مشخص کردن خطر رد کلیه قبل از پیوند و پس از پیوند با تعیین توالی رپرتوار ایمنی سلول B

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

مطالعه مجموعه ایمنی در زمینه پیوند عضو، اطلاعات مهمی در مورد اینکه چگونه ایمنی تطبیقی ​​ممکن است به رد پیوند کمک کرده و تعدیل کند، ارائه می دهد. در اینجا ما مجموعه ایمنی خون محیطی افراد را قبل و بعد از آن مشخص می کنیمکلیهپیوند با استفاده از توالی گیرنده سلول B در یک مطالعه بالینی طولی افرادی که پس از پیوند دچار رد می شوند، قبل از پیوند دارای مجموعه ایمنی متنوع تری هستند، که نشان دهنده مستعد خطر رد پس از پیوند است. علاوه بر این، در طی 2 سال پیگیری، بیمارانی که دچار رد می شوند، مجموعه خاصی از کلون های گسترش یافته را نشان می دهند که پس از رد شدن باقی می مانند. در حالی که کاهش کلی تنوع سلول های B محیطی وجود دارد که احتمالاً به دلیل افزایش مواجهه با سرکوب سیستم ایمنی عمومی در این گروه است، تشخیص استفاده از ژن IGHV خاص در همه بیماران ردکننده نشان می دهد که یک مجموعه مشترک از آنتی ژن های ایمنی زا ممکن است باعث رد پس از پیوند شود. یافته‌های ما ممکن است پیامدهای بالینی برای پیش‌بینی و مدیریت بالینی رد پیوند کلیه داشته باشد.

کلیهپیوند درمان ارجح در مرحله نهایی بیماری کلیوی (ESRD) و مزمن استکلیهمرض. اگرچه پیشرفت‌های قابل‌توجهی در فناوری‌ها و تطبیق بافت بر اساس آزمایش سازگاری بافتی برای آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی اهداکننده/گیرنده (HLA)l صورت گرفته است، پیش‌بینی نتیجه پیوند هنوز یک مشکل حل‌نشده است. عدم تطابق بافت اندازه‌گیری شده در سایر جایگاه‌های 23 غیر HLA جزئی نیز می‌تواند منجر به آسیب آلوی ایمنی با رد حاد و مزمن شود که منجر به پیامدهای طولانی مدت پیوند ضعیف می‌شود. علاوه بر این، حدود 50 درصد ازکلیهآلوگرافت ها، بدون عدم تطابق عمده HLA، هنوز در عرض 10 سال پس از پیوند از بین می روند. ما قبلاً فرض کرده‌ایم که جایگاه‌های غیر HLA ممکن است بر پاسخ ایمنی گیرنده در برابر او تأثیر بگذارند.کلیهdonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 آنتی بادی مختلف 0، که آنها را قادر می سازد تا مجموعه وسیعی از آنتی ژن های خارجی را تشخیص دهند. BCRهای انسانی یا Ig از دو زنجیره سنگین (I) یکسان تشکیل شده است که توسط پنج ایزوتیپ تشکیل شده است: IgM، IgD، IgA، IgE، و IgG، و دو زنجیره سبک. آنتی بادی دست نخورده حاوی یک متغیر و یک دامنه ثابت است. اتصال آنتی ژن در حوزه متغیر رخ می دهد که با ترکیب مجدد مجموعه ای از بخش های ژنی متغیر (V)، تنوع (D) و پیوستن (J) ایجاد می شود که مجموعه ایمنی سلول B را تشکیل می دهد و تنوع آن عمدتاً در منطقه تعیین کننده مکمل 3 (CDR3). در طول فرآیند بلوغ میل ترکیبی، هیپرجهش سوماتیک (SHM) در ناحیه متغیر رخ می دهد. یک پاسخ ایمنی تطبیقی ​​قوی به گسترش کلون‌های سلول B و فرآیندی به نام بلوغ میل وابسته است، که طی آن جهش‌های سوماتیک به بازآرایی‌های ژن Ig وارد می‌شوند و سلول‌های B با میل ترکیبی بالاتر برای یک آنتی ژن مشخص انتخاب می‌شوند.

مطالعه رپرتوار ایمنی در پیوند اعضا برای درک اینکه چه چیزی باعث تحریک و تداوم فرآیند رد پیوند می شود و چگونه ممکن است در نهایت مسیر شکست پیوند را تسریع کند، بسیار مهم است. با پیشرفت‌های نسل بعدی توالی‌یابی و رویکردهای محاسباتی قوی، می‌توانیم منطقه VDJ را با جزئیات دقیق مطالعه کنیم. تا به امروز، تجزیه و تحلیل رپرتوار ایمنی سلول T درکلیهپیوند در تعداد بسیار محدودی از بیماران3-15 انجام شده است، و حتی اگر BCRSeq برای سایر بیماری‌ها و پاسخ‌های ایمنی انسان، مانند مولتیپل اسدلروزیس۶، واکسن آنفلوآنزا ۷ یا اختلالات نقص ایمنی ۸ به کار رفته است، مطالعات کافی در پیوند وجود ندارد. طرد شدن. در یککلیهپیوند، BCRSeq تنها در زمینه تحمل، حساس به HLA انجام شده استکلیهکاندیدهای پیوند تحت درمان حساسیت زدایی20 و انفیلتراسیون سلولهای B با مقایسه گسترش کلونال در خون و پیوند2l. کاربرد دیگری در مورد BCRSeq در پیوند قبلاً در گروه کوچکی از 12 گیرنده پیوند قلب منتشر شده بود.

با درک اهمیت بازوی هومورال پاسخ ایمنی در رد دیررس پیوند و شکست مزمن آلوگرافت، ما مجموعه ایمنی خون محیطی را با استفاده از BCRSeq در یک مطالعه آینده‌نگر و طولی مشخص می‌کنیم. ما متوجه شدیم که تنوع رپرتوار ایمنی قبل از پیوند در افرادی که پیوند را رد می کنند بیشتر استکلیههمچنین گسترش کلون ها و ژن های IGHV خاص در طول 24 ماه پیگیری را نشان می دهد. این نتایج ممکن است به پیش‌بینی خطر رد قبل از پیوند کمک کند و ممکن است پیامدهای بالینی در تشخیص آنتی‌ژن‌های خاصی داشته باشد که باعث رد می‌شوند.

سیستانچ برای عملکرد کلیه مفید است

نتایج

موضوعات را مطالعه کنید. ما BCRSeq را در 83 نمونه خون محیطی از 27 بیمار منحصر به فرد انجام دادیم و خط لوله تحلیلی نشان داده شده در شکل 1 را اجرا کردیم. در این مطالعه سه گروه فنوتیپ بالینی تعریف شده توسط پاتولوژی مرکزی کور از بیوپسی‌های آلوگرافت زنجیره‌ای که بر اساس معیارهای Banff 23،24 نمره‌گذاری شده‌اند و شاخص آسیب مزمن آلوگرافت (CADI) در این مطالعه در نظر گرفته شدند: غیرپیشرونده‌ها (NP; n=10) نمره CADI غیرافزاینده پایین بدون رد حاد داشتند، پیشرفت‌کنندگان بدون رد (PNR;n=10) ​​نمره CADI افزایشی در طی 2 سال بدون رد داشتند، و پیشرفت‌کنندگان با رد (PR; n=7) نمرات CADI بالا افزایشی در طی 2 سال با قسمت های رد. جمعیت شناسی، عللکلیهشکست، و استفاده از سرکوب سیستم ایمنی در جدول 1 ارائه شده است. برجسته کردن برخی از ویژگی های این بیماران مهم است. مطالعه والدینی که این بیماران در آن ثبت‌نام شده‌اند، به طور کلی دارای نرخ پایین (17 درصد) رد حاد تایید شده با بیوپسی (میانگین{حداکثر{3}} {6،24} ماه زمان رد) بود. همه این بیماران در معرض خطر کم ایمونولوژیک برای رد بودند (وضعیت حساسیت آنتی‌بادی واکنشی اوج پانل<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

توالی یابی رپرتوار ایمنی سلول B. BCRSeq روی نمونه‌های DNA ژنومی (gDNA) استخراج‌شده از لخته‌های خون روی 81 نمونه از 27 نمونه انجام شد.کلیهگیرندگان پیوند در سه نقطه (0،6،24 ماه). توالی یابی مجموعاً 327703 خوانده شده (میانگین 4045/نمونه) پس از کنترل کیفیت (به بخش روش ها مراجعه کنید) به دست آورد. برای اعتبارسنجی نتایج و ارزیابی بیشتر هر ایزوتیپ، علاوه بر این، RNA را از PBMC همسان که برای 55 نمونه در دسترس بود استخراج کردیم، همزمان با لخته خون جمع‌آوری شد و توالی‌یابی DNA (cDNA) تکمیلی را در عمق بیشتر انجام دادیم و 1773330 خواندن به دست آوردیم. برای IgD (میانگین 31,667/نمونه)، 1,708,227 خوانده شده برای IgM (میانگین 30,504/نمونه)، 973,444 خواندن برای IgA (میانگین 17,383/نمونه)، 139,7345 خوانده شده برای IgG (میانگین 53,9,24) }} برای IgE (میانگین 5178/نمونه) خوانده می شود (شکل تکمیلی 1). کتابخانه ها برای هر ایزوتیپ به طور جداگانه تکثیر شدند و سپس برای توالی یابی گردآوری شدند. بنابراین، تجزیه و تحلیل ایزوتیپ متقابل مقایسه ای امکان پذیر نیست.

همانطور که در شکل 1b نشان داده شده است، ما یک کلون را به عنوان گروهی از سلول‌ها تعریف کردیم که از یک مولکول جد مشترک که دارای همان بخش IGHV و IGHJ، طول CDR3 یکسان و 90 درصد هویت نوکلئوتیدی بین CDR3 است، همانطور که قبلاً در مطالعات B تطبیقی ​​تعریف شده بود، تعریف کردیم. پاسخ های سلولی'8. این تعریف اجازه می دهد تا تنوع، مخروط های مشترک یا مشترک، و گسترش کلونال را در زمینه آلی ایمنی درکلیهپیوندها تعداد مخروط های منحصر به فرد برای هر فرد در هر نقطه زمانی به صورت بار پلات در مواد تکمیلی نشان داده شده است (شکل تکمیلی 1). برای دقت در تجزیه و تحلیل داده ها، نمونه ها را با تخفیف در نظر گرفتیم<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">کلیهپیوند، که با تکثیر اپشتین بار مشخص می شود

شکل 1 خط لوله مطالعه کلی. یک نمایش شماتیک از ساختار آنتی بادی و فرآیند ترکیب مجدد VDJ مسئول تنوع تولید شده در مجموعه ایمنی. تعیین توالی برای gDNA و cDNA، تجزیه و تحلیل تنوع با در نظر گرفتن تعداد کلون ها (غنا) و فراوانی هر کلون (آنتروپی شانون)، تجزیه و تحلیل شبکه، و تجزیه و تحلیل کلونال و ژن IGHV

سلول های B آلوده به ویروس (EBV). ما شاهد افزایش تعداد کلون ها در زمان 6 در این بیمار بودیم که قبلاً تنوع کلون کمتری داشتکلیهپیوند و در 24 ماه پس از پیوند کلیه. از آنجایی که کتابخانه ها از مقدار ثابتی از الگو تکثیر شده اند، بخش بالاتری از سلول های B در خون ممکن است منجر به تعداد بیشتری از کلونوتیپ های نمایش داده شده در محصولات توالی شده باشد. به دلیل فرآیند پاتولوژیک متمایز و منحصربفرد در این بیمار، این نمونه از تجزیه و تحلیل آتی حذف شد.

تنوع سلول های B قبل از پیوند با رد شدن همراه است. همانطور که در شکل 1c نشان داده شده است، ما تنوع رپرتوار ایمنی سلول B را با در نظر گرفتن غنای گونه (تعداد کلون های منحصر به فرد) و آنتروپی شانون (معادله (1) از روش ها) در نقاط زمانی و نتایج بالینی با استفاده از یک مدل رگرسیون خطی با در نظر گرفتن تعداد مورد بررسی قرار دادیم. کلون یا آنتروپی به عنوان متغیر وابسته و پیامد بالینی یا SHM به عنوان متغیر عامل مستقل. رپرتوار قبلکلیهپیوند در روابط عمومی به طور قابل توجهی متنوع تر از NP بود (غنای: P-value=0.005، آنتروپی: P-value=0.01) با روند مشابه در 6 ماه پس از آن ادامه داشت.کلیهپیوند (غنا: P-value=0.02، آنتروپی: P-value=0.02)، و بدون تفاوت گروهی قابل تشخیص در 2 سال پس از پیوند (شکل 2a) و شکل تکمیلی 2). داده‌های توالی‌یابی cDNA پس از پیوند، روند مشابهی را در تنوع رپرتوار بیشتر در 6 ماه پس از پیوند، عمدتاً برای ایزوتیپ‌های IgD نشان داد (غنا: P-value=0.02، آنتروپی: P-value=0). 03) (شکل 2b و شکل تکمیلی 2). هیچ اثر مخدوش‌کننده‌ای بر داده‌های متغیرهای جمعیت‌شناختی و بالینی مختلف، مانند سن گیرنده، جنسیت، نژاد، منبع اهداکننده، نوع سرکوب سیستم ایمنی، عدم تطابق HLA و علت نارسایی کلیوی وجود نداشت. از آنجایی که پاسخ سلول B یک 1-سال (حداقل سن در داده‌ها) و 19-سال (حداکثر سن در داده‌ها) ممکن است بسیار متفاوت باشد، ما یک حساسیت انجام دادیم. تجزیه و تحلیل به استثنای این دو بیمار و نتایج قابل توجه باقی ماندند (NP در مقابل PR در زمان 0: غنا: P-value=0.01، آنتروپی: P-value=0.03). در اندازه گیری دیگری از تنوع مجموعه ایمنی، ما SHM را که به عنوان فراوانی جهش در هر بخش ژن V تعریف می شود، ارزیابی کردیم و روندی برای تعداد بالاتر SHM برای PR قبل از پیوند و روندی برای SHM بالاتر در ایزوتیپ IgD یافتیم. در روابط عمومی در 6 ماه پس از پیوند (P-value=0.06).

تنوع سلول های B در طول زمان بر اساس نتایج بالینی تغییر می کند. برای یافتن اینکه آیا تنوع مجموعه ایمنی در طول زمان توسط نتیجه بالینی تغییر می‌کند، ما داده‌های طولی را با استفاده از مدل‌های خطی اثر مختلط با در نظر گرفتن تعامل بین نتیجه بالینی و زمان مدل‌سازی کردیم. ما دریافتیم که NP و PR در طول زمان پس از پیوند رفتار متفاوتی داشتند که نشان دهنده افزایش تنوع در NP و کاهش تنوع در PR بود، در حالی که برای PNR تنوع در طول زمان ثابت ماند. این برای gDNA (غنای: P-value=0.007، آنتروپی: P-value=0.001، شکل 3a) و همه ایزوتیپ ها برای cDNA مشاهده شد، با مهمترین تفاوت ها در آنتروپی برای ایزوتیپ‌های IgM و IgD (IgA: P-value=0.07, IgD: P-value=0.02, IgG: P-value=0.05, IgM: P-value=0.04، شکل 3b). نمودارهای غنا با مقادیر P متناظر در شکل تکمیلی 3 نشان داده شده است. همانطور که در نمودارها مشاهده شد، یک فرد یک نمونه اضافی در زمان 32 ماه دارد که ممکن است نتایج را منحرف کند، بنابراین یک تجزیه و تحلیل حساسیت انجام شد که این نمونه را حذف کرد. تجزیه و تحلیل و مشاهده نتایج مشابه به جز ایزوتیپ های IgG و IgM که در آن اهمیت از بین می رود (gDNA-انتروپی: P-value=0.004. cDNA-آنتروپی: IgA: P-value=0.1 , IgD: P-value=0.05, IgG: P-value=0.08, IgM: P-value=0.1).

اقدامات تنوع ممکن است تحت تأثیر نمونه برداری بیولوژیکی و فنی قرار گیرد. تنوع یک نمونه می تواند به طور قابل توجهی با تنوع کلی در یک مجموعه متفاوت باشد زیرا تنها کسری از میلیاردها سلول نشان داده شده است که به عنوان مشکل گونه های گم شده شناخته می شود. نمونه برداری فنی ممکن است وجود داشته باشد زیرا هر نمونه ممکن است در عمق توالی و درجاتی از خطاهای آزمایشی متفاوت باشد. برای مقابله با مشکل گونه های گمشده، از ابزار Recon (بازسازی کلون های تخمین زده شده از اعداد مشاهده شده) استفاده کردیم که توزیع کلی اندازه کلون را تخمین می زند. Recon برآوردهای دقیق و قوی از مجموعه ای از معیارهای تنوع، از جمله غنا و آنتروپی را ارائه می دهد که امکان مقایسه قوی تنوع بین افراد را فراهم می کند. برای مقابله با عمق توالی و درجاتی از خطاهای تجربی، ما یک استراتژی نمونه برداری کوچک را انجام دادیم. یک استراتژی بسیار خوب استفاده شده در تجزیه و تحلیل رپرتوار ایمنی11،17،30. در تجزیه و تحلیل Recon (شکل تکمیلی S4: A-E)، هم غنا و هم تنوع برای داده‌های gDNA تکرار شد. در داده‌های cDNA، ایزوتیپ IgD زمان 6 روند را نشان می‌دهد، اما به معنی‌داری نرسید، اگرچه نتایج طولی برای ایزوتیپ‌های IgA، IgD و IgG تکرار شد. در تجزیه و تحلیل پایین نمونه (شکل تکمیلی S4: F-J)، همه چیز تکرار می شود اما زمان برای داده های gDNA 0 است. این ممکن است نتیجه محدودیت‌هایی باشد که نمونه‌گیری پایین آورده است

شکل 2 نمودارهای ویولن که تعداد کلون ها (غنا) را در سه پیامد بالینی نشان می دهد. تعدادی کلون در زمان‌های 0، 6 و 24 از نمونه‌های gDNA. b تعداد کلون ها در زمان 6 برای ایزوتیپ IgD از نمونه های cDNA. مقادیر P از تنظیم یک مدل رگرسیون خطی با در نظر گرفتن تعداد کلون ها به عنوان متغیر وابسته و پیامد بالینی به عنوان متغیر عامل مستقل (n=27 نمونه) به دست می آیند. نمودارهای ویولن نشان دهنده چگالی احتمال داده ها در هر مقدار است. نشانگر نقطه نشان دهنده مقدار میانه با محدوده بین چارکی است. داده منبع به عنوان فایل داده منبع ارائه می شود

شکل 3 داده های طولی با خط مناسب برای هر پیامد بالینی ترسیم شده است. یک تنوع اندازه گیری شده توسط آنتروپی شانون که در نقاط زمانی با سه پیامد بالینی (NP، PNR، PR) در gDNA نشان داده شده است. b تنوع اندازه گیری شده توسط آنتروپی شانون در نقاط زمانی با سه پیامد بالینی (NP، PNR، PR) توسط ایزوتیپ ها در cDNA نشان داده شده است. مقادیر P مربوط به اصطلاح تعامل تعریف شده توسط زمان × نتیجه بالینی تنظیم یک مدل اثر مختلط خطی (n=27 نمونه) است. هر نقطه نشان دهنده آنتروپی هر نمونه در طول زمان با خط برازش و فاصله اطمینان آن است. داده منبع به عنوان فایل داده منبع ارائه می شود

استراتژی های ضمنی، به ویژه در داده های gDNA که در آن تعداد توالی ها بسیار کمتر از داده های cDNA است. در gDNA، ما تجزیه و تحلیل را به افرادی با حداقل 1000 کلون محدود کردیم تا توالی‌های کافی را حفظ کنیم. نمونه برداری پایین به حداقل 1062 کلون در مقایسه با 62173 کلون در cDNA انجام شد. علیرغم این محدودیت، ما روند را برای زمان 0 مشاهده کردیم، اهمیت آنالیز طولی را در gDNA حفظ کردیم، و همه ارتباطات را در cDNA تکرار کردیم. در هر دو تحلیل (نمونه‌سازی مجدد و نمونه‌برداری کوچک)، نتایج را علی‌رغم برخی محدودیت‌هایی که در اینجا برجسته شده است، تکرار کردیم و اعتبار نتایج گزارش‌شده قبلی را نشان می‌دهد.

شبکه های سلول B تفاوت هایی را در گسترش کلونال نشان می دهند. مجموعه سلول های B را می توان به طور طبیعی به عنوان یک شبکه بر اساس تنوع توالی نشان داد. در داده‌هایمان، یک شبکه بصری برای هر نمونه ایجاد کردیم (شکل 4 و شکل‌های تکمیلی 5-7) که در آن هر رأس یک BCR منحصر به فرد را نشان می‌دهد، و تعداد BCR‌های یکسان بر اساس توالی‌های نوکلئوتیدی آنها، اندازه راس را مشخص می‌کند. هنگامی که رئوس به یک کلون تعلق دارند، یک یال بین رئوس وجود دارد، بنابراین خوشه‌هایی از سلول‌های B را می‌توان به صورت گروه‌هایی از رئوس به هم پیوسته نشان داد که یک کلون را تشکیل می‌دهند. برای تعیین کمیت شبکه، از شاخص جینی استفاده کردیم، که یک اندازه گیری ناهمواری است که برای توزیع های راس و خوشه ای اعمال می شود. هنگامی که به اندازه راس، Gini (V) اعمال می شود، ماهیت کلونال نشان داده می شود. اگر Gini(V) به 1 نزدیک‌تر باشد، رئوس نابرابر هستند که بسط برخی از آنها را نشان می‌دهند و در غیر این صورت به 0 نزدیک‌تر هستند. هنگامی که به اندازه خوشه اعمال می شود، Gini (C)، غالبیت کلونال نشان داده می شود. اگر نزدیک به 1 باشد، خوشه ها نابرابر هستند و بنابراین کلون های غالب را نشان می دهند، اگر به 0 نزدیکتر باشند، همه خوشه ها اندازه یکسانی دارند.

در شکل 4 نمونه‌ای از تفاوت‌های بصری و کمی مشخص بین مجموعه‌های سلول B نماینده هر یک از سه گروه پیامد بالینی را در سه نقطه زمانی مختلف (قبل از پیوند و بعد از پیوند 6 و 24 ماه) نشان می‌دهیم. . در رپرتوار PR، توالی‌های سلول B فراوانی وجود دارد که خوشه‌های بیشتر و بزرگ‌تری از کلون‌ها را در مقایسه با NP تشکیل می‌دهند در حالی که PNR در بین آنها قرار دارد. در طول زمان، گروه PR کاهش تعداد BCR و کلون های منحصر به فرد را در مقایسه با NP نشان می دهد. مشروح شبکه های سلول B هر فرد در این مطالعه در شکل های تکمیلی ارائه شده است. 5-7. مشاهده الگوی بسیار متنوع شبکه سلول B در فردی که PTLD در گروه NP ایجاد کرده است (شکل تکمیلی 5)، بدون گسترش سلول B قبل از پیوند، و به دنبال آن افزایش سلول های B پس از 6 جالب است. ماه و یک گسترش کلونال واضح همراه با کاهش تنوع در 24 ماه پس از پیوند.

در ارزیابی بیشتر اندازه گیری شاخص جینی (شکل 5)، گروه PR به طور مداوم اندازه گیری های قابل توجهی بالاتری را برای هر دو راس و خوشه نسبت به گروه NP نشان داد، که نشان می دهد بیماران گروه PR در ابتدا گسترش کلونال بیشتری داشتند.

شکل 4 شبکه های رپرتوار سلول B از سه فرد که سه پیامد بالینی را در نقاط زمانی نشان می دهد. هر رأس یک BCR منحصر به فرد را نشان می دهد که اندازه راس با تعداد BCRهای یکسان با در نظر گرفتن توالی های نوکلئوتیدی تعریف می شود. یک یال بین رئوس زمانی وجود دارد که به همان کلونی که قبلاً تعریف شد تعلق داشته باشند، بنابراین خوشه ها گروه هایی از رئوس به هم پیوسته هستند که یک کلون را تشکیل می دهند. هر نمونه شاخص جینی به دست آمده برای اندازه راس (Gini (V)) و اندازه خوشه (Gini (C)) را نشان می دهد. BCR کل گیرنده های سلول B را برای آن نمونه خاص منعکس می کند و کلون ها تعداد کل کلون های منحصر به فرد را منعکس می کنند. منبع داده به عنوان فایل داده منبع ارائه می شود

و گسترش بیشتر پس از پیوند زیر مجموعه ای از کلون های غالب (P-value [رگرسیون خطی] < 0.05،="" شکل="" 5).="" گروه="" pnr="" همانطور="" که="" قبلا="" نشان="" داده="" شد="" بین="" np="" و="" pr="" قرار="" می="" گیرد،="" اگرچه="" این="" زمان="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" نسبت="" به="" گروه="" np="" در="" زمان="" 24="" متفاوت="" است="" (p-value="" [رگرسیون="" خطی]=""><0.05). اگرچه="" داده‌های="" شکل="" 5="" از="" داده‌های="" gdna="" تولید="" شد،="" ایزوتیپ="" igm="" برای="" cdna="" تفاوت‌های="" یکسانی="" را="" نشان="" داد="" (p-value="" [رگرسیون="" خطی]="0.05)" (شکل="" تکمیلی="">

کلون های خاص و ژن های IGHV در رد شدن نقش دارند.

اگرچه تمرکز اصلی ما مشخص کردن مجموعه سلول‌های B توسط گروه‌های پیامد بالینی، ارائه تصویری کلی از پاسخ ایمنی قبل و بعد از پیوند بود، داده‌های ما همچنین ما را قادر می‌سازد تا تجزیه و تحلیل اختصاصی توالی Ig را در کلون و IGHV انجام دهیم. سطح ژن

برای تجزیه و تحلیل کلونال، ما ارتباط وجود یا عدم وجود هر کلون خاص (118223 کلون) را با پیامد بالینی (PR، PNR، NR) در هر نقطه زمانی ارزیابی کردیم. با استفاده از آزمایش دقیق فیشر، 8، 4 و 21 کلون را پیدا کردیم که اسماً با پیامدهای بالینی در هر یک از 0، 6 و 24 ماه مرتبط بودند (جدول تکمیلی 1). در حالی که هیچ یک از اصلاحات آزمایشی چندگانه عبور نکرد، عمدتاً به دلیل کمبود نیرو، زیرا حجم نمونه محدودی در تجزیه و تحلیل با هزاران پارامتر (کلون) داریم، می‌توانیم مشاهده کنیم که تعداد کمی از کلون‌هایی که به اهمیت نزدیک می‌شوند (P-value < {{{="" 11}}.05)="" فقط="" در="" بین="" بیماران="" در="" گروه="" pr="" به="" اشتراک="" گذاشته="" شد="" و="" در="" 24="" ماه="" پس="" از="" پیوند="" غنی="">

ما همچنین در نظر گرفتیم که آیا برخی از کلون ها در طول زمان نمونه برداری، بیشتر از سایرین، در هر پیامد بالینی باقی می مانند (شکل تکمیلی 9). ما دو معیار مختلف را در نظر می گیریم: (1) تعداد کلون های ماندگار و (2) گسترش کلونال. ما مشاهده کردیم که کلون هایی که در PR پایدار بودند به طور قابل توجهی گسترش بیشتری داشتند (P-value [رگرسیون خطی]=0.01، PR در مقابل NP) و روند تعداد کلون های پایدار را نشان دادند (P- مقدار [رگرسیون خطی]=0.09). ما بیشتر بررسی کردیم که آیا این کلون های پایدار نیز در افراد مختلف در هر پیامد بالینی به اشتراک گذاشته شده است یا خیر. از 263 کلون پایدار شناسایی شده، 23 کلون بین افراد به اشتراک گذاشته شد. پنج نفر در همان PNR و شش نفر در گروه PR به اشتراک گذاشته شدند و هیچ کلونی بین گروه NP به اشتراک گذاشته نشد. در مجموع، 12 کلون مشترک در هر دو گروه از بیماران مبتلا به آسیب مزمن پیشرونده پیوند و فیبروز در طول زمان (PR و PNR) مشترک بود. فهرست کلون های به اشتراک گذاشته شده بین افراد در مواد تکمیلی ارائه شده است (جدول تکمیلی 2).

ما سپس آنالیز ژن IGHV را انجام دادیم، استفاده از ژن IGHV را در هر نمونه بررسی کردیم، که به عنوان تعداد دفعاتی که هر ژن IGHV استفاده شده است، با تعداد کلون ها نرمال شده (برای جلوگیری از سوگیری نمونه از ژن های IGHV خاص)، فیلتر کردن با بیان کم تعریف شد.

شکل 5 راس Gini Index در برابر شاخص Cluster Gini رسم شده است. نمودار پراکندگی هر نمونه را در زمان‌های 0، 6 و 24 نشان می‌دهد. نمودارهای جعبه‌ای تفاوت‌های Gini(V) و Gini(C) را در زمان 24 نشان می‌دهند. مقادیر P از تنظیم یک مدل رگرسیون خطی به دست می‌آیند. در نظر گرفتن Gini (V) و Gini (C) به عنوان یک متغیر وابسته و پیامد بالینی به عنوان یک متغیر عامل مستقل برای هر نقطه زمانی (n=27 نمونه). در نمودار جعبه فقط زمان 24 نشان داده شده است، اما زمان 0 و 6 نیز برای NP در مقابل PR: زمان 0: P (Gini (V))=0.1، P ( Gini(C))=0.05; زمان 6 P (Gini(V))=0.02, P (Gini(C))=0.01; زمان 24: P (Gini(V))=0.003، P (Gini(C))=0.01. نوار داخل جعبه مقدار میانه را نشان می دهد، جعبه محدوده بین چارکی (IQR) را مشخص می کند، و سبیل ها ربع اول و سوم را 1.5 ± IQR تعریف می کنند. داده منبع به عنوان فایل داده منبع ارائه می شود

ژن‌ها (استفاده از ژن IGHV > {{0}}.05 در حداقل 10 درصد نمونه‌ها)، و استفاده از یک مدل رگرسیون خطی برای یافتن ژن‌های مرتبط با هر پیامد بالینی، در هر نقطه زمانی. از 27 ژن IGHV که از فیلتر کم‌بیان عبور کردند، ژن‌های مهمی را بین گروه PR و NP یافتیم (P-value <0.05) با="" سه="" ژن="" در="" زمان="" 0،="" 7="" در="" زمان="" 6="" و="" 16="" در="" زمان="" 24="" (شکل="" 6a-c).="" از="" این="" ژن="" ها،="" 1="" (ighv3-11)="" در="" زمان="" 0،="" 5="" ژن="" (ighv3-7،="" ighv3-15،="" ighv3-21،="" ighv3-23،="" ighv{="" {22}})="" در="" زمان="" 6="" و="" 16="" ژن="" (ighv1-8،="" ighv1-18،="" ighv1-46،="" ighv2-="" 5،="" ighv3-7،="" ighv{{="" 30}}،="" ighv3-15،="" ighv3-23،="" ighv3-30،="" ​​ighv3-33،="" ighv3-48،="" ighv3-74،="" ighv{{37="" }}،="" ighv4-59،="" ighv4-61،="" ighv5-51)="" در="" زمان="" 24="" تصحیح="" آزمایش="" چندگانه="" نرخ="" کشف="" نادرست="" (fdr)="" را="" پشت="" سر="" گذاشت.="" جالب="" توجه="" است،="" ما="" دریافتیم="" که="" ighv{42}}="" مهم‌ترین="" و="" فراوان‌ترین="" ژن="" در="" هر="" سه="" نقطه="" زمانی="" در="" مقایسه="" np="" در="" مقابل="" pr="" بود="" (زمان="" 0:="" p-value="0.04،" زمان="" 6:="" p-="" مقدار="0.003،" زمان="" 24:="" p-value="0.02)" (شکل="" 6d).="" علاوه="" بر="" این،="" ما="" ارزیابی="" کردیم="" که="" آیا="" توالی‌های="" ighv{56}}="" در="" بین="" توالی‌های="" مشترک="" از="" تجزیه="" و="" تحلیل="" کلونال="" قبلی="" بیش="" از="" حد="" ارائه="" شده‌اند.="" ما="" با="" استفاده="" از="" تجزیه="" و="" تحلیل="" غنی‌سازی="" با="" آزمون="" دقیق="" فیشر="" دریافتیم="" که="" توالی‌های="" ighv{57}}="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" در="" هر="" دو،="" کلون‌های="" پایدار="" به="" اشتراک="" گذاشته="" شده="" در="" بین="" افراد="" (جدول="" تکمیلی="" 2)="" بیش="" از="" حد="" نشان="" داده="" شده‌اند="" (p-value="">< 2.2="" ×="" 10-16).="" و="" کلون="" های="" مرتبط="" با="" پیامد="" بالینی="" در="" زمان="" 24="" (جدول="" تکمیلی="" 1)="" (p-value="">< 2.2="" ×="" 10-16).="" ما="" مشاهده="" کردیم="" که="" فرد="" 9="" در="" گروه="" nr،="" که="" مشخص="" شده="" بود="" برخی="" از="" کلون‌های="" پایدار="" را="" با="" پیشرفت‌کنندگان="" در="" تحلیل‌های="" قبلی="" به="" اشتراک="" می‌گذارد،="" در="" همه="" زمان‌ها="" در="" گروه="" pr="" طبقه‌بندی="" می‌شوند.="" هیچ="" اثر="" مخدوش‌کننده‌ای="" بر="" داده‌های="" متغیرهای="" جمعیت‌شناختی="" و="" بالینی="" مختلف،="" مانند="" سن="" گیرنده،="" جنسیت،="" نژاد،="" منبع="" اهداکننده،="" نوع="" سرکوب="" سیستم="" ایمنی،="" عدم="" تطابق="" hla="" و="" علت="" نارسایی="" کلیوی="" وجود="" نداشت.="" علاوه="" بر="" این،="" این="" ژن="" همچنین="" در="" هر="" دو="" ایزوتیپ="" igm="" (p-value="" [رگرسیون="" خطی]="0.008)" و="" igd="" (p-value="" [رگرسیون="" خطی]="0.05)" معنی‌دار="" است.="" بر="" اساس="" cdna="" در="" 24="" ماه="" پس="" از="" پیوند،="" مطابق="" با="" نتایج="" قبلی="" نشان="" می="" دهد="" که="" سازگاری="" با="" این="" دو="" ایزوتیپ="" که="" در="" گروه="" pr="" غنی="" ترین="" هستند.="" تنها="" سه="" ژن="" دیگر="" در="" تجزیه="" و="" تحلیل="" cdna="" معنی‌دار="" یافت="" شدند="" و="" همه="" آنها="" در="" 24="" ماه="" پس="" از="" پیوند="" در="" ایزوتیپ‌های="" igd="" و="" igm="" بودند="" (ighv{83}}="" و="" ighv4-="" 61="" در="" igd="" و="" ighv4-39="" در="">

بحث

تنوع یک ویژگی اساسی سیستم ایمنی است و در انسان های سالم، برای مقابله با بیماری ها در برابر عوامل بیماری زا حیاتی است. در پیوند عضو، دستکاری درمانی عمدی از نظر بالینی انجام می شود تا به اندام خارجی اجازه داده شود که به طور فعال توسط سیستم ایمنی بیمار خود نادیده گرفته شود یا پذیرفته شود تا پاسخ آلی ایمنی ایجاد نشود و منجر به رد شود. سلول های B جزء مهمی از این فرآیند هستند و توسط گروه ما و سایرین نشان داده شده است که هم در ارائه آنتی ژن 32،33 و هم در تولید آلوآنتی بادی 34،35 نقش اساسی دارند. در این کار، ما از توالی یابی سلول های B با کارایی بالا برای درک بهتر تنوع و کلونیت سلول های B در سلول های B استفاده کرده ایم.کلیهگردش خون گیرنده پیوند، هم قبل از پیوند و هم پس از 24 ماه پیگیری، با یک ارزیابی طولی از مجموعه ایمنی سلول B. به طور کلی، تجزیه و تحلیل ما تنوع سلول های B بالاتر قبل از پیوند، تفاوت های طولی با کاهش تنوع همراه با گسترش کلونال، و افزایش استفاده از ژن IGHV خاص در میان افرادی که پیوندها را رد می کنند را نشان می دهد.

یک نیاز بالینی برآورده نشده کلیدی برای پیوند عضو، عدم پیش‌بینی غیرتهاجمی، حساس و دقیق آسیب پیوند و نتایج ضعیف است. این کار به دلیل این واقعیت پیچیده است که عوامل مختلفی وجود دارد که بر بقای پیوند تأثیر می گذارد. در این مطالعه، ما دریافتیم که افراد باثبات، در مقایسه با افرادی که اندام را رد کردند، دارای تنوع کمتری در مجموعه ایمنی سلول B قبل از پیوند بودند. گام بعدی باید نشان دادن ارزش پیش‌بینی تنوع مجموعه سلول‌های B، ارائه بیومارکرهای بالقوه بهتر برای پیش‌بینی رد قبل از پیوند، و امکان استفاده در مراقبت‌های بالینی و انتخاب‌های سرکوب سیستم ایمنی قبل و بعد از پیوند باشد.کلیهپیوند. اگر این ویژگی نتیجه هر عاملی باشد که در کاهش تنوع در افراد پایدار نقش داشته باشد، مانند عوامل محیطی یا ژنتیکی، نه تنها می‌توانیم رد را پیش‌بینی کنیم، بلکه از آن نیز جلوگیری کنیم. در واقع، یافته‌های بسیار اخیر نشان داد که تغییرات در سیستم ایمنی ناشی از عوامل محیطی-محیطی و ژنتیکی است37،38. در مطالعه ما، هیچ ارتباطی با هیچ‌یک از ویژگی‌های دموگرافیک و سایر ویژگی‌های بالینی بیمار (سن، جنسیت، نژاد، سرکوب سیستم ایمنی، منبع اندام، عدم تطابق HLA و ESRD) پیدا نکردیم. در این راستا، ما به یک تحلیل جدید نیاز داریم تا تأیید کنیم که آیا عوامل خاص بر تنوع مجموعه سلول B و نتایج پیوند تأثیر می‌گذارند یا خیر.

یکی دیگر از یافته های جالب در مطالعه ما نشان می دهد که مجموعه ایمنی در طول زمان بسته به گروه نتیجه بالینی متفاوت رفتار می کند. برای کسانی که پس از پیوند عضو را رد می کنند، تنوع سلول های B ابتدا بیشتر است و سپس با گذشت زمان کاهش می یابد، در حالی که روند تنوع معکوس در بیمارانی مشاهده می شود که رد یا آسیب مزمن پیوند ایجاد نمی شود. حتی اگر همه افراد پس از پیوند بار سرکوب کننده سیستم ایمنی یکسانی دریافت کردند، برخی از توضیحات احتمالی برای کاهش تنوع در بیمارانی که دچار رد می شوند ممکن است به این واقعیت مربوط باشد که این بیماران به طور موقت بار سرکوب کننده ایمنی را برای درمان پس زدن دریافت می کنند و سپس در پایه بالاتر نگه داشته می شوند. اگرچه این می تواند کاهش تنوع سلول های B را در طول زمان توضیح دهد و تفاوت را در 24 ماه پس از پیوند توضیح دهد، اما بعید است که این دلیل باشد، زیرا کاهش تنوع در گروه روابط عمومی

شکل 6 Heatmap و boxplot برای تجزیه و تحلیل استفاده از ژن IGHV. نقشه حرارتی که ژن‌های IGHV را به‌عنوان اسماً معنی‌دار (P-value < 0.{4}}5)="" در="" زمان="" 0="" (a)،="" 6="" (b)="" و="" 24="" (c)="" برای="" np="" نشان="" می‌دهد.="" در="" مقابل="" روابط="" عمومی="" مقیاس="" رنگ="" قرمز="" بیانگر="" هر="" ژن="" در="" بین="" نمونه="" ها="" است.="" نوارهای="" بالا،="" پیامد="" بالینی="" و="" علت="" esrd="" را="" نشان="" می="" دهند.="" نمودار="" جعبه="" ای="" بیانگر="" ighv3-23="" در="" نقاط="" زمانی="" برای="" np="" در="" مقابل="" pr="" (زمان="" 0:="" p-value="0.04،" زمان="" 6:="" p-value="0.003،" زمان="" 24:="" p="" -value="0.02)" (d).="" نوار="" داخل="" جعبه="" مقدار="" میانه="" را="" نشان="" می="" دهد،="" جعبه="" محدوده="" بین="" چارکی="" (iqr)="" را="" مشخص="" می="" کند،="" و="" سبیل="" ها="" ربع="" اول="" و="" سوم="" را="" 1.5="" ±="" iqr="" تعریف="" می="" کنند.="" مقادیر="" p="" از="" تنظیم="" یک="" مدل="" رگرسیون="" خطی="" با="" در="" نظر="" گرفتن="" ژن="" های="" v="" به="" عنوان="" یک="" متغیر="" وابسته="" و="" پیامد="" بالینی="" به="" عنوان="" یک="" متغیر="" مستقل="" به="" دست="" می="" آیند.="" (n="12" نمونه).="" داده="" منبع="" به="" عنوان="" فایل="" داده="" منبع="" ارائه="" می="">

همچنین در 6 ماه پس از پیوند مشاهده می شود، در زمانی که بیماران هنوز رد نشده اند، که نشان می دهد سایر فرآیندهای فعال احتمالاً درگیر هستند. مشاهده گسترش کلونال انتخابی با کلون های غالب فقط در بیمارانی که هم رد و/یا هم مزمن پیشرونده دارند.کلیهآسیب پیوند، یک انتخاب، ماندگاری و گسترش برخی از کلون‌های خاص از نظر بیولوژیکی مرتبط با آلوآنتی‌ژن را نشان می‌دهد که باعث کاهش کلی تنوع زمانی می‌شود. حتی اگر می‌توانیم فرض کنیم که گسترش این کلون‌ها احتمالاً با آسیب آلی‌ایمونی پیوند مرتبط است، شواهد مستقیمی که نشان می‌دهد گسترش این کلون‌ها آلئومیون است، نیازمند مطالعات اضافی در شرایط آزمایشگاهی و حیوانی است.

رد حاد قوی ترین عامل منفی برای بقای طولانی مدت پیوند با وجود پیشرفت های سریع در درمان های سرکوب سیستم ایمنی باقی می ماند 39،40. این مطالعه همچنین ارتباطی بین استفاده از برخی از ژن‌های IGHV با رد پیدا می‌کند، اگرچه پیوند علت باید در مطالعات آینده بررسی شود. IGHV{4}} جالب‌ترین ژن در تجزیه و تحلیل gDNA است، زیرا در بیمارانی که در تمام نقاط زمانی اندازه‌گیری شده رد می‌شوند به طور قابل‌توجهی بیشتر استفاده می‌شود و در کلون‌های پایدار مشترک بین افراد و کلون‌های غنی‌شده در بین افراد بیش از حد نشان داده می‌شود. بیماران رد شده در 24 ماه پس از پیوند. این ژن همچنین در 24 ماه پس از پیوند در هر دو ایزوتیپ IgD و IgM در تجزیه و تحلیل cDNA تایید شده است. IGHV{10}} به طور گسترده با پیش آگهی بد در لوسمی لنفوسیتی مزمن همراه بوده است. سوپرآنتی‌ژن‌های سلول B توسط ویروس‌ها و باکتری‌ها تولید می‌شوند که می‌دانند به ایمونوگلوبولین‌ها خارج از محل‌های اتصال آنتی‌ژن معمولی متصل می‌شوند. نشان داده شده است که مواجهه سلول های B با یک سوپرآنتی ژن باعث تکثیر، فعال سازی، مهاجرت و حذف می شود. در پیوندکلیهپتانسیل مواجهه مداوم با ویروس و آنتی ژن های باکتریایی وجود دارد که مربوط به علت ریزش ادراری اولیه به عنوان علت ESRD یا رفلاکس ادراری ثانویه پس از کاشت مجدد حالب پیوندی است، یا رفلاکس پس از عفونت مجاری ادراری، خطر که با قرار گرفتن در معرض سرکوب سیستم ایمنی مزمن پس از پیوند افزایش می یابد. ما نتایج تجزیه و تحلیل را برای علت نارسایی کلیه، در میان سایر عوامل بالینی و جمعیت شناختی تنظیم کردیم. نتایجی که قبلاً مورد بحث قرار گرفت همچنان قابل توجه است، اگرچه ما متوجه شدیم که بیمار NP که در آنالیز به اشتباه طبقه بندی شده بود (شکل 6) بیماری رفلاکس داشت. چنگ و همکاران همچنین قبلاً دریافته‌اند که کلون‌های موجود در بافت بیوپسی گیرندگان پیوند کلیه که توسط سلول‌های B نفوذ کرده‌اند، غالباً ژن IGHV{1}} را در میان دیگران دارند. گروور و همکاران 46 نشان دادند که آنتی‌بادی‌های این ژن خاص، آنتی‌ژن‌های HLA دهنده را تشخیص نمی‌دهند، بلکه برای E. coli خاص هستند و مودنا و همکاران.47 نشان دادند که بار تعداد باکتری‌ها در ادرار در بیماران مبتلا به آن بسیار بیشتر است. فیبروز بینابینی و آتروفی توبولی نسبت به پیوندهایی که عملکرد خوبی داشتند. ما این یافته‌ها را گسترش می‌دهیم که نشان می‌دهد استفاده از ژن IGHV3-23 به طور قابل‌توجهی در بیماران متعدد ردکننده در خون محیطی بیشتر است و ممکن است آنتی‌ژن‌های مشترک خاصی را در رد رانندگی دخالت دهد. در آینده، بیان IGHV{6}} می‌تواند به طور بالقوه برای نظارت بر پاسخ ایمنی نسبت به پیوند استفاده شود.کلیه.

با گسترش مطالعه خود با استفاده از توالی‌یابی cDNA، می‌توانیم اکثر نتایج خود را در دو ایزوتیپ (IgM و IgD) تکرار کنیم، که تنوع پایین‌تری را در پیش پیوند در NP نشان می‌دهد، که دو مهم‌ترین در تجزیه و تحلیل طولی با گسترش بیشتر و غالب است. کلون ها در تجزیه و تحلیل شبکه و همچنین تکثیر ژن IGHV3-23. اولین آنتی‌بادی‌هایی که در پاسخ ایمنی هومورال تولید می‌شوند همیشه IgM هستند و به سرعت به تولید همه ایزوتیپ‌های مختلف، IgD، IgA، IgG و IgE می‌رسند، اما علاقه خاصی به ایزوتیپ IgD48 نیاز دارد. IgD همراه با IgM بیان می شود و IgD ترشحی وجود دارد و در خون، ترشحات مخاطی و روی سطح سلول های عامل ایمنی ذاتی مانند بازوفیل ها عملکرد دارد. بازوفیل ها گلبول های سفیدی هستند که با ویروس ها، باکتری ها، انگل ها و قارچ ها مبارزه می کنند و در بیماری های کلیوی و رد پیوند نقش دارند. بنابراین، شواهد دیگری که پاسخ سلول های B را به فرآیند رد با ویروس ها و باکتری ها مرتبط می کند.

مطالعات آتی مورد نیاز است تا نشان دهد که این فعال سازی به دلیل تفاوت در میکروبیوم گیرنده با مفاهیمی در تشخیص و درمان است.

این مطالعه به ما امکان داد تا ارتباط برخی از این کلون‌های BCR را شناسایی کنیم، کلون‌های BCR مرتبط بالینی با رد آلوگرافت را شناسایی کنیم و نشان دهیم که احتمالاً ارتباط این کلون‌ها با ایمنی هترولوگ وجود دارد، با توجه به غنی‌سازی این کلون‌ها در بیماران مبتلا به دستگاه های ادراری کلونیزه شده قبل از پیوند و ارتباط بیولوژیکی آنها با پاسخ های پاتوژن درک بهتر رفتار مجموعه ایمنی درکلیهپیوند بدون استفاده از BCRSeq در ترکیب با اجرای قوی خطوط لوله محاسباتی و آماری ممکن نبود. با این وجود، چندین محدودیت در رویکرد ما وجود دارد که باید به رسمیت شناخته شود: اول، حجم نمونه ما در مجموعه‌ای از بیماران اطفال بسیار انتخاب شده و نسبتاً کوچک است و حتی اگر در تجزیه و تحلیل خود به اهمیت آماری رسیده‌ایم و در دو منبع مختلف داده اعتبارسنجی شده‌ایم، تجزیه و تحلیل بیشتر برای تایید نتایج ما مورد نیاز خواهد بود. ثانیاً، نتایج ما از تأثیری که نمونه‌برداری بیولوژیکی و فنی ممکن است در تحلیل ما داشته باشد مستثنی نیست. معیارهای تنوع به چندین موضوع بستگی دارد: این واقعیت که تنها کسری از میلیاردها سلول در یک مجموعه در یک نمونه نشان داده می شود، تفاوت در عمق توالی، و خطاهای آزمایشی احتمالی. ما به طور گسترده ای برای همه این مسائل، اول در آزمایشگاه، اجرای همان مقدار خون برای هر نمونه در همان دسته و دوم، از نظر محاسباتی و آماری، استفاده از ابزار recon برای تخمین مجموعه کلی و انجام نمونه برداری پایین برای کنترل عمق توالی کنترل کرده ایم. و خطاهای تجربی ثالثاً، ما BCRSeq را با استفاده از دو منبع مختلف gDNA و cDNA انجام داده‌ایم. توالی‌یابی gDNA تخمین کلونالیته یک توالی Ig معین را تسهیل می‌کند زیرا تعداد خوانده‌های توالی با تعداد مولکول‌های gDNA متناسب خواهد بود. توالی‌یابی cDNA تخمینی از سطح بیان نسبی توالی‌های Ig مختلف در مجموعه ارائه می‌دهد. نشان داده شده است که برای گیرنده های سلول T، توصیف کلونوتیپ انجام شده بر روی cDNA به خوبی gDNA نیست که نشان می دهد نسبت نسبی کلون های منفرد بسیار متفاوت است 15 یا اینکه ردیابی کلون های اختصاصی HIV فقط با gDNA موفقیت آمیز است، اما mRNA51 نیست. چهارم، تأثیر سرکوب سیستم ایمنی ممکن است یک عامل مخدوش کننده در این نوع تجزیه و تحلیل باشد. در این مطالعه، تمام نمونه‌ها از یک کارآزمایی بالینی می‌آیند که در آن بار سرکوب‌کننده ایمنی یکسان توسط همه بیماران پس از پیوند دریافت شد. با این وجود، ما با دو نوع مبتنی بر استروئید و بدون استروئید کنترل کردیم تا مطمئن شویم که این مشکل نیست، بدون اینکه تفاوتی در نتایج مشاهده شود. در نهایت، گروهی که ما در اینجا ارائه می کنیم پیوند کودکان است. اکثر جنبه های بالینی پیوند در کودکان و بزرگسالان مشابه است. سرکوب سیستم ایمنی و رژیم های مورد استفاده مشابه هستند، کراتینین بیومارکر اصلی سرم است، رد حاد در درجه اول با استفاده از بیوپسی با استفاده از معیارهای Banff تعیین می شود، و مکانیسم های ردکلیهپیوند به طور کلی مشابه است، بنابراین اکثر تحقیقات انجام شده در بزرگسالان یا کودکان ممکن است برای هر دو اعمال شود. با این حال، جنبه‌های دیگری مانند عدم انطباق/عدم پایبندی به سرکوب سیستم ایمنی، جنبه‌های ایمنی، بیماری‌های کلیوی اولیه، منجر به نارسایی کلیه، که اغلب با مشکلات اورولوژیک همراه است، و ایمن‌سازی‌هایی که قبل از پیوند لازم است ممکن است متفاوت باشد، بنابراین تجزیه و تحلیل بیشتر در یک جمعیت بالغ برای تعمیم این یافته ها ضروری است.

علی‌رغم این محدودیت‌ها، داده‌های ما نشان می‌دهد که تنوع بالاتری قبل از پیوند در افرادی مشاهده می‌شود که ارگان را رد می‌کنند، که نشان‌دهنده استعداد رد است، که ممکن است پیامدهای آینده در پیش‌بینی خطر رد قبل از پیوند، انتخاب‌های سرکوب سیستم ایمنی، و مراقبت‌های بالینی داشته باشد. تمرینات پس از 24 ماه پیگیری، کاهش کلی تنوع در طول زمان همراه با تداوم و گسترش کلون های خاص و استفاده بیشتر از چندین ژن IGHV در گروه رد مشاهده می شود که ممکن است آنتی ژن های مشترک خاصی را در رد رانندگی دخیل کند. علاقه ویژه ای به افزایش استفاده از ژن IGHV3-23 در بین بیماران طرد شده مشاهده شده است زیرا قبلاً باکلیهپیوند و می تواند یک جزء کلیدی برای هدایت فرآیند رد باشد. این کار یک تجزیه و تحلیل طولی از مجموعه ایمنی سلول های B در پیوند اعضا را ارائه می دهد که مطالعات بیشتری را برای تأیید این یافته ها ترویج می کند زیرا ممکن است پیامدهای بالینی در پیش بینی، کنترل، نظارت و درمان داشته باشند.کلیهطرد شدن.

مواد و روش ها

طراحی مطالعه ما 81 نمونه برای gDNA و 56 نمونه منطبق برای cDNA را به صورت طولی در زمان‌های 0، 6 و 24 ماه از مجموع 27 گیرنده اطفال دریافت کردیم.کلیهپیوند. افراد در این مطالعه از یک کارآزمایی بالینی (مطالعه چند مرکزی SNSO1) می آیند که در آن افراد به طور تصادفی (1:1) به یک رژیم سنتی سرکوب سیستم ایمنی مبتنی بر استروئید با دوز پایین (استروئیدها، القای داکلیزوماب استاندارد تا ماه دوم پس از پیوند، و سرکوب ایمنی نگهدارنده با تاکرولیموس (Prograf، Astellas Pharma) و MMF (CellCept، Hoffman-La Roche) یا یک رژیم سرکوب سیستم ایمنی بدون استروئید (القای طولانی داکلیزوماب تا ماه ششم پس از پیوند، تاکرولیموس و MMF). پس از تایید IRB ثبت نام کردند و رضایت آگاهانه داشتند.در این مطالعه، 14 بیمار رژیم اجتناب از استروئید دریافت کردند، در حالی که 13 بیمار یک رژیم سرکوبگر سیستم ایمنی مبتنی بر استروئید دریافت کردند. شامل سه پالس کورتیکواستروئید داخل وریدی (10 میلی گرم بر کیلوگرم) و تشدید سرکوب سیستم ایمنی پایه بود.

تمام نمونه‌های مورد استفاده در مطالعه دارای نمونه‌برداری سریالی آلوگرافت بودند که توسط پاتولوژیست مرکزی و با استفاده از نمرات بافت‌شناسی نیمه کمی خوانده شد. رد حاد بالینی به عنوان یک دوره رد حاد، همراه با اختلال عملکرد پیوند، بر اساس افزایش بیش از 10 درصدی کراتینین سرم از مقادیر پایه تعریف شد و از طریق یک مطالعه پاتولوژیک مرکزی بیوپسی ها مطابق با طبقه بندی به روز شده Banff تأیید شد. آسیب مزمن آلوگرافت با استفاده از امتیاز شاخص آسیب آلوگرافت مزمن (CADI) تعریف شد. بیماران در سه پیامد بالینی تعریف شده با نمره CADI و قسمت‌های رد طبقه‌بندی شدند. امتیاز بیوپسی‌های سریالی آنها در طول 2 سال و افزایشی در طول زمان‌های بدون رد و پیشرفت‌کنندگان با رد (PR) نمرات CADI بالایی در بیوپسی‌های سریال خود در طول 2 سال با قسمت‌های رد داشتند. این بیماران با دقت زیادی از میان گروهی بزرگتر از 120 بیمار انتخاب شدند که برای متغیرهای جمعیت شناختی و برای همه NP و PNR مطابقت داشتند تا هیچ مدرکی از التهاب در بیوپسی یا آسیب تحت بالینی نداشته باشند، همانطور که با وجود آنتی بادی های اختصاصی اهداکننده اندازه گیری شد. هیچ کدام پیوند HLA یا هاپلودیکال نداشتند زیرا این یک معیار خروج برای ثبت نام بود. همه نمونه ها از 12 برنامه مختلف پیوند اطفال ایالات متحده بین سال های 2004 و 2006، تحت پروتکل های مورد تایید IRB جمع آوری شدند. این مطالعه همچنین توسط برنامه حفاظت از تحقیقات انسانی (HRPP) دانشگاه کالیفرنیا، سانفرانسیسکو و دانشگاه استنفورد تایید شد تا امکان تجزیه و تحلیل نمونه‌های بانک زیستی را فراهم کند. همه بیماران/ سرپرستان رضایت آگاهانه خود را برای شرکت در تحقیق با رعایت کامل اعلامیه هلسینکی ارائه کردند. فعالیت های بالینی و تحقیقاتی گزارش شده مطابق با اصول اعلامیه استانبول است که در اعلامیه استانبول در مورد قاچاق اعضای بدن و گردشگری پیوند ذکر شده است.

جداسازی gDNA و RNA. نمونه های خون (4.5 میلی لیتر) در یک لوله قرمز 5 میلی لیتری جمع آوری شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد تا لخته تشکیل شود. سپس نمونه با استفاده از روتور سطل چرخان در 2000 × گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس لایه بالایی سرم به کرایوتوب دیگری منتقل شد و لخته تا زمان استفاده در همان لوله در دمای 80- درجه نگهداری شد. DNA ژنومی از لخته های خون کامل با استفاده از سبدهای Clotspin و کیت Gentra PuregeneBlood (Qiagen، Valencia، CA) استخراج شد.

برای استخراج RNA ازکلیهبیوپسی سوزنی (Qiagen، Valencia، CA) و در دمای 80- درجه نگهداری می شود. RNA کل با استفاده از مخلوط اصلی 790 میکرولیتر TRIZol و 10 میکرولیتر گلیکوژن استخراج شد. نمونه‌های بافت هموژنیزه شدند، در دمای 15 تا 25 درجه به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند و 160 میکرولیتر کلروفرم برای جداسازی فاز اضافه شد. مخلوط دوباره در دمای 25 درجه به مدت 2 دقیقه و سپس سانتریفیوژ در 4 درجه انکوبه شد و برای استخراج RNA با استفاده از کیت میکرو کیت RNeasy (Qiagen Catalog No.4004) استفاده شد. کمیت و یکپارچگی RNA به ترتیب با استفاده از Thermo Scientific NanoDrop ND{11}} اسپکتروفتومتر UV–Vis و Bioanalyzer Agilent تعیین شد.

توالی یابی سلول های B واکنش های PCR با الگوی DNA ژنومی تهیه شد

از 100 نانوگرم مقدار کمی از gDNA برای تولید شش کتابخانه بارکد مستقل در هر نمونه. پرایمرهای مالتی پلکس شده برای نواحی چارچوب IgH J یا FR1 یا FR2 در طرح BIOMED{3}} استفاده شد. "توالی بارکد" ده نوکلئوتیدی در پرایمرها برای نشان دادن هویت نمونه و هویت کتابخانه تکراری برای هر واکنش PCR استفاده شد. PCR با AmpliTaq Gold (Roche) پلیمراز با برنامه زیر انجام شد: 94 درجه به مدت 5 دقیقه. 35 چرخه (94 درجه برای 30 ثانیه، 60 درجه برای 45 ثانیه، 72 درجه برای 90 ثانیه)؛ و تمدید نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه. واکنش PCR دوم برای اطمینان از اینکه کتابخانه ها قبل از خالص سازی ژل و توالی یابی تا حد اشباع تقویت نشده اند انجام شد. در مجموع، 0.4 ul از هر اولین محصول PCR، واکنش PCR دوم را با استفاده از پرایمرهای خارجی خاص برای 454 توالی پیوند دهنده، الگوبرداری کرد. تقویت با این برنامه انجام شد: 94 درجه برای 15 دقیقه، 12 سیکل (94 درجه برای 30 ثانیه، 60 درجه برای 45 ثانیه، 72 درجه برای 90 ثانیه)، و گسترش نهایی در 72 درجه برای 10 دقیقه. میزان خطای AmpliTaq Gold باید حداقل تأثیری بر شناسایی توالی‌های مرتبط با کلون یا تخمین نرخ جهش جسمانی در توالی‌ها داشته باشد، همانطور که در جای دیگری بحث شد. cDNA از مجموع 300 نانوگرم RNA با پرایمینگ توسط هگزامرهای تصادفی سنتز شد. الگوها توسط PCR با استفاده از پرایمرهای Biomed IGHV در چارچوب 1 (FR1) و پرایمرهای خاص ایزوتیپ واقع در اگزون اول مناطق ثابت، تکثیر شدند. این آغازگرها 18،57 همچنین تقریباً نیمی از توالی های پیوند دهنده Illumina مورد نیاز برای تولید خوشه و توالی یابی در ابزار MiSeq را رمزگذاری کردند. هویت نمونه توسط بارکدهای شناسایی چندگانه هشت نوکلئوتیدی در هر آغازگر کدگذاری شد. برای شناسایی خوشه ایلومینا، چهار نوکلئوتید تصادفی شده در آغازگرها بلافاصله پس از توالی پیوند دهنده ایلومینا در آغازگرهای ناحیه ثابت کدگذاری شدند. هر ایزوتیپ آنتی بادی برای هر نمونه در یک واکنش PCR جداگانه برای جلوگیری از تشکیل محصولات PCR کایمریک ایزوتیپ متقاطع تکثیر شد. PCR با AmpliTaq Gold (روش) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد و از برنامه 94 درجه به مدت 7 دقیقه، 35 سیکل (94 درجه برای 30 ثانیه، 58 درجه برای 45 ثانیه، 72 درجه برای 120 ثانیه) و نهایی استفاده شد. گسترش در 72 درجه به مدت 10 دقیقه. مرحله دوم PCR برای افزودن بخش باقیمانده از پیوندهای Illumina به آمپلیکون‌ها استفاده شد و با کیت Qiagen Multiplex PCR (Qiagen) طبق دستورالعمل‌های سازنده، با استفاده از 0.4 میکرولیتر از اولین محصول PCR به عنوان یک الگو انجام شد. واکنش 30 میکرولیتری برنامه PCR برای مرحله دوم PCR 94 درجه به مدت 15 دقیقه، 12 سیکل (94 درجه برای 30 ثانیه، 60 درجه برای 45 ثانیه، 72 درجه برای 90 ثانیه)، و گسترش نهایی در 72 درجه به مدت 10 دقیقه بود. محصولات هر واکنش PCR در مقادیر هم مولار تخمین زده شده جمع آوری شدند، روی ژل آگارز الکتروفورز شدند و ژل با کیت های QIAquick (Qiagen) استخراج شد. توالی یابی با توان بالای کتابخانه های الگوی DNA ژنومی بر روی پلت فرم 454 (روش) با استفاده از شیمی تیتانیوم انجام شد. توالی یابی کتابخانه cDNA بر روی ابزار Illumina MiSeq با استفاده از کیت های توالی یابی چرخه انجام شد. لیست کامل پرایمرهای مورد استفاده با MiSeq (M154 و M155) و 454 Titanium (T7) در داده های تکمیلی 1 گنجانده شده است.

توالی‌خوانی‌ها به شرح زیر پردازش می‌شوند: خواندن‌های پایانی زوجی با استفاده از FLASH58 ادغام شدند، جایی که پس از آن، توالی‌ها از هم مولتی پلکس شدند و از بارکدها و دنباله‌های آغازگر IGHV بریده شدند. نواحی V، D و J و پیوندهای V-D (N1)، D-J (N2) با استفاده از برنامه هم ترازی IgBLAST59 شناسایی شدند. توالی‌ها برای حذف آرتیفکت‌های غیر IGH، توالی‌هایی با درج یا حذف ژن V، توالی‌های کایمریک و توالی‌های غیرعملکردی فیلتر شدند. در سطح نمونه، ما آنهایی را که دارای آن بودند حذف کردیم<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

تجزیه و تحلیل تنوع تنوع با غنای گونه ای با در نظر گرفتن تعداد کلون ها در هر نمونه اندازه گیری می شود. این اندازه گیری فراوانی هر گونه را در نظر نمی گیرد، بنابراین از آنتروپی شانون (H) نیز برای اندازه گیری تنوع ارائه شده استفاده کردیم.

اطلاعات در مورد توزیع اندازه گونه ها در جمعیت. H به صورت زیر تعریف می شود:

که در آن N تعداد کلون های یکتا و pi بسامد کلون i است. محدوده H از 0 (نمونه تنها با یک کلون) تا Hmax ¼ log2N (نمونه با توزیع یکنواخت کلون‌ها) است.

سپس، ما از یک مدل خطی کلی برای یافتن ارتباط بین غنا و آنتروپی با پیامد بالینی در مقاطع زمانی مختلف استفاده کردیم. ما این مدل را با تمام متغیرهای بالینی موجود در جدول 1 تنظیم کردیم تا مطمئن شویم که هر یک از ویژگی های بیمار یک عامل مخدوش کننده است.

برای مدل‌سازی مولفه طولی داده‌ها، یک مدل اثر مختلط خطی با در نظر گرفتن یک مدل رشد شرطی همانطور که در شکل تکمیلی 10 نشان داده شده است، اعمال کردیم. برای اعمال این مدل، از بسته lme4 در R با در نظر گرفتن تعامل بین پیامد بالینی و زمان استفاده کردیم. ارتباط با غنا و تنوع را با زمان که یک اثر تصادفی است بیابید.

برای مقابله با این واقعیت که معیارهای تنوع ممکن است تحت تأثیر مشکل گونه های از دست رفته باشد (تنها کسری از میلیاردها سلول در یک مجموعه نمایش داده شده است) و توالی و خطاهای تجربی، ما دو استراتژی را علاوه بر تجزیه و تحلیل کامل داده ها انجام دادیم. اول، ما از Recon (بازسازی کلون های تخمین زده شده از اعداد مشاهده شده) ابزار29 برای مقابله با مشکل گونه های گم شده استفاده کردیم. Recon یک روش حداکثر احتمال اصلاح‌شده است که تنوع کلی یک مجموعه را از اندازه‌گیری‌های یک نمونه به دست می‌آورد. Recon برآوردهای دقیق و قوی از مجموعه ای از معیارهای تنوع، از جمله غنا و آنتروپی را ارائه می دهد که امکان مقایسه قوی تنوع بین افراد را فراهم می کند. دوم، ما یک استراتژی پایین‌نمونه‌گیری را انجام دادیم که زیرمجموعه‌ای از قرائت‌های تصادفی را برای هر نمونه برابر با کوچک‌ترین اندازه توالی‌یابی انجام دادیم، به دنبال آن کلون‌های سلول B را مجدداً محاسبه کردیم تا با عمق توالی‌یابی تنظیم شده و با خطاهای آزمایشی احتمالی مقابله کنیم. برای gDNA، نمونه هایی با خوانش بسیار کم (< 1000)="" وجود="" دارد="" و="" برای="" جلوگیری="" از="" از="" دست="" دادن="" بسیاری="" از="" توالی="" ها="" و="" واقعیت="" داده="" ها،="" ما="" در="" مجموع="" 9="" نمونه="" را="" حذف=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

تجزیه و تحلیل شبکه الگوریتم تولید شبکه بسیار شبیه به الگوریتمی است که قبلا تعریف شده بود. به طور خلاصه، هر رأس یک دنباله سلول B را نشان می دهد که اندازه آن با تمام توالی های یکسان تعریف می شود. لبه ها با استفاده از تعریف کلون محاسبه می شوند (قطعات V و J یکسان، طول CDR3 یکسان و 90 درصد هویت نوکلئوتیدی بین CDR3s) و خوشه ها هر کلون را در مجموعه نمایش می دهند. تجزیه و تحلیل با استفاده از بسته گراف در R با استفاده از طرح‌بندی_با_گزینه graphopt برای تولید نمودار انجام شد.

برای تعیین کمیت شبکه، شاخص جینی را برای اندازه راس و اندازه خوشه محاسبه کردیم. شاخص جینی یک معیار ناهمواری است که به طور گسترده برای اندازه گیری توزیع ثروت استفاده می شود. نابرابری بین مقادیر توزیع فرکانس را اندازه گیری می کند. ما از تابع Gini از یک بسته در R برای محاسبه ضریب جینی برای اندازه راس و توزیع اندازه خوشه استفاده کردیم. ضریب جینی صفر برابری کامل و ضریب جینی 1 حداکثر نابرابری را بیان می کند.

تجزیه و تحلیل کلونال برای مطالعه کلون‌های خاص مرتبط با نتایج بالینی، ماتریسی با همه کلون‌هایی که در بیش از یک نمونه (تعداد کل=118،223) توسط همه نمونه‌ها در هر نقطه زمانی وجود دارند، ساختیم. سپس ما ارتباط با پیامد بالینی هر کلون خاص را مطالعه کردیم و یک متغیر را در هر کلون به عنوان موجود/بدون وجود تعریف کردیم. در نهایت، ما از آزمون دقیق فیشر برای محاسبه اهمیت در جداول 2×3 برای هر کلون در هر نقطه زمانی استفاده کردیم. ما همچنین کلون‌های ماندگاری را که توسط آن کلون‌هایی تعریف شده‌اند که در بیش از یک نقطه زمانی در هر فرد هستند، مطالعه کردیم. سپس، برای در نظر گرفتن تفاوت‌ها بر اساس پیامد بالینی، یک مدل خطی را اعمال کردیم که به عنوان متغیر وابسته تعداد کلون‌ها (برای اندازه‌گیری تفاوت در ماندگاری) و تعداد تعداد هر کلون (برای اندازه‌گیری گسترش کلونال) و پیامد بالینی را به‌عنوان متغیر وابسته تعریف کردیم. یک پیش بینی مستقل

تجزیه و تحلیل استفاده از ژن IGHV برای مطالعه ژن‌های IGHV، استفاده از ژن IGHV در هر نمونه را به‌عنوان تعداد دفعاتی که هر ژن با تعداد کلون‌ها نرمال می‌شود، ارزیابی کردیم تا از نمایش بیش از حد برخی ژن‌های IGHV جلوگیری شود. برای تجزیه و تحلیل آماری، ما آن ژن‌هایی را با بیان بسیار کم (IGHV usage/clone <{{0}}.05) در="" حداقل="" 10="" درصد="" از="" نمونه‌ها="" فیلتر="" کردیم.="" در="" مجموع،="" ما="" 27="" ژن="" ighv="" مربوط="" به="" 63="" نمونه="" را="" تجزیه="" و="" تحلیل="" کردیم.="" سپس،="" ما="" از="" یک="" مدل="" خطی="" برای="" یافتن="" آن="" دسته="" از="" ژن‌هایی="" استفاده="" کردیم="" که="" در="" هر="" نقطه="" زمانی="" با="" پیامد="" بالینی="" مرتبط="" بودند="" و="" این="" نتایج="" را="" با="" آزمایش‌های="" متعدد="" با="" استفاده="" از="" benjamini="" و="" hochberg="" fdr=""><0.05 اصلاح="" کردیم.="" ما="" این="" مدل="" را="" با="" همه="" متغیرهای="" بالینی="" موجود="" در="" جدول="" 1="" تنظیم="" کردیم="" تا="" مطمئن="" شویم="" که="" هر="" یک="" از="" ویژگی="" های="" بیمار="" یک="" عامل="" مخدوش="" کننده="">

خلاصه گزارش اطلاعات بیشتر در مورد طراحی تحقیق در خلاصه گزارش تحقیقات طبیعت مرتبط با این مقاله موجود است.

منابع

1.Cai,J.& Terasaki,PI مانیتورینگ آنتی بادی پس از پیوند و HLA 1.(شناسایی اپی توپ آنتی بادی. Curr.Opin.Immunol. 20،{4}}(2008).

2. Sigdel، TKet al. آنتی بادی های Non-HLA به اپی توپ های ایمونوژنیک، تکامل آسیب مزمن آلوگرافت کلیوی را پیش بینی می کنند. صبح. Soc. Nephrol.23,{3}} (2012).

3. Li, L.et al. محلی سازی بخشی و ارتباط بالینی آنتی بادی های MICA پس از پیوند کلیه پیوند 89،{2}}(2010).

4. Lamb، KE، Lodhi، S.& Meier-Kriesche، H.-U. بقای طولانی مدت آلوگرافت کلیه در ایالات متحده: ارزیابی مجدد انتقادی. Am.J. پیوند. 11، 450-462(2011).

5. ثبت علمی دریافت کنندگان پیوند. موجود در: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(دسترسی: 24 مه 2018) Pineda، S. et al. انواع جدید ناسازگار با آنتی ژن غیر سازگاری

6. بهبود توانایی پیش بینی خطر رد ناشی از آنتی بادی در پیوند کلیه. جلو. ایمونول. 8,1687 (2017).

7. Valuiskikh, A.Baldwin, WM& Fairchild, RLپیشرفت اخیر و دیدگاه های جدید در مطالعه پاسخ سلول های T به آلوگرافت. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G.& Serwal, MM یین و یانگ سلولهای B در رد پیوند و تحمل. پیوند. Rev.24,67-78(2010).

9. جورجیو، جی و همکاران. وعده و چالش توالی یابی با توان بالای مجموعه آنتی بادی پلاس. نات. Biotechnol.32,{3}}(2014).

10. Schroeder, HW شباهت و واگرایی در توسعه و بیان مجموعه های آنتی بادی موش و انسان. توسعه دهنده Comp. ایمونول. 30، {2}}(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH رهنمودهای عملی برای آنالیز توالی یابی رپرتوار گیرنده سلول B. Genome Med.7,121 (2015).

12. Shugay، M. et al. VDJtools: یکپارچه‌سازی پس از آنالیز مخزن‌های گیرنده سلول T. PLOS Comput. Biol.11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H.et al.Quantitative مشخصات رپرتوار سلول T و نشانگرهای زیستی در رد پیوند کلیه. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. موریس، اچ و همکاران. ردیابی سلول های T واکنش دهنده به دهنده: شواهدی برای حذف کلونال در بیماران پیوند کلیه متحمل علمی ترجمه Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau، M.et al. تجزیه و تحلیل رپرتوار TCR توسط توالی یابی نسل بعدی امکان تشخیص افتراقی پیچیده آسیب شناسی مربوط به سلول T را فراهم می کند. صبح. J.Transplant.13,{4}} (2013).

16. Palanichamy، A.et al. سلول های B با کلاس ایمونوگلوبولین یک محور ایمنی فعال بین CNS و محیط را در مولتیپل اسکلروزیس تشکیل می دهند. علمی ترجمه Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB & Hernandez, RDS استنتاج آماری پاسخ مجموعه آنتی بادی همگرا به واکسن آنفولانزا. ژنوم مد. 8,60 (2016).

18. راسکین، KM و همکاران. توالی های IgH در کمبود متغییر ایمنی متداول، رشد و انتخاب سلول های B تغییر یافته را نشان می دهد. علمی ترجمه Med.7,302ra135 (2015).

19. Massart, A., Ghisdal, L., Abramowicz, M. & Abramowicz, D. تحمل عملیات در پیوند کلیه و نشانگرهای زیستی مرتبط. کلین انقضا Immunol.189، {2}}(2017).

20. Beausang، JFet al.B cell repertoares در کاندیداهای پیوند کلیه حساس شده با HLA که تحت درمان حساسیت زدایی قرار می گیرند. ترجمه Med.15, 9 (2017).

21. فردمن، جی و همکاران. گسترش و هیپرجهش سوماتیک کلون های سلول B در پیوندهای رد شده کلیه انسان. پیوند 98، 766-772(2014).

22. وولمرز، سی و همکاران. نظارت بر سرکوب سیستم ایمنی ناشی از فارماکولوژیک توسط توالی یابی رپرتوار ایمنی برای تشخیص رد حاد آلوگرافت در بیماران پیوند قلب: یک مطالعه صحت تشخیصی اثبات مفهوم. PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al.Banff'05 Meeting Report: تشخیص افتراقی آسیب مزمن آلوگرافت و حذف نفروپاتی مزمن آلوگرافت (CAN). صبح. J. Transplant.7،{3}}(2007). سرکوب سیستم ایمنی در پیوند کلیه: آیا زمان آن رسیده است که آن را به عنوان یک درمان استاندارد در نظر بگیریم؟ کلیه Int.76,825-830(2009).

28. لژاندر، سی و همکاران. نتایج سه ساله در بیماران پیوند کلیه تصادفی شده به سرکوب سیستم ایمنی بدون استروئید یا ترک استروئید، با مایکوفنولات سدیم و سیکلوسپورین پوشش داده شده روده: مطالعه بی نهایت. J. Transplant.2014،1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. برآوردهای قوی از تنوع کلی مجموعه ایمنی از اندازه گیری های با توان بالا در نمونه ها. نات. Commun.7, 11881 (2016).

30. استرن، JNHet al. سلول های B که در مغز مولتیپل اسکلروزیس پر می شوند در غدد لنفاوی دهانه رحم در حال تخلیه بالغ می شوند. علمی ترجمه Med.6,248ra107 (2014).

31. باشفورد-راجرز، RJMet al. ویژگی های شبکه به دست آمده از توالی یابی عمیق مخزن های گیرنده سلول B انسانی، جمعیت سلول های B را مشخص می کند. Genome Res.23,{6}} (2013).

32. سروال، متال. ناهمگنی مولکولی در رد حاد آلوگرافت کلیه

شناسایی شده توسط پروفایل ریزآرایه DNA. N.Engl.J. Med.349،{1}}(2003). 33. Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C.& Sarwal, MMPhenotypic Evaluation زیرمجموعه های سلول b بعد از ریتوکسیماب برای درمان رد حاد آلوگرافت کلیه در دریافت کنندگان کودکان. پیوند 91،{7}} (201).

34. Clatworthy، MR&Targeting، B. سلول ها، و آنتی بادی ها در پیوند. J. Transplant.11,{2}} (2011).

35. Dijke,EIet al.Bcells in transplantation.J. پیوند ریه قلب.35،704-710(2016).

36. Nankivell, BJ & Kuypers, DRDdiagnosis and prevention of allograft allograft . Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. تنوع طبیعی در پارامترهای سلول ایمنی ذاتی ترجیحاً توسط عوامل ژنتیکی هدایت می شود. Nat.Immunol.19،302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. ریشه های تنوع در ایمنی انسان. ایمونول. 19، 209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. عدم بهبود بقای آلوگرافت کلیه علیرغم کاهش قابل توجه میزان رد حاد در دوره اخیر.Am.J. Transplant.4،{4}} (2004).

40. Keith، DS، Vranic، G.& Nishio-Lucar، A. عملکرد پیوند و نتایج میان مدت پیوند کلیه در دهه گذشته بهبود یافته است: تجزیه و تحلیل پایگاه داده پیوند کلیه ایالات متحده. پیوند. مستقیم 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. et al. بیان ژن‌های جهش‌یافته IGHV3-23 در لوسمی لنفوسیتی مزمن، زیرمجموعه‌ای از بیماری را با ویژگی‌های بالینی و بیولوژیکی خاص شناسایی می‌کند. کلین سرطان Res. 16،{3}}(2010).

42. Levinson، AI، Kozlowski، L، Zheng، Y.& Wheatley، L. سوپرآنتی ژن های سلول B: تعریف و تاثیر بالقوه بر پاسخ ایمنی. Clin.Immunol.15, 26S{4}}S(1995.

43. Silverman، GJ&Goodyear، سوپرآنتی ژن B-Cell مدل CSA و ایمونوبیولوژی لنفوسیت های B. Clin.Immunol.102،{3}}(2002).

44. Silverman, GJ & Goodyear, CSCConfounding B-cell Defense: درسهایی از سوپرآنتی ژن استافیلوکوک. نات. Rev. Immunol.6،{3}}(2006). 45. Cheng, J.et al. خوشه های سلول B نابجا که به کلیه های پیوندی انسان نفوذ می کنند، کلونال هستند. Proc. Natl Acad. علمی 108، {8}} (2011).

46. ​​گروور، RKet al. LPS ایمونوژن همزمان باعث ایجاد کلون های سلول B می شود که به کلیه های پیوندی انسان نفوذ می کنند. Proc. Natl Acad. علمی USA 109, 6036-6041(2012).

47, Modena, BDet al. تغییرات در جمعیت میکروبیوم ادراری در پیوند کلیه با فیبروز بینابینی و آتروفی لوله‌ای که در بیوپسی‌های نظارت اولیه ثبت شده است، مرتبط است. صبح. J. Transpl.17,{2}} (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. بینش های جدید در مورد معمای ایمونوگلوبولین D. Immunol. Rev. 237,160-179 (2010).

49. Chen, K. et al. ایمونوگلوبولین D با فعال کردن برنامه های ضد میکروبی، پیش التهابی و تحریک سلول های B در بازوفیل ها، نظارت ایمنی را افزایش می دهد. نات. ایمونول. 10، 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Basophils and mastcells in renal damage.KidneyInt.76,{2}} (2009).

51. نیکسون، DFet al. ردیابی مولکولی ویروس نقص ایمنی انسانی

کلون سلول T سیتوتوکسیک اختصاصی nef ادامه DNA گیرنده سلول T اختصاصی کلون را نشان می‌دهد اما mRNA را به دنبال درمان ضدرتروویروسی ترکیبی اولیه نشان نمی‌دهد. Lett.66,{4}}(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina,P.& Harmon, WEK پیوند کلیه در کودکان.N.Engl. جی. مد. 371، {2}}(2014).

53. سروال، MMet al. اجتناب کامل از استروئید در کودکان با پیوند کلیه موثر و بی خطر است: یک کارآزمایی تصادفی چند مرکزی با پیگیری سه ساله. Am.J.Transplant.12,{4}}(2012).

24. Solez, K. et al.Banff 07 طبقه بندی آسیب شناسی آلوگرافت کلیه: به روز رسانی ها و جهت گیری های آینده. Am.J.Transplant.8،{3}} (2008).

54. لی، ال و همکاران. سرکوب سیستم ایمنی بدون استروئید از سال 1999: 129 پیوند کلیه کودکان با پیوند پایدار و مزایای بیمار. Am.J. Transpl. 9، 1362-1372(2009).

25. چودهری، ع. و همکاران. تاثیر بالینی ایمنی هومورال در پیوند کلیه کودکان. صبح. Soc.Nephrol.24, 655-664 (2013).