گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche Tubulosa از طریق مسیر وابسته به میتوکندری باعث ایجاد آپوپتوز در سلول های Eca-109 می شوند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

CHANGSHUANG FU، JINYU LI، ADILA AIPIRE، LIJIE XIA، YI YANG، QIUYAN CHEN، JIE LV، XINHUI WANG و JINYAO LI

خلاصه

Cistanche tubulosaعملکردهای بیولوژیکی مختلفی دارد. در مطالعه حاضر، اثر ضد توموری گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی محلول در آب C. tubulosa (CTPG-W) بر سرطان مری بررسی شد. سلول های Eca{2}} با CTPG-W تیمار شدند و زنده ماندن سلول ها با روش MTT اندازه گیری شد. آپوپتوز، چرخه سلولی، پتانسیل غشای میتوکندری (Δψm)، و گونه های اکسیژن فعال توسط فلوسیتومتری تجزیه و تحلیل شد. سطح پروتئین ها در مسیرهای آپوپتوز توسط آنالیز وسترن بلات شناسایی شد. مشخص شد که CTPG-W از طریق القای آپوپتوز و توقف چرخه سلولی، زنده ماندن سلول های Eca{4} را به طور قابل توجهی کاهش می دهد. پس از درمان CTPG-W، Δψm Eca{6}} به طور قابل توجهی کاهش یافت، که با سطوح بالای تنظیم شده لنفوم سلول B (Bcl{9}}) مرتبط با X و سطوح پایین‌تنظیم شده مرتبط است. از Bcl{11}}. در نتیجه، سطوح سیتوکروم c و c-Jun NH{13}}ترمینال کیناز افزایش یافت، که سطح پلیمراز پلی‌شکاف (ADP-ribose) و کاسپاز شکافته{17}}، {{18} را افزایش داد. } و -9، اما نه کاسپاز-8. به همین ترتیب، سطوح گونه‌های اکسیژن فعال در سلول‌های Eca{21}} تغییرات قابل‌توجهی را نشان داد. این نتایج نشان داد که CTPG-W آپوپتوز سلول‌های Eca{23}} را از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری القا می‌کند.

مقدمه

سرطان مری یکی از شایع ترین انواع سرطان با یازدهمین میزان مرگ و میر و ششمین میزان مرگ و میر در سطح جهان است و باعث 439،{3}} مرگ و میر در سال 2015 شده است (1). بروز سرطان مری به طور قابل توجهی در بین مناطق مختلف متفاوت است، به طوری که آسیای شرقی و شرق و جنوب آفریقا بالاترین میزان بروز و غرب آفریقا کمترین میزان را در سال 2012 نشان دادند (1،2). در چین، موارد تخمینی سرطان مری و مرگ و میر به ترتیب 477،{10}} و 375{12}} در سال 2015 بود (3). اگرچه میزان عوارض سرطان مری در کشورهای با شاخص اجتماعی جمعیت‌شناختی متوسط ​​و متوسط ​​بین سال‌های 2005 تا 2015 کاهش یافته است، اما به دلیل پیش‌آگهی ضعیف، میزان مرگ و میر همچنان بالاست (1،4). ترکیب برداشتن جراحی با شیمی درمانی یا رادیوتراپی برای درمان سرطان مری استفاده شده است، اما گزارش شده است که بین سال‌های 2003 و 2014 میزان بقای سالانه 5- باقی مانده است.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">

طب گیاهی سنتی چینی (CHM) برای درمان انواع سرطان، از جمله سرطان ریه سلول غیر کوچک (6)، سرطان کولورکتال (7)، کارسینوم کبدی (8) استفاده شده است. اخیراً، کارآزمایی‌های بالینی گزارش کرده‌اند که ترکیب CHM با شیمی‌درمانی یا رادیوتراپی نه تنها تعدادی از فواید را بر کیفیت زندگی و کاهش عوارض جانبی ناشی از شیمی‌درمانی یا رادیوتراپی نشان می‌دهد (9،10)، بلکه میزان بقای بیماران را نیز بهبود می‌بخشد. با سرطان سلول غیر کوچک ریه، کبد، معده، روده بزرگ، نازوفارنکس یا دهانه رحم (9). با این حال، شواهد متناقضی در مورد اثربخشی درمان CHM بر سرطان مری وجود دارد (10،11). مطالعات متعدد مشخص کردند که تعدادی از داروها یا اجزای گیاهی می توانند رشد سلول های سرطانی مری را در شرایط in vitro و in vivo مهار کنند، از جمله Andrographis paniculata (12،13)، Daikenchuto (14)، ایکاریین (15)، Rosa Roxburghii Tratt و Fagopyrum. Cymosum (16)، Jaridonin (17)، Marsdenia tenacissima (18)، OP16 (یک دیترپنوئید جدید ent-kaurene) (19)، Qigesan (20) و جوشانده Tonglian (21). سیستانچ نوعی CHM است و عملکردهای بیولوژیکی مختلفی از جمله ضد اکسیداسیون، ضد التهاب و محافظت عصبی را اعمال می کند (22،23). مطالعه قبلی ما این را نشان دادگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche tubulosa(CTPG) می‌تواند رشد ملانوم B16-سلول‌های F10 را در شرایط in vitro و in vivo سرکوب کند (24). با این حال، حلالیت ضعیف CTPG در آب که قبلاً استفاده می شد، توسعه دارو را محدود می کند (24). بنابراین از CTPG محلول در آب (CTPG-W) استفاده شد و اثر ضد توموری روی سلول‌های سرطانی مری (Eca-109) بررسی شد. مشخص شد که CTPG-W می تواند به طور وابسته به دوز از زنده ماندن سلول های Eca{9}} از طریق القای آپوپتوز از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری جلوگیری کند.

مواد و روش ها حیوانات.

موش ماده C57BL/6 (6-8 هفته، ~25 گرم) از مرکز تحقیقات حیوانات آزمایشگاهی پکن (پکن، چین) خریداری شد و در دمای کنترل شده (25 درجه سانتیگراد)، چرخه نور (12/12) نگهداری شد. 12) مرکز حیوانات دانشگاه سین کیانگ (اورومچی، چین). همه حیوانات آب و غذای بدون پاتوژن دریافت کردند.

خط سلولی و کشت. رده سلولی سرطان مری انسانی (Eca-109) توسط آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین کیانگ (کالج علوم و فناوری زندگی، دانشگاه سین کیانگ، ارومچی، چین) حفظ و در RPMI کشت داده شد{{1} } محیط (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) تکمیل شده با 10 درصد سرم جنین گاوی غیرفعال شده با حرارت (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1 درصد L گلوتامین (100 میلی‌مولار)، 100 واحد بر میلی‌لیتر پنی‌سیلین و 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در اتمسفر مرطوب حاوی 5 درصد CO2.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC). CTPG-W (شماره Cat. SGJG2{10}}170410) از Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (شانگهای، چین) خریداری شد. طبق مطالعه قبلی ما، ترکیبات اصلی CTPG توسط HPLC تعیین و کمیت شدند (24). به طور خلاصه، HPLC بر روی ستون ZORBAX SB‑C18 (250x4.6 میلی متر؛ 5 میکرومتر) در دمای 30 درجه سانتی گراد انجام شد و با محلول اسید فرمیک 0.2 درصد و گرادیان متانول که از 23 درصد شروع می شد، شستشو داده شد، زیرا هر دقیقه 1 میلی لیتر اضافه می شد. به مدت 45 دقیقه تا رسیدن به 31 درصد. در مجموع 10 میکرولیتر نمونه تزریق شد و در 330 نانومتر شناسایی شد. استاندارد اکیناکوزید از Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (شانگهای، چین) و استاندارد acteoside از Sigma-Aldrich (Merck KGaA، دارمشتات، آلمان) خریداری شد. از استانداردها برای تجزیه و تحلیل اجزای CTPG-W استفاده شد.

سنجش MTT تکثیر سلولی با روش MTT اندازه گیری شد. سلول‌های Eca{0}} در 96-صفحه‌های چاهکی با تراکم 5x1{14}}3 سلول در 1{21}}{27}} میکرولیتر RPMI تلقیح شدند. }} محیط / چاه و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت کشت، سپس با غلظت های مختلف (0، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم در میلی لیتر) CTPG-W یا 0.4 درصد دی متیل سولفوکسید (DMSO) به مدت 24 ساعت، تیمار شد. ساعت 48 و 72 DMSO به عنوان شاهد حلال (800 میکروگرم در میلی لیتر CTPG-W حاوی 0.4 درصد DMSO) استفاده شد. سیس پلاتین (20 میکروگرم بر میلی لیتر) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. پس از آن، مایع رویی پس از سانتریفیوژ در 225 xg به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق دور ریخته شد و 100 میکرولیتر محلول MTT (0.5 میلی گرم در میلی لیتر در محیط RPMI{29}} بدون FBS) به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. به مدت 3 ساعت بلورهای فرمازان تشکیل شده در 200 میکرولیتر DMSO حل شدند. مقادیر چگالی نوری (OD) در طول موج 490 نانومتر توسط یک میکروپلیت خوان {{34} چاه (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) اندازه گیری شد. زنده ماندن نسبی سلول طبق فرمول محاسبه شد: زنده ماندن سلولی ( درصد ){36}}(ODtreated/ODuntreated)x100 درصد. مورفولوژی سلول های Eca-109 با یک میکروسکوپ فلورسانس معکوس (بزرگنمایی، x200) مشاهده شد (Nikon Eclipse Ti-E؛ Nikon Corporation، توکیو، ژاپن).

برای تکثیر سلول‌های طحال، موش‌های C57BL/6 با دررفتگی دهانه رحم کشته شدند و طحال‌ها جدا شدند. سوسپانسیون تک سلولی ساخته شد و اسپلنوسیت ها در 96-صفحه های چاهکی با تراکم 1×105 سلول در چاهک در محیط 100 میکرولیتر RPMI-1640 کاشته شدند و سپس با غلظت های مختلف تیمار شدند. (0، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم بر میلی لیتر) CTPG-W به مدت 24، 48 و 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد CO2. تکثیر سلول های طحال طبق پروتکل فوق با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. شاخص محرک{20}}ODtreated/ODuntreated.

اندازه گیری آپوپتوز و چرخه سلولی سلول های Eca{{0}} در ظروف 6{12}} میلی متری با تراکم 2.5x1{27}}5 سلول در ظرف به مدت 24 ساعت کشت و با غلظت های مختلف تیمار شدند ({31} }، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم در میلی لیتر) CTPG-W یا 0.4 درصد DMSO به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2. طبق پروتکل‌های سازنده، سلول‌ها با کیت تشخیص آپوپتوز انکسین وی-فلورسین ایزوتیوسیانات (FITC)/یدید پروپیدیوم (PI) (شرکت بیوتکنولوژی شانگهای شنگ‌شنگ، شانگهای، چین) رنگ‌آمیزی شدند. نمونه‌ها با فلوسایتومتری (BD FACSCalibur؛ BD Biosciences، Franklin Lakes، NJ، ایالات متحده) جمع‌آوری شدند و توسط FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) آنالیز شدند. برای تجزیه و تحلیل اثر CTPG-W بر چرخه سلولی، سلول های 2.5x105 Eca در ظروف کشت 60 میلی متری کاشته شدند و با CTPG-W (0، 100، 200 و 400 میکروگرم در میلی لیتر) یا 0.4 تیمار شدند. درصد DMSO به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2. تمام سلول ها برداشت و دو بار با PBS سرد یخی (Gibco؛ Thermo Fisher Scientific, Inc.) شسته شدند، سپس در اتانول سرد 70 درصد در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه ثابت شدند. پس از دو بار شستشو با PBS سرد، سلول‌ها در 300 میکرولیتر بافر رنگ‌آمیزی PI/RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق مجدداً معلق شدند. توزیع چرخه سلولی با نرم افزار ModFit LT 3.0 توسط فلوسایتومتری (BD FACSCalibur) آنالیز شد.

تجزیه و تحلیل پتانسیل غشای میتوکندری (Δψm) و گونه های اکسیژن فعال (ROS). برای تجزیه و تحلیل Δψm، سلول های Eca{{0}} با CTPG-W (0، 4{23}}0، 600 و 800 میکروگرم در میلی لیتر) یا 0.4 درصد DMSO برای 24 تیمار شدند. ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد با 5 درصد CO2، و رنگ آمیزی با کیت سنجش پتانسیل غشای میتوکندری با JC{12}} (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime، شانگهای، چین)، طبق پروتکل سازنده، به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد . پس از دو بار شستشو با بافر شستشوی JC{15} (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime)، نمونه‌ها با 300 میکرولیتر بافر شستشوی JC-1 معلق شدند و با فلوسیتومتری (BD FACSCalibur) آنالیز شدند. فلورسانس رنگ JC-1 در سلول های Eca-109 نیز با میکروسکوپ فلورسانس معکوس مشاهده شد (بزرگنمایی، x200؛ Nikon Eclipse Ti-E). برای تجزیه و تحلیل ROS، سلول‌های Eca با CTPG-W (0، 400، 600 و 800 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 2، 4، 6، 12 و 24 ساعت تیمار شدند و با گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر رنگ‌آمیزی شدند. کیت سنجش (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime)، طبق پروتکل سازنده، به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد. پس از سه بار شستشو با PBS سرد، نمونه ها با فلوسیتومتری (BD FACSCalibur) جمع آوری و توسط نرم افزار FlowJo 7.6 تجزیه و تحلیل شدند.

فعالیت مهار رادیکال 2،2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل (DPPH). فعالیت مهار رادیکال آزاد CTPG-W با سنجش رادیکال آزاد DPPH مطابق پروتکل منتشر شده با یک اصلاح جزئی تعیین شد، زیرا متانول با اتانول جایگزین شد تا DPPH را حل کند (25،26). برای اندازه‌گیری‌های حالت پایدار، 150 میکرولیتر DPPH (100 mmol/l) در اتانول با غلظت‌های مختلف CTPG-W (25، 50، 75، 100، 250، 300، 400، 500 و 600 میکروگرم بر میلی لیتر) در 50 میکرولیتر PBS، و در تاریکی به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. جذب در 517 نانومتر در حضور و غیاب CTPG-W تشخیص داده شد. در مجموع 50 میکرولیتر ویتامین C به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. فعالیت مهار رادیکال DPPH با استفاده از فرمول محاسبه شد: Scavenging ( درصد )=[1-(A sample-Ablank)/A0] x100، که در آن Ablank جذب کنترل است (بدون DPPH)، یک نمونه جذب نمونه و A0 جذب PBS با DPPH است.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات سلول های Eca{0}} با CTPG-W (0، 200، 600 میکروگرم در میلی لیتر) یا 0.4 درصد DMSO به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2 تیمار شدند. شستشوی زیر دو بار با PBS، سلول‌ها در بافر Lysis Assay Radioimmunoprecipitation (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, China) به مدت 20 دقیقه روی یخ لیز شدند. پس از سانتریفیوژ در 10،{13}} xg به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، مواد رویی جمع آوری شد و غلظت پروتئین با کیت اسید بیسینکونیک (Thermo Fisher Scientific, Inc.) مطابق پروتکل های سازنده تشخیص داده شد. تجزیه و تحلیل وسترن بلات طبق توضیحات قبلی ما انجام شد (24). آنتی‌بادی‌ها علیه کاسپاز{17}} (گروه شماره D120077)، کاسپاز{19}} (شماره گربه D155240)، کاسپاز{21}} (شماره گربه D220078)، لنفوم سلول B{ {24}} (Bcl-2) مرتبط با X (Bax) (شماره گربه D220073) و Bcl-2 (گروه شماره D260117)، و ضد IgG-پراکسیداز ترب کوهی موش (HRP) ) (cat. No. D111050) و anti-rabbit IgG-HRP (cat. No. D110058) از BBI Life Sciences (شانگهای، چین) خریداری شد. آنتی‌بادی‌ها علیه کاسپاز{36}} (گروه شماره E-AB-10050) و کاسپاز فعال-3 (شماره گربه E-AB-22115) از Elabscience خریداری شدند. ووهان، چین). سایر آنتی بادی ها علیه کاسپاز{42}} (گروه شماره 9492)، پلی (ADP-ribose) پلیمراز (PARP) (شماره گربه 9542)، سیتوکروم c (cat. no. AC909)، c-Jun NH{ {48}}ترمینال کیناز (JNK) (گروه شماره 9252S)، و -اکتین (گروه شماره 58169) از Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) به دست آمد. همه آنتی‌بادی‌های اولیه و ثانویه به نسبت 1:1 رقیق شدند{54}}. آنتی بادی های اولیه در دمای 4 درجه سانتیگراد در طول شب و آنتی بادی های ثانویه در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت انکوبه شدند.

طبق پروتکل سازنده، پروتئین های هدف با استفاده از کیت سنجش نورتابی شیمیایی تقویت شده (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) شناسایی شدند.

تحلیل آماری. معنی‌داری آماری با استفاده از تحلیل واریانس یک‌طرفه با آزمون تعقیبی توکی محاسبه شد و نتایج با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism 5.{2}} (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) در بین گروه‌های درمان و کنترل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تمام داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شد. پ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche tubulosa(CTPG)

نتایج

CTPG-W رشد سلول های Eca-109 را سرکوب می کند. اجزای CTPG-W توسط HPLC (شکل 1) واجد شرایط و کمی سازی شدند که با استانداردهای اکیناکوزید و آکتئوزید مقایسه شدند. با توجه به زمان نگهداری پیک و نواحی پیک، CTPG-W حاوی 16/39 درصد اکیناکوزید و 44/2 درصد اکتئوزید بود. در ابتدا، اثر CTPG-W بر زنده ماندن سلول های Eca{9}} با روش MTT تعیین شد. CTPG-W در DMSO با 200 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر حل شد و با محیط RPMI حاوی 10 درصد FBS غیرفعال شده با حرارت تا غلظت‌های مشخص شده رقیق شد. سلول‌های Eca با CTPG-W تیمار شدند و زنده‌مانی سلول‌ها با سنجش MTT در زمان‌های مشخص شده آنالیز شد. درمان CTPG-W به طور قابل توجهی زنده ماندن سلول های Eca را به روشی وابسته به دوز و زمان کاهش داد (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">

CTPG-W باعث القای آپوپتوز در سلول های Eca-109 می شود. برای بررسی اینکه آیا CTPG-W رشد سلول های Eca{2}} را از طریق القای آپوپتوز یا نکروز سرکوب می کند، سلول ها با غلظت های مختلف CTPG-W تیمار شدند. پس از 24 ساعت، آپوپتوز و نکروز سلول های Eca با رنگ آمیزی Annexin V/PI شناسایی شد. همانطور که در شکل 3A نشان داده شده است، سلول های Annexin V-/PI plus به عنوان سلول های نکروزه دربندی شدند، و Annexin V به اضافه /PI plus و Annexin V به علاوه /PI- سلول ها به عنوان سلول های آپوپتوز در نظر گرفته شدند. CTPG-W اساساً آپوپتوز سلول‌های Eca{10}} را به روشی وابسته به دوز القا کرد، اگرچه سلول‌های نکروزه Eca{12}} نیز تحت تیمار 600 و 800 میکروگرم بر میلی‌لیتر CTPG-W به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">

CTPG-W باعث توقف چرخه سلولی در فاز S در سلول‌های Eca-109 می‌شود. اختلال در چرخه سلولی سرطان باعث سرکوب رشد سلولی و ترویج آپوپتوز می شود (27). توزیع چرخه سلولی در سلول‌های Eca{2}} با رنگ‌آمیزی PI پس از درمان CTPG-W به مدت 24 ساعت شناسایی شد. مشاهده شد که سلول‌های فاز S افزایش یافتند و سلول‌های فاز G0/G1 کاهش کلی قابل‌توجهی را پس از تیمار CTPG-W نشان دادند (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">

CTPG-W Δψm را کاهش می دهد و باعث آزاد شدن سیتوکروم c می شود. آپوپتوز می تواند توسط یک مسیر وابسته به میتوکندری القا شود (28،29). اعضای طرفدار و ضد آپوپتوز خانواده پروتئین BCL نقش مهمی در تنظیم یکپارچگی غشای میتوکندری ایفا می کنند (30،31). پس از درمان CTPG-W به مدت 24 ساعت، Δψm با استفاده از رنگ آمیزی JC-1 ارزیابی شد. دانه های JC-1 (فلورسانس قرمز شناسایی شده در FL-2) به مونومر متلاشی می شود (فلورسانس سبز در FL-1) هنگامی که Δψm در حال کاهش است (32). همانطور که در شکل 5A نشان داده شده است، فرکانس سلول های FL-1 به علاوه FL-2-/ پلاس به طور قابل توجهی به صورت وابسته به دوز افزایش یافته است، که نشان می دهد Δψm سلول های Eca-109 کاهش یافته است. تغییرات فلورسانس در سلول های Eca-109 نیز با میکروسکوپ فلورسانس معکوس مشاهده شد (شکل 5B). با افزایش غلظت CTPG-W، فلورسانس قرمز کاهش و فلورسانس سبز افزایش یافت، که با داده‌های فلوسیتومتری مطابقت دارد. همچنین مشاهده شد که سطح سیتوکروم c در سیتوزول به طور قابل توجهی افزایش یافته است (شکل 5C)، که در نتیجه کاهش Δψm است. این نتیجه گیری از افزایش تعداد FL-1 به علاوه FL{-2-/به علاوه سلول‌هایی را که Δψm در نتیجه درمان CTPG-W کاهش یافت، تقویت می‌کند. گزارش شده است که JNK می تواند فعال شدن خانواده پروتئین BCL{25}} را که باعث آزادسازی سیتوکروم c (33-35) می شود، تنظیم کند. همچنین مشخص شد که سطح JNK به طور قابل توجهی به دنبال درمان CTPG-W تنظیم شد (شکل 5C). نتایج نشان داد که CTPG-W ممکن است آپوپتوز سلول های Eca{30}} را از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری القا کند.

تأثیر CTPG-W بر تولید ROS داخل سلولی. ROS می تواند Δψm را برای القای آپوپتوز کاهش دهد (36). برای بررسی اینکه آیا CTPG-W می تواند تولید ROS را افزایش دهد، سلول های Eca{2}} با غلظت های مختلف CTPG-W تیمار شدند. سلول ها در نقاط زمانی مشخص شده جمع آوری و با DCFH-DA رنگ آمیزی شدند. تولید ROS داخل سلولی در سلولهای Eca با استفاده از فلوسیتومتری تعیین شد. همانطور که در شکل 6A نشان داده شده است، 800 میکروگرم در میلی لیتر CTPG-W به طور قابل توجهی تولید ROS را از 2-6 ساعت افزایش داد و از 12-24 ساعت کاهش یافت. علاوه بر این، 400 میکروگرم در میلی لیتر CTPG-W به طور قابل توجهی تولید ROS را از 12-24 ساعت افزایش داد. علاوه بر این، 200 میکروگرم در میلی لیتر CTPG-W به طور قابل توجهی تولید ROS را تغییر نداد. تغییرات دینامیکی تولید ROS ممکن است با آپوپتوز سلولی Eca{15}} مرتبط باشد. همچنین مشخص شد که CTPG-W دارای فعالیت مهار رادیکال های آزاد است (شکل 6B)، که ممکن است با کاهش تولید ROS در سلول های Eca{18}} تحت درمان با 800 میکروگرم بر میلی لیتر CTPG-W پس از 12 ساعت مرتبط باشد.

CTPG-W فعالیت کاسپاز-3، کاسپاز-7، کاسپاز-9 و PARP را افزایش می دهد. انتشار سیتوکروم c به دلیل کاهش Δψm می تواند پروتئازهای کاسپاز را برای القای آپوپتوز فعال کند (29،30،37). پس از درمان CTPG-W به مدت 24 ساعت، فعال شدن کاسپاز{8}}، 7، 8، 9 و PARP توسط آنالیز وسترن بلات شناسایی شد. در مقایسه با شاهد، سطوح cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-7, cleaved-caspase-3 و cleaved-PARP، اما سطوح cleaved-caspase{{ 20}}، توسط درمان CTPG به صورت وابسته به دوز تنظیم شدند (شکل 7). این نتایج نشان داد که CTPG-W، Δψm را کاهش داد و باعث آزادسازی سیتوکروم c برای فعال کردن کاسپازهایی شد که آپوپتوز سلول‌های Eca{24}} را القا می‌کنند.

عصاره سیستانچ توبولوزا

بحث

CHM سنتی می تواند آپوپتوز سلول های سرطانی مری را از طریق مسیرهای مختلف، از جمله گیرنده مرگ بیرونی، مسیرهای استرس میتوکندری درونی و شبکه آندوپلاسمی القا کند (29). مطالعه قبلی ما نشان داد که CTPG، به عنوان مؤلفه اصلی C. tubulosa، رشد سلول‌های ملانوم B16-F10 را از طریق القای آپوپتوز از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری مهار می‌کند (24). در مطالعه حاضر، اثر ضد توموری CTPG-W بر روی سلول‌های Eca{6}} بررسی شد و مشخص شد که CTPG-W رشد سلول‌های Eca را سرکوب می‌کند، آپوپتوز را القا می‌کند و چرخه سلولی را متوقف می‌کند. کاهش Δψm، افزایش آزادسازی سیتوکروم c و فعال شدن کاسپازها. CTPG و CTPG-W می توانند آپوپتوز و توقف چرخه سلولی را در سلول های سرطانی القا کنند. با این حال، مکانیسم های دقیق به دلیل اجزای مختلف CTPG (26.64 درصد اکیناکوزید، 10.19 درصد آکتئوزید، و 1.71 درصد ایزواکتئوزید) و CTPG-W (39.16 درصد اکیناکوزید و 2.44 درصد آکتئوزید) متفاوت است. CTPG سلول‌های B{21}F10 را در فازهای G0/G1 متوقف کرد، اما CTPG-W سلول‌های Eca{26}} را در فاز S دستگیر کرد (24). تولید ROS وابسته به دوز توسط CTPG افزایش یافت، اما نشان دهنده تغییر به روش وابسته به زمان با دوز بالای CTPG-W بود که در شروع درمان CTPG-W ({31}} ساعت) به طور قابل توجهی افزایش یافت. پس از 12 ساعت به طور قابل توجهی در مقایسه با شاهد کاهش یافت. یک دلیل احتمالی این است که جزء اصلی CTPG-W اکیناکوزید است. تعدادی از مطالعات گزارش کردند که اکیناکوزید می تواند تولید ROS و آپوپتوز ناشی از ROS را برای اعمال اثرات محافظت کننده عصبی و ضد پیری آن مهار کند ({36}}). به طور مشابه، فعالیت مهار رادیکال های آزاد در مطالعه حاضر مشاهده شد. بنابراین، حدس زده شد که برخی از اجزا، از جمله ورباسکوزید، ایزو ورباسکوزید، و سالیدروسید در دوز بالای CTPG-W ممکن است فوراً تولید ROS را برای ایجاد آپوپتوز سلول‌های Eca القا کنند (41،42) و سپس ROS توسط اکیناکوزید پاکسازی شد. یکی دیگر از دلایل احتمالی تفاوت در تولید ROS توسط CTPG و CTPG-W این است که از رده های سلولی مختلف در این مطالعه و مطالعه قبلی استفاده شده است (24). دونگ و همکاران (43) گزارش کردند که اکیناکوزید می‌تواند آپوپتوز سلول‌های سرطانی کولورکتال SW480 انسان را از طریق تولید آسیب‌های DNA اکسیداتیو بدون افزایش سطح ROS القا کند.

درمان CTPG-W Δψm را کاهش داد و باعث آزاد شدن سیتوکروم c شد که باعث برش کاسپاز می شود (28). به طور مداوم، سطح کاسپاز بریده شده با درمان CTPG-W تنظیم شد. متعاقباً، کاسپاز فعال-9 می‌تواند کاسپاز-3 را برای القای آپوپتوز فعال کند (44). سطوح کاسپاز شکافته{10}} نیز با درمان CTPG-W تنظیم شد. با این حال، کاسپاز{12}} توسط CTPG-W فعال نشد، که نشان می‌دهد مسیر گیرنده مرگ بیرونی در آپوپتوز ناشی از CTPG-W دخیل نبوده است. این مشاهدات نشان می‌دهد که CTPG-W از طریق فعال‌سازی یک مسیر وابسته به میتوکندری، آپوپتوز سلول‌های Eca{16}} را القا می‌کند.

PARP نقش مهمی در پایداری ژنومی ایفا می کند و می تواند توسط کاسپازهای فعال، به ویژه کاسپاز-3 و -7 جدا شود (45). مشخص شد که درمان CTPG-W کاسپاز-3 و -7 را فعال می‌کند که ممکن است PARP را برای مهار ترمیم DNA و آپوپتوز ایجاد کند.

CTPG-W همچنین به طور وابسته به دوز و زمان رشد سلول‌های BEL{3}} کارسینوم کبدی انسان را سرکوب می‌کند (داده‌های منتشر نشده). اگرچه CTPG-W رشد سلول‌های Eca{5}} و BEL-7404 را مهار می‌کند، اما باعث تکثیر سلول‌های طحال می‌شود که ممکن است به دلیل محتوای پلی ساکارید (~50 درصد) در CTPG-W باشد (46). ). به طور مشابه، تعدادی از مطالعات گزارش کرده اند که پلی ساکاریدها می توانند تکثیر سلول های طحال را تقویت کنند ({10}}). در مدل موش مشخص شد که CTPG-W به طور قابل توجهی شاخص طحال را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد، اما بر وزن بدن و سایر شاخص‌های اندام از جمله قلب، کبد، کلیه و ریه تأثیری نداشت (داده‌های منتشر نشده). نشان می دهد که CTPG-W هیچ اثر سیتوتوکسیک بر سلول های طبیعی ندارد.

در مجموع، داده‌ها نشان داد که CTPG-W با القای آپوپتوز از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری، رشد سلول‌های Eca{1}} را مهار می‌کند.

فواید سیستانچ: ضد آپوپتوز

قدردانی

نویسندگان مایلند از دکتر Jianhua Yang (کالج پزشکی بیلور) برای صیقل دادن نسخه خطی تشکر کنند.

منابع مالی

این مطالعه توسط سیزدهمین برنامه پنج ساله برای پروژه مناقصه رشته کلیدی زیست شناسی (با شماره کمک هزینه 17SDKD0202)، دانشگاه عادی سین کیانگ و آزمایشگاه کلیدی کاربرد و مقررات محیطی ویژه تنوع زیستی در سین کیانگ (شماره کمک هزینه XJTSWZ{4}}) پشتیبانی شد. به JL و کمک مالی بنیاد ملی علوم طبیعی چین (با شماره کمک مالی 31760260) به XW.

در دسترس بودن داده ها و مواد

داده ها و مواد مورد استفاده و تجزیه و تحلیل در طول مطالعه حاضر در صورت درخواست منطقی از نویسنده مسئول در دسترس است.

مشارکت نویسندگان

CF، AA، YY، و QC آزمایش ها را انجام دادند. LX، JLv و XW داده ها و ارقام تهیه شده را تجزیه و تحلیل کردند. JinyuL و JinyaoL پروژه را طراحی کردند و دستنوشته را نوشتند.

تایید اخلاق و رضایت برای شرکت

همه آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته اخلاقیات آزمایش‌های حیوانی آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین‌کیانگ تأیید شد (تأیید، شماره BRGE-AE001؛ دانشگاه سین‌کیانگ).

رضایت بیمار برای انتشار

قابل اجرا نیست.

منافع رقابتی

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع رقابتی ندارند.

منابع

1. Wu CR، Lin HC و Su MH: Reversal by aqueousعصاره Cistanche tubulosaاز نقص های رفتاری در مدل موش شبیه بیماری آلزایمر: ارتباط با رسوب آمیلوئید و عملکرد انتقال دهنده عصبی مرکزی BMC Complement Altern Med 14: 202، 2014.

2. Li J، Aspire A، Gao L، Huo S، Luo J و Zhang F:گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از Cistanche tubulosaبا القای آپوپتوز از طریق مسیر وابسته به میتوکندری، رشد سلولهای B{0}F10 را هم در شرایط in vitro و هم in vivo مهار می کند. J Cancer 7: 1877-1887، 2016.

3. Brand-Williams W، Culver ME و Berset C: استفاده از روش رادیکال آزاد برای ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30، 1995.

   ---