداد اسپرم در مردان شده و بر ساختار مورفولوژیکی اسپرم و بیضه ها تأثیر می گذارد [3]. اکثر تحقیقات ذکر شده قبلاً عمدتاً بر روی سمیت MSG در موش‌ها در دوزهای 2000-8000 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن متمرکز شده‌اند که برای انسان در این سطح بسیار بعید است [4].

تبدیل آلومتریک توسط Shin و همکاران. [5] نشان داد که این دوز معادل 120 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن در موش ها است. تعداد قابل توجهی از گیرنده های گلوتامات در اندام های تولید مثل و اسپرم وجود دارد که آنها را مستعد آسیب ناشی از تحریک گلوتامات اضافی در بدن می کند. این باعث می شود که سیستم تولید مثل هدف مکرر آسیب های ناشی از گلوتامات باشد. علاوه بر این، سمیت گلوتامات به طور مستقیم به محور هیپوتالاموس-هیپوفیز-گناد آسیب می رساند و منجر به عدم تعادل هموستاتیک در تولید مثل می شود [6].

MSG منجر به آسیب اکسیداتیو (افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی) و تغییرات اسپرماتوژنیک شده است که با تعداد کم اسپرم و ناهنجاری های مورفولوژیکی آشکار می شود [3]. بنابراین، ما اثرات مصرف خوراکی MSG را بر روی موش‌ها هنگامی که دوز متوسطی را که مستقیماً از مصرف روزانه در انسان برون‌یابی شده بود مصرف کردند، مطالعه کردیم. این اثر دوز MSG بر مورفولوژی بیضه موش صحرایی نیز در مطالعات تجربی مشاهده شد [3،7].

تولید بیش از حد گونه های فعال اکسیژن (ROS) باعث استرس اکسیداتیو و آپوپتوز می شود. رادیکال های آزاد به دلیل ساختار واکنشی خود می توانند با لیپیدها، اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها تعامل داشته باشند و اثرات مضری بر بدن داشته باشند [8]. استرس اکسیداتیو، ناشی از ROS، نقش مهمی در ناباروری مردان دارد [9]. مطالعات نشان داده اند که NADPH اکسیداز (NOX) یکی از منابع اصلی ROS است [10]. ROS بیش از حد و استرس اکسیداتیو در سیستم تولید مثل مردان باعث تغییرات منفی در غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم می شود. اسپرم تحلیل رفته و پارامترهای منی مختل منجر به ناباروری می شود [11]. ROS به دلیل آسیب DNA در اسپرم باعث ناباروری مردان می شود [12]. استرس اکسیداتیو یکپارچگی غشای پلاسمایی اسپرم را به خطر می اندازد و باعث ایجاد ظرفیت اولیه می شود.

در نتیجه توانایی لقاح اسپرم کاهش می یابد و ناباروری رخ می دهد [13]. آپوسینین (APO)، استخراج شده از ریشه گیاه Apocynum cannabinum، به عنوان یک مهارکننده NOX موثر شناخته شده است [14]. اثر ضد التهابی APO در بسیاری از مطالعات تجربی نشان داده شده است [15]. فعال شدن NOX از طریق مهاجرت اجزای سیتوزولی به غشای سلولی رخ می دهد [16،17]. APO با اثر بر فعالیت NOX در نوتروفیل های فعال انسانی به عنوان یک مهارکننده انتخابی تولید ROS عمل می کند.

با این حال، APO بر فاگوسیتوز یا سایر مکانیسم های مرگ درون سلولی تأثیر نمی گذارد [18،19]. ایزوفرم های NOX در سلول های مختلف بیان می شوند و عملکردهای فیزیولوژیکی متفاوتی دارند. NOX{2}} ایزوفرم NOX است که در ائوزینوفیل ها، ماکروفاژها و نوتروفیل ها وجود دارد [20]. سلول های اسپرماتوژن و سلول های سرتولی به هم متصل هستند. این رابطه پویا توسط اتصالات محکم و اتصالات شکاف تنظیم می شود [21]. اتصالات محکم بین سلول های سرتولی برای تشکیل و عملکرد سد خونی بیضه (BTB) مهم است.

ساختار BTB شامل اتصالات محکم، دسموزوم ها، تخصص های اکتوپلاسمی پایه و اتصالات شکاف است. اتصالات محکم با منشاء اپیتلیال، تخصص های غشایی چند مولکولی هستند که حاوی پروتئین های غشایی انتگرال چندگانه مانند zonula occludens-1 (ZO-1) و اکلودین [21] هستند. اکلودین ها یکی از مولکول هایی هستند که در ایجاد اتصالات محکم نقش دارند. پروتئین های Zonula occludens مانند zonula occludens-1 (ZO-1)، ZO-2 و ZO-3 پروتئین های مهمی هستند که در این ساختار نقش دارند. اکلودین، ZO-1، و ZO-3 با اسکلت سلولی اکتین تعامل دارند. پروتئین ZO-3 با حوزه‌های سیتوپلاسمی ZO{10}} و اکلودین [22] مرتبط است.

استرس اکسیداتیو زمانی رخ می دهد که آنتی اکسیدان کافی در برابر رادیکال های آزاد وجود نداشته باشد. کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند سطح سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و گلوتاتیون (GSH) منجر به افزایش آسیب اکسیداتیو می شود [23]. مالون دی آلدئید (MDA)، یک پارامتر آسیب غشای سلولی، نشان دهنده چگالی حمله رادیکال اکسیژن در سلول های واکنشی و متابولیسم رادیکال های آزاد در داخل بدن است. کاهش SOD و افزایش MDA باعث استرس اکسیداتیو و آسیب سلولی و در نتیجه مرگ سلولی می شود [24]. مطالعات NOX{2}} را به عنوان منبع ROS نشان دادند [20،25]. APO، یک مهارکننده قوی NOX-2 [26]، می‌تواند در مهار NOX-2 برای جلوگیری از آسیب بافت به دلیل استرس اکسیداتیو مؤثر باشد.

تجویز APO می تواند اثر درمانی بر پارامترهای استرس اکسیداتیو و آسیب هیستوپاتولوژیک داشته باشد. این مطالعه با هدف بررسی اثرات MSG بر آسیب بافت بیضه، تکثیر سلولی، آپوپتوز و استرس اکسیداتیو نشان‌دهنده NOX{0}} و بر سد خونی بیضه انجام شد. علاوه بر این، این مطالعه با هدف بررسی اینکه آیا آپوسینین می‌تواند اثرات روی همه این پارامترها را بهبود بخشد، انجام شد.

2. مواد و روشها

2.1. طراحی تجربی

این مطالعه تجربی توسط کمیته اخلاق حیوانات آزمایشی دانشگاه Acibadem Mehmet Ali Aydinlar (ACU-HADYEK، شماره تأیید: HDK2020/39) تأیید شد. در این مطالعه، 8-موش‌های صحرایی نر یک هفته‌ای اسپراگ داولی (تعداد=32) در قفس‌هایی با دمای 2±22 درجه سانتی‌گراد و نور/تاریکی استاندارد (12:12 ساعت) نگهداری شدند. چرخه موش‌ها به مدت 28 روز از دوره آزمایشی با غذای استاندارد حیوانی به طور آزاد تغذیه شدند. این تحقیق توسط دستورالعمل ها و مقررات ARRIVE (تحقیقات حیوانی: گزارش آزمایش های درون بدن) انجام شده است. در این مطالعه، موش‌های صحرایی نر Sprague Dawley (n=8 در هر گروه) به‌طور تصادفی به 4 گروه کنترل، APO، MSG و MSG به اضافه APO تقسیم شدند. آب مقطر (1 میلی‌لیتر) به‌مدت 28 روز با گاواژ خوراکی به گروه کنترل موش‌ها داده شد. به گروه‌های MSG و MSG به اضافه APO 120 میلی‌گرم بر کیلوگرم MSG توسط گاواژ خوراکی به مدت 28 روز متوالی داده شد [4]. گروه های APO و MSG به اضافه APO 25 mg/kg APO توسط گاواژ خوراکی در 5 روز آخر آزمایش تجویز شدند [27]. وزن موش‌ها در گروه‌های آزمایشی به صورت هفتگی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. پس از بیهوشی ایزوفلوران، موش ها قربانی شدند. نمونه‌های خون و همچنین نمونه‌های بافت بیضه و اپیدیدیم برای ارزیابی‌های بیوشیمیایی و میکروسکوپی استفاده شد.

2.2. اندازه گیری غلظت سرمی تستوسترون، FSH و LH

غلظت سرمی تستوسترون، هورمون محرک فولیکول (FSH) و هورمون لوتئینه کننده (LH) با استفاده از کیت های سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) اندازه گیری شد. تستوسترون موش (شماره کاتالوگ: EA0023Ra، کیت الایزا آزمایشگاه فناوری زیست سنجی)، FSH موش (شماره کاتالوگ: EA0015Ra، آزمایشگاه فناوری زیست سنجش، شانگهای، چین)، و موش صحرایی LH ELISA (شماره کاتالوگ: EA0013Ra) Technology استفاده شد. تجزیه و تحلیل سطح هورمون با توجه به روش کیت. نتایج تستوسترون به صورت nmol/L و FSH و LH به صورت mIU/L داده شد.

2.3. اندازه گیری سطوح MDA، GSH و SOD بیضه

سطوح MDA با استفاده از یک کیت تجاری (E-BC-K025-M، Elabscience، هیوستون، TX، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد. MDA، یکی از محصولات تخریب پراکسیداسیون لیپیدی، با اسید تیوباربیتوریک (TBA) واکنش می دهد و یک کمپلکس صورتی با حداکثر جذب 532 نانومتر تشکیل می دهد. سطوح MDA در بافت بر حسب nmol/g محاسبه شد. آنالیز GSH در بافت بیضه طبق روش بیتلر [28] انجام شد. اصل روش بر این واقعیت استوار است که GSH در لوله آنالیز با 5،50 -دیتیوبیس-2-نیتروبنزوئیک اسید (DTNB) واکنش می‌دهد تا رنگی مایل به زرد بدهد. شدت نور این رنگ در اسپکتروفتومتر در طول موج 410 نانومتر خوانده شد. هموژن های بافتی سانتریفیوژ شدند و یک محلول TCA 10 درصد به مایع رویی به دست آمده اضافه شد، مخلوط شد و دوباره سانتریفیوژ شد تا پروتئین ها رسوب کنند. مایع رویی رنگ روشن برای تجزیه و تحلیل GSH استفاده شد. شدت رنگ تشکیل‌شده در نمونه‌هایی که به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری می‌شوند در طول موج 410 نانومتر در اسپکتروفتومتر خوانده شد و سطوح GSH بر حسب میکرومول بر گرم در بافت با استفاده از منحنی استاندارد گلوتاتیون تعیین شد. فعالیت SOD با استفاده از کیت تعیین SOD Sigma (E-BC-K{14}}M, Elabscience, Houston, TX, USA) تعیین شد. مقادیر جذب در 450 نانومتر پس از انکوباسیون فعالیت SOD با یک محلول آنزیمی خوانده شد. سطح SOD در بافت بر حسب واحد بین المللی در گرم محاسبه شد

2.4. تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم

نمونه‌های بافت اپیدیدیم از موش‌ها در محلول Earle's Balanced Salts با محلول بافر Hepes قرار داده شد و برای تجزیه و تحلیل تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم بر اساس مطالعه قبلی پردازش شد [27]. به طور خلاصه، نمونه‌های بافت اپیدیدیم موش‌ها به محلول Earle's Balanced Salts با محلول بافر هپس پس از تشریح به آن‌ها اضافه شد. برای ارزیابی اسپرم از روش شیب چگالی معمولی استفاده شد. مایع رویی برداشته شد و پلت با یک محیط شستشوی اسپرم (SAGE, Newcastle upon Tyne, UK) رقیق شد و سانتریفیوژ شد. سپس پلت با یک محیط آماده سازی اسپرم (SAGE، انگلستان) رقیق شد. گلوله 10 میکرومتری برای شمارش اسپرم در یک محفظه شمارش Macler (Sefi cut out Medical Instruments, Haifa, Israel) با فوتومیکروسکوپ برای شمارش آنها استفاده شد. برای ارزیابی مورفولوژیک، اسمیر تهیه شد و سپس با استفاده از کیت Diff-Quick (Medion Diagnostics، Grafelfing، مونیخ، آلمان) رنگ‌آمیزی شد. در هر اسلاید، 100 اسپرم با بزرگنمایی 100× با فوتومیکروسکوپ (Zeiss A1 Axio Scope، Oberkochen، آلمان) برای ارزیابی مورفولوژی اسپرم مورد بررسی قرار گرفت.

2.5. پردازش بافت برای میکروسکوپ نوری

بافت های بیضه با محلول Bouin برای بررسی های بافت شناسی معمول تثبیت شدند. برای بررسی های ایمونوهیستوشیمی، بافت های بیضه با محلول 4 درصد پارافورمالدئید (PFA) تثبیت شدند. پس از تثبیت، بافت ها تحت یک روش معمول جاسازی پارافین قرار گرفتند [29]. رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) برای ارزیابی بافت شناسی معمول بر روی مقاطع اعمال شد. یک واکنش پریودیک اسید-شیف (PAS) برای آشکار کردن ساختار غشای پایه لوله‌های اسپرم ساز اعمال شد. لوله های اسپرم ساز در مقاطع بیضه رنگ آمیزی شده با H&E بر اساس پارامترهای امتیازدهی هیستوپاتولوژیک اصلاح شده جانسن [30،31] نمره گذاری شدند. همچنین ضخامت اپیتلیال 100 لوله اسپرم ساز در تمامی مقاطع با استفاده از برنامه Image J (نرم افزار Image J، موسسه ملی بهداشت) اندازه گیری شد.

2.6. ایمونوشیمی دی اکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

روش برچسب گذاری انتهایی دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز dUTP (TUNEL) بر روی بخش های بافت بیضه مطابق دستورالعمل کیت ارائه شده توسط سازنده (ApopTag Plus، کیت تشخیص آپوپتوز درجا، S7101، Merck Millipore، دارمشتات، آلمان) اعمال شد. به طور خلاصه، پس از پارافین زدایی و هیدراتاسیون مجدد، مقاطع در PBS شسته و سپس در مایکروویو در بافر سیترات حرارت داده شدند. پس از سرد شدن، پروتئیناز K (20 میکروگرم بر میلی لیتر) بر روی مقاطع بافتی ریخته شد. بخش ها در آب مقطر شسته و در محلول 3 درصد پراکسید هیدروژن خیسانده شدند. پس از شستشو در PBS، یک تامپون تثبیت کننده 10 میکرولیتری به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق روی مقاطع قرار داده شد. سپس 10 میکرولیتر آنزیم Tdt چکانده شد و مقاطع به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. بافر توقف شستشو به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق چکه شد. پس از شستشو با PBS، 13 میکرولیتر آنتی دیگوکسیژنین بر روی مقاطع ریخته شد. پس از انکوباسیون در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه، بخش ها 4 بار به مدت 2 دقیقه در PBS شسته شدند. سپس 13 میکرولیتر محلول 3،3'-دیامینوبنزیدین (DAB) چکه شد. سپس برش ها با آب مقطر تکان داده شدند. برای رنگ آمیزی کنتراست، مقاطع در محلول مایر هماتوکسیلین (JT Baker, Center Valley, PA, USA) خیسانده شدند. پس از شستشو در آب مقطر قطعات با ایتالیایی سوار شدند. مقاطع با میکروسکوپ نوری (Zeiss A1 Axio Scope، Oberkochen، آلمان) تصویربرداری شدند. شاخص آپوپتوز با تقسیم تعداد کل لوله های بیضه بر تعداد لوله های اسپرم ساز با 3 یا بیشتر سلول های TUNEL مثبت برآورد شد [32].

2.7. آنتی ژن هسته ای تکثیر شونده (PCNA) ایمونوهیستوشیمی

برش ها برای تعیین تعداد سلول های پرولیفراتیو و شاخص تکثیر تحت آزمایش ایمونوهیستوشیمی PCNA قرار گرفتند. پس از پارافینیزاسیون و آبرسانی مجدد، بخش ها برای ایمونوهیستوشیمی PCNA همانطور که در مطالعه قبلی توضیح داده شد، پردازش شدند [32]. به طور خلاصه، مقاطع در محلول پراکسید هیدروژن 3 درصد (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) به مدت 20 دقیقه نگهداری شدند. بخش ها در اجاق مایکروویو با قدرت 200 وات در بافر اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) به مدت 20 دقیقه گرم شدند. پس از 3 بار شستشو با PBS، مقاطع به مدت 10 دقیقه در محلول مسدود کننده سرم 5 درصد بز (Invitrogen، Waltham، MA، USA) خیسانده شدند. سپس، آنتی بادی ضد PCNA خرگوش اولیه (شماره کاتالوگ: SY{12}}، Novus Biologicals، Littleton، CO، USA) (1:50) اعمال شد. بخش ها در یک محفظه مرطوب در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت یک شب نگهداری شدند و هر بار 3 بار با PBS به مدت 5 دقیقه شسته شدند. آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش بز نشاندار شده با بیوتین (شماره کاتالوگ: A16100، Invitrogen، Waltham، MA، USA) (1:500) روی بخش ها ریخته شد و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. استرپتاویدین پراکسیداز (Invitrogen، Waltham، MA، USA) به بخش ها تزریق شد و به مدت 10 دقیقه باقی ماند. پس از 3 بار شستشو با PBS، بخش ها در 3 کروموژن دی آمینو بنزیدین (DAB) (1 میلی لیتر بستر DAB به اضافه 30 میکرولیتر کروموژن DAB) به مدت 5 دقیقه خیس شدند. پس از شستشو با آب مقطر، مقاطع با محلول هماتوکسیلین مایر برای رنگ آمیزی کنتراست رنگ آمیزی شدند. سپس مقاطع با ژلاتین گلیسرول کایزر سوار شدند (شماره کاتالوگ: 1.09242، سیگما-آلدریش، دارمشتات، آلمان). مقاطع زیر میکروسکوپ نوری (A1 Axio Scope، Oberkochen، Zeiss، آلمان) مورد بررسی قرار گرفتند. برای تعیین شاخص تکثیر، تعداد سلول های PCNA مثبت در 20 توبول در هر بخش بر تعداد کل سلول ها تقسیم شد [32].

2.8. ایمونوهیستوشیمی ZO-1 و اکلودین

مقاطع بافت ثابت شده با PFA 4 درصد پارافین زدایی شدند و با محلول های الکلی هیدراته شدند. سپس بخش ها در محلول پراکسید هیدروژن 3 درصد (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) به مدت 20 دقیقه خیس شدند تا آنزیم های درون زا مسدود شوند. پس از شستشو با PBS، مقاطع در مایکروویو با قدرت 200 وات در بافر EDTA (سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) گرم شدند. مقاطع به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق خنک شدند و 3 بار به مدت 5 دقیقه در PBS و سپس 10 دقیقه در سرم بز بافر 10 درصد (Invitrogen، USA) نگهداری شدند. بخش‌ها با rabbit anti-ZO{13}} (کاتالوگ شماره: 61-7300، Invitrogen، Waltham، MA، USA) و rabbit anti-occludin (1:100) درمان شدند (کاتالوگ شماره: {{18} }، Invitrogen، Waltham، MA، USA) آنتی بادی (در طول شب، در دمای +4 ◦C). پس از شستشوی 3 بار در PBS به مدت 5 دقیقه، یک آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش نشاندار شده با بیوتین (کاتالوگ شماره: 65-6140، Invitrogen، Waltham، MA، USA) (1:1000) روی بخش ها ریخته شد. پس از خیساندن در PBS 3 بار و 5 دقیقه، استرپتاویدین پراکسیداز (Invitrogen، Waltham، MA، USA) بر روی مقاطع اعمال شد. پس از شستشو در PBS، AEC Single/Plus Chromogen (Abcam، کمبریج، انگلستان) ریخته شد، و بخش ها با آب مقطر تکان داده شدند و با ژلاتین گلیسرول Kaiser سوار شدند (شماره کاتالوگ: 1.09242، Sigma-Aldrich، دارمشتات، آلمان). مقاطع با استفاده از میکروسکوپ نوری (A1 Axio Scope، Oberkochen، Zeiss، آلمان) تصویربرداری شدند. شدت رنگ‌پذیری ZO{33}} و اکلودین با استفاده از برنامه Image J (نرم‌افزار 1.44، مؤسسه ملی بهداشت) محاسبه شد.

2.9. ZO-1، Occludin و NOX-2 آنالیز ایمونوفلورسانس

مقاطع در پراکسید هیدروژن 3 درصد نگهداری و با PBS شسته شدند. سپس، بخش‌ها با ضد زوای خرگوش-1(1:100) ZO-1(شماره کاتالوگ: 61-7300، Invitrogen، Waltham، MA، USA)، خرگوش آنتی اکلودین (1) انکوبه شدند. :100) (شماره کاتالوگ: 71-1500، اینویتروژن، ایالات متحده آمریکا)، و آنتی بادی های اولیه خرگوش ضد NOX-2 (1:100) (شماره کاتالوگ: NBP2-41291، Novus، BioTechne، مینه سوتا، ایالات متحده آمریکا). اسلایدها با PBS شسته شدند و سپس با AF 488 (شماره کاتالوگ: ab150077، Abcam، ایالات متحده) با برچسب آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش بز (1:1000) انکوبه شدند. پس از شستشوی مقاطع با PBS برای آخرین بار، آنها با محلول 406- دیامینو-2-فنیل آیدل (DAPI) (شماره کاتالوگ: ab104139، Abcam، بوستون، MA، ایالات متحده آمریکا) سوار شدند. مقاطع با میکروسکوپ فلورسانس (میکروسکوپ Zeiss Axio Scope.A1 با ضمیمه فلورسانس دوربین Zeiss AxioCam MRc 5) تصویربرداری شدند. شدت فلورسانس در بخش های عکس گرفته شده با استفاده از برنامه Image J (نرم افزار Image J، موسسه ملی بهداشت) محاسبه شد.

2.10. پردازش بافت برای میکروسکوپ الکترونی انتقالی

نمونه های بافت بیضه با محلول گلوتارآلدئید 2.5 درصد بافر (در 0.1 مولار PBS، pH 7.2) تثبیت شدند و برای آماده سازی معمول میکروسکوپی الکترونی عبوری طبق پروتکل منتشر شده قبلی [32] پردازش شدند. مقاطع تحت یک میکروسکوپ الکترونی عبوری (TALOS L 120 C، Thermo Scientific Fisher، آیندهوون، هلند) آنالیز شدند.

2.11. تحلیل آماری

داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون های مقایسه چندگانه توکی با p < 0 تجزیه و تحلیل شدند.05 معنی دار در نظر گرفته شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از Graph Pad Prism 8.0 (San Diego, CA, USA) انجام شد.

سیستانچ چگونه تستوسترون را افزایش می دهد؟

سیستانچ گیاهی است که به طور سنتی در طب چینی برای تقویت انرژی، میل جنسی و نشاط کلی استفاده می شود. اعتقاد بر این است که سیستانچ ممکن است با مهار فعالیت آنزیمی به نام آروماتاز، که تستوسترون را به استروژن تبدیل می کند، سطح تستوسترون را افزایش دهد. سیستانچ همچنین تولید هورمون لوتئینیزه کننده (LH) را در بدن افزایش می دهد. LH نقش مهمی در تنظیم تولید تستوسترون در بیضه ها ایفا می کند. با افزایش سطح LH، سیستانچ ممکن است به طور غیر مستقیم تولید تستوسترون را افزایش دهد. علاوه بر این، سیستانچ همچنین حاوی چندین ماده شیمیایی گیاهی مانند اکیناکوزید و اکتئوزید است که دارای خواص آنتی اکسیدانی هستند. این ترکیبات ممکن است به محافظت از بیضه ها و سایر اندام های تولید مثل در برابر آسیب اکسیداتیو کمک کنند، در نتیجه عملکرد آنها را بهبود بخشیده و تولید تستوسترون را افزایش می دهند. به طور کلی، مکانیسم های دقیق افزایش سطح تستوسترون Cistanche به طور کامل شناخته نشده است، اما احتمالاً اثر متقابل مهار آروماتاز، افزایش تولید LH و ارائه حمایت آنتی اکسیدانی برای سیستم تولید مثل است.

ادامه دارد...

Merve Acikel-Elmas 1,*, Salva Asma Algilani 1, Begum Sahin 1, Ozlem Bingol Ozakpinar 2, Mert Gecim 2, Kutay Koroglu 3 و Serap Arbak 1

1 گروه بافت شناسی و جنین شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه Acibadem Mehmet Ali Aydinlar، Icerenkoy Mah.، Kayisdagi Cad. ترکیه 34752 استانبول آتاشهیر پلاک 32

2 گروه بیوشیمی، دانشکده داروسازی، دانشگاه مرمره، Basibuyuk Yolu، 4/A، Basibuyuk، استانبول 34854، ترکیه

3 گروه بافت شناسی و جنین شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه مرمره، Basibuyuk Yolu شماره 9 D:2، Maltepe، استانبول 34854، ترکیه