سیستانچ دسرتیکولا پلی ساکارید ملانوژنز را در ملانوسیت ها تحریک می کند، استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد و باعث سفید شدن می شود.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

Yibo Hu1|Jinhua Huang1|Yixiao Li2|لینگ جیانگ1|Yujie Ouyang1|Lun Yang1|Xiaojiao Zhao1|Lihua Huang3|Hong Xiang3|جینگ چن1 چینگهای زنگ1

خلاصه

به عنوان بخش اصلی اختلالات رنگدانه، بیماری های دپیگمانتاسیون پوست مانند ویتیلیگو و نایووس آکرومیک بسیار شایع هستند و در حال حاضر بیشتر مورد توجه قرار گرفته اند. پاتوژنز دپیگمانتاسیون شامل اختلال عملکرد و از دست دادن ملانوسیت است که احتمالاً به دلیل وراثت، خودایمنی واسترس اکسیداتیوs. در میان آنها، استرس اکسیداتیو نقش کلیدی ایفا می کند. با این حال، درمان های بالینی کمی می توانند با استرس اکسیداتیو مقابله کنند. همانطور که گزارش شده،پلی ساکارید سیستانش دسرتیکولا(CDP) یک آنتی اکسیدان موثر است. بر این اساس، ما نقش آن را در ملانوسیت ها ارزیابی کردیم و مکانیسم ها را بیشتر نشان دادیم. در این مطالعه، ما دریافتیم که CDP می تواند ارتقاء دهدملانوژنزدر ملانوسیت های اپیدرمی انسان (HEMs) و سلول های ملانوم B16F10 موش، همچنین باعث ایجاد رنگدانه در گورخرماهی شد. علاوه بر این،CDPمی تواند مسیر سیگنال پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) را فعال کند، سپس بیان فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) و ژن های پایین دست TYR، TRP1، TRP2 و RAB27A را تنظیم کند. در غیر این صورت، ما دریافتیم که CDP می‌تواند سمیت سلولی و آپوپتوز ناشی از H2O2-در ملانوسیت‌ها را کاهش دهد. شواهد بیشتر نشان داد که CDP می تواند مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{9}} را بهبود بخشد و ROS داخل سلولی را از بین ببرد. به طور خلاصه، CDP می تواند ترویج کندملانوژنزو از ملانوسیت ها جلوگیری می کنداکسیداتیوفشارآسیب، نشان می دهد که CDP به حفظ وضعیت طبیعی ملانوسیت ها کمک می کند. بدین ترتیب،CDPممکن است یک داروی جدید برای درمان بیماری های دپیگمانتاسیون باشد.

کلید واژه ها

پلی ساکارید سیستانش دسرتیکولا، بیماری دپیگمانتاسیون، ملانوسیت، ملانوژنز، NRF2، استرس اکسیداتیو

تازهسیستانچ

1|مقدمه

بیماری های رنگدانه پوست، مانند ویتیلیگو و نایووس آکرومیک، با رنگدانه های پوستی تکه تکه یا گسترده مشخص می شوند. اگرچه ضایعات پوستی به ندرت باعث آسیب فیزیکی شدید می شوند، اما بر ظاهر بیمار تأثیر می گذارند و بار روانی شدید، حتی اختلالات سلامت روانی ایجاد می کنند. تغییرات پاتولوژیک عمده در رنگدانه شامل اختلال در عملکرد و از دست دادن ملانوسیت است که بر سنتز و انتقال ملانین تأثیر زیادی می گذارد، بنابراین منجر به تجمع ناکافی ملانین در پوست می شود.

مکانیسم های دخیل در رنگدانه در حال حاضر ناشناخته است، اما مطالعات برخی از عوامل مرتبط را شناسایی کرده اند. از یک طرف، عملکرد ملانوسیت تا حدی به فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) بستگی دارد، که به خوبی برای ترویج بیان شناخته شده است.ملانوژنزژن های مرتبط از جمله تیروزیناز (TYR)، پروتئین مربوط به تیروزیناز 1 (TRP1)، پروتئین مربوط به تیروزیناز 2 (TRP2)، پروتئین مرتبط با ras Rab-27a (RAB27A) و پروتئین بسته بندی اکتین فاسین 1 (FSCN1) در میان این ژن‌ها، TYR نقش کلیدی در سنتز ملانین از طریق اکسید کردن ال-دوپا به دوپاکینون بازی می‌کند. از سوی دیگر، مطالعات ترکیبی از چندین عامل را نشان می‌دهند که ممکن است مسئول از بین رفتن ملانوسیت‌ها باشند، از جمله وراثت، محیط، خودایمنی. ، واسترس اکسیداتیو.6-9 در میان این عوامل، استرس اکسیداتیو مهم ترین است.

مکانیسم هایاسترس اکسیداتیوایجاد رنگدانه تا حدی آشکار شده است. اضافه بار گونه های اکسیژن فعال (ROS) یکی از عوامل کلیدی است. 10 اضافه بار ROS در رنگدانه شامل عدم تعادل بین سیستم های پرو و ​​آنتی اکسیدان است. عامل 2/عنصر پاسخ آنتی اکسیدانی (NRF2/ARE) اختلال در مسیر آنتی اکسیدانی.12 مسیر از NRF2 و آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند هم اکسیژناز (HMOX{11}}، HO{12}}) تشکیل شده است. کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون پراکسیداز 1 (GPX1)، و NAD(P)H کینون دهیدروژناز 1 (NQO1). زمانی که ملانوسیت ها در معرض ROS بیش از حد قرار می گیرند، NRF2 می تواند به هسته منتقل شود و به ARE حفظ شده متصل شود، سپس ارتقا یابد. بیان آنزیم های آنتی اکسیدان با این حال، در برخی از بیماری های رنگدانه، مانند ویتیلیگو، یک مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/ARE مختل نمی تواند به طور موثر ROS را از بین ببرد.

درمان‌های بالینی که معمولاً در دپیگمانتاسیون استفاده می‌شوند شامل کورتیکواستروئیدهای موضعی یا سیستمیک، مهارکننده‌های کلسینورین، اشعه ماوراء بنفش با باند باریک B (NBUVB؛ 311 نانومتر)، نور اگزایمر 308- نانومتر، پیوند اپیدرم اتولوگ و درمان طب سنتی چینی (TCM) می‌باشد. کورتیکواستروئیدها و مهارکننده‌های کلسینورین می‌توانند فعال‌سازی غیرطبیعی سیستم ایمنی را کاهش دهند، در حالی که فتوتراپی به‌عنوان خط اول درمان استفاده می‌شود. به ویژه، NBUVB تکثیر ملانوسیت ها و تخریب سلول های T را تحریک می کند، در حالی که نور اگزایمر {7}nm باعث آپوپتوز سلول های T می شود.17 علاوه بر این، اثرات درمان های TCM با ارتقاملانوژنز.18 تا حدی، این روش ها برای بهبود رنگدانه مفید هستند، اما کنترل پیشرفت بیماری همچنان چالش برانگیز است. توسعه درمان های جدید به ویژه برایاسترس اکسیداتیو، که قبلا مورد غفلت قرار گرفته بود.

Cistanche deserticola به عنوان "جین سینگ صحرا" شناخته می شود. اجزای آن در آسیب کبدی ناشی از اتانول و هیپرپلازی التهابی روده مفید است. همچنین می تواند به عنوان یک معرف ضد خستگی، ضد التهاب و ضد تومور استفاده شود.{5}} اخیراً Guo و همکاران گزارش کردند کهپلی ساکارید سیستانش دسرتیکولا(CDP)، یکی از اجزای اصلی آن، دارای فعالیت آنتی اکسیدانی و محافظت از کبد است. دو مطالعه دیگر نقش آن را در محافظت از سلول‌ها در برابر سرطان مشخص کردنداسترس اکسیداتیوآسیب در شرایط محرومیت از اکسیژن-گلوکز/ پرفیوژن مجدد و پوکی استخوان. با این حال، نقش CDP در بیماری های رنگدانه روشن نشده است. در اینجا، هدف ما تایید این بود که آیاCDPمی تواند تاثیر بگذاردملانوژنزو ملانوسیت ها را از استرس اکسیداتیو محافظت می کند.

2|مواد و روش ها

2.1|مواد شیمیایی و آنتی بادی ها

پلی ساکارید سیستانش دسرتیکولا(CDP) و l-dopa از Yuanye Biotec (خلوص بیشتر یا برابر 98 درصد؛ شانگهای، چین) خریداری شد. پراکسید هیدروژن (H2O2)، دی متیل سولفوکسید (DMSO)، NaOH، تریتون X{4}}، 4،5-دی متیل تیازول-2-ایل-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید ( MTT)، و یک کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC از Sigma-Aldrich خریداری شد. 4 درصد پارافورمالدئید خنثی از Biosharp (Hefei، چین) خریداری شد. و یک کیت رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس (الکسا فلور 488) و 2 دی کلرو فلورسین-دی استات (DCFH-DA) از Beyotime Biotec (شانگهای، چین) خریداری شد. یک کیت رنگ آمیزی Fontana-Masson و یک کیت استخراج پروتئین نوکلئوپلاسمی از Sloarbio (پکن، چین) خریداری شد. مکمل رشد ملانوسیت انسانی (HMGS)، محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و محیط 254 از Gibco خریداری شد. سرم جنین گاوی (FBS) از BI (Kibbutz Beit-Haemek، اسرائیل) خریداری شد. آنتی بادی های اولیه برای -اکتین، TYR، TRP2، RAB27A، FSCN1، ERK، p-ERK، JNK، p-JNK، p38، p-p38، NRF2 و HO{31}} از Cell Signaling Technology، یک فناوری اولیه خریداری شد. آنتی بادی برای MITF از آزمایشگاه سنت جان، یک آنتی بادی اولیه برای p-MITF از Affinity Biosciences، یک آنتی بادی اولیه برای GAPDH از Bioworld، و آنتی بادی اولیه برای TRP1 از EMD Millipore خریداری شد.

2.2|کشت و درمان سلولی

سلول‌های ملانوم B16F1{14}} موش در محیط DMEM حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد مخلوط آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند. ملانوسیت های اپیدرمی انسانی (HEMs) از پوست ختنه گاه انسان جدا شدند (به مطالعه قبلی ما مراجعه کنید) و در محیط 254 حاوی HMGS، 5 درصد FBS و 1 درصد ترکیب آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند. تمامی سلول ها در انکوباتور مرطوب در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 کشت داده شدند. CDP قبل از استفاده در DMSO حل و با محیط رقیق شد و غلظت نهایی DMSO کمتر از 0.1 درصد بود. H2O2 قبل از استفاده با محیط رقیق شد.

2.3|پرورش و درمان گورخرماهی

جنین گورخرماهی و محیط کشت از EzeRinka Biotech خریداری شد. پروتکل آزمایشی مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه مرکزی جنوب قرار گرفت. گورخرماهی در 12-صفحات چاهک در 37 درجه دور از نور کشت داده شد و با غلظت‌های مختلف CDP تیمار شد. از یک میکروسکوپ معکوس برای مشاهده و ثبت روزانه ملانین ها در سر و دم گورخرماهی استفاده شد. پس از مشاهده، محیط را تغییر داده و مجدداً اضافه کردیمCDP. چگالی ملانین در دم گورخرماهی با Image J اندازه‌گیری شد و مقادیر به صورت چگالی نوری یکپارچه (IOD) ارائه می‌شوند.

2.4|زنده ماندن سلولها

زنده ماندن سلول ها با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. برای بررسی سمیت سلولیCDPسلول‌های HEM و B16F10 در صفحات چاهک با تراکم 2×103 سلول در چاهک کاشته شدند و تا زمانی که سلول‌ها به پلیت‌ها متصل شوند، کشت داده شدند. سپس سلول ها با غلظت های مختلف (0، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80، 160 و 320 میکروگرم در میلی لیتر) تیمار شدند.CDPبه مدت 24، 48 یا 72 ساعت. قبل از اندازه گیری، 20 میکرولیتر MTT به هر چاهک اضافه شد و پلیت ها در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت انکوبه شدند. پس از آن، مایع رویی را دور انداختیم و 160 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه کردیم تا بلورهای فورمازان حل شوند. مقدار جذب در 490 نانومتر توسط یک صفحه خوان چند حالته (PerkinElmer) اندازه گیری شد. برای بررسی اثر CDP در شرایط سمیت سلولی ناشی از H2O{9}}، سلول‌های HEM و B16F10 در صفحات چاهک با تراکم 4 × 103 سلول در چاهک قرار گرفتند. سلول ها با غلظت های مختلف تیمار شدندCDP({0}}، 20، 40، یا 80 ug/mL) به مدت 24 ساعت، در این مرحله H2O2 (غلظت نهایی: 500 میکرومتر برای سلول‌های HEM و 1.0 میلی‌متر برای سلول‌های B16F10) به هر چاه اضافه کردیم و سلول ها را به مدت 24 ساعت دیگر انکوبه کرد. ما گروه های تحت درمان با CDP و کنترل منفی (NC) را راه اندازی کردیم. مراحل تشخیص همان است که قبلا توضیح داده شد.

2.5|سنجش NaOH محتوای ملانین

سلول‌ها در ظرف‌های پتری 100- میلی‌متری کشت و با آن تیمار شدندCDPدر غلظت‌های مختلف ({0}}، 20، 40 و 80 ug/mL) به مدت 48 ساعت، سپس با تریپسین هضم و در لوله‌های 1.5-میلی‌لیتری جمع‌آوری شد. سلول ها را دو بار با آب دوبار تقطیر شستیم، مجدداً در 1 میلی لیتر اتانول معلق کردیم و آنها را گرداب کردیم تا ملانین آزاد شود. سپس مخلوط را (200 گرم، 5 دقیقه) سانتریفیوژ کردیم و مایع رویی را دور انداختیم، 1 میلی لیتر DMSO 10 درصد (رقیق شده با محلول NaOH 1 میلی متر) به هر لوله اضافه کردیم و رسوب را به حالت تعلیق درآوریم. سوسپانسیون را در یک حمام آب در دمای 80 درجه به مدت 1 ساعت انکوبه کردیم تا ملانین حل شود. در نهایت، ما 200 میکرولیتر از مایع را به یک صفحه چاهی 96- منتقل کردیم و از یک صفحه خوان چند حالته برای اندازه گیری مقدار جذب در 470 نانومتر استفاده کردیم.

سیستانچبررسی ها: مهار می کندملانینتولید

2.6|اندازه گیری فعالیت تیروزیناز

سلول‌ها در ظروف پتری 100- میلی‌متری کشت داده شدند و تحت تیمار قرار گرفتندCDPقبل از اندازه‌گیری، با تریپسین هضم شده و در لوله‌های 1.5- میلی‌لیتری جمع‌آوری شد و دو بار با سالین بافر فسفات (PBS) شسته شد. ما 106 سلول از هر نمونه را به یک لوله جدید منتقل کردیم و پس از سانتریفیوژ، مایع رویی را دور انداختیم، سپس 1 میلی لیتر 0.5 درصد تریتون X-100 را به گلوله سلولی اضافه کردیم و آن را ذخیره کردیم. مخلوط در 0 درجه به مدت 15 دقیقه. پس از آن، 1 میلی لیتر L-dopa (1 میلی متر، رقیق شده با 0.1 مولار بافر فسفات) به عنوان سوبسترا اضافه کردیم و محلول را مخلوط کردیم، 0 میکرولیتر از مخلوط را به یک 0 انتقال دادیم. {16}} بلافاصله صفحه چاه، و مقدار جذب (A0) را در 475 نانومتر با استفاده از صفحه خوان چند حالته اندازه‌گیری کرد و اندازه‌گیری را در 10 دقیقه تکرار کرد (A10). فعالیت تیروزیناز با (A{21}}A0)/105 محاسبه شد و نتایج به صورت درصد (درصد) در مقابل کنترل منفی بیان می‌شوند.

2.7|رنگ آمیزی ملانین فونتانا ماسون

سلول‌ها تا رسیدن به تراکم 50 درصد در 12-صفحه‌های چاهک کشت داده شدند. پس از تیمار، سلول ها با 4 درصد پارافورمالدئید خنثی به مدت 30 دقیقه تثبیت شدند و با آب مقطر شسته شدند. سپس 500 میکرولیتر محلول آمونیاک-نقره فونتانا را به هر چاهک اضافه کردیم و صفحات را به مدت 16 ساعت در تاریکی نگهداری کردیم تا ملانین رنگ شود. سپس سلول ها را با آب مقطر 5 بار (هر بار 1 دقیقه) شستیم و به مدت 5 دقیقه در 500 میکرولیتر هیپوسولفیت خیس کردیم. در نهایت هیپوسولفیت را خارج کرده و مجدداً سلول ها را با آب مقطر به مدت 1 دقیقه شستشو دادیم. سپس از یک میکروسکوپ معکوس برای مشاهده و ثبت ملانین ها استفاده کردیم.

2.8|استخراج RNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی

سلول ها در 6-صفحه های چاهک کشت داده شدند. پس از درمان، سلول ها با تریپسین هضم و در لوله های 1.{2}} میلی لیتری جمع آوری شدند. سلول ها را دو بار با PBS شستیم، سپس به 1 میلی لیتر بافر لیز اضافه کردیم، مخلوط را گرداب کردیم و لوله ها را به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار دادیم تا سلول ها کاملاً لیز شوند. RNA با استفاده از کیت توتال RNA (Omega Bio-Tek) استخراج و با استفاده از ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) رونویسی معکوس (RT) انجام شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی (PCR) با استفاده از KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO) انجام شد. حجم واکنش مخلوط RT 20 میکرولیتر بود، در حالی که حجم واکنش مخلوط PCR 20 میکرولیتر بود (cDNA 1-8 میکرولیتر، MIX 10 میکرولیتر، پرایمر F 1 میکرولیتر، پرایمر R 1 میکرولیتر، DEPC H2O را به 20 میکرولیتر اضافه کنید. ). آزمایش ها طبق پروتکل ها انجام شد. توالی پرایمرها در جدول S1 آمده است.

2.9|استخراج پروتئین و وسترن بلات/ایمونوفلورسانس

سلول ها در ظرف های پتری 100- میلی متری کشت شدند. پس از درمان، سلول ها با تریپسین هضم و در لوله های 1.{2}} میلی لیتری جمع آوری شدند. سلول ها را دو بار با PBS شستیم، سپس به 500 میکرولیتر بافر لیز RIPA (Thermo Fisher) همراه با 1 میلی متر فنیل متیل سولفونیل فلوراید (ترمو فیشر) و کوکتل بازدارنده فسفاتاز رقیق شده 1:100 (روش) اضافه کردیم. پروتئین هسته و سیتوپلاسم با استفاده از کیت استخراج پروتئین نوکلئوپلاسمی طبق پروتکل سازنده استخراج شد. لوله ها را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار دادیم و هر 5 دقیقه یکبار آنها را چرخاندیم تا سلول ها کاملاً لیز شوند. ما سلول ها را سانتریفیوژ کردیم (200 گرم، 4 درجه، 15 دقیقه)، مایع رویی را به یک لوله جدید منتقل کردیم، و غلظت کل پروتئین را با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (KeyGEN Biotec) اندازه گیری کردیم. ما پروتئین ها را با بافر بارگذاری 5× (بیوتیم بیوتک، چین) در 100 درجه به مدت 10 دقیقه جوشاندیم، سپس آنها را در دمای 80- درجه نگهداری کردیم. از روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) در وسترن بلات استفاده شد و 20 گرم پروتئین از هر گروه جدا و به غشای پلی وینیلیدین فلوراید منتقل شد. پس از انسداد آنتی ژن، غشا را در یک آنتی بادی اولیه رقیق شده 1:1000 به مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه انکوبه کردیم، سپس غشا را با PBST شستیم و در آنتی بادی ثانویه 1:{24}} فلورسنت رقیق شده به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه کردیم. . شدت فلورسانس با استفاده از یک سیستم تصویربرداری Odyssey CLx (LI-COR) شناسایی شد. ایمونوفلورسانس با استفاده از کیت رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس (الکسا فلور 488) با رقت 1:100 آنتی بادی اولیه انجام شد.

سیستانچ ردیت

2.10|اندازه گیری آپوپتوز سلولی

سلول‌ها در ظرف‌های پتری {0}} میلی‌متری کشت داده شدند و با غلظت‌های مختلف (۰، ۲۰، ۴۰ و ۸۰ میکروگرم بر میلی‌لیتر) تیمار شدند.CDPبه مدت 24 ساعت، و H2O2 (غلظت نهایی: 50 0 میکرومتر برای HEMs، 1.0 میلی‌متر برای سلول‌های B16F10) به هر چاهک اضافه شد و برای 24 ساعت دیگر انکوبه شد. ما همچنین گروه های تحت درمان با CDP و NC را راه اندازی کردیم. پس از درمان، سلول ها را با تریپسین بدون EDTA هضم کردیم و در لوله ها جمع آوری کردیم، سپس سلول ها را دو بار با PBS شستیم و مجدداً در 100 میکرولیتر PBS معلق کردیم. سلول ها با کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC مطابق پروتکل رنگ آمیزی شدند و با فلوسیتومتری (FCM) شناسایی شدند. برای تجزیه و تحلیل میزان آپوپتوز از نرم افزار FlowJo استفاده شد.

2.11|اندازه گیری ROS داخل سلولی

سلول‌ها در {0}}صفحه‌های چاهک کشت داده شدند و با غلظت‌های مختلف (0، 20، 40 و 80 میکروگرم در میلی‌لیتر) تیمار شدند.CDPبه مدت 24 ساعت، که ما H2O2 (غلظت نهایی: 50 0 میکرومتر برای HEMs، 1.0 میلی‌متر برای سلول‌های B16F10) را به هر چاه اضافه کردیم، آنها را برای 24 ساعت دیگر انکوبه کردیم و گروه‌های تیمار شده با CDP و NC را راه‌اندازی کردیم. پس از درمان، سلول ها را دو بار با PBS شستیم تا تمام محیط و FBS حذف شود، سپس پروب DCFH-DA را با محیط تا 1:1000 رقیق کردیم و به هر چاهک اضافه کردیم. سلول ها را در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه کردیم و سه بار با محیط بدون سرم شستیم. ما از یک استفاده کردیممیکروسکوپ فلورسانس معکوس برای مشاهده و ثبت فلورسانس، سپس از ImageJ برای اندازه گیری شدت فلورسانس استفاده کرد.

2.12|آمار و تجزیه و تحلیل

داده ها در این کار به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شده است و تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از GraphPad Prism (نسخه 7.0) یا SPSS (نسخه 22.{3}}) و Student's انجام شد. برای مقایسه چند گروهی از آزمون t یا آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) استفاده شد. مقدار خاکستری نوارهای پروتئین WB با GAPDH یا -اکتین استاندارد شد. مقادیر P <.05 معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" شد.="" تمام="" آزمایشات="" حداقل="" سه="" بار="" تکرار="">

3|نتایج

3.1|CDP ملانوژنز را در سلول های HEM و B16F10 القا کرد

قبل از شروع، ما از روش MTT برای بررسی سمیت سلولی بالقوه CDP بر روی سلول‌های HEM و ملانوم B16F10 موش استفاده کردیم. سلول ها تحت درمان قرار گرفتندCDPدر غلظت های مختلف به مدت 24، 48 یا 72 ساعت. آزمایش زنده ماندن HEM نشان داد که وقتی غلظت‌ها کمتر از 320 میکروگرم در میلی‌لیتر بود، CDP هیچ تأثیری بر زنده‌مانی سلول نداشت. با این حال، زنده ماندن به طور قابل توجهی کاهش یافت زیرا غلظت به 320 میکروگرم در میلی لیتر در 24، 48 و 72 ساعت رسید (P <.05؛ شکل="" 1a).="" زنده="" ماندن="" سلول="" های="" b16f10="" نیز="" در="" ساعت="" های="" 48="" و="" 72="" کاهش="">CDPبه 320 میکروگرم در میلی لیتر (P <.01) رسید="" اما="" در="" غلظت="" های="" پایین="" تر="" تغییری="" مشاهده="" نشد="" (شکل="" 1b).="" سپس="" به="" طور="" مقدماتی="" نقش="" cdp="" را="" بررسی="">ملانوژنزو اثرات آن را با اثرات هورمون محرک ملانوسیت (-MSH؛ غلظت: 20، 10 0 و 400 نانومتر) و DMSO (0.1 درصد) در HEM مقایسه کرد. نتایج رنگ‌آمیزی ملانین، فعالیت تیروزیناز و سنجش محتوای ملانین نشان داد که CDP برای ارتقای ملانوژنز با -MSH قابل مقایسه است، در حالی که تیمار 0.1 درصد DMSO هیچ تفاوتی نداشت (شکل S1).

بر این اساس اکتشاف خود را بیشتر اصلاح کردیم. HEM ها تحت درمان قرار گرفتندCDPدر غلظت های مختلف (20، 40 و 80 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 48 ساعت. رنگ آمیزی ملانین، محتوای ملانین و سنجش فعالیت تیروزیناز انجام شد، و همه افزایش قابل توجهی را پس از درمان CDP به روشی وابسته به غلظت نشان دادند که در گروه 80 ug/mL به اوج خود رسید (P <0.05، شکل="" 2a-c).="" سپس="" سطوح="" mrna="" و="" پروتئین="" را="" اندازه="" گیری="">ملانوژنزژن های مرتبط (MITF، TYR، TRP1، TRP2، RAB27A و FSCN1). CDP به طور قابل توجهی سطوح mRNA این ژن ها را در HEM ها افزایش داد (P <.05؛ شکل="" s2a).="" علاوه="" بر="" این،="" سطوح="" پروتئین‌های="" mitf،="" tyr،="" trp1،="" و="" rab27a="" افزایش="" یافت،="" همانطور="" که="" نسبت="" mitf="" فسفریله="" به="" کل="" mitf="" افزایش="" یافت="" (05/0="" p=""><)، در="" حالی="" که="" trp2="" و="" fscn1="" تفاوتی="" را="" نشان="" ندادند="" (شکل="" 2d,e).="" نتایج="" نشان="" داد="" که="" cdp="" می‌تواند="" ملانوژنز="" را="" ارتقا="" دهد="" و="" بیان="" ژن‌های="" مرتبط="" با="" ملانوژنز="" را="" در="" ملانوسیت‌های="" انسانی="" تنظیم="">

علاوه بر این، ما اثرات آن را دوباره تأیید کردیمCDPدوباره با سلول های B16F10 و دریافت که محتوای ملانین سلول های B16F10 به طور قابل توجهی افزایش یافته است (P <0.01؛ شکل="" s2b).="" علاوه="" بر="" این،="" cdp="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" سطوح="" mrna="" را="" افزایش="">ملانوژنزژن‌های مرتبط (P <.05؛ شکل S2C)، و سطوح پروتئین MITF، TYR، TRP1، TRP2، و RAB27A نیز پس از درمان CDP افزایش یافت (P <.05؛ شکل S2D-E).

شکل 1 سمیت سلولی CDP در سلول های HEM و B16F10.

3.2|CDP ملانوژنز را در گورخرماهی ترویج کرد

برای بررسی اینکه آیاCDPمی تواند ترویج کندملانوژنزدر داخل بدن از جنین گورخرماهی استفاده کردیم. جنین های گورخرماهی به چهار گروه تقسیم شدند و به طور مداوم با محیط به تنهایی (NC) یا CDP در غلظت های مختلف (20، 40 و 80 میکروگرم بر میلی لیتر) تیمار شدند. تراکم و توزیع گرانول ملانین هر روز مشاهده و ثبت شد. با رشد جنین گورخرماهی، متوجه شدیم که تراکم ملانین به تدریج در سر و دم افزایش می یابد. در روز سوم، تفاوت‌های بین گروهی قابل تشخیص بود و این تفاوت همچنان افزایش می‌یابد تا اینکه آزمایش را در روز ششم به پایان رساندیم (شکل 3A). ما از Image J برای اندازه گیری تراکم ملانین در دم گورخرماهی استفاده کردیم. چگالی ملانین در گروه های تحت درمان با CDP به طور قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود (P<0.05؛ شکل="">

3.3|CDP مسیر سیگنال MAPK را در سلول های HEM و B16F10 فعال کرد

برای آشکار ساختن مکانیسم هایی که توسط آنCDPارتقاء یافتملانوژنزما HEM ها را با CDP در غلظت های مختلف (20، 40 و 80 ug/mL) به مدت 48 ساعت درمان کردیم و سپس سطوح فسفریله و کل پروتئین های ERK، JNK و p38 را در مسیر سیگنالینگ MAPK بررسی کردیم. همانطور که توسط وسترن بلات اندازه گیری شد، سطوح p-ERK، p-JNK، و p-p38 پس از درمان CDP افزایش یافت (0.05 > P)، در حالی که سطوح کل آنها تغییر نکرد (شکل 4A، B). آزمایش‌ها با سلول‌های B16F10 تکرار شد و سطوح فسفریله پروتئین‌های ERK، JNK و p38 افزایش یافت (05/0 > P)، اما سطوح MAPK کل تغییر نکرد (شکل 4C، D)، مطابق با نتایج. در HEMs

3.4|سیتوتوکسیسیتی و آپوپتوز ناشی از H2O{3} ضعیف شده توسط CDP در سلول‌های HEM و B16F10

ما از H2O2 برای شبیه‌سازی محیط استرس اکسیداتیو استفاده کردیم و نقش CDP را در ملانوسیت‌ها تحت استرس اکسیداتیو بیشتر بررسی کردیم. غلظت نهایی H2O2 مورد استفاده در HEM ها 5{8}}0 میکرومتر بود، در حالی که در سلول های B16F10 1.0 میلی متر بود. برای بررسی اثر CDP بر سمیت سلولی ناشی از H2O، ما سلول‌های HEM و B16F10 را باCDPدر غلظت‌های مختلف (20، 40 و 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت، سپس H2O2 اضافه شد و قبل از انجام مشاهده و سنجش MTT به مدت 24 ساعت به درمان ادامه داد.

H2O2 باعث ایجاد حباب ظاهری غشاء و انقباض سلولی در HEMها شد، در گروه‌های تحت درمان با CDP، وضعیت کاهش یافت. درمان با CDP به تنهایی هیچ تاثیری نداشت (شکل 5A). سنجش MTT نتیجه مشابهی را نشان داد که درمان H2O2 باعث کاهش زنده ماندن HEM شد، در حالی که CDP به طور قابل توجهی این تأثیر مضر را بهبود بخشید (01/0>P). درمان باCDPبه تنهایی هیچ تفاوتی نداشت (شکل 5C). سپس دوباره اثر محافظتی را در سلول‌های B16F10 تأیید کردیم. تیمار H2O2 باعث ایجاد حباب ظاهری غشاء و انقباض سلولی شد، در حالی که شرایط نامطلوب نیز توسط CDP در سلول‌های B16F10 بهبود یافت (شکل 5B). در همین حال، سنجش MTT نشان داد که زنده ماندن سلول های B16F10 پس از درمان H2O2 کاهش یافت، اما وضعیت به طور قابل توجهی در گروه های تحت درمان با CDP بهبود یافت (P <0.05؛ شکل="">

علاوه بر این، ما از FCM برای اندازه‌گیری آپوپتوز ناشی از H2O{1} در سلول‌های HEM و B16F10 استفاده کردیم. نتایج نشان داد که H2O2 باعث آپوپتوز قابل توجهی در سلول های HEM و B16F10 می شود، اما پیش تیمار باCDPدر غلظت های مختلف می تواند آپوپتوز را به طور قابل توجهی کاهش دهد. در غیر این صورت، درمان CDP به تنهایی هیچ تفاوتی ایجاد نمی کند (شکل 5E، F). نرخ آپوپتوز پس از درمان H2O2 افزایش یافت، اما در گروه‌های تحت درمان با CDP کاهش یافت، این تغییر در سلول‌های HEM و B16F10 معنی‌دار بود (P <0.05، شکل="" 5g،="">

شکل 2 CDP ملانوژنز را در HEM ها ترویج می کند.

3.5|ROS درون سلولی ناشی از H2O{3}}در سلول‌های HEM و B16F10 حذف شده توسط CDP

برای بررسی مکانیسم هایCDPبرای کاهش سمیت سلولی و آپوپتوز ناشی از H2O، ما ROS داخل سلولی را در سلول‌های HEM و B16F10 با استفاده از پروب فلورسانس DCFH-DA شناسایی کردیم. تیمارها همان بودند که در بالا توضیح داده شد، شدت فلورسانس برای نشان دادن سطح ROS اندازه گیری شد. همانطور که در HEM مشاهده کردیم، تیمار H2O2 در بالا بردن ROS موثر بود، اما CDP به طور قابل توجهی ROS داخل سلولی را در گروه‌های تحت درمان با H2O{8}} از بین برد (P <0.01؛ شکل="" 6a,="" c).="" علاوه="" بر="" این،="" استفاده="" از="" cdp="" به="" تنهایی="" هیچ="" تفاوتی="" نداشت.="" ما="" نتایج="" را="" در="" سلول="" های="" b16f10="" مجدداً="" تأیید="" کردیم.="" در="" سلول="" های="" b16f10،="" تیمار="" با="" cdp="" به="" تنهایی="" بر="" سطح="" ros="" تأثیری="" نداشت،="" در="" حالی="" که="" تیمار="" h2o2="" سطح="" ros="" را="" به="" وضوح="" افزایش="" داد،="" اما="" این="" تغییر="" نیز="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" با="" پیش="" تیمار="" cdp="" کاهش="" یافت="" (p=""><0.05؛ شکل="" 6b،="">

3.6|مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{4}} با تنظیم بالا در ملانوسیت ها

برای آشکارسازی بیشتر مکانیسم‌هایی که توسط آن‌ها CDP ROS را پاکسازی می‌کند، ابتدا سطح پروتئین مسیر آنتی‌اکسیدانی NRF2/HO{1}} را در سلول‌های B16F10 اندازه‌گیری کردیم. ما دریافتیم که درمان با CDP به تنهایی تأثیر معنی‌داری بر پروتئین‌های NRF2 و HO-1 ندارد، اما در گروه‌های تحت درمان با H2O، سطح این دو پروتئین به‌طور معنی‌داری افزایش یافت.CDPپیش درمانی ارتفاع را بیشتر افزایش داد (ص<.05; figure="" s3).="" moreover,="" we="" investigated="" the="" protein="" levels="" of="" nrf2="" and="" ho-1="" in="" hems="" after="" h2o2="" and/or="" cdp="" treatment.="" the="" results="" showed="" that="" ho-1="" level="" was="" elevated="" in="" h2o2-treated="" groups,="" and="" further="" increased="" in="" cdp="" pretreatment="" groups=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" to="" know="" the="" distribution="" of="" nrf2,="" we="" compared="" the="" level="" of="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" with="" the="" total="" level="" of="" β-actin="" in="" hems.="" similarly,="" we="" found="" that="" both="" nuclear="" and="" cytoplasmic="" nrf2="" were="" elevated="" under="" h2o2="" treatment;="" their="" levels="" further="" increased="" in="" the="" cdp="" pretreated="" groups.="" based="" on="" that,="" we="" calculated="" the="" ratio="" of="" nuclear="" nrf2="" to="" cytoplasmic="" nrf2.="" the="" result="" suggested="" that="" cdp="" increased="" the="" ratio="" significantly="" at="" concentrations="" of="" 40="" and="" 80="" μg/ml=""><.05; figure="" 7a,="" b).="" using="" immunofluorescence,="" we="" observed="" the="" fluorescence="" of="" nrf2="" in="" hems="" and="" knew="" that,="" under="" h2o2="" treatment,="" the="" nucleus="" seemed="" to="" have="" expanded="" and="" the="" levels="" of="" nrf2="" in="" the="" nucleus="" and="" cytoplasm="" were="" enhanced.="" among="" them,="" the="" cells="" pretreated="" with="">CDPتفاوت‌هایی را نشان داد، زیرا می‌توانیم ببینیم که فلورسانس در هسته قوی‌تر از سیتوپلاسم بود، و توزیع در سه غلظت CDP نزدیک بود (شکل 7C).

شکل 3 CDP باعث افزایش ملانوژنز در گورخرماهی می شود.

4|بحث و نتایج

در این مطالعه به بررسی نقشCDPدر سلول های HEM و B16F10. برای اولین بار، ما دریافتیم که CDP می تواند ملانوژنز را در ملانوسیت ها ترویج کند و رنگدانه را در گورخرماهی تقویت کند. آزمایش بعدی نشان داد که مسیر سیگنالینگ MAPK تحت درمان CDP فعال شد. ما نقش آن را بیشتر بررسی کردیماسترس اکسیداتیوو دریافت که CDP می تواند سمیت سلولی و آپوپتوز ناشی از H2O2- را در ملانوسیت ها کاهش دهد. در همین حال، CDP می تواند مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{3}} را فعال کند و ROS درون سلولی را تحت شرایط استرس اکسیداتیو حذف کند.

پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن یک مسیر حیاتی است که در تنظیم MITF، یک فاکتور رونویسی کلیدی که بیانملانوژنزژن‌های مرتبط و متعاقباً بر سنتز و انتقال ملانین تأثیر می‌گذارد. 26،27 در مطالعه ما، فعال‌سازی ERK، JNK و p38 در ملانوسیت‌ها پس از درمان CDP به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافت. در همین حال، عبارات MITF/p-MITF و TYR، TRP1، TRP2، و RAB27A مبتنی بر MITF بر این اساس تنظیم شدند. بنابراین، ما پیشنهاد می کنیم که CDP می تواند ترویج کندملانوژنزاز طریق فعال کردن مسیر MAPK، اما چگونهCDPMAPK ها را فعال می کند ناشناخته باقی می ماند. بر اساس مطالعات اخیر، گیرنده شبه 4 (TLR4) به میزان زیادی در ملانوسیت ها بیان می شود و درملانوژنز0.28،29 TLR4 یک پروتئین گذرنده مهم است که می تواند به طور خاص لیپوپلی ساکارید (LPS)30 را متصل کند. مطالعات گزارش کردند که LPS می تواند ملانوژنز را القا کند. جالب توجه است که چندین پلی ساکارید استخراج شده از گیاهان یا قارچ ها، طبق گزارشات، TLR و مسیرهای سیگنال دهی پایین دستی مانند MAPK و فاکتور هسته ای کاپا بتا (NF-κB) را فعال می کنند.CDPمی تواند توسط TLR ها شناسایی و محدود شود، سپس مسیر سیگنالینگ MAPK پایین دست را فعال کرده وملانوژنز. علاوه بر این، گیرنده‌های شبه دامنه الیگومریزاسیون متصل شونده به نوکلئوتید (NLRs) شناخته شده‌اند که لیگاندهای داخل سلولی را شناسایی کرده و باعث فعال‌سازی مسیرهای سیگنالینگ MAPK و NF-kB می‌شوند. همانطور که گزارش شده است، پلی ساکاریدهای استخراج‌شده از گانودرما لوسیدوم و گون می‌توانند وارد سلول شوند. و NLRs را تحت تأثیر قرار می دهد. بنابراین، ممکن است CDP بتواند وارد ملانوسیت ها شود و مسیر سیگنال دهی MAPK را از طریق NLR ها تنظیم کند. با این حال، مطالعات بیشتری برای تأیید این فرضیه مورد نیاز است.

برخی از مطالعات تا به امروز، کاربرد پلی ساکاریدهای گیاهی در ملانوژنز را برای مهار تولید ملانین گزارش کرده اند. با این حال، در این مطالعه،CDPارتقاء یافتملانوژنزدر ملانوسیت ها، و این اثر پس از مقایسه با -MSH بیشتر تایید شد. CDP همچنین نوعی پلی ساکارید استخراج شده از گیاهان است، ما گمان می کنیم که اثر متضاد CDP ممکن است مربوط به تفاوت های ساختاری بین CDP و سایر پلی ساکاریدها باشد. پلی ساکاریدها از پلیمریزاسیون مونوساکاریدها تشکیل می شوند، اما از نظر نوع مونوساکارید، ترکیب مونو ساکارید، پیوند گلیکوزیدی، ساختار زنجیره جانبی و وزن مولکولی متغیر هستند. تصور می شود که این عوامل عملکردهای بیولوژیکی آنها را تعیین می کنندCDPو پیشنهاد کرد که ساختار CDP متعاقباً بر عملکرد آن تأثیر می گذارد. بنابراین، برای درک کامل CDP و تأیید فرضیه ما، به شواهد بیشتری نیاز است.

ملانوژنزیک مکانیسم حفاظتی مهم برای مقاومت در برابر آسیب اشعه ماوراء بنفش و حفظ هموستاز بدن است. در عین حال، ملانوسیت ها به راحتی در معرض محیط های نامطلوب مانند اضافه بار ROS قرار می گیرند.11 مشخص است که ROS در ترویج ملانوژنز مشارکت دارد، یکی از مکانیسم ها فعال کردن MAPK ها است. سطح، در حالی که اضافه بار ROS مختل می شودملانوژنزرابطه بین ROS، MAPK، و ملانوژنز تحت شرایط مختلف متغیر است، بنابراین، تعادل بین سیستم های پرو و ​​آنتی اکسیدان به وضوح مهم است. در بیماری های رنگدانه مانند ویتیلیگو، یک سیستم آنتی اکسیدانی نامتعادل و اضافه بار غیرقابل کنترل ROS به ملانوسیت ها آسیب می رساند و زنده ماندن سلولی را کاهش می دهد. H2O2 نسبت به سلول های B16F10. هنگامی که ملانوسیت ها تحت درمان H2O2 قرار گرفتند، میزان زنده ماندن و آپوپتوز آنها بدتر شد، اما پیش تیمار CDP می تواند تا حدی روند را معکوس کند. در همان زمان، ROS پاکسازی شد. همانطور که گزارش شد، فعال‌سازی مسیر آنتی‌اکسیداسیون NRF2/ARE یک روش اصلی برای مهار ROS در سلول‌های پوست است. در آزمایش‌های ما، سطح پروتئین NRF2 و HO{16}} در ملانوسیت‌ها پس از درمان H2O2 بدون CDP تنظیم شد. این بدان معناست که H2O{21}}القا شده استاسترس اکسیداتیومی تواند مسیر NRF2/HO{1}} را فعال کند، اما برای حفظ تعادل اکسیداسیون و کاهش و محافظت از سلول در برابر آسیب کافی نیست. با این حال، پیش تیمار CDP مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{3}} را افزایش داد و تعادل را بازیابی کرد. بنابراین، ما پیشنهاد می‌کنیم که CDP می‌تواند ملانوسیت‌ها را از طریق فعال کردن مسیر آنتی‌اکسیداسیون NRF2/HO{5}} و حذف ROS از آسیب‌های استرس اکسیداتیو محافظت کند.

این محصول ماست

برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید.

ما آن را پیدا کردیمCDPدرمان به تنهایی تأثیری بر ROS یا NRF2/HO{1}} در ملانوسیت ها ندارد. این نتیجه نشان می دهد که CDP می تواند تعادل ردوکس را تحت تاثیر قرار دهداسترس اکسیداتیو، اما نه در شرایط عادی. علاوه بر این، مسیر آنتی اکسیداسیون NRF2/HO-1 طبق گزارشات توسط مسیرهای سیگنالینگ PI3K، NF-kB، و MAPK تنظیم می شود. 47،48 در مطالعه ما، CDP توانست مسیر سیگنالینگ MAPK را فعال کند. این امکان وجود دارد که CDP بتواند مسیر NRF2/HO{7}} را از طریق MAPKهای تنظیم کننده بالا فعال کند. همانطور که اسلومینسکی گزارش کرد، ملانوسیت ها حسگرهای استرس هستند که در یک شبکه تنظیمی دخیل هستند و عملکرد آنها می تواند به سرعت در پاسخ به محیط تغییر کند.ملانوژنزبدون تأثیر بر سیستم آنتی اکسیدانی در شرایط عادی، اما تعادل ردوکس را در شرایط استرس اکسیداتیو بازیابی می کند. بنابراین، عملکرد ملانوسیت و بقا را می توان به دو روش مختلف توسط CDP حفظ کرد. CDP به ملانوسیت ها کمک می کند تا هموستاز را حفظ کنند، که این نیز یک عملکرد مهم استملانوژنز.50,51

در نتیجه،CDPمی تواند ملانوژنز ملانوسیت ها را از طریق فعال کردن مسیر سیگنالینگ MAPK ترویج کند. CDP می تواند بقای ملانوسیت ها را از طریق فعال کردن مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{1}} و حذف ROS داخل سلولی تحتاسترس اکسیداتیوشرایط یافته‌های ما معنادار هستند زیرا نشان می‌دهند که CDP می‌تواند هر دو را ارتقا دهدملانوژنزو ملانوسیت ها را از آسیب استرس اکسیداتیو محافظت می کند، که احتمالاً مسئول اختلال عملکرد و از بین رفتن ملانوسیت است. یافته‌های این مطالعه نشان می‌دهد که CDP می‌تواند یک داروی جدید در درمان بیماری‌های دپیگمانتاسیون باشد.