خواص ضد ملانوژنز و ضد تیروزیناز Pistacia atlantica subsp. عصاره موتیکا روی سلول های ملانوما موشی B16F10

مخاطب: ali.ma@wecistanche.com

سمیرا اقبالی-فریز1، اکرم طالقانی2، هادی النجار3، سید احمد امامی1، هما رحیمی4، جواد اصیلی1، سمیرا حسن زاده1، و زهرا طیارانی نجاران5،*

خلاصه:Pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. موتیکا در طب سنتی مورد استفاده قرار گرفته است و به دلیل خواص دارویی آن مشهور است. هدف از این مطالعه بررسی اثر متانول (MeOH)، n-هگزان، دی کلرومتان (CH2Cl2)، n-بوتانول (BuOH)، اتیل استات (EtOAc)، عصاره آبی و اسانس P. atlantica subsp. موتیکا بر سنتز ملانین و استرس اکسیداتیو در رده سلولی ملانوم B16F10 بقای سلول های B16F10 پس از تیمار با افزایش غلظت عصاره های مختلف گیاه (0.{9}} میکروگرم در میلی لیتر) با استفاده از رسازورین اندازه گیری شد. ترکیب اسانس با تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی گازی- طیف سنجی جرمی (GC-MS) و اثر بازدارنده بر سنتز ملانین، قارچ شناسایی شد.تیروزینازفعالیت، تیروزیناز سلولی و استرس اکسیداتیو با استفاده از روش های رنگ سنجی و فلورومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. داده‌ها عصاره‌ها را در غلظت‌های 0 نشان دادند.2-200 میکروگرم در میلی‌لیتر، سمیت قابل‌توجهی بر سلول‌های ملانوما نشان نداد، اما غلظت‌های 200 میکروگرم در میلی‌لیتر اسانس دارای اثر سیتوتوکسیک بود. Pistacia atlantica subsp. mutica می تواند قارچ را مهار کندتیروزینازفعالیت. همچنین میزان ملانین در سلول های B16F10 کاهش یافت. علاوه بر این، توانایی P. atlantica subsp. عصاره موتیکا در کاهش میزان گونه های فعال اکسیژن در سلول های ملانوما قابل توجه بود.آنتی اکسیدانفعالیت. علاوه بر این، تمامی غلظت‌های اسانس اثر معنی‌داری در این مطالعه نداشتند. اینملانوژنزبازدارنده وآنتی اکسیداناثرات P. atlantica subsp. mutica روی سلول‌های B16F10 ممکن است فعالیت سفید کنندگی بالقوه این گیاه را برای استفاده در محصولات مراقبت از پوست و پیشگیری از پیری پوست در صنایع آرایشی نشان دهد.کلید واژه ها:ضدتیروزیناز; ملانوژنز; P. atlantica subsp. موتیکا

کلیک کنید تافواید سیستانچ برای آنتی اکسیدان

مقدمه

ملانین یک رنگدانه پوستی است که در ملانوزوم ها سنتز می شود و در طول فرآیند فیزیولوژیکی به کراتینوسیت ها منتقل می شود.ملانوژنز. ملانین نقش مهمی در محافظت در برابر آسیب اشعه ماوراء بنفش دارد و رنگ پوست، مو و چشم را تعیین می کند. تولید بیش از حد ملانین به ملانوم و رنگدانه های غیر طبیعی پوست نسبت داده می شود (1-3). آنزیم کلیدی در بیوسنتز ملانین، تیروزیناز است که دو واکنش مجزا را کاتالیز می کند، اکسیداسیون 3،4-دی هیدروکسی فنیل آلانین (DOPA) به دوپاکینون و هیدروکسیلاسیون L-تیروزین به DOPA (4).تیروزینازیا پلی فنل اکسیداز یک آنزیم با عملکرد مخلوط مس است که در میکروارگانیسم ها، حیوانات و گیاهان یافت می شود (5). تیروزیناز موثرترین عامل برای قهوه ای شدن میوه ها و سبزیجات است. تولید بیش از حد و تجمع ملانین ممکن است منجر به تعداد زیادی از اختلالات پوستی از جمله ملاسما، کک و مک، ملانوز خورشیدی و لکه های پیری شود (6). از این رو،تیروزینازمهارکننده ها در صنایع غذایی و آرایشی توجه زیادی را به خود جلب کرده اند. در بسیاری از موجودات زنده، اکسیداسیون برای تولید انرژی برای سوخت فرآیندهای بیولوژیکی ضروری است.

با این حال، پراکسید هیدروژن (H2O2) و سایر گونه‌های اکسیژن فعال (ROS)- باعث مرگ سلولی و آسیب بافتی در بسیاری از پدیده‌های فیزیولوژیک و پاتولوژیک از جمله افزایش ROS به دنبال تابش اشعه ماوراء بنفش در طول فرآیند ملانوژنز می‌شوند. همچنین، به خوبی شناخته شده است که تولید ROS ناشی از UV در پاتوژنز چندین بیماری پوستی از جمله پیری، چین و چروک، حساسیت به نور و بدخیمی نقش دارد (7). بنابراین، یافتن منابع طبیعی ازآنتی اکسیدان هابا ضدتیروزینازفعالیت به اصلاح آسیب های پوستی مربوط به بیش از حد کمک می کندملانوژنز (4).

جنس Pistacia عضوی از خانواده Anacardiaceae است که حدود 9 گونه را شامل می شود و بیشتر در منطقه مدیترانه، اروپا و برخی از مناطق آسیا پراکنده است (8،9). Pistacia atlantica (P. atlantica)Desf. دارای 3 زیرگونه به نام های: P. atlanticasubsp. kurdica (Zohary) Rech. f.، P. atlanticasubsp. mutica (Fischer & CA Meyer) Rech. f. و P. atlantica subsp. cabulica (سهام) Rech. f. سه زیرگونه ذکر شده P. atlantica، P. khinjuk Stocks و P. vera L. در ایران رشد می کنند (10). میوه های P. atlanticasubsp. mutica یعنی بانه گرد تا بیضی با قطر 0.{6}}.7 سانتی متر است. فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد سرطانی پوسته P. atlantica به محتوای بالای فنول کل گیاه مربوط می شود. P. atlantica به طور سنتی برای تسکین ناراحتی و درد فوقانی شکم، سوء هاضمه و زخم معده استفاده می شود (11-13). با این حال، هیچ مطالعه ای در مورد فعالیت مهاری ملانوژنز P. atlantica subsp وجود ندارد. موتیکا بنابراین، در این پروژه، سلول‌های ملانوما B16F10 را برای بررسی خواص آنتی اکسیدانی و ضد ملانوژنیک P. atlantica subsp انتخاب می‌کنیم. عصاره های موتیکا هدف از این مطالعه بررسی اثر بازدارندگی عصاره های متانول (MeOH)، n-هگزان، دی کلرومتان (CH2Cl2)، n-بوتانول (BuOH)، اتیل استات (EtOAc)، آب (H2O) و اسانس فسفر بود. atlanticasubsp. میوه موتیکا رویملانوژنزو برای ارزیابی پتانسیلآنتی اکسیدانظرفیت گیاه بر روی سلول های ملانوما B16F10.

مواد و روش ها

مواد شیمیایی

قارچتیروزینازاز آگاریکوس بیسپروس، کوجیک اسید، رزازورین، ال-3،4-دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA)، دی کلرو دی هیدرو فلورسین دی استات (DCFH-DA)، اگتازیک اسید (EGTA)، دی متیل سولفوکسید (DMSO) ، فنیل متیل سولفونیل فلوراید، گلیسروفسفات، مرکاپتواتانول، سالین بافر فسفات (PBS)، سدیم ارتووانادات، تریس بافر سالین توئین 20 (TBST) خریداری شده از سیگما (ایالات متحده آمریکا). سرم جنین گاو (FBS)، پنی سیلین، استرپتومایسین و تریپسین-EDTA از GibcoBRL (جزیره بزرگ، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. رده سلولی ملانوما (B16F10، Cat. No C540) از انستیتو پاستور ایران (تهران، جمهوری اسلامی ایران) خریداری شد. تمام مواد شیمیایی و حلال های دیگر از Merck (آلمان) بودند.

تهیه عصاره

P. atlantica subsp. mutica در اردیبهشت 1393 از کوه های بردسکن، استان خراسان رضوی، شمال شرق ایران جمع آوری و توسط خانم م سوزنی شناسایی شد. یک نمونه کوپن (شماره: 13069) در هرباریوم دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، جمهوری اسلامی ایران سپرده شد. میوه نارس P. atlantica subsp. mutica (200 گرم) توسط مخلوط کن (شرکت توس چکان، IR ایران) زمین شد و سپس طبق پروتکل گزارش شده قبلی به مدت 24 ساعت با MeOH در دمای اتاق نفوذ کرد (14). پس از استخراج، حلال با استفاده از اواپراتور چرخشی تبخیر شد و سپس خشک شد. عصاره متانولی (94 گرم) بیشتر توسط پارتیشن حلال-حلال تکه تکه شد تا پنج فراکسیون مختلف از جمله MeOH، n-هگزان، CH2Cl2، BuOH، EtOAc و H2O بدست آورد.

جداسازی اسانس

میوه نارس P. atlantica subsp.mutica (15{3}} گرم) با استفاده از دستگاه کلونجر به مدت 3 ساعت تحت تقطیر با آب قرار گرفت. روغن بی رنگ با بازده 0.8 درصد (v/w) به دست آمد. اسانس به دست آمده روی سولفات سدیم بی آب خشک شده و تا آزمایش بعدی در دمای 4 درجه در تاریکی نگهداری شد.

گاز کروماتوگرافی و گاز کروماتوگرافی طیف سنجی جرمی

تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی گازی (GC) با استفاده از یک Varian CP{{0}} مجهز به آشکارساز FID، متصل به یک ستون سیلیس ذوب شده (CP-Sil 8CB، 50 m×0.25) انجام شد. میلی متر، ضخامت فیلم 0.12 میکرومتر) در شرایط زیر: دمای فر 50-250 درجه با نرخ 3 درجه در دقیقه. دمای انژکتور 260 درجه، نسبت تقسیم 1:5، با گاز حامل، سرعت جریان N2 2 میلی لیتر در دقیقه. دمای آشکارساز 280 درجه

آنالیزهای گاز کروماتوگرافی جرمی (GC-MS) با استفاده از دستگاه Agilent 5975 مجهز به ستون HP{4}} MS (30 m × 0.25 mm × ID, {{ 14}}.25 میکرومتر ضخامت فیلم) با یک آشکارساز جرم چهارگانه و یک کامپیوتر مجهز به کتابخانه Wiley 7n.L در ارتباط است. دمای کوره 50-250 درجه با سرعت 3 درجه در دقیقه، دمای انژکتور 250 درجه، حجم تزریق: 0.1 میکرولیتر، تزریق تقسیم شده با نسبت تقسیم 1:50، با سرعت جریان گاز حامل (هلیوم) 1 میلی لیتر/ دقیقه، منبع یون: 70 eV، جریان یونیزاسیون: 150 µA، و محدوده اسکن: 35-465. شناسایی اجزای اسانس بر اساس کروماتوگرافی گازی احتباس به‌دست‌آمده با اشاره به سری n-آلکان (C{23}}C20) در ستون HP{25}}MS، مقایسه طیف جرمی و الگوهای تکه تکه‌شدن آنها گزارش شد. در ادبیات، و تطبیق کامپیوتر با کتابخانه Wiley 7n.L (15). کمی سازی مقدار نسبی اجزای جداگانه میوه نارس بر اساس روش درصد سطح بدون در نظر گرفتن فاکتور کالیبراسیون انجام شد.

کشت سلولی

رده سلولی ملانوما، B16F10، در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب (90 درصد) حاوی 5 درصد CO2 نگهداری می شود. سلول ها در RPMI{6}} (Bioidea، ایران) با 10 درصد (v/v) FBS، 100 IU/mL پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین کشت داده شدند. محلول سهام P. atlantica subsp. موتیکا با غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر در DMSO تهیه شد و در درجه -40 نگهداری شد. کوجیک اسید (2 و 4 میلی مولار) به عنوان کنترل مثبت در تمام آزمایش ها استفاده شد. سلول ها در صفحات چاهک با تراکم 105 سلول در میلی لیتر کشت داده شدند. فعالیت عصاره در هر آزمایش با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:

درصد فعالیت=جذب نمونه/جذب کنترل*100

سنجش بقای سلولی

Resazurin یک شاخص سلامت سلولی است که از قدرت کاهنده سلول زنده استفاده می کند و به resorufin تبدیل می شود. Resazurin یک ترکیب آبی، غیر سمی، غیر فلورسنت و نفوذپذیر از سلول است که به رنگ قرمز و در سلول های زنده به رزوروفین بسیار فلورسنت تبدیل می شود (16). حدود 104 سلول ملانوم B16F10 در هر چاهک 96-صفحه میکرووله کاشته شد و با غلظت‌های مختلف عصاره و اسانس P. atlantica subsp. mutica (0.{8}} میکروگرم در میلی لیتر). پس از 4 ساعت انکوباسیون، جذب رزازورین و رزوروفین در طول موج‌های 570 و 600 نانومتر با استفاده از میکروپلیت‌خوان هیبریدی چند حالته H4 (BioTek، Winooski، ایالات متحده آمریکا) اندازه‌گیری شد. هر آزمایش در سه تکرار انجام شد. نیمه حداکثر غلظت مهاری (IC50) با استفاده از نرم افزار GraphPad از منحنی غلظت-اثر: غلظت ورود به سیستم در مقابل پاسخ محاسبه شد.

سنجش فعالیت تیروزیناز قارچ

فعالیت قارچتیروزینازدر اکسیداسیون L-DOPA به روش اسپکتروفتومتری همانطور که قبلا توضیح داده شد (17)، با برخی تغییرات اندازه گیری شد. به طور خلاصه، 160 میکرولیتر از 5 میلی‌مولار L-DOPA (در بافر 100 میلی‌مولار فسفات سدیم pH 6.8) و 20 میکرولیتر از همان بافر با و بدون P. atlanticasubsp. عصاره موتیکا و اسانس ({9}} میکروگرم در میلی لیتر) با 20 میکرولیتر تیروزیناز قارچ (200 واحد در میلی لیتر) مخلوط و سپس در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. جذب در 475 نانومتر با میکروپلیت خوان Hybrid Multi-Mode Synergy H4 (BioTek, Winooski, USA) اندازه گیری شد.

تعیین محتوای ملانین در سلول های ملانوما

سلول های ملانوما، B16F1{5}}، با تراکم 105 سلول در هر چاهک در 96-صفحه های کشت چاه کاشته شدند و به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس آنها با غلظت‌های مختلف (0.{6}} میکروگرم در میلی‌لیتر) از P. atlantica subsp انکوبه شدند. عصاره موتیکا و اسانس به مدت 24 ساعت. محتوای ملانین همانطور که قبلا توضیح داده شد اندازه گیری شد (18). پس از درمان، سلول ها با استفاده از تریپسین جمع آوری شدند. آنها با PBS شسته شدند. گلوله های سلولی به مدت 60 دقیقه در 60 درجه در محلول 50 میکرولیتری هیدروکسید سدیم (2 مولار) حل شدند. محتوای ملانین با اندازه‌گیری جذب در 405 نانومتر با دستگاه میکروپلیت خوان Hybrid Multi-Mode Synergy H4 (BioTek، Winooski، ایالات متحده آمریکا) اندازه‌گیری شد.

سنجش فعالیت تیروزیناز سلولی

اکسیداسیون DOPA به کروم DOPA توسط اسپکتروفتومتری به عنوان شاخص مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.تیروزینازفعالیت (18). 106 سلول B16F10 ملانوم در طول شب در هر چاهک صفحه چاهک کاشته شد. پس از تیمار سلول با غلظت‌های مختلف (0.2-200 میکروگرم در میلی‌لیتر) P. atlantica subsp. عصاره موتیکا و اسانس به مدت 24 ساعت، سلول ها با استفاده از تریپسین جدا شدند. با PBS شسته و با 50 میکرولیتر بافر فسفات سدیم (pH 6.8، 100 میلی‌مولار) حاوی 1 درصد تریتون X{13}} و 0.1 میلی‌مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید لیز شد. لیزات با سرعت 10،{17}} دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند. 100 میکرولیتر از هر لیزات (هر کدام حاوی 100 میلی گرم پروتئین) با 30 میکرولیتر DOPA 5 میلی‌مولار در پلیت 96 چاهی مخلوط شد و در دمای 37 درجه به مدت 2 ساعت انکوبه شد، جذب در 475 نانومتر با میکروپلیت خوان Hybrid Multi-Mode Synergy H4 اندازه‌گیری شد. (BioTek, Winooski, USA).

تعیین سطح گونه های اکسیژن فعال سلولی

سطح گونه های اکسیژن فعال همانطور که قبلاً با تغییرات جزئی توضیح داده شد اندازه گیری شد (19). سلول های ملانوما، B16F10، (2 × 104) یک شبه در 96-صفحه های چاهک کاشته شدند و سپس با غلظت های مختلف (0.{7}} میکروگرم در میلی لیتر) P. atlantica subsp تحت تیمار قرار گرفتند. . عصاره موتیکا و اسانس به مدت 24 ساعت. سپس سلول ها با 50 میکرولیتر H2O2 (24 میلی مولار) در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. سپس 50 میکرولیتر DCFH-DA به سلول ها اضافه شد و شدت فلورسانس DCF در گسیل 504 نانومتر و تحریک 524 نانومتر با استفاده از میکروپلیت خوان Synergy H4 (BioTek، ایالات متحده آمریکا) اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سلول های ملانوما، B16F10 در فلاسک های 75 سانتی متر مکعبی با و بدون عصاره متانولی ({17}}.{5}} میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. سپس سلول ها در یک بافر (5{29}} میلی مولار tris-HCl، pH 7.4، 2 میلی مولار EGTA، 1 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید، 10 میلی مولار گلیسروفسفات، 10 میلی مولار - مرکاپتواتانول، 1 میلی مولار سدیم اورتوکسیلیک اسید، 1 میلی‌مولار اسید اورکوکسیلیک 1 درصد، 1 میلی‌مولار اورکوکسیلیک اسید، 1 میلی‌مولار EGTA) لیز شدند. نمک سدیم). مقدار مساوی پروتئین (50 میکروگرم) روی الکتروفورز ژل دودسیل سولفات سدیم (SDS)-پلی آکریل آمید 12 درصد بارگذاری و به غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید منتقل شد. غشاها به مدت 2 ساعت در شیر بدون چربی 10 درصد در TBST (20 میلی مولار tris-HCl pH 7.4، 100 میلی مولار NaCl و 0.1 درصد توئین 20) بافر در دمای اتاق مسدود شدند. پس از شستشو با بافر TBST، غشا در طول شب با یک آنتی بادی اولیه انکوبه شد: 1:300 (ضد خرگوشتیروزینازآنتی بادی (سانتا کروز بیوتکنولوژی، CA)). پس از شستشوی 3 بار با بافر TBST، غشاها به مدت 2 ساعت با IgG ضد خرگوش (1:2000) به عنوان آنتی بادی ثانویه (سلول سیگنالینگ) انکوبه شدند. شستشوی 3 بار با بافر TBST تکرار شد و باندهای پروتئینی با استفاده از سیستم تشخیص وسترن بلات اولیه (BioRaD، ایالات متحده آمریکا) افزایش یافته شیمیایی لومینسانس (ECL) شناسایی شدند (20). آنتی بادی ضد اکتین به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد.

تحلیل آماری

نتایج نسبی آزمایش ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار سه اندازه گیری مستقل ارائه شد. آنالیز واریانس و محاسبه IC5 با GraphPad Prism 6 انجام شد. P <0.05 نشان="" دهنده="" تفاوت="" معنی="" دار="" آماری="" بین="" سلول="" های="" تیمار="" شده="" با="" عصاره="" و="" شاهد="" است.="" برای="" مقایسه="" اثر="" عصاره="" های="" مختلف="" در="" هر="" سنجش="" از="" آزمون="" آنالیز="" واریانس="" دو="" طرفه="" و="" پس="" آزمون="" مقایسه="" بونفرونی="" استفاده="">

نتایج

ترکیب اسانس

از گاز کروماتوگرافی برای تعیین کمیت و از Gc-Mass برای شناسایی ترکیبات استفاده شده است. نتایج هر دو تجزیه و تحلیل GC و GC-MS در جدول شناسایی کمی و کیفی ترکیبات ارائه شده است. در مورد P. atlanticasubsp. mutica، 68 ترکیب در اسانس شناسایی شد و 99.8 درصد از کل ترکیب اسانس را به خود اختصاص داد (جدول 1). ترکیبات گروه بندی شده اسانس به صورت هیدروکربن های مونوترپن 86.5 درصد، مونوترپن های اکسیژن دار 3.7 درصد، هیدروکربن های سسکوئی ترپن 8.7 درصد، سسکوی ترپن های اکسیژن دار 0.1 درصد، و متفرقه تعیین شد {{15} .8 درصد اجزای اصلی اسانس E-ocimene 29.7 درصد، myrcene 17.1 درصد، -Z-ocimene 17.{26}} درصد، -pinene 10.2 درصد و E-caryophyllene 7.1 درصد بودند.

تأثیر عصاره ها بر بقای سلولی

زنده ماندن سلول ها با resazurin بررسی شد. سلول های ملانوما، B16F10، در یک صفحه 96- چاه کاشته شدند. پس از 24 ساعت، سلول‌ها با غلظت‌های مختلف ({9}}.{5}} میکروگرم در میلی‌لیتر) P. atlantica subsp تیمار شدند. عصاره mutica، نتایج نشان داد که عصاره هیچ اثر سیتوتوکسیک قابل توجهی بر روی سلول های B16F10 در غلظت های مورد استفاده در این مطالعه نداشت (شکل 1). دوکسوروبیسین به عنوان کنترل مثبت به طور معنی داری باعث مرگ سلولی شد (05/0 > P).

اثر عصاره بر فعالیت تیروزیناز قارچ

اثر P. atlantica در مهار تیروزیناز قارچ در اکسیداسیون L-DOPA مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که قارچتیروزینازفعالیت توسط تمام عصاره های مختلف مهار شد، اما غلظت 1{4}}00 میکروگرم در میلی لیتر از عصاره هگزانی n-هگزانی تأثیر معنی داری در این آزمایش نداشت. اسید کوجیک (2 و 4 میلی مولار) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد (05/0 > P) (شکل 2).

تأثیر عصاره ها و اسانس ها بر سنتز ملانین

به منظور بررسی اثر عصاره های مختلف و اسانس P. atlantica subsp. بر روی سنتز ملانین، محتوای ملانین سلول‌های ملانوما B16F10 تیمار شده با عصاره مورد بررسی قرار گرفت. اسید کوجیک (2 و 4 میلی مولار) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

نتایج نشان داد که عصاره‌های MeOH، CH2Cl2 و EtOAc ({2}}.2-200 میکروگرم در میلی‌لیتر)، هگزان (2-200 میکروگرم در میلی‌لیتر)، و عصاره H2O (2{{9) }} و 200 میکروگرم بر میلی لیتر) اثر مهاری بر سنتز ملانین داشتند (05/0 > P) (شکل 3). با این حال، تمام غلظت‌های اسانس و عصاره BuOH اثر بازدارندگی معنی‌داری بر سنتز ملانین نداشتند. نتایج اسانس در شکل ها نشان داده نشده است.

اثر عصاره ها بر فعالیت تیروزیناز سلولی

برای ارزیابی مکانیسم اثر مهاری P. atlantica subsp. عصاره mutica درملانوژنزبه طور خاص، ما درون سلولی را ارزیابی کردیمتیروزینازفعالیت در سلول های ملانوم B16F10. نتایج نشان داد که عصاره‌های MeOH، EtOAc و BuOH ({5}}.{3}} میکروگرم در میلی‌لیتر)، هگزان (0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر)، و CH2Cl2 (20 و 200) میکروگرم بر میلی لیتر) عصاره P. atlantica subsp. mutica می تواند به طور قابل توجهی فعالیت تیروزیناز سلولی را مهار کند (P <0.05) (شکل="" 4)="" اما="" عصاره="" آب="" هیچ="" اثر="" مهاری="" بر="" فعالیت="" تیروزیناز="" سلولی="">

اثر عصاره ها بر سطح گونه های اکسیژن فعال سلولی

سطح ROS داخل سلولی به عنوان نشان دهندهآنتی اکسیدانظرفیت P. atlantica subsp.mutica در سلول های تیمار شده با 24 میلی مولار H2O2 به تنهایی یا با عصاره های مختلف در سلول های ملانوم B16F1 اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که تمام غلظت عصاره P. atlanticasubsp. mutica به جز 0.2 میکروگرم در میلی لیتر عصاره CH2Cl2 می تواند به طور قابل توجهی استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 را سرکوب کند (P <0.05) (شکل="">

اثر عصاره ها بر سطح پروتئین تیروزیناز سلولی

اثر درون سلولی P. atlanticasubsp. موتیکا روی پروتئین های مرتبط با ملانوژن مانند تیروزیناز به عنوان یک شاخصملانوژنزتوسط وسترن بلات ارزیابی شد. همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است،تیروزینازسطح پروتئین به طور قابل توجهی توسط P. atlantica subsp کاهش یافت. تیمار عصاره موتیکا در غلظت‌های 5/0 {0}}} و میکروگرم در میلی‌لیتر ۱۰ (۰۵/۰ > P). اکتین به عنوان کنترل داخلی استفاده شد.

تاثیر اسانس بر پارامترهای مختلف

اسانس در 0.2-200 میکروگرم در میلی‌لیتر اثر معنی‌داری بر روی تمام پارامترهای ذکر شده در بالا نشان نداد، به جز در غلظت 200 میکروگرم بر میلی‌لیتر که اثر سیتوتوکسیک بر سلول‌های ملانوما نشان داد. از این رو، نتایج اسانس در بخش نتیجه درج نمی شود زیرا هیچ اثر بازدارندگی مشاهده نشد.

بحث

محصولات آرایشی مبتنی بر طبیعی به دلیل ایمنی و فعالیت چند منظوره به طور گسترده توسط آژانس های تجاری تبلیغ می شوند. یافتن عوامل جدید ضد ملانوژن باآنتی اکسیدانفعالیت از منابع طبیعی یکی از موارد مورد علاقه در فرمولاسیون محصولات مورد استفاده برای اختلالات هایپرپیگمانتاسیون است. در فرآورده های دارویی و آرایشی به عنوان سفید کننده پوست، مهار تشکیل ملانین، از بین بردن رادیکال های آزاد و مهار کننده استفاده می شود.تیروزینازفعالیتی که برای درمان اختلالات پوستی مرتبط مهم است (21).

در این مطالعه فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های مختلف P. atlantica subsp. mutica مورد ارزیابی قرار گرفت و اثرات آنها بر فعالیت تیروزیناز و سنتز ملانین مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. عصاره MeOH و EtOAc از P. آتلانتیکا subsp. mutica قابل توجهی نشان دادآنتی اکسیدانفعالیت در 2، 20 میکروگرم بر میلی لیتر و 20، 200 میکروگرم در میلی لیتر که ممکن است به پلی فنل ها و فلاونوئیدهای موجود در گیاه نسبت داده شود. نتایج نشان داد که تمامی عصاره‌ها به‌ویژه عصاره‌های MeOH، EtOAc و H2O می‌توانند به طور قابل توجهی قارچ را مهار کنند.تیروزینازفعالیت. همچنین عصاره‌های MeOH، EtOAc و BuOH توانستند فعالیت تیروزیانز سلولی را کاهش دهند که مطابق با کاهش تولید ملانین در سلول‌ها بود. در این مطالعه، تمامی غلظت‌های اسانس اثر مهاری معنی‌داری بر تیروزیانز سلولی، سنتز ملانین وآنتی اکسیدانفعالیت. با توجه به فعالیت بیشتر عصاره MeOH در آزمایش‌های مختلف نسبت به سایر عصاره‌ها، عصاره مذکور را برای آنالیز وسترن بلات انتخاب کردیم. به طور خلاصه، اثر ضد ملانوژنی این عصاره در تمام آزمایش‌ها در سلول‌های B16F10 تأیید شد که با اسید کوجیک کنترل مثبت قابل مقایسه است (جدول 2).

عصاره‌های MeOH، CH2Cl2 و EtOAc سلولی را کاهش داده‌اندتیروزینازفعالیت، محتوای ملانین و ROS. فراکسیون های طبیعت نیمه قطبی ممکن است مواد شیمیایی گیاهی را استخراج کنند که مسئول فعالیت ضد ملانوژنی مانند پلی فنول ها و فلاونوئیدها هستند. کسر هگزان و اسانس کمتر فعال بودند که نشان می‌دهد فیتوکمیکال‌های گیاهی با طبیعت غیرقطبی و فرار تأثیر معنی‌داری بر روی گیاه ندارند.ملانوژنزفرآیند (22،23).

پلی فنول ها و فلاونوئیدها به عنوان بازدارنده های تولید ROS عمل می کنند و می توانند مسئول خواص ضد ملانوژنی عصاره های گیاهی باشند ({1}}). ترکیبات اصلی در عصاره P. atlantica subsp. موتیکا کوئرستین، لوتئولین، ایزوکورستین، روتین، لوتئولین 7-لاکتات و ترکیبات فنلی مانند اسید p-کوماریک، اسید کافئیک و اسید گالیک هستند که مسئولآنتی اکسیدانفعالیت (28). گزارش شده است که روتین فعالیت تیروزیناز را مهار می کند و به دلیل وجود گروه های هیدروکسیل یک عامل ضد رنگدانه قوی است (29). جالب توجه است که کورستین، لوتئولین و ایزوکورستین نیز دارای گروه‌های هیدروکسیل زیادی در ساختار خود هستند که آنها را برای برهمکنش با تیروزیناز و در نتیجه فعالیت ضد تیروزیناز مناسب می‌سازد (21،30). اخیراً نشان داده شده است که اثرات فلاونوئیدها مانند لوتئولین و کورستین عمدتاً از طریق مدولاسیون فاکتور رونویسی انجام می شود.ملانوژنزفاکتور رونویسی مرتبط (MITF) و/یا آنزیم های ملانوژنزتیروزیناز، DCT یا پروتئین مربوط به تیروزیناز 1 (TYRP{2}}) (31). اسید پی کوماریک و اسید کافئیک فعالیت تیروزیناز قارچ را مهار کردند و نسبت به اسید کوجیک 10- و 3- برابر قوی‌تر بودند (32).

اسید گالیک فعالیت مهاری تیروزیناز را نشان می دهد و دوپاکینون را از طریق چرخه ردوکس، مشابه اسید اسکوربیک، به L-DOPA کاهش می دهد (33). به طور مشابه، در مطالعه حاضر P. atlantica subsp. mutica سطح پروتئین تیروزیناز را در سلول ها کاهش داد که به شدت با حضور کوئرستین، لوتئولین، ایزوکورستین، روتین و سایر پلی فنول ها در گیاه همبستگی دارد.

گزارش های زیادی در مورد گیاهان وجود دارد که دارای فعالیت ضد ملانوژنیک و آنتی اکسیدانی هستند که استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد، که ممکن است پتانسیل بالایی برای درمان اختلالات پوستی داشته باشد. به عنوان مثال، عصاره های مختلف اندام های هوایی P. atlantica تنش اکسیداتیو را کاهش می دهد، که ممکن است به پلی فنول ها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین که به طور گسترده در گیاه یافت می شود نسبت داده شود (34). در مطالعه دیگری، عصاره MeOH P. vera باعث کاهش ترشح ملانین شد که به برخی نسبت داده شدآنتی اکسیدانترکیبات موجود در این گیاه این مطالعه نشان داد که اسید کوجیک به عنوان یک کنترل مثبت، مقدار IC5{1}} 0.05 میلی‌گرم در میلی‌لیتر را نشان می‌دهد و غلظت‌های بالاتر P. vera می‌تواند به عنوان یک عامل مؤثر برای درمان اختلالات پوستی مانند سرطان ملانوم استفاده شود (35). ). گورین و همکاران نشان داد که اندام های هوایی P. atlantica دارای خواص آنتی اکسیدانی قوی هستند (36). همچنین، فراکسیون های MeOH و CH2Cl2 Nepeta satureioides اثرات بالقوه ای را علیه تولید ملانین در سلول های ملانوما B16F10 نشان می دهد و ممکن است به فرمولاسیون آرایشی محصولات مراقبت از پوست کمک کند (37). مشتقات کوجیک اسید دارای فعالیت بازدارنده بودندتیروزیناز. به نظر می رسد وجود گروه هیدروکسیل آزاد و جایگزین متیل در این ترکیب، فعالیت بازدارندگی را تایید می کند. در این مطالعه اسید کوجیک (کنترل مثبت) مقدار IC5028.28 میلی مولار 0 را نشان داد (38). گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید و فلاونوئیدهای جدا شده از Teucrium polium L. var. gnaphalodes فعالیت آنتی اکسیدانی و مهاری تیروزیناز نشان داد. نویسندگان ژارانول را نشان دادند که بالاترین فعالیت مهاری تیروزیناز (IC{4}}.041 میلی مولار) را نشان داد و پولیوموزید بهترین آنتی اکسیدان در بین ترکیبات آزمایش شده بود. اسید کوجیک مقدار IC50 0.02 میلی مولار را نشان داد (39).

کاهش سطح پروتئین ازتیروزینازتوسط P. atlantica subsp. موتیکا وآنتی اکسیدانخواص و کاهش ROS استفاده از این عامل را به عنوان یک عامل ضد ملانوژنز تایید کرده است. این مطالعه برای اولین بار اثر مهاری P. atlanticasubsp را تعیین کرده است. موتیکا درملانوژنزدر سلول های ملانوما B16F10. به منظور جلوگیری از تجمع و تولید بیش از حد ملانین در پوست، مهارتیروزینازنقش مهمی دارد. از این رو، با توجه به اثر آنتی اکسیدانی گزارش شده P. atlantica subsp.mutica، ترکیبات فلاونوئیدی و فنلی از اجزای مهم گیاه مسئول فعالیت های ضد ملانوژنز و آنتی تیروزیناز P. atlantica subsp. موتیکا فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد ملانوژنیک P. atlantica subsp. mutica ممکن است یک عامل مناسب برای فرمولاسیون های سفید کننده پوست باشد و می تواند در محصولات آرایشی برای فرمولاسیون های مراقبت از پوست گنجانده شود.

نتیجه

در نتیجه، این مطالعه برای اولین بار نشان داد که عصاره MeOH و EtOAc گونه P. atlantica subsp. mutica قوی استتیروزینازفعالیت مهاری که مطابق با کاهش ملانین است. علاوه بر این، P. atlanticasubsp. mutica همچنین فعالیت مهاری بالایی را نشان داد وآنتی اکسیدانخواصی که عمدتاً می تواند به سطوح بالای فلاونوئیدها و پلی فنول های کل آن نسبت داده شود. نتایج نشان داد که توانایی P. atlanticasubsp. موتیکا برای کاهش تولید ملانین ممکن است با کاهش ROS سلولی و اثر مهاری آن در تنظیم مسیر سیگنالینگ مرتبط باشد.تیروزینازفعالیت. از آنجایی که عصاره نیمه قطبی دارای آنتی تیروزیناز و ضدملانوژنبنابراین، نتیجه می گیریم که ترکیبات مسئول این اثرات در عصاره انباشته شده اند نه در اسانس.