اثرات کاهنده دیکول بر نفروپاتی پرفشاری خون در موش های صحرایی فشار خون خود به خود

Ang II باعث انقباض عروق و در نتیجه افزایش فشار خون می شود [30]. در پرفشاری خون، RAAS به طور سیستمیک فعال می شود و تنظیم مثبت RAAS در چندین اندام، مانندکلیه[31،32]. بیش فعال شدن RAAS داخل کلیوی یک مکانیسم مهم فشار خون بالا و مزمن استبیماری کلیوی[31،32]. هر دو TGF 1 و Ang II باعث فعال شدن RAAS داخل کلیوی می شوند و بیان آنژیوتانسینوژن، رنین، ACE و AT1R را افزایش می دهند که EMT را القا می کنند [33]. در مطالعه ما، BP سیستولیک SHR ها با تجویز ECE یا DK به طور قابل توجهی کاهش یافت. سطح سرمی Ang II از SHR ها به طور قابل توجهی با تجویز ECE یا DK کاهش یافت. بیان AT1R در قشر و بصل النخاع SHR ها با تجویز ECE یا DK به طور قابل توجهی کاهش یافت.

تنظیم مثبت RAAS، مانند افزایش بیان AT1R، مسیر سیگنالینگ پایین TGF 1 را فعال می کند [34]. فعال شده توسط RAAS، TGF 1 EMT را از طریق مسیرهای وابسته به SMAD و مستقل از SMAD القا می کند [33]. به عنوان مسیر سیگنالینگ وابسته به SMAD، سیگنالینگ TGF 1 از طریق TGF RII و TGF RI انتقال داده می شود و منجر به فعال شدن SMAD2/3 می شود. [10]. SMAD4 به SMAD2/3 متصل می شود و انتقال کمپلکس SMAD را به درون هسته ترویج می کند [10]. SMADهای جابجا شده بیان ژنهای EMT مانند حلزون، Twist و ZEB را تنظیم مثبت می کنند [34]. در مطالعه ما، بیان AT1R در قشر و مدولای SHR به طور قابل توجهی بالاتر از موش های WKY بود و با تجویز ECE یا DK کاهش یافت. بیان TGF و SMAD2/3 در قشر و مدولای SHR با تجویز ECE یا DK کاهش یافت.

سیستانچ عفونت کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

EMT با از دست دادن یک نشانگر اپیتلیال، مانند E-cadherin، و دستیابی به نشانگرهای مزانشیمی، مانند -SMA، ویمنتین و فیبرونکتین مشخص می شود [35]. E-cadherin بیشترین کادرین را در سلول های اپیتلیال بیان می کند و بنابراین اغلب به عنوان نشانگر اپیتلیال استفاده می شود [36]. -SMA یک نشانگر فنوتیپی سلول های میوفیبروبلاست است و بیان آن یکی از ویژگی های مراحل پیشرفته EMT است [37]. -میوفیبروبلاست های بیان کننده SMA، که تحت EMT قرار می گیرند، باعث سنتز ECM بیش از حد و بازسازی غیر طبیعی ECM می شوند وکلیهفیبروز [37]. نفروپاتی فشار خون بالا باعث ایجاد گلومرولواسکلروز و فیبروز بینابینی می شود که باعث کاهشعملکرد کلیهو پروتئینوری قابل توجه [6]. در مطالعه ما، بیان ویمنتین و -SMA در مدولا و قشر SHRها با تجویز ECE یا DK افزایش یافته و کاهش یافت. مقدار ناحیه فیبروز در بصل النخاع و قشر SHRها افزایش یافت و با تجویز ECE یا DK کاهش یافت. شاخص اسکلروز گلومرولی SHR ها افزایش یافت و با تجویز ECE یا DK کاهش یافت.

حجم ادرار SHR ها به تدریج در مقایسه با موش های WKY هم سن کاهش یافت [38]. مشخص شده است که هر چه میزان دفع سدیم ادرار بیشتر باشد، دفع پتاسیم از طریق ادرار کمتر است. علاوه بر این، در مطالعات انسانی، نسبت Na/K ادرار با افزایش BP و اختلال سریع در ارتباط است.عملکرد کلیه[39]. در مطالعه ما، حجم ادرار SHRها کمتر از موش‌های WKY بود، حتی اگر مقدار آب مصرفی بین موش‌های SHR و WKY تفاوتی نداشت. نسبت Na/K ادرار SHRها در بین موش‌های WKY، SHRs و گروه‌های تحت درمان با ECE یا DK تفاوت معنی‌داری داشت. نسبت Na/K ادرار به عنوان نشانگر دریافت سدیم و پتاسیم در رژیم غذایی در مطالعات انسانی استفاده شد [39]. BP با افزایش مصرف سدیم افزایش یافت. با این حال، افزایش دریافت پتاسیم با افزایش دفع سدیم در ادرار باعث کاهش BP شد [40]. بنابراین، نسبت Na/K ادرار با BP در انسان مرتبط است [40]. در مطالعه ما، همه حیوانات با رژیم غذایی پر سدیم تغذیه نشدند، که توضیح می دهد که چرا نسبت Na/K ادرار در بین گروه ها تفاوت معنی داری نشان نمی دهد. فشار خون بالا تمایل به افزایش پروتئینوری دارد [37]. مشخص است که نسبت آلبومین به کراتینین ادرار با کاهش نرخ فیلتراسیون گلومرولی همراه است [41]. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ایجاد میکروآلبومینوری در SHR ها به دلیل آسیب لوله‌ای غالب است که باعث از دست رفتن پروتئین‌های با وزن مولکولی کم در ادرار می‌شود [42،43]. در مطالعه ما، نسبت آلبومین به کراتینین ادرار SHR ها بیشتر از موش های WKY بود و با تجویز ECE یا DK کاهش یافت.

مطالعات قبلی نشان داد که چندین پلی فنل اثر مهاری بر فعالیت ACE دارند [14-17]. با این حال، این مطالعات فقط فعالیت مهاری ACE را به عنوان یک مقدار IC50، که 50 درصد غلظت مهاری کنترل مثبت است، گزارش کردند، و آنها اثر ضد فشار خون یا اثر محافظتی در برابر نفروپاتی فشار خون بالا در حیوانات نشان ندادند. یک مطالعه نشان داد که ECE باعث کاهش فشار خون در 2-کلیه1-کلیپ موش‌های مبتلا به فشار خون گلدبلات [44]. Pyrogallol-phloroglucinol{3}}،6-بیکول BP را در مدل حیوانی پرفشاری خون ناشی از رژیم غذایی پرچرب با تعدیل اختلالات عروقی کاهش داد [45]. با این حال، این مطالعات فقط کاهش فشار خون را نشان دادند و ارزیابی نکردند که آیا ECE اثری از کاهش نفروپاتی فشار خون بالا را نشان می‌دهد یا خیر. مطالعه ما نشان داد که ECE و DK باعث کاهش بیان AT1R/TGF /SMAD2/3 درکلیهو سطح سرمی Ang II را کاهش داد. علاوه بر این، ECE و DK EMT را کاهش دادند،کلیهفیبروز و اسکلروز گلومرولی. به نظر می رسد ECE و DK ممکن است در کاهش نفروپاتی فشار خون بالا مفید باشند

4. مواد و روش ها

4.1. تهیه ECE و جداسازی DK

ECE از Aqua Green Technology Co., Ltd. (Jeju، کره) به دست آمد. E. cava به طور کامل با آب خالص شسته شد و در دمای اتاق به مدت 48 ساعت در هوا خشک شد. آسیاب شد و 50 درصد اتانول اضافه شد و سپس در دمای 85 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت حرارت داده شد. ECE فیلتر شد و پس از غلیظ شدن، با حرارت دادن در دمای بالا به مدت 40-60 دقیقه استریل شد و سپس با اسپری خشک شد. مدیر، که یکی از فلوروتانین های نماینده E. cava است، سپس جدا شد. به طور خلاصه، کروماتوگرافی پارتیشن گریز از مرکز با استفاده از یک سیستم حلال دو فازی که آب خالص، اتیل استات، n-هگزان و مخلوط متانول را مخلوط می‌کرد (نسبت 7:7:2:3) انجام شد. فاز ثابت آلی در ستون و فاز متحرک در ستون، به ترتیب نزولی نرخ همراه (2 میلی لیتر در دقیقه) تکمیل شد و برای جداسازی استفاده شد. ما از روش های دکتر سون و همکاران پیروی کردیم. (2019) [45].

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

4.2. مدل حیوانی فشار خون بالا

موش‌های نر SHR (8 هفته‌ای) و موش‌های نر WKY (8 هفته‌ای) از Orient Bio (Sungnam، کره) خریداری شدند و در دمای ثابت تقریباً 24 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 50-55 درصد و نور / نگهداری شدند. چرخه تاریکی 12 ساعت / 12 ساعت. تصعید موش به مدت 1 هفته انجام شد. موش ها به طور تصادفی به شش گروه (پنج موش در هر گروه) تقسیم شدند: (من) گروه WKY، که در آن موش ها به مدت 4 هفته به صورت خوراکی با آب آشامیدنی تجویز شدند. (ب) گروه SHR، که در آن موش ها به مدت 4 هفته به صورت خوراکی با آب آشامیدنی تجویز شدند. (iii-v) گروه SHR، که در آن موش‌ها با ECE خوراکی (iii) mg/kg/day 50، (IV) mg/kg/day 100 و (v) mg/kg/day 150 برای 4 مورد تجویز شدند. هفته؛ (vi) گروه SHR، که در آن موش‌ها به‌مدت 4 هفته به‌صورت خوراکی با mg/kg/day 2.5 DK تجویز شدند. پس از 4 هفته، مصرف آب، حجم ادرار و آنالیز شیمیایی ادرار با قفس متابولیک به مدت 24 ساعت اعتبارسنجی شد. پس از تکمیل تجزیه و تحلیل متابولیک، همه موش‌ها طبق اصول اخلاقی کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی دانشگاه گاچون (شماره تأیید: LCDI{19}}) قربانی شدند.

4.3. ایمونوهیستوشیمی

بافت کلیهبلوک های پارافینی در 8 میکرومتر برش داده شدند، روی لام های پوشش ژلاتینی قرار گرفتند و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز خشک شدند. اینکلیهاسلایدهای بافتی پارافین زدایی شدند و سپس با پراکسید هیدروژن 3/0 درصد (Sigma-Aldrich, MO, USA) به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند. پس از آن، لام ها سه بار با سالین بافر فسفات (PBS) شستشو داده شدند و با سرم حیوانی برای مهار اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی انکوبه شدند. علاوه بر این، آنها با آنتی‌بادی‌های اولیه (آنتی AT1R، آنتی‌ای‌کادهرین، آنتی‌- -SMA و آنتی‌ویمنتین) انکوبه شدند و سه بار با PBS شستشو داده شدند. اسلایدهای بافت سپس با آنتی بادی های ثانویه بیوتینیله از کیت ABC (Vector Laboratories، Burlingame، CA، USA) انکوبه شدند، به مدت 3 ساعت با محلول مسدود کننده انکوبه شدند و با PBS سه بار شستشو داده شدند. اسلایدهای بافتی با 3،{13}}دیامین‌وبنزیدین به‌عنوان یک بستر به مدت 3 دقیقه، نصب شده با محلول DPX مبتنی بر زایلن (سیگما-آلدریچ) و با میکروسکوپ نوری (Olympus Optical Co.، توکیو، ژاپن) ساخته شدند. .

4.4. استخراج RNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (qRT-PCR)

RNA موشکلیهبافت ها با استفاده از معرف RNAiso Plus (TAKARA، ژاپن) طبق دستورالعمل سازنده جدا شد. اینکلیهبافت ها ابتدا به دو قسمت یعنی قسمت قشر و بخش مدولا تقسیم شدند. بافت های کلیه به خوبی بریده شده و به صورت پودر خرد شدند و پودرها با 1 میلی لیتر معرف RNAiso Plus، مخلوط با 0.1 میلی لیتر کلروفرم خالص گلید (Amresco, Solon, OH, USA) مجدداً معلق شدند و سپس در دمای 13، 000× گرم به مدت 2{7}} دقیقه در دمای 4 ◦C سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی با 0.25 میلی لیتر ایزوپروپیل الکل خالص گلید مخلوط شد و گلوله های RNA استخراج شده با الکل 70 درصد شسته و در 7500× گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. گلوله های خشک شده در 30-10 میکرولیتر آب خالص تیمار شده با دی اتیل پیروکربنات حل شدند و RNA با استفاده از NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) اندازه گیری و بررسی شد. DNA مکمل (cDNA) از RNA با استفاده از کیت سنتز cDNA (PrimeScript™، TAKARA) تهیه شد. یک واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (qRT-PCR) سطوح RNA را ازکلیهبافت ها پرایمرهای فوروارد و معکوس با آب مقطر مخلوط شده و سپس مخلوط 10 میکرولیتری در یک صفحه 384- چاهی qRT-PCR قرار داده شد. cDNA و SYBR سبز (TAKARA) متعاقبا اضافه شدند و سپس با استفاده از دستگاه qRT-PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) اعتبارسنجی شدند. ژن های مورد نظر در جدول تکمیلی S1 فهرست شده اند. ما از روش های دکتر سون و همکاران پیروی کردیم. 2019 [45].

4.5. سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

برای تایید سطح Ang II سرم، مقدار کمی از خون خارج شده (1.5 تا 1.7 میلی لیتر) در لوله های جداکننده سرم (Becton Dickinson، Franklin Lakes، NJ، USA) اضافه شد و سپس در 2000 × g به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. . پس از آن، سرم جدا شده به یک لوله جدید منتقل شد و در یک فریزر عمیق نگهداری شد. کیت Ang II ELISA (MyBioSource، San Diego، CA، USA) برای آنالیز حضور سرم طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. آنگ II در عرض 1 هفته پس از جمع آوری خون از حیوانات اندازه گیری شد.

4.6. تجزیه و تحلیل بافت شناسی

4.6.1. لکه تری کروم ماسون (MT).

رنگ ماسون تری کروم (MT) فیبروز را تایید می کندکلیهبلوک های پارافین تعبیه شدهکلیهبافت به ضخامت 8 میکرومتر برش داده شد، روی لام پوشش قرار گرفت و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز خشک شد. اسلایدهای بافت با زایلن و الکل پارافین زدایی شدند و مجدداً با محلول Bouin به مدت 24 ساعت تثبیت شدند و به مدت 3 دقیقه با آب جاری شسته شدند. اسلایدها با محلول هماتوکسیلین آهن وایگرت به مدت 10 دقیقه و محلول فوشسین اسکارلت بیبریچ به مدت 15 دقیقه غوطه ور شدند و سپس با محلول اسید فسفومولیبدیک-فسفو تنگستیک به مدت 10 دقیقه تمایز یافتند. در نهایت لام ها به مدت 3 دقیقه به محلول آبی آنیلین منتقل و سپس با آب شسته شدند. اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده با محلول DPX مبتنی بر زایلن (Sigma-Aldrich) سوار شدند و از طریق میکروسکوپ نوری (Olympus) مشاهده شدند. فیبرهای کلاژن در ناحیه فیبروز به رنگ آبی به نظر می رسند، در حالی که الیافکلیهاپیتلیوم قرمز رنگ به نظر می رسد. نواحی فیبروز آغشته به MT با استفاده از نرم افزار ImageJ اندازه گیری شد. تصاویر اصلی کلیه رنگ آمیزی شده با MT به تصاویر RGB تبدیل شدند و سپس این تصاویر با استفاده از نرم افزار ImageJ با استفاده از پلاگین deconvolution رنگ، تبدیل شدند.

4.6.2. رنگ آمیزی اسید-شیف دوره ای (PAS).

رنگ آمیزی اسید پریودیک شیف (PAS) آسیب گلومرولی را تایید کردکلیه. بلوک های پارافین تعبیه شدهکلیهبافت به ضخامت 8 میکرومتر برش داده شد، روی لام پوشش قرار گرفت و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز خشک شد. اسلایدهای بافت با زایلن و الکل پارافین زدایی شدند، با آب هیدراته شدند، با محلول اسید پریودیک 0} به مدت 5 دقیقه اکسید شدند و با آب شسته شدند. اسلایدها به مدت 15 دقیقه با معرف شیف غوطه ور شدند و سپس با آب ولرم به مدت 5 دقیقه شسته شدند. در نهایت لام ها به مدت 1 دقیقه به محلول هماتوکسیلین مایر منتقل و سپس با آب شسته شدند. اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده با محلول DPX مبتنی بر زایلن (Sigma-Aldrich) سوار شدند و از طریق میکروسکوپ نوری (Olympus) مشاهده شدند.

گلومرول ها به طور تصادفی انتخاب شدند و آسیب گلومرولی با استفاده از روش نمره دهی نیمه کمی (درجات 0-4) با استفاده از رنگ آمیزی PAS ارزیابی شد.کلیهاسلایدهای بافتی

(1) درجه 0: گلومرول طبیعی. (2) درجه 1: حداقل اسکلروز (ناحیه اسکلروتیک تا 25 درصد). (3) درجه 2: اسکلروز متوسط ​​(ناحیه اسکلروتیک 25 درصد تا 5{29}} درصد)؛ (4) درجه 3: اسکلروز متوسط ​​تا شدید (ناحیه اسکلروتیک 50 تا 75 درصد). (5) درجه 4: اسکلروز شدید (ناحیه اسکلروتیک 75 درصد تا 100 درصد). شاخص گلومرولواسکلروتیک (GSI) با استفاده از معادله زیر محاسبه شد: (4 × n4) به علاوه (3 × n3) به علاوه (2 × n2) به علاوه (1 × n1) / n4 به علاوه n3 به علاوه n2 به علاوه n1 به علاوه n0، که در آن n ( x) تعداد استکلیهاسکلروز گلومرولی در هر درجه [46]. این تجزیه و تحلیل در گروه های درمان توسط یک ناظر نقابدار انجام شد.

4.7. اندازه گیری فشار خون سیستولیک، فشار خون دیاستولیک و فشار خون متوسط ​​شریانی

فشار خون سیستولیک، فشار خون دیاستولیک و میانگین فشار خون شریانی با استفاده از یک سیستم غیرتهاجمی CODA دم کاف (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA) اندازه‌گیری شد. تصعید موش به مدت 20 دقیقه به مدت 5 روز انجام شد و BP در روز آخر اندازه گیری شد.

4.8. مدل‌سازی در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از سلول‌های TCMK-1

سلول های TCMK-1، یک رده سلولی لوله پروگزیمال موش، از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (واشنگتن، دی سی، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. محیط کشت Eagle اصلاح شده Dulbecco با گلوکز بالا (Gibco؛ Grand Island, NY, USA)، 10 درصد سرم جنین گاو (FBS) و 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین به عنوان محیط کشت استفاده شد. برای تأیید اثرات مهاری ECE و DK در سلول‌های TCMK-1 تیمار شده با آنژیوتانسین II، ECE (5، 25، 50 میکروگرم در میلی‌لیتر) و DK (1.8 میکروگرم در میلی‌لیتر) را با 100 نانومول در لیتر آنژیوتانسین II درمان کردیم. (سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به مدت 12 ساعت. تلمیزارتان (1 میکرومول در لیتر، سیگما آلدریچ) برای آنتاگونیست گیرنده AT1 استفاده شد و قبل از آنژیوتانسین II به مدت 3 ساعت پیش تیمار شد [47].

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

4.9. تهیه پروتئین و وسترن بلاتینگ

برای جداسازی پروتئین از سلول‌های TCMK-1 تیمار شده با آنژیوتانسین II، سلول‌ها با استفاده از بافر لیز RIPA با مهارکننده فسفاتاز و پروتئیناز (EzRIPA؛ ATTO؛ توکیو، ژاپن) خراش داده شدند و به مدت ۲{20} روی یخ انکوبه شدند. دقیقه پس از سانتریفیوژ در 13،{4}}× گرم به مدت 20 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتیگراد، مایع رویی تمیز به یک لوله جدید منتقل شد و غلظت سوپرناتانت با کیت سنجش بیسینکونیک اسید (کیت BCA؛ Thermo Fisher Scientific, شرکت؛ Waltham، MA، ایالات متحده). برای تایید بیان پروتئین از سلول‌های TCMK{7}} بلات انجام شد. مقدار مساوی از پروتئین لیزات (30 میکروگرم در خط) توسط ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید 10 درصد با استفاده از الکتروفورز جدا شد. سپس، پروتئین های در حال اجرا به غشاهای پلی وینیلیدین فلوراید منتقل شدند، که با آنتی بادی های اولیه رقیق شده (Anti{11}}actin، AGTR1، TGF-، SMAD2/3 و pSMAD2/3) در دمای 4◦C انکوبه شدند. غشاهای انکوبه شده با آنتی بادی ها با استفاده از نمک تریس بافر شده با 0.1 درصد Tween 20 به طور کامل شسته شدند و با آنتی بادی های ثانویه به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. همه غشاها با افزایش نورتابی شیمیایی (LAS{24}s؛ GE Healthcare، شیکاگو، IL، ایالات متحده آمریکا) ایجاد شدند. اطلاعات آنتی بادی مورد استفاده در این مطالعه را می توان در جدول S2 یافت.

4.10. تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار و مقادیر p ارائه شده است<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">

5. نتیجه گیری ها

در نتیجه، AT1R در SHR ها تنظیم مثبت شد، و مسیر سیگنال TGF و SMAD2 یا 3 را افزایش داد، که EMT را القا کرد. هر دو ECE یا DK مسیر سیگنال را کاهش دادند و EMT را کاهش دادند. بنابراین، ECE یا DK نشانگرهای سلولی مزانشیمی مانند بیان ویمنتین و -SMA، بافت فیبروتیک را کاهش داد.کلیهو نسبت آلبومین/کراتینین ادرار و EMT را کاهش داد. علاوه بر این،کلیهفیبروز منجر به ترمیم شدعملکرد کلیه(شکل 7).