عصاره متانولی پوست Beta Vulgaris Rubra L. (چغندر) استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد و تکثیر سلولی را از طریق افزایش بیان VEGF در سلول های اندوتلیال ورید ناف انسانی تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 تحریک می کند.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:ظرفیت آنتی اکسیدانی پلی فنول ها و فلاونوئیدهای موجود در مواد غذایی به توقف رشد گونه های فعال اکسیژن (ROS) و محافظت از سلول های ماهیچه صاف اندوتلیال در برابر استرس اکسیداتیو/نکروز ناشی از آن کمک می کند. چغندر (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) یک سبزی پرمصرف است که منبعی غنی از آنتی اکسیدان ها است. ترکیبات زیست فعال پوست چغندر و نقش آنها در سلول های اندوتلیال ورید ناف انسان (HUVECs) هنوز مورد تحقیق قرار نگرفته است. در مطالعه حاضر، عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) تهیه شد و اثر آن بر روی کارایی زیستی، یکپارچگی هسته ای، پتانسیل غشای میتوکندری، رشد سلول های عروقی و سطوح بیان ژن مرتبط با تنظیم ایمنی در HUVECs با استرس اکسیداتیو القایی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. . نتایج طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی (GC-MS) تأیید کرد که BPME حاوی 5-هیدروکسی متیل فورفورال (32.6 درصد)، متیل پیروات (15.13 درصد)، فورفورال (9.98 درصد) و 2،{13}}دی هیدرو{ 14}}،5-دی هیدروکسی-6-متیل-4H-Pyran{19}}یک (12.4 درصد). عصاره BPM به طور موثر تکثیر سلولی را افزایش داد و با روش MTT تایید شد. یکپارچگی هسته ای با روش رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم (PI) تایید شد. پتانسیل غشای میتوکندری (Aψm) با استفاده از روش رنگ‌آمیزی JC تأیید شد. سنجش Annexin V تایید کرد که HUVEC های تیمار شده با BPME 99 درصد سلول های زنده را نشان می دهند، اما تنها 39.8 درصد زنده ماندن در HUVEC های تیمار شده با H2O2 به تنهایی نشان داده شد. علاوه بر این، تیمار BPME HUVECs به مدت 48 ساعت بیان mRNA لیپیدی پراکسید (LPO) را کاهش داد و NOS{30}}، Nrf{31}}، GSK{32}}، GPX، اکسید نیتریک سنتاز اندوتلیال (eNOS) را افزایش داد. و سطوح بیان mRNA فاکتور رشد سلول عروقی (VEGF). ما دریافتیم که درمان BPME پیش التهابی (فاکتور هسته‌ای-k (Fk)، فاکتور نکروز بافتی (TNF-)، گیرنده‌های شبه تلفات-4(TLR{39}})، اینترلوکین{40}} ( بیان mRNA مربوط به IL-1) و التهاب عروقی (مولکول چسبندگی داخل سلولی (ICAM)، مولکول چسبندگی سلول عروقی (VCAM)، EDN، IL{42}}). در نتیجه، درمان پوست چغندر به طور موثر فاکتورهای رشد سلول های صاف عروقی و توسعه میکروتوبول ها را افزایش داد، در حالی که تنظیم کننده های التهابی عروقی را کاهش داد. BPM ممکن است برای بازسازی سلول های صاف عروق، ترمیم بافت و پتانسیل ضد پیری مفید باشد.

کلید واژه ها:چغندر; استرس اکسیداتیو؛ میتوکندری؛ رگزایی؛ التهاب

1. مقدمه

آنژیوژنز فرآیند فیزیولوژیکی واسکولوژنز از عروق موجود بدن است [1. این نه تنها برای رشد و تولید مثل جنین بلکه برای چرخه سلولی و ترمیم بافت ضروری است[2،3]. با این حال، با پاتوژنز بیماری‌های مختلف مانند رشد تومور، آرتریت روماتوئید و بیماری‌های ایسکمیک و التهابی مختلف مرتبط است [{3}}]. اندوتلیوم عروقی با تنظیم تون عروق خونی و واکنش های ایمنی و التهابی نقش مهمی در حفظ هموستاز عروقی ایفا می کند [6،7].ویتامین C پوریتانسسلول‌های اندوتلیال (ECs) لایه‌های تک سلولی نازکی هستند که تمام سطوح داخلی رگ‌های خونی را می‌پوشانند و مولکول‌های مختلفی تولید می‌کنند که به صورت موضعی یا در مکان‌های دور عمل می‌کنند [7]. اندوتلیوم برای هموستاز بدن ضروری است و هر گونه تغییر در پاسخ سلول های اندوتلیوم منجر به رویدادهای اولیه فرآیندهای بیماری التهابی و عروقی مانند تصلب شرایین و فشار خون بالا می شود [6،8،9]. این بیماری ها باعث استرس اکسیداتیو می شوند که ساختار و عملکرد EC را تغییر می دهد و منجر به اختلال عملکرد اندوتلیال می شود [9]. ECs ورید ناف انسان (HUVECs) به طور گسترده ای به عنوان مدلی برای مطالعات مرتبط با اندوتلیوم عروقی انسان استفاده شده است. علاوه بر این، آنها یک مدل مفید برای مطالعه مسیرهای بیولوژیکی اصلی درگیر در عملکرد اندوتلیوم [10] ارائه می کنند.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

ترکیبات زیست فعال و فیتوکمیکال‌ها به وفور در میوه‌ها، سبزیجات، گیاهان سبز و بسیاری از گیاهان یافت می‌شوند که فواید سلامتی متعددی از جمله خواص ضد التهابی، آنتی‌اکسیدانی، ضد سرطان‌زایی و رگ‌زایی دارند [11-13]. در این راستا، چغندر قرمز (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) متعلق به خانواده Amaranthaceae است و به عنوان یکی از بهترین منابع سطوح بالای آنتی اکسیدان ها طبقه بندی می شود [14،15. به طور خاص، حاوی مواد شیمیایی گیاهی متعددی است که از نظر بیولوژیکی فعال هستند، از جمله بتالین ها، فلاونوئیدها، پلی فنول ها، آنزیم های درمانی، اسید اسکوربیک، دهیدروآسکوربیک اسید (DHAA) و نیترات معدنی (NO3)[16-18]. علاوه بر این، مواد مغذی ضروری ارزشمندی مانند پتاسیم، کلسیم، منیزیم، سدیم، آهن، روی، فسفر، مس و منگنز را فراهم می‌کند [19]. چندین مطالعه گزارش کرده اند که عصاره چغندر قرمز (ریشه) به دلیل خواص کاهنده قند خون، کاهنده چربی، ضد التهاب، ضد فشار خون و ضد تکثیر، اثرات مفید متعددی دارد [20-22].سیستانچههمه این خواص مفید را می توان با توانایی های مهار رادیکال های آزاد ترکیبات زیست فعال مرتبط دانست. بنابراین، مصرف چغندر قرمز با فواید تغذیه ای و سلامتی متعددی مرتبط است. به دلیل ارزش غذایی آن، ممکن است به عنوان یک منبع غذایی کاربردی در برابر استرس های اکسیداتیو که باعث بیماری های متابولیک مزمن مانند دیابت نوع 2 و بیماری های قلبی عروقی می شوند، استفاده شود [23].

بر اساس بررسی متون، بتا ولگاریس دارای خواص آنتی اکسیدانی قوی، تنظیم کننده ایمنی و رگ زایی است. آپیژنین در برگ چغندر یافت شده است. دارای اثرات ضد تکثیری در سلول های کبد و روده است و می تواند بیماری چاقی ناشی از رژیم غذایی پرچرب را از طریق فعال سازی AMPK بهبود بخشد [24،25]. De Silva و همکاران، (2020) [26] شناسایی کردند که بتا ولگاریس از EC های عروقی در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از خارج محافظت می کند، که ممکن است به دلیل اثر ترکیبی چندین ترکیب فعال زیستی موجود در این گیاه باشد. تا به حال، عمل مکانیکی برای تکثیر EC و اثر رگزایی پوست ریشه بتا ولگاریس کمتر مورد بررسی قرار گرفته است. از این رو، هدف ما این بود که مطالعه حاضر را برای بررسی تکثیر سلول های عروقی، توسعه میکروتوبول، استرس اکسیداتیو و ظرفیت رگزایی مربوط به لایه برداری ریشه بتا ولگاریس با استفاده از مورفولوژی سلولی و تجزیه و تحلیل بیان ژن در HUVECs انجام دهیم. اثرات رگ زایی عصاره متانولی پوست چغندر قرمز مرتبط با یکپارچگی هسته ای، توسعه میکروتوبول، کارایی میتوکندری و تحریک چرخه سلولی در EC های عروقی انسان بررسی شده است.

2. مواد و روشها

2.1. تهیه عصاره متانولی چغندر (Beta vulgaris rubra L.)

نمونه‌های چغندر تازه (Beta Vulgaris var. Rubra L.; BVr.) در ابتدا از فروشگاه‌های سبزیجات در ریاض، پادشاهی عربستان سعودی (KSA) تهیه شد. چغندرهای تازه با آب مقطر شسته شدند تا ساقه ها و آلاینده ها از بین بروند. پوست بیرونی پوست کنده شد و به قطعات کوچک بریده شد. نمونه ها در آون با هوای گرم با دمای 40 درجه خشک شده و سپس با استفاده از مخلوط کن الکترونیکی پودر شدند. سپس 500 گرم پودر در یک بطری استریل حاوی 1 لیتر متانول (Sigma, St. Louis, MO, USA) به مدت 24 ساعت در دمای اتاق روی شیکر استخراج شد و سه بار تکرار شد. پس از آن، یک فیلتر Whatman (Whatman، Clifton، NJ، ایالات متحده آمریکا) برای فیلتر کردن عصاره استفاده شد. در نهایت با کاهش فشار، حلال از عصاره جدا شد و پس از تبخیر متانول، عصاره به صورت ماده خشک جامد جمع آوری شد. نمونه استخراج شده تا زمان استفاده بعدی در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

2.2. کروماتوگرافی گازی و آنالیز طیف سنجی جرمی

عصاره متانولی پوست چغندر (BPME) به ستون مویرگی سیلیکا (3{1}} m×{3}}.25 میلی‌متر ID× 0.25 میکرومتر ضخامت فیلم) دستگاه GC-MS (Agilent 6890N/5973I) تزریق شد. ، کالیفرنیا، کالیفرنیا، ایالات متحده) با یک آشکارساز انتخابی انبوه برای تشخیص ترکیبات شیمیایی. دمای دستگاه به عنوان 70 درجه اولیه، نگه داشتن 2 دقیقه، تا 305 درجه در 20 درجه در دقیقه تنظیم شد و سپس به مدت 1 دقیقه نگه داشت. کل زمان کار GC روی 45 دقیقه با گاز هلیوم (99.999 درصد) به عنوان گاز حامل (میزان جریان ثابت 1.2 میلی لیتر در دقیقه)، 250 درجه به عنوان دمای انژکتور و 230 درجه به عنوان دمای منبع یون تنظیم شد. بر اساس طیف GC-MS، درصد نسبی مولفه مربوطه محاسبه شد و طیف جرمی جزء مجهول با مقایسه با 62،{22}} الگوهای شناخته شده موجود در مؤسسه ملی استاندارد و فناوری شناسایی شد. کتابخانه کامپیوتری (NIST08).

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

2.3. مواد و مواد شیمیایی کشت سلولی

HUVEC ها از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC، Manassas، VA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. مواد کشت سلولی مانند محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM)، EDTA، تریپسین و سایرین از Gibco (Paisley، انگلستان) به دست آمد. پنی سیلین استرپتومایسین (PS) و سرم جنین گاوی (FBS) از آزمایشگاه Hyclone، ایالات متحده آمریکا خریداری شد.سیستانچ چیستمواد شیمیایی مورد استفاده در آزمایش بیولوژی مولکولی از سیگما آلدریچ، به ویژه، MTT [3-(4,{3}}dimethylthiazol-2-yl)-2،5- به دست آمد. رنگ آمیزی دی فنیل تترازولیوم بروماید]، PI و JC{7}}. SYBR Green PCR Master Mix و کیت سنتز cDNA از Qiagen (Hilden، آلمان) به دست آمد.

2.4.HUVECs

HUVECها در DMEM کشت داده شدند و با 1 درصد PS و 10 درصد کمپلکس FBS تکمیل شدند. سلول ها در اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO انکوبه شدند و تقریباً هر 3 روز یکبار کشت فرعی شدند.

2.5. زنده ماندن سلولی و تکثیر سلولی با روش MTT

HUVECs (1×104 سلول در چاه) با یک محیط نگهدارنده کشت داده شدند و اجازه داده شد تا یک شب در یک صفحه کشت 96-چاه بچسبند. سپس، محیط کشت با یک محیط کشت جدید حاوی غلظت فزاینده BPME (0،0) جایگزین شد.05،{{{{0}}. 0.4، 0.8، 1.6 و 3.2ug/mL) طبق نقشه صفحه سنجش MTT و 24 و 48 ساعت انکوبه شدند. سلول های تیمار نشده به عنوان شاهد استفاده شدند. پس از دوره انکوباسیون، سلول های تجربی با 20 میکرولیتر در چاه 5 میلی گرم در میلی لیتر MTT (3-【4،{24}}دی متیل تیازول-2-yl»-2 تیمار شدند، 5-دی فنیل تترازولیوم بروماید که در دی متیل سولفوکسید (DMSO) حل شد) و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. سپس، محیط دور ریخته شد و فورازان بنفش تولید شده در 100 میکرولیتر 100 درصد DMSO حل شد. جذب محلول با استفاده از میکروپلیت خوان (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) در طول موج 570 نانومتر اندازه گیری شد. درصد (درصد) تکثیر سلولی با معادله زیر محاسبه شد: (جذب نمونه/میانگین جذب شاهد) × 100.

2.6. طراحی تجربی

سنجش تکثیر سلولی حاضر غلظت پایین‌تری از BPME ({0}}.1 و 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر) را آزمایش کرد و HUVECs در حال تکثیر و مورفولوژی میکروتوبول را بدون سمیت نشان داد. حجم‌های 0.1 و 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر دوز BPME انتخاب و با HUVECs معمولی و 10 میلی‌مولار HUVECs تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H، O، به مدت 48 ساعت تیمار شدند تا تکثیر سلولی، ضد التهابی تعیین شود. پتانسیل های رگ زایی و آپوپتوز (شکل 1). کنترل وسیله نقلیه نیز به مدت 48 ساعت در هر دو گروه حفظ شد. کوئرستین (10 میکرومولار) به عنوان کنترل مرجع در هر دو گروه تجربی استفاده شد.ضد پیری سیستانچپس از انکوباسیون، سلول‌های تیمار نشده و آزمایشی برای مورفولوژی سلولی و هسته‌ای و پتانسیل غشای میتوکندری با استفاده از کیت BDM MitoScreen (C{0}}) آنالیز شدند. آپوپتوز با روش مرتب سازی سلولی مبتنی بر Annexin V/Apoptosis در فلوسیتومتری تعیین شد. استرس اکسیداتیو، و سطوح بیان ژن مربوط به پیش التهابی و رگ زایی مورد بررسی قرار گرفت.

2.7. سنجش رنگ آمیزی یدید پروپیدیوم برای آسیب هسته ای

مورفولوژی سلولی برای آسیب مشخصه هسته‌ای، پیکنوز یا تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوتیک پس از تیمار با {0}}.1 و 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME (با یا بدون H، O2) در HUVECs با استفاده از آنالیز رنگ‌آمیزی PI تعیین شد. تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس، همانطور که توسط Leite و همکارانش توضیح داده شده است. [27].

2.8. سنجش پتانسیل غشای میتوکندری （△中m） توسط رنگ آمیزی رنگ JC-1

پتانسیل غشای میتوکندری (△!m) با استفاده از روش JC{{0}} برای ارزیابی کارایی میتوکندری در کنترل وسیله نقلیه و 0.1 و 0.2 ug/mL HUVECهای تیمار شده با BPME تعیین شد. (با و بدون H2O2). به طور خلاصه، محلول رنگ‌آمیزی JC{8}} با حجم مشابهی از محیط کشت مخلوط شد و سپس به HUVEC‌های آزمایشی اضافه شد و در تاریکی به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شد. سپس رنگ JC{11}} به آرامی دو بار با استفاده از 200 میکرولیتر از بافر شستشوی رنگ‌آمیزی JC در دمای 4 درجه شسته شد. پس از آن، تجمع j-aggregated در برابر رنگ‌آمیزی JC{16}} در میکروسکوپ فلورسانس با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد و تصاویر گرفته شد. علاوه بر این، پتانسیل غشای میتوکندری در فلوسیتومتری با استفاده از کیت BDIM MitoScreen (JC{17}}) اندازه‌گیری شد.

2.9. آنالیز انکسین ولاپوپتوز با استفاده از فلوسیتومتری

روش کیت تشخیص Annexin V/PI مبتنی بر فلوسیتومتری (Sigma Chemicals، USA) برای تعیین کمیت سلول‌های زنده، پرواپوپتوز، آپوپتوز اولیه و نکروزه استفاده شد. HUVECهای ناشی از استرس اکسیداتیو (1×10 درجه /چاه) در 24-صفحات چاهک آبکاری شدند و با BPME (0.1 و 0.2 میکروگرم در میلی لیتر) یا کنترل وسیله نقلیه برای انکوبه شدند. 48 ساعت پس از انکوباسیون، سلول ها در 400 میکرولیتر از 5 میکرولیتر Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) و 5 میکرولیتر PI حاوی بافر اتصال انکوبه شدند. پس از این، سلول ها به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق (RT) در تاریکی نگهداری شدند. سلول ها با فلوسایتومتری (BD Biosciences، San Jose، CA، USA) برای شناسایی سلول های آپوپتوز (PInegative و Annexin V مثبت) و آپوپتوز دیررس (PI-مثبت و Annexin V مثبت) تجزیه و تحلیل شدند [28].

2.10. تجزیه و تحلیل کمی PCR Real-Time

کیت سلول به cDNA Fastlane@ (Qiagen، Hilden، آلمان) برای استخراج RNA کل و سنتز cDNA از کنترل وسیله نقلیه، HUVECهای تیمار شده با BPME (با و بدون H-O2) با استفاده از یک ابزار نیمه خودکار PCR کمی (qPCR) (Applied Biosystems) استفاده شد. فاستر سیتی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا). سطوح بیان استرس اکسیداتیو شامل (پراکسید لیپیدی، NOS{3}})، آنتی اکسیدان (Nrf-2، GSK-3 و GPx)، پیش التهابی (فاکتور هسته‌ای-k (NF-k)، فاکتور نکروز تومور- (TNF-)، اینترلوکین{10}} (IL{11}})، فاکتور رشد سلولی عروقی (VEGF)، گیرنده شبه تلفات-4(TLR{14}})، و ژن های مرتبط با التهاب عروقی (مولکول چسبندگی داخل سلولی (ICAM)، مولکول چسبندگی سلول عروقی (VCAM)، EDN1 و اکسید نیتریک اندوتلیال سنتاز (eNOS)) و ژن مرجع، اکتین، در HUVECs مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و با روش اندازه گیری شد. یوان و همکاران [29]. مقادیر تقویت (ACt) با تفاوت بین Ct (درمان شده) و Ct (شاهد) محاسبه شد. بیان ژن با استفاده از بیان مقدار 2-AACt ترسیم شد.

2.11.تحلیل آماری

همه آزمایش‌ها تکرار شدند و داده‌های به‌دست‌آمده به صورت مقادیر میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان شد. تجزیه و تحلیل آماری تفاوت‌های گروه‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) با استفاده از نرم‌افزار SPSS (نسخه 28.5، SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) انجام شد.سیستانچ سودسپس در صورت مشاهده تفاوت معنی دار، آزمون مقایسه چندگانه توکی انجام شد. تمامی نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار برای شش تکرار در هر گروه ارائه شد. مقدار p < 0.05="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" شد="">

3. نتایج

3.1. مولکول های زیست فعال در BPME

ترکیبات شیمیایی BPME با استفاده از GC-MS (Turbomass، PerkinElmer) تایید شد. ترکیب شیمیایی عصاره پوست چغندر با مقایسه طیف جرمی موجود با پایگاه داده طیفی موسسه ملی استاندارد و فناوری (NIST) تعیین شد. نتایج GC-MS تأیید کرد که BPME حاوی هیدروکسی استون (8.18)، 5-هیدروکسی متیل فورفورال (32.6 درصد)، متیل پیروات (15.13 درصد)، بتا-d-آلوپیرانوز (1.48 درصد)، فورفورال (9.98 درصد)، {15}}هیدروکسی گاما بوتیرولاکتون (1.32 درصد)، و 2،3-دی هیدرو-3.{23}}دی هیدروکسی-6-متیل{25}}H-Pyran {27}}یک (12.4 درصد ؛ شکل 2a، جدول 1).

3.2. تکثیر سلولی

پتانسیل تکثیر سلولی در شرایط آزمایشگاهی BPME در برابر HUVECs در شکل 2b ارائه شده است. مهار رشد سلولی قابل توجهی در گروه های آزمایشی در مقایسه با کنترل وسیله نقلیه مشاهده نشد. در مطالعه حاضر تأیید شد که افزایش غلظت BPME تیمار شده با HUVECs منجر به افزایش تکثیر و زنده ماندن سلولی پس از 48 ساعت (112 درصد) در مقایسه با 24 ساعت (103 درصد) درمان شد. علاوه بر این، تصاویر میکروسکوپی نوری HUVEC های تیمار شده با BPME پس از 48 ساعت سلول های نرمال را با شکل یکنواخت مورفولوژی سلولی چسبنده تایید کرد، افزایش تعداد سلول های در حال تکثیر (تکثیر) بدون هیچ آسیبی آشکار شد (شکل 2c).

3.3. تجزیه و تحلیل مورفولوژی سلولی و هسته‌ای، تشکیل میکروتوبول و JC{2}} ماندن در HUVECS

شکل 3 مورفولوژی توسعه میکروتوبول را در تصاویر میکروسکوپی فلورسانس نشان می دهد. HUVEC های تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در مقایسه با HUVEC های کنترل، تکثیر ضعیف و مورفولوژی نامنظم سلول های چسبنده را نشان دادند. HUVECهای نرمال تیمار شده با 0.2 میکروگرم در میلی لیتر BPME سلولهای در حال تکثیر را از طریق تکثیر یا نئوژنز با مورفولوژی میکروتوبول نشان دادند. در همین حال، 1.1 میکروگرم در میلی‌لیتر دوز سلول‌های تیمارشده با BPME، 1{{1{12}}}}0 درصد سلول‌های چسبنده با مراحل اولیه میکروتوبول‌ها را نشان داد. HUVEC های تحت استرس اکسیداتیو تیمار شده با 0.2 ug/mL BPME سلول های جدید در حال تکثیر را با مورفولوژی میکروتوبول شناسایی کردند و آسیب سلولی اکسیداتیو را کاهش دادند. علاوه بر این، 0.1 میکروگرم در میلی لیتر BPME نیز مورفولوژی سلول های عروقی طبیعی را با سلول های در حال تکثیر افزایش داد.

شکل 4a مورفولوژی طبیعی ساختار هسته ای را با شکل کروی در HUVEC های تیمار شده با BPME (0.1 یا 0.2 ug/mL) نشان می دهد. شکل 4b تصاویری را برای رنگ آمیزی PI از نرمال و HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H, O نشان می دهد. } دقیقه با این حال، 0.2 میکروگرم در میلی لیتر از تیمار BPME برای HUVECs تحت استرس اکسیداتیو، هسته‌های دایره‌ای با مورفولوژی طبیعی را نشان داد. در مقایسه با 0.2 ug/mL عصاره BPME، 0.1 ug/ml BPME اثر محافظتی کمتری در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در HUVECها داشت.

شکل 5a نتایج رنگ آمیزی JC-1 را برای HUVECها، از جمله سلول های کنترل و تیمار شده با BPME نشان می دهد. شکل سلول‌های سالم با میتوکندری فعال را نشان می‌دهد، همانطور که توسط جذب میتوکندری با بار منفی کاتیونی چربی دوست خارج ازمیتوکندری JC{3}}(رنگ سبز) و دانه‌های J تبدیل شده با رنگ قرمز در داخل میتوکن تأیید می‌شود. شکل 5b نتایج رنگ‌آمیزی JC{7}} را برای 0.2 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME تجویز شده به HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 نشان می‌دهد. نتایج نشان داد که تقریباً 94 درصد از میتوکندری‌های دارای بار منفی در مقایسه با تیمار BPME (61.4 درصد) کاتیونی لیپوفیل JC{13}}(رنگ سبز) را به J-رنگ قرمز تبدیل کردند. یا

استرس اکسیداتیو ناشی از HO در HUVECs (2 درصد). مشاهده شد که پتانسیل غشای میتوکندری (MMP) در سلول‌های تحت درمان با BPME در مقایسه با داروی مرجع کورستین بالاتر است.

3.4. پتانسیل غشای میتوکندری به کمک FACS (△pm؛ BD MitoScan) و آنالیز Annexin V/apoptosis در HUVECs

Figure 6 shows the mitochondrial membrane potential capacity in BD MitoScan analysis after 0.2 ug/mL of BPME treatment of normal HUVECs and HUVECs with oxidative stress induced by H>O، ما دریافتیم که 0.2 میکروگرم در میلی لیتر از تیمار BPME، MMP(Aum) را در مقایسه با HUVECهای تیمار شده با HO2 به تنهایی (27.9 ± 7.2 درصد) به 3.7 ± 92.7 درصد افزایش داد. در مقابل، سلول‌های تیمار شده با کوئرستین در مقایسه با HUVECهایی که با BPME و H2O2 یا H2O2 به تنهایی تیمار شده بودند، 1.6 ± 41.4 درصد درصد افزایش MMP (Aum) را نشان دادند.

3.5. کمی سازی سطوح بیان ژن در HUVECs

استرس اکسیداتیو (LPO3)، آنتی اکسیدان (NOS-3، Nrf-2، GSK-3 و GPX)، پیش التهابی (IL-1، TNF-، باند NF TLR{ {7}})، و التهاب عروقی (VCAM، ICAM، EDN، eNOS) مربوط به سطوح بیان mRNA ژن VEGF در کنترل وسیله نقلیه کمی سازی شد، 0.1 و 0. HUVECهای تیمار شده با BPME و کوئرستین (10 میکرومولار) پس از 48 ساعت (شکل 8). ما به طور قابل توجهی یافتیم (ص<0.001) increased="" levels="" of="" lpo,="" nos-3,="" and="" nf-kb.il-1.tnf-α,="" vcam,="" icam,="" edn,="" and="" enos="" expression="" and="" decreased="" nrf-2,="" gsk-3β,="" and="" gpx="" levels="" in="" ho,-induced="" huvecs.="" treatment="" with="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme="" significantly="" decreased="" oxidative="" stress="" and="" vascular="" inflammation="" and="" increased="" antioxidant="" factor-related="" mrna="" expression="" when="" compared="" with="" oxidative-stressed="" huvecs.="" vegf="" expression="" levels="" showed="" a="" significant="" two-fold="" increase="" in="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme-treated="" cells="" only="" when="" compared="" to0.1="" ug/ml="" of="" bpme.="" vegf="" expression="" was="" not="" detected="" in="" huvecs="" with="" oxidative="" stress="" induced="" by="" h2o2.="" the="" observed="" effect="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" 0.1="" ug/ml="" bpme="" or="" quercetin="" (10="">

4. بحث

در اثر استرس خارج سلولی یا درون سلولی، فراهمی زیستی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) از دفاع آنتی اکسیدانی سبقت می‌گیرد و استرس اکسیداتیو سیگنال‌دهی و کنترل ردوکس را مختل می‌کند [31]. ایجاد استرس اکسیداتیو با پاتوژنزهای اختلالات مزمن مانند بیماری های نورودژنراتیو، دیابت و تصلب شرایین مرتبط است. از جمله استرس اکسیداتیو باعث شروع اختلال عملکرد اندوتلیال و ترویج التهاب سیستمیک و جذب ماکروفاژها می شود [32]. سلول‌های ایمنی فعال شده به داخل عروق مهاجرت می‌کنند و سیتوکین‌ها و کموکاین‌ها را آزاد می‌کنند که با انقباض عروق و بازسازی عروق خونی سلول‌های عضلانی صاف و التهاب روی سلول‌های ماهیچه صاف عروق و دیواره عروقی تأثیر می‌گذارد [33]. افزایش استرس اکسیداتیو عروقی با آسیب عروقی، سفتی سلول های ماهیچه صاف و ناهنجاری های ساختاری الاستین پایان می یابد. علاوه بر این، استرس اکسیداتیو عروقی در سایر شرایط پاتولوژیک مانند چاقی احشایی یا آترواسکلروز به دلیل افزایش فعالیت NADPH اکسیداز (NOX{3}}) در بافت چربی اطراف عروقی تحریک شده است [34]. استرس اکسیداتیو عروقی باعث تغییرات اپی ژنتیکی اصلی می شود که در طول پیری رخ می دهد و با یک فرآیند پیری زودرس به پایان می رسد [35].

توسعه تولید ROS و استرس اکسیداتیو در سیستم بیولوژیکی تا حد زیادی به اختلال عملکرد میتوکندری، علاوه بر NOX{0}}، گزانتین اکسیداز اندوتلیال، eNOS غیر جفت نشده و لیپوکسیژناز بستگی دارد [36]. خواص آنتی اکسیدانی عوامل رژیمی ممکن است تولید ROS را از طریق افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی خنثی کند [26]. عصاره جینکو بیلوبا با کاهش تولید ROS و فعالیت لیپوکسیژناز در اختلال عملکرد اندوتلیال ناشی از OxiLDL در برابر پیشرفت آترواسکلروز محافظت می کند [37]. علاوه بر این، ترکیبات فنلی و فلاونوئیدهای مختلف از گیاهان و غلات خوراکی این ویژگی را دارند که ROS و پراکسیداسیون لیپیدی را از بین ببرند [38]. عصاره متانولی پوست چغندر (بتا ولگاریس) به دلیل در دسترس بودن فیبر بالا، آنتوسیانین ها و فلاونوئیدهایی مانند ویتکسین و بتانین دارای پتانسیل آنتی اکسیدانی است [39]. در مطالعه حاضر، BPME برای شناسایی رویکرد مکانیکی وابسته به میتوکندری برای کشف اثر آن بر پتانسیل غشای میتوکندری، خاموش کردن LPO، و مهار سطوح بیان mRNA مربوط به التهاب عروقی انتخاب شد.

سنجش MTT تأیید کرد که BPME به طور قابل‌توجهی تکثیر سلولی را افزایش می‌دهد، همانطور که با افزایش یکپارچگی هسته‌ای در رنگ‌آمیزی PI با دوز مؤثر {{0}.2 میکروگرم در میلی‌لیتر BPME در مقابل آزمایش شده 0 تأیید شد. 1 میکروگرم در میلی لیتر BPME. شناسایی دوز موثر با غلظت کم و بیشترین فعالیت ممکن است از نظر فیزیولوژیکی بی خطر در نظر گرفته شود. ما رنگ‌آمیزی میکروسکوپی فلورسانس JC{4}} را پیدا کردیم، و پتانسیل غشای میتوکندری هم در HUVEC‌های طبیعی و هم در HUVEC‌های تحت استرس اکسیداتیو تحریک‌شده خارجی، پس از ۰.۲ میکروگرم در میلی‌لیتر BPME بازسازی شد. اختلال عملکرد میتوکندری فسفوریلاسیون اکسیداتیو را تغییر می دهد، که نمی تواند رادیکال های اکسیژن (O,.-) را به H، O، و H، Oby glutathione peroxidase تبدیل کند. به دلیل سم زدایی ناکافی ROS یا تولید کنترل نشده ROS، افزایش استرس اکسیداتیو میتوکندری با آترواسکلروز مرتبط است [40]. عصاره پوست چغندر به طور موثر پتانسیل غشای میتوکندری را بازسازی کرد که با موفقیت سم زدایی ROS و تولید H2O2 را افزایش داد. آنالیز رنگ‌آمیزی Annexin V/PI تأیید کرد که تیمار BPME درصد سلول زنده را حفظ کرده و مرحله تکثیر سلولی را هم در HUVECs و هم HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از HO افزایش می‌دهد. در این زمینه، چو و همکاران. [41] تأیید کرد که پس از تولید ROS بیش از حد یا HO اگزوژن، در محل ایسکمیک، سلول‌های بنیادی مزانشیمی پیوندی (MSCs) ممکن است به خودتکثیر و ظرفیت چند دودمانی آسیب برساند. در طب ترمیمی، سلول‌های عضله صاف عروقی از طریق حفظ مقاومت محیطی شریانی، تنظیم‌کننده‌های فشار خون، جریان خون و ترمیم شریان‌ها، تنظیم‌کننده‌های اصلی شریان‌های تن انقباضی هستند [42]. با کاهش انقباض سلولی و افزایش پیری سلولی همراه است. با استرس مداوم یا به دلیل کاهش حساسیت مکانیکی، کاهش انطباق سیگنال‌های ریزمحیط در سلول‌های عضله صاف مسن شناسایی می‌شود[43]. نتایج حاضر تایید کرد که درمان BPME جمعیت سلولی زنده را حفظ می‌کند، همانطور که ظرفیت رگزایی نشان می‌دهد.

ظرفیت تکثیر شناسایی شده BPME روی HUVECs با کاهش بیان LPO و افزایش بیان ژن آنتی اکسیدانی پشتیبانی شده است. ROS و LPO در ابتدا از مجتمع میتوکندریایی (I و I) و NOX{0}} در طی تکثیر یا تمایز سلولی تولید می‌شوند [44]. ROS بیش از حد واکنش نشان می دهد و به بیومولکول ها آسیب می رساند، به ویژه یکپارچگی DNA ژنومی را تغییر می دهد، که برای تکثیر و عملکرد سلولی حیاتی است [45]. با این حال، تایید شده است که دریافت رژیم غذایی پلی فنول های آنتی اکسیدانی، مانند اپی گالوکاتچین و توکوفرول، سلول ها را از استرس اکسیداتیو محافظت می کند و ظرفیت تکثیر را افزایش می دهد [46]. در مطالعه ما، سطح بیان mRNA LPO کاهش یافت و NOS{4}}، Nrf-2 و eNOS دو برابر در HUVECs با استرس اکسیداتیو ناشی از Hoo افزایش یافت. eNOS ایزوفرم غالب NOS است که مسئول اکثر محصولات NO. در سلول های ماهیچه صاف و بافت های عروقی است. نه همه انواع عروق عروقی را گشاد می کند و از تجمع پلاکت ها و چسبندگی لکوسیت ها در EC ها محافظت می کند[47]. تاکنون گزارش‌های متناقض زیادی در مورد عوامل خطر قلبی عروقی وجود داشته است و اختلال عملکرد اندوتلیال با کاهش یا افزایش بیان eNOS همراه بوده است [48]. افزایش بیان eNOS در بیماری عروقی مشاهده شد که احتمالاً نتیجه تولید بیش از حد H-Oz است. O{10}}، یک محصول تغییر شکل، ممکن است بیان eNOS را از طریق مکانیسم‌های رونویسی و پس از رونویسی افزایش دهد [49]. پاتوژنز بیماری عروقی با تخریب سریع NO همراه است. پس از واکنش با O{13}}، و در نهایت، ONOO- شکل می‌گیرد که منجر به جدا شدن eNOS و اختلال در عملکرد آنزیم NOX می‌شود [50]. استرس اکسیداتیو توسط آنزیم های آنتی اکسیدانی سرکوب شده است و سطوح mRNA GSK{16}} و GPX پس از درمان BPME افزایش یافته است. BPME حاوی مواد شیمیایی گیاهی متعددی است که از نظر بیولوژیکی فعال هستند، از جمله بتالین ها، فلاونوئیدها، پلی فنول ها، آنزیم های درمانی، اسید آسکوربیک، دهیدروآسکوربیک اسید (DHAA) و نیترات معدنی (NOg) و اینها ممکن است در افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی در HUVECs نقش داشته باشند. در این زمینه، چا و همکاران. (2014) [51] گزارش داد که اسید کلروژنیک به طور موثری در برابر آسیب DNA ناشی از استرس اکسیداتیو در کراتینوسیت های انسانی محافظت می کند.

اندوتلین-1 (Edn-1)، یک منقبض کننده عروق مشتق از اندوتلیوم، مهاجرت سلول های ماهیچه صاف را انجام می دهد و به عنوان یک عامل ضد آپوپتوز در سلول های دارای استرس ناشی از اکسید نیتریک عمل می کند[52،53]. فرآیندهای بازسازی عروقی، مهاجرت، تکثیر و تجمع ماتریکس خارج سلولی توسط Edn{6}} و NO [54,5] تحریک شده است. ما افزایش بیان Edn-1 را پس از درمان BPME در HUVECs با استرس اکسیداتیو مشاهده کردیم. با استرس اکسیداتیو یا تجمع LPO، مرحله اولیه التهاب عروقی، چسبندگی لکوسیت ها به سلول های عضله صاف اندوتلیال است، که برای رویدادهای مهم ایسکمی و آترواسکلروز برجسته است [56]. این توسط عبارات VCAM و ICAM واسطه می شود. توسط بسیاری از کموکاین‌ها و عوامل کموتاکسی مانند NF-kB، IL{12}} و عبارات TNF[57] تحریک شده است. مهار فعال‌سازی IL{15}} و به دنبال آن بیان مولکول چسبندگی توسط ترکیب فنولیک رژیم غذایی الاژیک اسید حاصل شده است [58]. درمان با BPME برای HUVEC های تحریک شده خارجی با استرس اکسیداتیو به طور قابل توجهی باعث کاهش فاکتورهای پیش التهابی خاص سلول های عروقی مانند VCAM، ICAM، NF-KB، IL{19}} و سطوح بیان TNF-x شد. در این زمینه، کرسپو و همکاران. [59] گزارش کردند که کامفرول و کورستین به ترتیب ژن های پیش التهابی مانند VCAM، ICAM، NF-kB و IL{24}} را مهار می کنند. به طور کلی، مهار استرس اکسیداتیو و پتانسیل بیان ژن مربوط به التهاب عروقی BPME بیان فاکتورهای رشد سلول های عروقی را مورد علاقه قرار داد و به طور بالقوه به تکثیر و رشد سلول های عروقی کمک کرد.

5. نتیجه گیری ها

یافته‌های حاضر تأیید می‌کنند که افزایش بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانی با فرونشاندن استرس اکسیداتیو همراه بوده و به غلبه بر اختلال در تکثیر HUVEC و رگ‌زایی کمک می‌کند. سیر سیاه حاوی هیدروکسی متیل فورفورال اثر التهابی چسبندگی سلول‌های مونوسیتی ناشی از TNF به HUVECs را سرکوب می‌کند و بیشتر تولید ROS، بیان VCAM{1}} و فعال‌سازی NF-kB را سرکوب می‌کند [60]. علاوه بر این، او و همکاران. [61] تایید کرد که هیدروکسی متیل فورفورال پتانسیل محافظت از هیپوکسی را دارد. همچنین مشخص شده است که پوست چغندر حاوی فلاونوئیدها، فوران و ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند 5-هیدروکسی متیل فورفورال، متیل پیروات، فورفورال، و 2،3-دی هیدرو-3،5- است. دی هیدروکسی{10}}متیل-4H-Pyran-4-one; این اجزا مسئول افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی و سرکوب مولکول های چسبنده سلول های عضله صاف عروقی پیش التهابی هستند. پوست چغندر به عنوان یک محرک برای استخرهای آنتی اکسیدانی برای خاموش کردن محرک خارجی یا محرک پاتولوژیک داخلی استرس پراکسیداتیو سلولی استفاده شده است. یافته‌های ما نشان داد که اجزای چغندر به کاهش استرس متابولیک و التهاب در HUVECها کمک می‌کند، که ممکن است برای تکثیر سلول‌های عروقی و رگ‌زایی مفید باشد.

این مقاله از Genes 2021, 12, 1380 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/genes12091380 https://www.mdpi.com/journal/genes