تقویت فعالیت ضد سرطانی تاکسول آسپرژیلوس فاووس "اندوفیت جوجوبا" از طریق کونژوگاسیون با نانوذرات طلا به واسطه تابش

تاکسول جایگزین گیاه چینی سیستانچ

کلید واژه ها:آسپرژیلوس فاووس · جوجوبا · قارچ های اندوفیت · نانوذرات طلا · تاکسول · پرتودهی · بهینه سازی تغذیه

معرفی

تاکسول یکی از تجاری ترین طیف وسیع استداروهای ضد سرطان[1]. فعالیت تاکسول از ویژگی منحصر به فرد آن برای اتصال با هترودایمر زیرواحدهای توبولین سلولی، ترویج پلیمریزاسیون توبولین، در نتیجه تقسیم میتوزی سلول‌های تومور را مختل می‌کند [2]. تاکسول فعالیت قوی در برابر سرطان های سینه، ریه، سر و گردن، سرطان رحم و انواع پیشرفته سارکوم کاپوزی نشان داد [3]. تاکسول ابتدا از پوست درخت سرخدار Taxus brevifolia "family Taxaceae" [4، 5] تولید شد. با این حال، عملکرد کمتر از تاکسول که بودن<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as آسم,التهاب، وسرطان[32]. بنابراین، هدف اصلی این کار کشف یک جدایه قارچی جدید از گیاه جوجوبا با پایداری متابولیک منحصر به فرد برای تولید تاکسول، ارزیابی رویکردهای مختلف برای به حداکثر رساندن بازده تاکسول آنها و همچنین افزایش فعالیت ضد تکثیری ترکیبات تاکسول استخراج شده بود. از طریق کونژوگاسیون با نانوذرات طلا، با واسطه تابش گاما.

مواد و روش ها

جداسازی و کشت قارچ اندوفیت

بخش‌های مختلف جوجوبا (Simmondsia chinensis) به‌عنوان برگ، پوست، شاخه‌ها و جوانه‌ها از دانشکده کشاورزی دانشگاه قاهره جمع‌آوری شد و به عنوان منبع قارچ‌های اندوفیت مورد استفاده قرار گرفت. قسمت‌های گیاه جمع‌آوری و در زیر آب جاری شسته شد، سطح آن با اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه استریل شد و سپس با آب استریل شستشو داده شد [28]. قسمت‌های گیاه استریل شده سطحی تحت شرایط استریل به قطعات کوچک بریده شدند و روی صفحات محیط دکستروز آگار سیب‌زمینی (PDA)، محیط کشت Czapek's-Dox و محیط کشت عصاره مالت آگار [33-36] قرار گرفتند و پلیت‌ها در دمای 30 درجه انکوبه شدند. 10 روز. اثربخشی استریل کردن سطحی قطعات گیاه با سانتریفیوژ کردن آب شستشو ارزیابی شد، سپس 500 لیتر آب استریل به رسوب اضافه شد و در محیط PDA قرار داده شد [37]. جدایه های قارچ اندوفیت خالص شده به مدت 7 روز روی شیارهای PDA تلقیح و در دمای 4 درجه نگهداری شدند.

غربالگری، استخراج و تعیین کمیت تاکسول از قارچ های اندوفیت

قارچ های اندوفیت بازیابی شده ساکن جوجوبا از نظر تولید تاکسول با رشد بر روی آبگوشت دکستروز سیب زمینی (PDB) غربالگری شدند [38]. یک پلاگ از هر یک از ایزوله‌های fun gal 7 روزه به 1{8}}{39}} میلی‌لیتر PDB/250 میلی‌لیتر ارلن مایر تلقیح شد که به مدت 15 روز در دمای 1±30 درجه در شرایط تکان دادن (120) انکوبه شد. دور در دقیقه). پس از انکوباسیون، کشت ها فیلتر شدند و فیلتر با 0.2 درصد بی کربنات سدیم اصلاح شد تا اسیدهای چرب رسوب کند. تاکسول با دی کلرومتان استخراج شد و فاز آلی جمع آوری شد و تا خشک شدن تبخیر شد و باقی مانده ها دوباره در متانول حل شدند [17، 39]. تاکسول با استفاده از صفحات ژل سیلیکا 1 میلی متری (20×20 سانتی متر) مرک (TLC Silicagel 60 F254, Darmstadt, Germany) که توسط نور UV در 254 نانومتر شناسایی شد، جداسازی و شناسایی شد. نقاط احتمالی تاکسول از صفحات سیلیکاژل TLC خراشیده شد و در متانول حل شد، به مدت 10 دقیقه به شدت گرداب شد و به مدت 5 دقیقه در 1000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. ذرات سیلیس رسوب‌شده حذف شدند و مایع رویی برای تعیین کمیت تاکسول و بررسی خلوص توسط HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) ستون فاز معکوس C18 (Eclipse Plus C{27}}) گرفته شد. × 150 میلی‌متر، 3.5 میکرومتر، گربه شماره 959،963-902). فاز متحرک مورد استفاده متانول/استونیتریل/آب (25:35:40، V/V/V) با سرعت 1 میلی‌لیتر در دقیقه به مدت 20 دقیقه [40] بود، و کسرهای تاکسول در طول موج 227 نانومتر اندازه‌گیری شدند. هویت شیمیایی و غلظت از زمان ماند و منطقه پیک جذب در مقایسه با نمونه معتبر تایید شد.

شناسایی مورفولوژیکی و مولکولی قارچ های اندوفیت بازیابی شده

جدایه‌های قارچی اندوفیت بر اساس ویژگی‌های ماکرو و میکرومورفولوژیکی آن‌ها با رشد بر روی محیط‌های PDA، Czapek's-Dox و عصاره مالت با توجه به کلیدهای مرجع شناسایی شدند [33-36]. هویت قوی‌ترین جدایه‌های قارچی تولیدکننده تاکسول از نظر مولکولی بر اساس توالی فاصله‌گذار رونویسی داخلی (ITS) تأیید شد [41، 42]. DNA ژنومی قارچ (gDNA) با پودر کردن میسلیوم (~{7}}.2 گرم) در نیتروژن مایع استخراج شد، سپس در 1 میلی لیتر بافر استخراج CTAB (2 درصد CTAB، 2 درصد PVP4{13}}، 0، {21}}.2 درصد 2-مرکاپتواتانول، 20 میلی‌مولار EDTA، 1.4 مولار NaCl در 100 میلی‌مولار Tris-HCl، pH 8.0). مجموعه پرایمرهای PCR ITS4 5'-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3' و ITS{{25}'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' بودند. واکنش PCR شامل 10 میکرولیتر از مخلوط اصلی 2×PCR (i-Taq™، Cat. No. 25027)، 2 ul از gDNA، 1 ul از هر پرایمر (10 pmol/ul)، و تا 20 اول با تقطیر استریل تکمیل شد. اب. PCR به دناتوراسیون اولیه در 94 درجه برای 2 دقیقه، دناتوراسیون در 94 درجه برای 30 ثانیه، بازپخت در 55 درجه برای 10 ثانیه، اکستنشن در 72 درجه برای 30 ثانیه برای 35 سیکل، و اکستنشن انتهایی در 72 درجه برای 2 برنامه تنظیم شد. دقیقه آمپلیکون‌های PCR توسط ژل آگارز 1.5 درصد در بافر 1×TBE (Ambion Cat# AM9864)، با استفاده از نردبان DNA 1 کیلوبایتی (Cat. # PG010-55DI) آنالیز و توسط سیستم مستندسازی ژل مشاهده شد. آمپلیکون ها توسط Applied Biosystems Sequencer، HiSQV Bases، نسخه 6.0 با همان مجموعه های پرایمر خالص و توالی یابی شدند. توالی‌های به‌دست‌آمده BLAST بدون نیاز به جستجو در پایگاه داده NCBI، وارد نرم‌افزار MEGA 6.0 و با الگوریتم عضله Clustal W [43] تراز شدند و درخت فیلوژنتیک با روش همسایگی MEGA 6.0 [44] ساخته شد.

ساختار شیمیایی تاکسول استخراج شده

لکه های احتمالی تاکسول از صفحات سیلیکاژل TLC خراشیده و خالص شدند و خلوص و غلظت با آنالیز UV-Vis در λ 227 نانومتر (RIGOL، سری Ultra{2}}) در مقایسه با تاکسول معتبر تعیین شد. [39]. محیط خالی تحت شرایط یکسان به عنوان خط پایه منفی برای آنالیزهای اسپکتروفتومتری استفاده شد. طیف FT-IR نمونه های تاکسول خالص شده توسط اسپکتروفتومتر JASCO FT-IR 3600 آنالیز شد. نمونه تاکسول با گلوله‌های KBr آسیاب شد، در دیسک‌ها تحت خلاء فشرده شد و جذب در ناحیه 400 تا 4000 سانتی‌متر مربع [3] در مقایسه با نمونه اصلی اندازه‌گیری شد. ساختار شیمیایی تاکسول استخراج‌شده از طیف‌سنجی HNMR (JEOL، ECA{11}}II، 500 مگاهرتز NMR) در مقایسه با تاکسول معتبر تأیید شد. نمونه‌ها در CDCl3 حل شدند، شیفت‌های شیمیایی بر حسب ppm (مقیاس δ) و ثابت‌های جفت با هرتز (Hz) بیان می‌شوند.

تأثیر انواع مختلف رسانه بر تولید تاکسول

دو پلاگ آگار (9 میلی‌متر) از کشت‌های 7 روزه از هر ایزوله قارچی در سه نسخه در محیط 100 میلی‌لیتر/250 میلی‌لیتر ارلن مایر دکستروز سیب‌زمینی (PDB)، Czapek's-Dox (CZD)، M1D و عصاره مالت (ME) تلقیح شدند. ) رسانه آبگوشت. شاهد تلقیح نشده از هر محیط بدون اسپور قارچ به عنوان کنترل منفی استفاده شد و در دمای 30 درجه به مدت 15 روز تحت شرایط یکسان انکوبه شد. پس از انکوباسیون، کشت های قارچی فیلتر شدند و تاکسول استخراج شد و همانطور که در بالا ذکر شد تعیین شد.

بهینه سازی فرآیندهای زیستی از شرایط تغذیه ای برای به حداکثر رساندن بازده تاکسول

بهینه‌سازی ترکیب محیط برای به حداکثر رساندن بازده تاکسول توسط ایزوله قارچ قوی با روش سطح پاسخ با استفاده از طرح Placket-Burman و سپس طراحی مرکب مرکزی [17-20، 45] انجام شد. از طرح‌های RSM، متغیرهای مثبت و معنی‌دار مؤثر بر تولید تاکسول توسط جدایه قارچی قوی با استفاده از بسته نرم‌افزاری آماری توسط Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc.، مینیاپولیس، ایالات متحده آمریکا) ارزیابی شد. هر آزمایش در سه تکرار بیولوژیکی اجرا شد و مقادیر میانگین در نظر گرفته شد. پس از انکوباسیون در شرایط مورد نظر، زیست توده قارچی فیلتر شد و تاکسول استخراج شد و با استفاده از TLC و HPLC همانطور که در بالا توضیح داده شد، اندازه‌گیری شد.

طرح پلاکت-برمن

طرح پلکت-برمن اغلب برای بهینه‌سازی مولفه رسانه برای رشد قارچ و تولید متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی، ارزیابی متغیرهای مهم مؤثر بر تولید تاکسول استفاده شده است [18، 20، 46]. انتخاب عامل بر اساس رسانه های مورد استفاده در غربالگری کیفی و کمی بود. یازده عامل گنجانده شده است. عصاره مالت، پپتون، ساکارز، سویتون، گلوتامین، عصاره گوشت گاو و مقادیر و فاکتورهای دما، pH، زمان جوجه کشی و سرعت تکان دادن در دو سطح متفاوت بودند و محدوده سطوح حداقل و حداکثر انتخاب شدند. آماری Design-Expert 7.0 برای تولید مجموعه ای از 12 آزمایش استفاده شد. برای هر آزمایش، تولید تاکسول در سه تکرار بیولوژیکی تعیین شد و میانگین بازده تاکسول در نظر گرفته شد.

تجزیه و تحلیل رگرسیون داده ها با استفاده از نرم افزار آماری انجام شد. اثر هر متغیر با استفاده از معادله زیر محاسبه شد (Biometrika, 2020):

که در آن، E اثر یک متغیر آزمایشی است، M به علاوه، و M- غلظت تاکسول آزمایش‌ها در زمانی است که پارامتر به ترتیب در سطوح بالاتر و پایین‌تر بود، و N تعداد آزمایش‌هایی است که انجام شده است. تأثیر هر متغیر بر تولید با محاسبه مقادیر E مربوط به آنها تعیین شد.

در جایی که Tot high کل پاسخ‌ها در سطح بالا است، Tot low کل پاسخ‌ها در سطح پایین و No تعداد آزمایش‌ها است.

طراحی کامپوزیت مرکزی و تعامل بین عوامل مؤثر بر تولید تاکسول

مهم‌ترین عوامل مثبت مؤثر بر تولید تاکسول توسط جدایه قارچی انتخاب شده با استفاده از طرح آزمایشی مدل CCD نوع سطح پاسخ بهینه شدند [47]. با استفاده از CCD، غلظت اجزای محیط بهینه شد و از برهمکنش های مورد مطالعه آنها برای تولید مجموعا 20 آزمایش برای سه متغیر استفاده شد. برای تعیین سطوح بهینه متغیرها برای تولید تاکسول از جدایه قارچی قوی، منحنی‌های سطح پاسخ سه‌بعدی (3D) برای مطالعه برهم‌کنش بین عوامل مختلف و تعیین شرایط متغیر هر عامل مؤثر بر تولید تاکسول ترسیم شد. نمودارهای سه بعدی با نگه داشتن ثابت سه عامل در سطح ایده آل و رسم پاسخ به دست آمده از بازده تاکسول برای سطوح مختلف دو عامل دیگر انجام شد.

اثر تابش گاما بر بازده تاکسول

جدایه های اندوفیت قوی تولید کننده تاکسول در معرض تابش 6 0منبع کبالت (سلول گاما 4000-A-India) در دوزهای مختلف تابش گاما (0.25-3.0 کیلوگری) قرار گرفتند. برای کنترل فرهنگ بدون تابش؛ نرخ دوز 1.2 کیلوگری در ساعت در زمان آزمایش. محیط‌های بهینه‌شده در مقایسه با تلقیح اسپور بدون تابش به‌عنوان شاهد، با کشت پرتودهی شده تحت شرایط استاندارد کشت تلقیح شدند. کشت ها در دمای 2±30 درجه به مدت 15 روز روی شیکر چرخشی (120 دور در دقیقه) انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، کشت‌ها فیلتر شدند و تاکسول استخراج، خالص‌سازی و با TLC و HPLC اندازه‌گیری شد که در بالا توضیح داده شد.

سنتز و خصوصیات نانوذرات طلا (AuNPs)؛ صرف با تاکسول

فعالیت ضد سرطانی تاکسول

فعالیت ترکیبات Taxol خالص شده و Taxol-PVP-AuNPs در برابر کارسینوم کبد (HPG2) و سرطان پستان (MCF7) توسط 3- (4,{6}}dimethylthiazol- 2-yl) تعیین شد. سنجش -2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) [48]. صفحه چاهک با 103 سلول در هر چاهک کاشته شد و یک شبه در دمای 37 درجه انکوبه شد، سپس غلظت‌های مختلف دارو اضافه شد و پلیت‌ها مجدداً به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. معرف MTT (25 ul) اضافه شد و به مدت 2 ساعت انکوبه شد و رنگ بنفش کمپلکس فورمازان توسعه‌یافته در λ570 نانومتر اندازه‌گیری شد. مقدار IC50 با مقدار دارویی که رشد 50 درصدی تعداد اولیه سلول‌های تومور را به حالت عادی در کنترل مثبت کاهش می‌دهد بیان شد.

فعالیت ضد میکروبی تاکسول و ترکیبات Taxol-AuNPs

فعالیت ضد میکروبی تاکسول و کونژوگه‌های Taxol-AuNPs در برابر جدایه‌های مختلف باکتری مورد بررسی قرار گرفت. Bacillus subtilis ATCC 6633 و Staphylococcus epidermidis، Pseudomonas aeruginosa، Escherichia coli و Enterobacter agglomerans، علاوه بر کاندیدا آلبیکنس. سلول های باکتریایی آزمایش شده در آب پپتون استریل تعلیق شدند تا تلقیح استاندارد ~0.5 McFarland (1-1.5)× 1{{10}}8 CFU/ml در λ6{18 بدست آید. }}0 نانومتر. مهار رشد (mm) رشد پاتوژن های میکروبی با روش انتشار دیسک آگار ارزیابی شد. دیسک های آنتی بیوتیک استاندارد استریل با قطر 6.0 میلی متر به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. دیسک های آنتی بیوتیکی استریل (6.0 میلی متر) با 20 میکرولیتر متانول و آموکسی سیلین-کلاوولانیک اسید (AMC) به عنوان کنترل منفی و مثبت بارگذاری شدند. دیسک ها با همان غلظت تاکسول، Taxol-PVP-AuNPs، و AuNPs (1.0 ug/ml) بارگذاری شدند. سه تکرار بیولوژیکی تهیه شد. پلیت ها در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و مناطق بازدارندگی اندازه گیری شد. آموکسی سیلین کلاوولانیک اسید (AMC) و نیستاتین برای عادی سازی فعالیت ضد میکروبی تاکسول استفاده شد. ناحیه مهار رشد با کولیس ورنیه (mm) تعیین شد.

تحلیل های آماری

شناسایی مورفولوژیکی و مولکولی تولیدکنندگان قوی تاکسول

ویژگی های مورفولوژیکی جدایه قارچی قوی تولید کننده تاکسول با توجه به کلیدهای توصیفی ماکروسکوپی و میکروسکوپی، همانطور که در مواد و روش ها توضیح داده شده است، مورد بررسی قرار گرفت و نزدیکی مورفولوژیکی آن با A. favus را نشان داد (شکل 2). جدایه قارچ به مدت 10 روز روی PDA در دمای 30 درجه رشد کرد و ویژگی‌های ماکروسکوپی و میکروسکوپی هویت آن را مانند سر کنیدی‌ها، نحوه انشعاب، هویت کلاله و هستی‌شناسی کندی‌ها و تشکیل اجسام بارده نشان داد. کلیدهای مورفولوژیکی [33]، و مشخص شد که با آسپرژیلوس فاووس یکسان هستند. ایزوله A. favus قوی تولید کننده تاکسول بر اساس توالی ITS آنها با استفاده از gDNA به عنوان یک الگو شناسایی شد. آمپلیکن های PCR (~550 جفت باز) A. favus جدا، خالص و توالی یابی شدند (شکل 2). توالی ITS A. favus به صورت انفجاری غیر زائد در پایگاه داده NCBI جستجو شد و 99 درصد شباهت با A. favus، با مقادیر E. صفر، و پوشش پرس و جو 95 درصد را نشان داد. بنابراین، از تجزیه و تحلیل های میکروسکوپی و مولکولی، ایزوله هدف به عنوان A.favus تایید شد و در GenBank با شماره دسترسی MW485934.1 سپرده شد، همچنین ایزوله در مرکز قارچ شناسی دانشگاه Assiut (AUMC)، مصر با شماره رسوب AUMC13892. جدایه فعلی 99 درصد شباهت با ایزوله های A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

شکل 1 نمای مورفولوژیکی گیاه جوجوبا. B کشت های بشقابی قارچ های اندوفیت قوی مولد تاکسول. A. favus Bd1 (13)، A. niger Lv1 (21)، Penicillium polonium (23) و A. oryzae Bd (25) روی PDA پس از 8 روز انکوباسیون در دمای 30 درجه. جدایه های قارچی روی PDB رشد داده و در شرایط استاندارد انکوبه شدند و تاکسول استخراج و با TLC (C) بررسی شد. کروماتوگرام D HPLC تاکسول از جدایه های قارچی قوی. E بازده تاکسول همانطور که از HPLC تعیین شد. F، تجزیه و تحلیل طیفی UV-Vis تاکسول استخراج شده از جدایه های قارچی. تجزیه و تحلیل G FT-IR تاکسول استخراج شده در مقایسه با تاکسول معتبر

شکل 2 ویژگی های ماکرومورفولوژیک A. favus یک اندوفیت جوجوبا پس از 3، 5 و 8 روز رشد در PDA. ویژگی های میکرومورفولوژیکی، سر مخروطی A. favus با بزرگنمایی 400X. آمپلیکون C PCR از ناحیه A. favus ITS 500 جفت باز، نرمال شدن به نردبان 1 کیلوبایتی (Cat.#. SM0312). D تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک ITS A. favus با روش حداکثر درستنمایی [44]

بیشتر بخواهید:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950