سنجش زیستی برای نظارت بر اثر ضد پیری درمان خون بند ناف

تماس:jerry.he@wecistanche.com

سانگ هون بائه1*، آلا جو1،2*، جاه هیون پارک1، چول وو لیم1، یوری چوی1، جوهیون اوه2، جی مین پارک1، تاهو کنگ1، رالف وایسلدر2،3، هاخو لی2، جیسوک مون1

1. گروه بیوتکنولوژی، کالج علوم زیستی، دانشگاه CHA، Gyeonggi-do 13488، جمهوری کره

2. مرکز زیست شناسی سیستمی، بیمارستان عمومی ماساچوست، دانشکده پزشکی هاروارد، بوستون، MA 02114، ایالات متحده آمریکا

3. گروه زیست شناسی سیستمی، دانشکده پزشکی هاروارد، بوستون، MA 02115، ایالات متحده آمریکا *این نویسندگان به طور مساوی مشارکت داشتند.

نویسنده مسئول: هاخو لی، دکترا. مرکز بیولوژی سیستمی، بیمارستان عمومی ماساچوست، خیابان کمبریج 185، CPZN 5206، بوستون، MA 02114، ایالات متحده آمریکا. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu جیسوک مون، دکترا. گروه بیوتکنولوژی، کالج علوم زیستی، دانشگاه CHA، Pangyo-ro 335، Bundang-gu، Seongnam-si، Gyeonggi-do 13488، جمهوری کره. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.{3}}/) توزیع شده است. برای اطلاع از شرایط و ضوابط کامل به http://ivyspring.com/terms مراجعه کنید.

دریافت: 1397.10.04; پذیرش: 2018. 11. 18; تاریخ انتشار: 1398/01/01

سیستانچ اثر ضد پیری دارد

خلاصه

زمینهدرمان حیوانات مسن با پلاسمای مراحل اولیه رشد (به عنوان مثال، پلاسمای بند ناف) پتانسیل قابل توجهی برای کند کردن تخریب عملکردهای عصبی و شناختی مرتبط با سن نشان داد. با این حال، ترجمه چنین یافته‌هایی به واقعیت‌های بالینی به روش‌های مؤثری برای ارزیابی اثربخشی درمان نیاز دارد. روش‌های ایده‌آل باید حداقل تهاجمی، برای سنجش‌های سریالی، مقرون‌به‌صرفه و کمی باشند.

مواد و روش ها: ما یک رویکرد حسگر زیستی جدید برای نظارت ایجاد کردیمضد پیریدرمان. ما دو جزء کلیدی حسگر را توسعه دادیم: 1) یک متابولیت منتقله از خون به عنوان یک نشانگر جایگزین پیری شناسایی شد. و دوم) یک سیستم سنجش فشرده و مقرون به صرفه برای برنامه های کاربردی در محل توسعه داده شد. ما موش های مسن را با پلاسمای بند ناف انسان یا سالین درمان کردیم. پروفایل متابولیت بی طرفانه روی پلاسمای موش اسید آراشیدونیک (AA) را به عنوان یک شاخص قوی مرتبط باضد پیریاثر ما در مرحله بعد یک حسگر مغناطیسی الکتروشیمیایی رقابتی (cMES) را که برای تشخیص AA به طور مستقیم از پلاسما بهینه شده است، اجرا کردیم. پلتفرم توسعه‌یافته می‌تواند AA را مستقیماً از حجم‌های کوچک پلاسما ({1}}.5 µL) در عرض 1.5 ساعت شناسایی کند.

نتایج: سنجش cMES همبستگی قوی بین سطوح AA واثر ضد پیریسطح AA، در حالی که با افزایش سن کاهش می یابد، در موش های مسن تحت درمان با پلاسما افزایش می یابد که همچنین عملکرد یادگیری و حافظه را بهبود می بخشد.

نتیجه گیری: پلت فرم cMES هم پیش و هم بالینی را توانمند می کندضد پیریتحقیق با امکان نظارت بر درمان کم تهاجمی و طولی؛ این ظرفیت ها توسعه را سرعت می بخشدضد پیریدرمان، بهبود کیفیت زندگی فردی.

کلمات کلیدی: ضد پیری، آراشیدونیک اسید، پروفایل متابولیت، حسگر مغناطیسی الکتروشیمیایی، حسگر زیستی

مقدمه

افزایش سن به طور فزاینده ای به عنوان یک عامل خطر بالینی برای انحطاط شناختی (به عنوان مثال، تخریب عصبی، زوال عقل) و سایر بیماری های مزمن (مانند سرطان، بیماری های قلبی عروقی، دژنراسیون عضلانی) شناخته می شود [1]. با گسترش طول عمر انسان و رشد جمعیت سالمندان، تلاش‌های قابل توجهی برای روشن کردن مکانیسم‌های پیری [1-3] و یافتن استراتژی‌های درمانی برای کند کردن یا حتی معکوس کردن فرآیندهای پیری [4] در حال انجام است. در واقع، نتایج امیدوارکننده ای از مطالعات حیوانی گزارش شده است. موش های بالغی که از موش های جوان تزریق پلاسما دریافت کردند، عملکرد شناختی، شکل پذیری سیناپسی و فعالیت عصبی را بازیافتند [5]. توسعه سریع درضد پیریدرمان ها و ترجمه آنها به آزمایشات انسانی پیش بینی می شود [6]. معیارهای فعلی برای نظارت بر اثرات درمان، با این حال، عملی محدودی دارند، زیرا روش‌ها اغلب به سختی می‌توانند در مورد انسان اعمال شوند (مثلاً تصویربرداری تهاجمی از مغز، مشاهده رفتار کنترل‌شده) و ذهنی (مثلاً پرسشنامه‌های تجربیات بیمار). یک شرط کلیدی برای پیشرفتضد پیریبنابراین، درمان‌ها در توسعه سنجش‌های کمی و کم تهاجمی برای نظارت بر درمان نهفته است.

ما استدلال کردیم که متابولیت ها منبعی قوی برای آن خواهند بودضد پیرینشانگرهای زیستی متابولیت ها یک فنوتیپ ضروری در یک ارگانیسم هستند و به عنوان نشانگرهای زیستی تشخیصی برای سایر بیماری ها مورد مطالعه قرار می گیرند [7]. به طور خاص، پیری به طور معمول با تغییرات متابولیک یا اختلال در عملکرد مرتبط است که بر پروفایل های متابولیت کلی در موجودات تاثیر می گذارد. به این ترتیب، می توان تصور کرد که ردیابی ترکیب و/یا سطوح متابولیت ها از اثربخشیضد پیریرفتار. علاوه بر این، سنجش متابولیت، به ویژه در قالب آزمایش خون، می تواند کمی و کم تهاجمی باشد. این شایستگی‌ها دریافت رژیم‌های درمانی مختلف یا گروه‌های بیمار و پایش پویایی (ضد) پیری را از طریق نمونه‌برداری سریال تسهیل می‌کند.

ما در اینجا یک استراتژی جدید حسگر زیستی را برای نظارت شرح می دهیمضد پیریرفتار. دو عنصر کلیدی پیشرفته بودند: 1) یک متابولیت منتقله از خون به عنوان یک نشانگر پیری جایگزین شناسایی شد. و دوم) یک سیستم سنجش سریع و مقرون به صرفه برای کاربردها در تنظیمات بالینی معمول توسعه داده شد. به طور خاص، ما گروهی از موش‌های مسن (حدود 2 سال) را با پلاسمای خون بند ناف انسان درمان کردیم. تجزیه و تحلیل جامع متابولومیک بر روی خون موش نشان داد که اسید آراشیدونیک (AA) که سطح آن با افزایش سن به طور قابل توجهی کاهش می یابد، در گروه تحت درمان به طور معکوس افزایش می یابد. این مشاهدات ما را به ابداع یک حسگر مغناطیسی الکتروشیمیایی برای اهداف مولکولی کوچک سوق داد: ما یک واکنش الکتروشیمیایی رقابتی را بهینه کردیم که در آن AA بر روی دانه‌های مغناطیسی گرفته شده و برای حساسیت بالاتر متمرکز شد. پلتفرم توسعه‌یافته می‌تواند AA را مستقیماً از حجم‌های کوچک پلاسما ({5}}.5 µL) در عرض 1.5 ساعت شناسایی کند. با استفاده از این پلت فرم، می‌توانیم ارتباط مثبتی بین سطوح AA خون و عملکرد بهتر حیوانات در کار حرکتی ایجاد کنیم.

نتایج

درمان موش های بالغ با پلاسمای خون بند ناف شکل 1a طرح کلی آزمایش را نشان می دهد.

به عنوان یک عامل، ما از پلاسمای مشتق شده از نمونه خون بند ناف انسان استفاده کردیم. مطالعات قبلی نشان داد که موش‌های مسن که پلاسمای موش جوان تزریق شده بودند، عملکرد حافظه فضایی را بهبود می‌بخشند و تجویز سیستمیک پلاسمای خون بندناف انسان، شناخت وابسته به هیپوکامپ را در موش‌های مسن بهبود می‌بخشد [5، 8]. تزریق پلاسما، که فاقد اجزای سلولی است، خطر رد ایمنی ناشی از عدم تطابق گونه ها را به حداقل می رساند. موش های مسن (سن شروع، 18 ماهگی) تصادفی شدند و پلاسما (یک گروه درمان) یا بافر سالین (یک گروه شم) از طریق تزریق دم بیهوده (130 میکرولیتر؛ برای جزئیات بیشتر به شکل S1 مراجعه کنید) دریافت کردند. به عنوان کنترل مثبت، از موش های جوان (3 ماهه) استفاده شد. پلاسمای مشتق شده از خون بند ناف جمع آوری نشد و به هر موش مکرراً پلاسمای یک اهداکننده تزریق شد (شکل S1). پس از یک درمان 4-هفته‌ای، موش‌ها تحت آزمایش رفتار (یعنی روتارود) قرار گرفتند و خون برای آنالیز گرفته شد.

شکل 1. طراحی آزمایشی. پلاسمای خون بندناف انسان به گروه‌های جوان (3-ماهه)، مسن (20- و 23-ماهه) و گروه‌های مسن تحت درمان با پلاسما (20-) تزریق شد. و 23-ماهگی). سه گروه برای اندازه‌گیری هماهنگی حرکتی و یادگیری، تحت آزمایش‌های روتارود آزمایشی قرار گرفتند. پروفایل متابولیت غیر هدفمند بر روی خون سه گروه و بیشتر انجام شدضد پیریمسیر مربوطه از طریق یک رویکرد بیوانفورماتیک تعیین شد. حسگر زیستی برای شناسایی مهم ترین متابولیت مسیر توسعه یافته است.

شکل 2. تعیین بیومارکرهای متابولیت مرتبط با درمان پلاسمای خون بند ناف انسان. (الف) مشخصات جهانی اختلال متابولیت. ردیف ها با ویژگی ها (ترکیبی منحصر به فرد از مقدار m/z و زمان نگهداری) از LC/MS و ستون ها تا نمونه ها مطابقت دارند. ردیف ها به صورت سلسله مراتبی خوشه بندی می شوند. (B) نمودار امتیاز PCA برای کاهش ابعاد. نمونه ها در برابر مولفه اصلی (PC) 1 و 2 ترسیم شدند. مقادیر در پرانتز افسانه های محور نسبت های واریانس توضیح داده شده توسط آن مؤلفه ها هستند. PC1 به احتمال زیاد اثرات ضد پیری را توضیح می دهد، با توجه به اینکه گروه تحت درمان با پلاسما به گروه جوان بسیار نزدیکتر از گروه شم بود. (C) تجزیه و تحلیل غنی سازی مسیر. متابولیت ها با تطبیق مقادیر اندازه گیری m/z با اطلاعات جرم مولکولی شناسایی شدند. هر دایره نشان دهنده یک مسیر مشخص است. برای یک مسیر معین، مکان یا اندازه x دایره به مرکزیت نسبی بین (معیار تأثیر مسیر) متابولیت ها، و مکان یا رنگ y (مقدار p پایین تر برای قرمز و بیشتر برای آبی) تا حدی مطابقت دارد. کدام متابولیت ها بیش از حد نشان داده می شوند. مسیرهای غالب مقادیر x و y بالاتری دارند. بر این اساس، متابولیسم اسید آراشیدونیک (AA) به عنوان محتمل ترین مسیر برای توضیحاثرات ضد پیریاز پلاسمای خون بند ناف

تجزیه و تحلیل متابولیک بر روی نمونه های خون موش

ما ابتدا یک پروفایل متابولیت مولکول کوچک بی طرفانه را در پلاسمای موش انجام دادیم. نمونه‌های خون از هر سه گروه موش تحت آنالیز کروماتوگرافی مایع و طیف‌سنجی جرمی (LC/MS) قرار گرفتند. ما داده‌های m/z را توسط MAIT (مجموعه ابزار شناسایی خودکار متابولیت) پردازش کردیم و ویژگی‌های آماری معنی‌داری را از طریق ANOVA (8572 ترکیب منحصر به فرد m/z و زمان ماند) شناسایی کردیم (شکل 2a). تجزیه و تحلیل خوشه‌بندی سلسله مراتبی (HCA) متابولیت‌ها دو الگوی کلیدی را نشان داد: i) پروفایل‌های متابولیت به‌طور مشخصی بین موش‌های مسن (درمان نشده) و جوان متفاوت بود. و دوم) مشخصات موش های مسن تحت درمان با پلاسما به موش های جوان نزدیک تر بود.

تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) ساختارهای ذاتی داده های متابولومیک را نشان داد (شکل 2b). حدود 50 درصد از کل تغییرات با مولفه های اصلی اول (PC1) و دوم (PC2) قابل توضیح بود. هر سه گروه (به عنوان مثال، گروه های جوان، تحت درمان با پلاسما، و گروه های شم) در موقعیت های گسسته مستقر شدند، که نشان می دهد ویژگی های بیولوژیکی مرتبط برای افتراق طبقات گروه شناسایی شد. جالب اینجاست که گروه سنی تحت درمان با پلاسما از شم به سمت گروه جوان حرکت کردند. برای تعیین کمیت جداسازی گروه، خوشه بندی سلسله مراتبی را بر روی دو جزء اصلی محاسبه کردیم. در دندروگرام، گروه های جوان و تحت درمان با پلاسما در سطح ناهمسانی کمتر (یا سطح شباهت بالاتر، 1120.9) نسبت به گروه بدون درمان (3162.5) دسته بندی شدند (شکل S2). این نتایج نشان می‌دهد که ویژگی‌های انتخاب شده (متغیرها یا ردیف‌ها در شکل 2a) می‌توانند برای استنباط بیومارکر متابولیت مربوط به پیری و پیری استفاده شوند.ضد پیری. ما ویژگی ها را با متابولیت های شناخته شده با استفاده از پایگاه داده در حوزه عمومی [9] حاشیه نویسی کردیم.

ما عملکردها و اتصال متابولیت‌های شناسایی‌شده را با استفاده از نقشه‌برداری KEGG (دایره‌المعارف ژن‌ها و ژنوم‌های کیوتو) [10] ارزیابی کردیم. برای یک مسیر مشخص، i) نمایش بیش از حد یک متابولیت نامزد و دوم) اهمیت آن (یعنی مرکزیت بین) [11] به عنوان یک گره میانی کلیدی بین جفت متابولیت های دیگر را اندازه گیری کردیم (برای جزئیات بیشتر به روش ها مراجعه کنید). ما دریافتیم که متابولیسم اسید آراشیدونیک (AA) بیش از حد نشان داده شده است (بالاترین مقدار y در شکل 2c)، و متابولیت ها در آن مسیر تمایل به قرار گرفتن در مسیرهای ارتباطی دارند (مقادیر x بالاتر در شکل 2c) و بر جریان اطلاعات حاکم است در میان بسیاری از متابولیت ها در متابولیسم AA، ما خود AA را به عنوان نشانگر زیستی انتخاب کردیم. به عنوان یک ورودی شروع به مسیر، AA به تنهایی می تواند نماینده سایر متابولیت های آشفته باشد.

سنسور مغناطیسی الکتروشیمیایی رقابتی (cMES) برای تشخیص AA در پلاسما

در مرحله بعد شروع به پیشبرد یک سیستم سنجش سریع و در محل برای تشخیص AA کردیم. ما تصمیم گرفتیم از فناوری سنجش مغناطیسی الکتروشیمیایی استفاده کنیم [12-17]. غنی‌سازی و شناسایی هدف را در یک پلت فرم واحد ترکیب می‌کند: دانه‌های مغناطیسی (MBs) برای گرفتن و برچسب‌گذاری اهداف مولکولی استفاده می‌شوند، و اهداف متصل به مهره از طریق سنجش الکتروشیمیایی شناسایی می‌شوند. این رویکرد مزایای عملی زیادی دارد: 1) نمونه‌های بومی (پلاسما یا خون) می‌توانند مستقیماً بدون نیاز به خالص‌سازی نمونه استفاده شوند. ii) سنجش از طریق غنی سازی مغناطیسی و تقویت سیگنال آنزیمی به حساسیت تشخیص بالایی دست می یابد. iii) بر اساس طرح تشخیص الکتریکی، حسگرها را می توان به راحتی به عنوان یک دستگاه قابل حمل کوچک کرد (شکل 3a).

با این حال، تشخیص AA از طریق حسگر مغناطیسی الکتروشیمیایی یک چالش فنی ایجاد کرد. از آنجایی که AA یک مولکول کوچک است (~304.5 Da)، آزمایش های ایمنی با استفاده از یک جفت آنتی بادی AA دشوار بود. بنابراین ما یک فرمت سنجش رقابتی (cMES؛ حسگر مغناطیسی الکتروشیمیایی رقابتی) را بررسی کردیم که تنها به یک آنتی بادی AA نیاز داشت (شکل 3b). برای گرفتن هدف، MB ها را با آنتی بادی های AA (MBAb) پوشاندیم. ما همچنین یک عامل رقیب (AA-HRP) را با کونژوگه کردن AA با یک آنزیم اکسید کننده (پراکسیداز ترب، HRP) تهیه کردیم. به طور خاص، ما از یک فرم هاپتن استفاده کردیم. AA روی آلبومین سرم گاوی (BSA) کونژوگه شد و HRP را به حامل BSA کونژوگه کرد (شکل S3). برای سنجش cMES، نمونه های خون با MBAb و AA-HRP مخلوط شدند. مقدار AA-HRP برای اشباع کردن مکان‌های اتصال AA در MBAb کافی بود (روش‌ها). این امر منجر به بارگذاری HRP تفاضلی بر روی مگابایت ها می شود که بستگی به مقادیر AA درون زا در نمونه ها دارد. با افزودن متوالی یک واسطه الکترونی کروموژنیک (3،3'،5،5'-تترا متیل بنزیدین، TMB) جریان الکتریکی تولید شد که توسط یک الکترود مسطح خوانده شد. زمان واکنش برای گرفتن AA و انکوباسیون TMB برای به حداکثر رساندن سطح سیگنال بهینه شد (شکل S4).

شکل 3. سنسور مغناطیسی الکتروشیمیایی رقابتی (cMES) برای سنجش AA. (الف) شماتیک دستگاه. دستگاه cMES ردپای کوچکی دارد و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است

عملیات در محل (ب) ما یک سنجش الکتروشیمیایی رقابتی برای تشخیص AA ابداع کردیم. دانه های مغناطیسی (MBAb) با آنتی بادی های ضد AA کونژوگه شدند.

نمونه های کنترل فقط حاوی AA-HRP بودند و با دانه های مغناطیسی مخلوط شدند. نمونه های آزمایش با دانه های مغناطیسی و AA-HRP مخلوط شدند. ج) جریان های الکتریکی

توسط خواننده cMES قابل حمل اندازه گیری می شود. در سنجش cMES، مقدار جریان با افزایش غلظت AA [AA] کاهش می‌یابد. سیگنال از کنترل

نمونه خط پایه را برای [AA]=0 نانوگرم در میلی لیتر تنظیم کرد. اختلاف فعلی (∆I) بین نمونه های پلاسمای هدف و کنترل به عنوان یک متریک تحلیلی استفاده شد. (د)

مقادیر شناخته شده AA در سرم افزایش یافته و توسط cMES اندازه گیری شد. حد تشخیص 126 نانوگرم در میلی لیتر بود. (E) cMES و ELISA برای مقایسه شدند

هماهنگی نتایج حاصل از هر دو روش تطابق خوبی را نشان داد (959/02=0). داده ها به صورت میانگین ± SEM از اندازه گیری های سه تکراری نمایش داده می شوند.

شکل 4. اندازه گیری AA در نمونه های پلاسما. (الف) تجزیه و تحلیل دوره زمانی سطح AA موش پس از تزریق پلاسما. ما 13{{10}} میکرولیتر پلاسما (غلظت AA=7.2 میکروگرم در میلی‌لیتر) به موش‌ها (n=6) تزریق کردیم و پس از 3، 7 و 14، خون موش‌ها را جمع‌آوری کردیم. روزها. سپس سطح AA خون موش کنترل شد. سطح AA به طور قابل توجهی در روز 3 افزایش یافت و پس از 7 روز به سطح طبیعی بازگشت. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" نمونه="" های="" پلاسمای="" موش="" مورد="" سنجش="" قرار="" گرفت.="" در="" گروه="" کنترل="" (n="5)،" موش‌های="" جوان="" (سن،="" 5="" و="" 8="" ماه)="" سطوح="" aa="" بالاتری="" نسبت="" به="" موش‌های="" مسن="" تحت="" درمان="" شم="" داشتند="" (سن،="" 20="" و="" 23="" ماه؛="" n="8)." برای="" گروه="" تحت="" درمان="" با="" پلاسما="" (n="5)،" افزایش="" پایدار="" در="" aa="" مشاهده="" شد.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (c)="" نمونه‌های="" پلاسما="" از="" گروه‌های="" مشابه="" در="" (ب)="" با="" طیف‌سنجی="" جرمی="" آنالیز="" شدند.="" سطوح="" aa="" روند="" مشابهی="" را="" با="" اندازه="" گیری="" cmes="" نشان="" داد.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" داده="" ها="" به="" صورت="" میانگین="" ±="" sem="" نمایش="" داده="" می="">

در نتیجه سنجش رقابتی، مقدار جریان الکتریکی با غلظت‌های بالاتر AA پلاسما ([AA]) کاهش یافت. بنابراین ما یک نمونه کنترل را با جوجه کشی MBAb تنها با AA-HRP تهیه کردیم. نمونه کنترل برای تنظیم خط پایه بالایی (یعنی [AA]=0 ng/mL) برای محاسبه تفاوت سیگنال استفاده شد. جریان الکتریکی از نمونه شاهد و پلاسما اندازه گیری شد و اختلاف خالص |∆I |=|Icontrol - Iplasma|به دست آمد (شکل 3c). چنین

اندازه‌گیری‌های دیفرانسیل نیز سیگنال پس‌زمینه مشترک را جبران می‌کنند.

آزمایش تیتراسیون (شکل 3d) با استفاده از نمونه هایی با مقادیر مختلف AA، حد تشخیص (LOD) را 125.9 نانوگرم در میلی لیتر نشان داد. LOD سنجش ~{3}} برابر کمتر از غلظت معمولی AA (38 میکروگرم در میلی لیتر) در پلاسمای موش های جوان (5 ماه، n=2) بود. بر اساس این نتایج، نمونه‌های اولیه پلاسما را با افزودن یک محلول بافر رقیق کردیم (100- برابر) (به روش‌ها مراجعه کنید). سیگنال از اتصال غیر اختصاصی نزدیک به سطح پس زمینه ذاتی (~43 nA) بود که به طور بالقوه از فاکتور رقت بالا بهره می برد. ما همچنین تأیید کردیم که نتایج سنجش با نتایج ELISA معمولی مطابقت دارد (R{9}}.961، شکل 3e). روش cMES، با این حال، سریعتر (1 ساعت) از ELISA (4 ساعت)، بیشتر به دلیل سینتیک اتصال سریع بود. در cMES، مگابایت ها AA را در کل حجم نمونه می گیرند ({14}}انتشار بعدی)، در حالی که ضبط AA بر انتشار 1-بعدی در ELISA مبتنی بر صفحه تکیه دارد.

نظارت بر AA در موش های تحت درمان با پلاسما

ما از cMES برای تجزیه و تحلیل سطوح AA در موش پس از یک درمان پلاسما استفاده کردیم. از آنجایی که AA به طور طبیعی در خون بند ناف انسان وجود دارد، تزریق پلاسما می تواند سطح AA موش را افزایش دهد. میانگین غلظت AA از شش پلاسمای مختلف خون بند ناف انسان 7.2 ± 0.5 میکروگرم در میلی لیتر (میانگین ± SEM) بود. ما 130 میکرولیتر پلاسمای خون بند ناف انسان را به موش‌ها (n=6) تزریق کردیم و سطوح AA آنها را کنترل کردیم (شکل 4a). تزریق پلاسما بلافاصله سطوح AA خون را افزایش داد (روز 3؛ p <0.01، در="" مقایسه="" با="" سایر="" نقاط="" زمانی)،="" اما="" اثر="" موقتی="" بود.="" سطوح="" aa="" 7="" روز="" پس="" از="" درمان="" به="" حالت="" عادی="" بازگشت="" (p="0.34،" در="" مقایسه="" با="" زمان="" قبل="" از="" تزریق="">

سطح AA پلاسما را بعد از برنامه کامل درمان کنترل می کنیم (شکل S1). از سه گروه مختلف موش استفاده شد: یک گروه سنی تحت درمان با پلاسما (n=8) و یک گروه سنی شم (n=8) (20-23 ماه)، و یک گروه کنترل جوان (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

درمان پلاسما منجر به بهبود شناختی و رفتاری در موش های مسن می شود

ما بیشتر فنوتیپ‌های رفتاری گروه‌های حیوانی را ارزیابی کردیم، به ویژه عملکردهای یادگیری حرکتی و حافظه آنها را ارزیابی کردیم. ما آزمایشات روتارود آزمایشی را در 1 و 4 ماه پس از درمان پلاسما یا شم انجام دادیم (شکل 5a). تأخیر (زمان اجرا) یک موش قبل از افتادن روی میله چرخان برای ارزیابی عملکرد حرکتی حیوان استفاده شد. در 1 ماه پس از درمان ({5}}ماهگی)، تأخیر هر دو گروه شم و تحت درمان با پلاسما به طور قابل‌توجهی کمتر از گروه جوان (5-ماهه) بود (0001/0p<) )="" گروه="" (شکل="" 5b).="" گروه="" تحت="" درمان="" با="" پلاسما،="" با="" این="" حال،="" بهبود="" تدریجی="" در="" یادگیری="" حرکتی="" و="" حافظه="" نشان="" داد،="" در="" حالی="" که="" همان="" قوه="" در="" گروه="" ساختگی="" کاهش="" یافت.="" تغییرات="" در="" سطوح="" aa="" باعث="" تغییرات="" رفتاری="" می="" شود="" که="" می="" تواند="" به="" عنوان="" یک="" شاخص="" اولیه="" عمل="">ضد پیریاثر درمان (شکل 5c).

تجزیه و تحلیل بافت مغز (شکل 5d، 5e) نشان داد که موشهای مسن (گروه شم) دارای ناحیه کوچکتری از سلولهای DCX مثبت در ناحیه زیر بطن نسبت به موشهای جوان بودند. برعکس، مساحت سلول‌های DCX مثبت در حیوان تحت درمان با پلاسما افزایش یافت و بدون تغییر باقی ماند (0.04=0) که نشان می‌دهد پلاسمای خون بند ناف تزریقی نوروژنز مغز پیر را تحریک می‌کند. نتایج حاکی از مزایای بالقوه درمان پلاسما بر نوروژنز پایدار است که منجر به بهبود عملکرد حرکتی در گروه تحت درمان شد.

بحث

پیشرفت‌ها در درمان‌های جوان‌سازی به طور همزمان نیاز به یک معیار عینی و کمی برای خواندن اثربخشی درمان را افزایش می‌دهد. بنابراین ما مطالعه خود را برای شناسایی نشانگرهای زیستی مولکولی طراحی کردیم که می توانند ویژگی های فنوتیپی پیری و پیری را به بهترین شکل توضیح دهند.ضد پیریرفتار. آزمایش‌های حیوانی ما منجر به مشاهدات زیر شد: الف) پروفایل‌های متابولیت گروه‌های موش جوان و بالغ به وضوح متفاوت است. و 2) تزریق پلاسمای بند ناف انسان به موشهای مسن الگوهای متابولیت آنها را به موشهای جوان نزدیکتر می کند. جالب توجه است، ما اسید آراشیدونیک (AA) را به عنوان موثرترین نشانگر زیستی جایگزین برایضد پیریرفتار؛ متابولیسم AA هم در موش‌های جوان و هم در موش‌های تحت درمان با پلاسما بسیار تنظیم‌نشده بود و مشخص شد که نقش کلیدی در تعامل با سایر مسیرهای متابولیک مانند متابولیسم اسید لینولئیک دارد [10، 18].

ما بیشتر یک سیستم حسگر سریع و قابل حمل (cMES) را برای تسهیل تشخیص AA در تحقیقات معمول و تنظیمات بالینی توسعه دادیم. ما به طور خاص یک طرح سنجش رقابتی با غنی‌سازی ایمونومغناطیسی را در تلاش برای شناسایی اهداف مولکولی کوچک (یعنی متابولیت‌ها) مستقیماً از نمونه‌های پلاسما یکپارچه کردیم. این ترکیب مزایای زیر را به همراه دارد. (i) سنجش از سینتیک اتصال سریع سود می‌برد، زیرا دانه‌های مغناطیسی AA را در کل حجم نمونه می‌گیرند (3- انتشار بعدی). (ب) فرآیندهای سنجش (به عنوان مثال، مراحل شستشو) با آهنرباهای خارجی مورد استفاده برای جمع آوری مهره ساده شده است. (iii) با تمرکز مغناطیسی مهره های متصل به AA در نزدیکی الکترود تشخیص، سیگنال تحلیلی کلی را می توان بهبود بخشید (72 درصد) [12]. در واقع، ما نشان دادیم که از روش cMES استفاده می‌کند<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

شکل 5. سنجش های رفتاری و مولکولی. (الف) 2-آزمایشات روتارود آزمایشی در 1 و 4 ماه پس از تزریق پلاسما انجام شد. (ب) گروه تحت درمان با پلاسما

بهبود پیشرونده در هماهنگی حرکتی نشان داد. عملکرد در پایان به عملکرد گروه جوان نزدیک بود (دومین آزمایش در 3 ماهگی). زمان اجرای گروه شم با افزایش سن کاهش یافت. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" برای="" گروه="" تحت="" درمان="" با="" پلاسما،="" افزایش="" سطح="" aa="" قبل="" از="" بهبود="" عملکرد="" حرکتی="" بود.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (d)="" سلول="" های="" مغزی="" در="" ناحیه="" زیر="" بطنی="" برای="" نشانگر="" نوروژنز،="" دابل="" کورتین="" (dcx)="" رنگ="" آمیزی="">

نوار مقیاس 50 میکرومتر است. توجه داشته باشید که گروه شم دارای سطح قابل توجهی کوچکتر از سلول های DCX مثبت در ناحیه زیر بطنی نسبت به موش های جوان بود، در حالی که این ناحیه در حیوان تحت درمان با پلاسما افزایش یافت و بدون تغییر باقی ماند. (E) مساحت سلول های DCX مثبت در تصویر (D) اندازه گیری شد. *p < 0.05;="" ***p=""><>

نشان داده شده است که AA باعث رشد ماهیچه ها و رشد مغز می شود [19، 20]. گزارش های دیگر همچنین مزایای بالقوه AA در را برجسته کردندضد پیری[21، 22]. مطالعه حاضر با این یافته ها مطابقت دارد، اما دامنه آن به ایجاد یک رابطه همبستگی بین سطوح AA وضد پیریفنوتیپ ها با این حال، نظارت سریال AA نشان داد که افزایش AA در موش‌های تحت درمان با پلاسما احتمالاً از منابع درون‌زا بود، نه از پلاسمای تزریق‌شده. علاوه بر این، پایدار استضد پیریاثرات در موش های دریافت کننده حتی 4 ماه پس از پایان درمان با پلاسما مشاهده شد. یادگیری حرکتی و عملکردهای حافظه بهبود یافته است. و تعداد سلول های پیش ساز عصبی در مغز افزایش یافت. این مشاهدات به شدت تغییرات فیزیولوژیکی را در موش های تحت درمان با پلاسما نشان می دهد. مکانیسم دقیق هنوز مشخص نشده است.

چندین محدودیت دیگر این مطالعه باید در تحقیقات آتی مورد توجه قرار گیرد. ابتدا، سنجش cMES برای دقت بالاتر باید اصلاح شود. به طور خاص، با فقدان نمونه های منفی واقعی (به عنوان مثال، نمونه های خون بدون هیچ گونه AA درون زا)، آن را به حساب برای سیگنال های از اتصال غیر اختصاصی دشوار بود. ممکن است تأثیر ماتریس‌های خون ناچیز باشد زیرا نمونه‌ها را 100-برابر رقیق کردیم. با این حال، چنین فرضی باید با استفاده از نمونه‌های پلاسمای حذف‌شده با AA که می‌توانند از مدل موش دارای کمبود AA [23] یا از طریق کاهش ایمنی AA تهیه شوند، تأیید شود. دوم، ما بر روی تشخیص یک متابولیت منفرد در متابولیسم AA برای سادگی تمرکز کردیم، اما این رویکرد ممکن است زمینه بیولوژیکی مانند تعاملات بین متابولیت‌ها در یک مسیر مشخص را نادیده بگیرد. گنجاندن پانلی از متابولیت‌ها، آشفتگی‌های متابولیک را بهتر دریافت می‌کند و همچنین دقت تشخیصی را افزایش می‌دهد. cMES را می توان به راحتی برای شناسایی نشانگرهای مختلف در حین مصرف مقادیر کم نمونه مقیاس کرد. سوم، درون یابی یافته های فعلی برای انسان ها چالش برانگیز خواهد بود. اگرچه موش‌ها و انسان‌ها مسیرهای متابولیک مشابهی دارند، موش‌ها نسبت به انسان 7-برابر سرعت متابولیسم بیشتری دارند [24]. آزمایشات انسانی برای تعیین دوزهای بهینه پلاسما برای تزریق و تعیین خطوط پایه برای نشانگرهای زیستی ضروری است. با توجه به مطالعات حیوانی، ما در حال برنامه ریزی چنین مطالعات انسانی هستیم. این تلاش ها توسعه را تسریع خواهد کردضد پیریدرمان، بهبود کیفیت زندگی فردی و همچنین کاهش بار اجتماعی.

مواد و روش ها

طراحی تجربی

پلاسما از خون بند ناف انسان جمع آوری شده در هنگام زایمان جدا شد. پلاسمای خون بند ناف به صورت انفوزیون داخل وریدی به موش‌های مسن (18-ماهه)، و کنترل شم (18-ماهه) و موش‌های جوان (3- ماهه مثبت) تزریق شد. شاهد) با سالین تزریق شد. در 1 و 4 ماه پس از پیوند، آزمایشات روتارود آزمایشی برای ارزیابی هماهنگی حرکتی و حافظه بلند مدت انجام شد (شکل S1). پروفایل متابولیت بدون هدف بر روی خون از سه گروه انجام شد و تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک تعیین کردضد پیریمسیر مربوطه (متابولیسم اسید آراشیدونیک). این حسگر زیستی برای تشخیص آسان و کارآمد اسید آراشیدونیک در گردش خون ساخته شده است.

تهیه نمونه خون بند ناف

خون بند ناف انسان تحت هیئت بازبینی سازمانی بیمارستان عمومی CHA (سئول، کره، شماره IRB CHAMC-2015- 08-130-009) جمع‌آوری شد. خون بند ناف انسان از 4 اهداکننده اهدا شد و تحت درمان با سیترات-فسفات-دکستروز با ضد انعقاد آدنین (CPDA{4}}) قرار گرفت. پلاسمای خون بند ناف انسان با سانتریفیوژ در 2،{6}} گرم به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق جدا شد. نمونه های پلاسمای جدا شده در دمای -80 درجه نگهداری شدند و با یک چرخه انجماد و ذوب در دمای اتاق استفاده شدند.

آزمایشات روی حیوانات

پروتکل های حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه CHA (IACUC) تایید شد. ما از 18-موش ماده C57BL/6 یک ماهه برای ارزیابی اختلالات متابولیک و فنوتیپ‌های رفتاری که با پیری و پیری مرتبط هستند استفاده کردیم.ضد پیری. کنترل‌های مثبت موش‌های ماده C57BL/6 3-ماهه بودند. همه موش ها در دمای اتاق در چرخه استاندارد 12 ساعت نور تا تاریکی پرورش داده شدند. برای موش های بالغ، پلاسمای خون بند ناف یا سالین (130 میکرولیتر) 12 بار به مدت 4 هفته به صورت داخل وریدی تزریق شد. پلاسمای خون بند ناف انسان جدا شده ادغام نشد و یک حیوان معین پلاسمای خون بند ناف را از همان اهدا کننده دریافت کرد. تعداد حیوانات مورد استفاده در هر آزمایش در بخش روش مربوطه توضیح داده شده است. پلاسما از طریق سانتریفیوژ (3،{10}} گرم، 15 دقیقه در دمای اتاق) جمع آوری شد.

اکتساب متابولیت و تجزیه و تحلیل داده ها

برای تعیین پروفایل متابولیت‌های منتقله از خون، خون از موش‌ها با سوراخ قلبی در مقاطع زمانی تعیین‌شده جمع‌آوری شد: گروه جوان (3-ماهگی، n=10)، گروه ساختگی ({{{{ 4}}month-old, n=10; 23-month-old, n=12)، گروه تحت درمان با پلاسما (20-month-old, n {{13} }}؛ 23-ماهگی، n=5). نمونه های خون با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع - طیف سنجی جرمی (LC-MS) (Agilent) آنالیز شدند. ما فایل‌های LC/MS را به فرمت استاندارد mzXML (ProteoWizard) [25] تبدیل کردیم و سپس آنها را با استفاده از MAIT (مجموعه ابزار شناسایی خودکار متابولیت) [26] برای تشخیص ویژگی، تجزیه و تحلیل آماری و شناسایی متابولیت پردازش کردیم. ویژگی‌های آماری معنی‌دار (یعنی متابولیت‌های یونیزه و/یا تکه تکه‌شده) از طریق آنالیز واریانس (ANOVA) شناسایی شدند. این ویژگی‌ها بر اساس نسبت جرم/بار یون طیفی جرمی (تحمل m/z 0.{26}}05) با همه متابولیت‌های احتمالی موجود در پایگاه داده متابولوم [9] مطابقت داده شد. ما تغییرات متابولیت جهانی را از طریق تجزیه و تحلیل خوشه‌بندی سلسله مراتبی و ساختارهای ذاتی داده‌های متابولومیک از طریق تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) مشخص کردیم. دو یا سه تکرار فنی (با اطمینان از اینکه تغییرات فنی بسیار کوچکتر از تغییرات بیولوژیکی است) در هر موش در یادگیری بدون نظارت مانند PCA و خوشه‌بندی سلسله مراتبی گنجانده شد. خوشه بندی سلسله مراتبی بر روی اجزای اصلی (HCPC) توسط FactoMineR، یک بسته R انجام شد [27]. برای تجزیه و تحلیل عملکردی، محتمل‌ترین مسیرهای متابولیک که با افزایش سن و درمان پلاسما مختل می‌شوند، از طریق آنالیز مسیر KEGG (MetaboAnalyst 3.0) تعیین شدند [28]. توزیع هایپرهندسی برای اندازه گیری نمایش بیش از حد متابولیت های همسان در مسیرهای خاص KEGG مورد استفاده قرار گرفت.

تهیه دانه های ایمونومغناطیسی

دانه های مغناطیسی (5 میلی گرم) پوشیده شده با گروه های اپوکسی (Dynabeads M-270 Epoxy، Invitrogen) در 1{3}} 0 میکرولیتر از محلول 0.1 مولار فسفات سدیم معلق شدند. صد میکروگرم آنتی بادی علیه آراشیدونیک اسید (Biomatik) اضافه شد و کاملاً مخلوط شد. 100 میکرولیتر محلول سولفات آمونیوم 3 مولار اضافه شد و مخلوط به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد و سپس در دمای 4 درجه به مدت یک شب با چرخش شیب آهسته انکوبه شد. واکنش کونژوگه در pH=7.4 انجام شد. این فرآیندها باعث ایجاد پیوند کووالانسی بین گروه‌های اپوکسی (دانه) و آمین (آنتی بادی) می‌شوند، که قبلاً با قرار دادن کونژوگه‌های آنتی‌بادی مهره‌ای در معرض چالش‌های pH [29] تأیید شد. به طور متوسط ​​104×2.4 آنتی بادی در هر مهره تثبیت شد. دانه های مغناطیسی کونژوگه با آنتی بادی با یک آهنربای دائمی جدا شده، دو بار با محلول PBS شسته شدند و در 200 میکرولیتر PBS با 1 درصد BSA معلق شدند. دانه ها در دمای 4 درجه تا یک ماه نگهداری شدند.

ترکیب HRP به اسید آراشیدونیک

سپس HRP از طریق شیمی آمیناسیون کاهشی به BSA کونژوگه شد. به طور خاص، 1{3}}0 میکروگرم AA کونژوگه با BSA (RPU51089، Biomatik) در 0.5 میلی لیتر بافر کربنات-بیو کربنات 0.2 مولار (PH 9.4) حل شد، به یک میلی گرم EZ-link لیوفیل شده اضافه شد. Plus Activated Peroxidase (Thermo Scientific) و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. سپس 10 میکرولیتر سدیم سیانوبرو هیدرید (Thermo Scientific) اضافه شد و مخلوط به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. در نهایت، 20 میکرولیتر از بافر Quenching (Thermo Scientific) اضافه شد و سپس 15 دقیقه در دمای اتاق انکوباسیون شد. الکتروفورز ژل و آنالیز باند پروتئین، کونژوگه HPR به BSA-AA را تایید کرد (شکل S3a). AA کونژوگه با HRP جمع آوری و با فیلتر سانتریفیوژ Amicon Ultra 100K (Millipore) تغلیظ شد. پراکسیداز باقیمانده و BSA-AA به مدت چهار بار با PBS شسته شدند.

تشخیص الکتروشیمیایی AA در نمونه های پلاسما

برای تشخیص الکتروشیمیایی AA، خون از گروه های جوان (n {{0}})، شم (n=8) و گروه های تحت درمان با پلاسما (n=5) به مدت 1 ماه جمع آوری شد. و n=5 به مدت 3 ماه). نمونه های پلاسمای موش ({20}}.5 میکرولیتر) در 50 میکرولیتر BSA 1 درصد در PBS (رقت برابر ×) رقیق شدند و با محلول مهره ایمونومغناطیسی (50 میکرولیتر) و محلول AA کونژوگه با HRP مخلوط شدند. (50 میکرولیتر). مقدار AA-HRP به اندازه‌ای بزرگ بود که مکان‌های اتصال در دانه‌های مغناطیسی را اشباع کند. ما از حدود 8.4 × 107 مهره در هر آزمایش استفاده کردیم که سایت های اتصال AA 2.0 × 1012 را در دسترس قرار داد. مقدار AA-HRP ~1.7×1013 بود. نسبت بین AA-HRP و محل اتصال ~8:1 بود. مخلوط در دمای اتاق به مدت 1 ساعت با چرخش شیب آهسته انکوبه شد. مهره شاهد با مخلوط کردن 1 درصد BSA در PBS (50 میکرولیتر) با محلول مهره ایمونومغناطیسی (50 میکرولیتر) و محلول AA کونژوگه با HRP (50 میکرولیتر) تهیه شد. تمام دانه های واکنش داده شده با آهنربای دائمی جدا شده و دو بار با 80 میکرولیتر PBS (1 درصد BSA) شسته شدند. در نهایت، دانه ها در 7 میکرولیتر PBS معلق شدند. محلول مهره تهیه شده و 20 میکرولیتر محلول TMB (Biomatik) در بالای الکترود قرار داده شد. پس از 6 دقیقه، اندازه گیری کرونوآمپرومتری شروع شد. ما از یک سنسور الکتروشیمیایی کوچک استفاده کردیم (یک سیستم نمونه اولیه که توسط AcurreHealth Inc. توسعه یافته است). سطوح فعلی در محدوده 40-45 ثانیه به طور میانگین محاسبه شد. ما از ضریب تبدیل (100 ×) برای گزارش غلظت تخمینی اولیه AA در پلاسما استفاده کردیم.

سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

آزمایش‌های الایزا با استفاده از کیت الایزای اسید آراشیدونیک موش (AA) با توجه به دستورالعمل‌های ساخت انجام شد. AA رقیق شده سریال به هر چاهک اضافه شد و با AA کونژوگه با HRP در دمای 37 درجه به مدت 40 دقیقه انکوبه شد. پس از چهار بار شستشو با بافر شستشو، محلول TMB اضافه شد و به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. توسعه رنگ با افزودن محلول توقف متوقف شد. جذب با استفاده از میکروپلیت ریدر (Tecan) در طول موج 450 نانومتر خوانده شد.

تست روتارود

ما تست روتارود کنگ و همکاران را اصلاح کردیم. [30] برای ارزیابی هماهنگی حرکتی. روتارود با میله ای با قطر 3-سانتی متر از 4 دور در دقیقه شروع شد و به مدت 5 دقیقه 4 دور در دقیقه در 30 ثانیه شتاب گرفت. موش ها روی میله قرار گرفتند و مدت زمان افتادن موش ها از میله اندازه گیری شد. به هر موش 3 بار آزمایشی در روز داده شد و زمان های دویدن هر روز به عنوان میانگین زمان های تمرین محاسبه شد. اولین آزمایش روتارود در 1-ماه پس از درمان پلاسما انجام شد: گروه جوان (n=29)، گروه شم (n=17)، گروه تحت درمان با پلاسما (n {{{ 11}}). یک جلسه بازآموزی در 4-ماه پس از درمان پلاسما آغاز شد. برای جلوگیری از تمرین بیش از حد، بازآموزی به مدت 2 روز انجام شد. روش دیگر مانند جلسه اول بود.

تصویربرداری از بافت مغز

در 1 ماه (n=4) و 4 ماه (n=3) پس از تزریق پلاسمای خون بند ناف انسان یا تزریق سالین، حیوانات معدوم شدند و سپس با 4 درصد پارافورمالدئید (PFA) و PBS از طریق تزریق خون بند ناف انسان پرفیوژن شدند. بطن چپ گروه های جوان (n=5) و گروه های شم (n=4) به عنوان کنترل استفاده شدند. مغزشان بود

استخراج و محافظت در برابر سرما. هر مغز بر روی یک کرایوتوم به ضخامت 30 میکرومتر برش داده شد. به

انجام ایمونوهیستوشیمی، اتصال غیر اختصاصی با 5 درصد سرم طبیعی بز در 0.3 درصد Triton X-100 به مدت 40 دقیقه مسدود شد. آنتی بادی اولیه علیه Doublecortin (DCX؛ 1:400، Cell Signaling، #4604S) یک شبه در دمای 4 درجه اعمال شد و سپس PBS برای شستشو استفاده شد [31]. آنتی بادی ثانویه Alexa Fluor 488 (1:2000، Invitrogen، #A11008) برای تشخیص DCX استفاده شد. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (Nikon Eclipse 80i) گرفته شد و با استفاده از Image J [32] تجزیه و تحلیل شد.

تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از توابع پایه R و lme4، یک بسته R برای هر دو خطی انجام شد

مدل‌های با جلوه‌های ترکیبی یا مدل خطی تعمیم‌یافته

(GLM) و به دنبال آن یک تست تعقیبی LSD [33]. داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده و مقدار ap <{2}}.05 معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

مواد تکمیلی

ارقام تکمیلی

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

قدردانی

از شرکت AccureHealth برای ارائه سنسور الکتروشیمیایی کوچک تشکر می کنیم. این مطالعه تا حدی توسط کمک مالی موسسه ارتقای فناوری اطلاعات و ارتباطات (IITP) با بودجه دولت کره (MSIT) (2017M3A9B4025699) پشتیبانی شد.

منافع رقابتی

نویسندگان اعلام کرده اند که هیچ علاقه رقابتی وجود ندارد.