روغن‌های ضروری حاوی سیترال به‌عنوان مهارکننده‌های بالقوه تیروزیناز: یک رویکرد تقسیم‌بندی هدایت‌شده زیستی

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

خلاصه:

تولید بیش از حد ملانین باعث بیماری های جدی پوستی و همچنین مشکلات جزئی زیبایی (به عنوان مثال، کک و مک و لنتیگو خورشیدی) می شود. کاهش تیروزیناز یک رویکرد گسترده برای درمان چنین اختلالاتی است و عصاره های گیاهی اغلب به عنوان منابع ارزشمندی ازتیروزینازمهار کننده ها سیترال (مخلوطی از نرال و ژرانیال) یک ماده معطر مهم است که پتانسیل ضد تیروزیناز را نشان داده است. در اسانس‌های (EOs) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng.، Litsea cubeba (Lour.) Pers.، Melissa officinalis L. و Verbenaofficinalis L. با این حال، فقط L. cubeba EO برای بررسی قرار گرفته است. به عنوان یک عامل سفید کننده بالقوه پوست استفاده کنید. این کار شرایط آزمایشگاهی را ارزیابی می کندتیروزینازفعالیت بازدارنده این EOs و مطالعات، با استفاده از تقسیم‌بندی مبتنی بر سنجش زیستی، اینکه آیا ترکیبات شیمیایی متفاوت آن‌ها بر فعالیت‌های بازدارندگی کلی EO از طریق برهمکنش‌های احتمالی هم افزایی، افزودنی و/یا رقابتی بین اجزای EOs تأثیر می‌گذارد. فعالیت مهاری C. schoenanthus EO و M. officinalis EOs، با مقادیر ناچیز (به علاوه) -citronellal، در خط با محتوای سیترال آنها بود. از سوی دیگر، L. cubeba و V. officinalis EOs را مهار کردندتیروزینازبه میزان قابل توجهی بیشتر از آنجا که آنها حاوی -myrcene بودند که به فعالیت های کلی EO کمک کرد. مشاهدات مشابهی برای M. officinalis EO، که دارای محتوای سیترونل (به علاوه) بالا است که فعالیت سیترال را افزایش می‌دهد، انجام شد.

کلید واژه ها:تیروزینازبازداری؛ روغن ضروری؛ سیترال

سیستانچ عملکرد سفید کنندگی دارد

مقدمه

تیروزینازآنزیم کلیدی در بیوسنتز رنگدانه های ملانین در چندین باکتری، قارچ، گیاهان، حیوانات و انسان است. در انسان، تیروزیناز مراحل محدود کننده سرعت در مسیر بیوسنتزی ملانین را کاتالیز می کند. این بیوسنتز با چندین واکنش آنزیمی و شیمیایی مشخص می شود که منجر به تشکیل ملانین از اسید آمینه L-تیروزین می شود، با تیروزیناز که هیدروکسیلاسیون آن را به o-dopaquinone از طریق فعالیت های مایکوفنولات و دیفنول ها کاتالیز می کند. اگرچه آنزیم‌های دیگری نیز در ملانوژنز دخیل هستند، تنها واکنش‌های کاتالیز شده با تیروزیناز نمی‌توانند خود به خود رخ دهند، در حالی که مراحل باقی‌مانده می‌توانند بدون فعالیت آنزیم در pH فیزیولوژیکی [1] ادامه دهند. به همین دلیل، کاهش تیروزیناز یک رویکرد بسیار گسترده برای کاهش ملانین بیش از حد است. تولید، و استفاده از مهارکننده‌های تیروزیناز به‌عنوان عوامل سفیدکننده پوست، اهمیت بالینی و زیبایی چشمگیری را نشان داده است [2].

در بازار اتحادیه اروپا،تیروزینازمهارکننده‌هایی که به‌عنوان عامل سفیدکننده پوست استفاده می‌شوند را می‌توان به دو دسته اصلی دسته‌بندی کرد: آن‌هایی که طبق مقررات آرایشی اتحادیه اروپا 1223/2009 ممنوع شده‌اند (یعنی هیدروکینون و مونو بنزیل اتر هیدروکینون) به دلیل عوارض جانبی شدیدشان، اما همچنان برای درمان هایپرپیگمانتاسیون در پزشکی استفاده می‌شوند. نظارت و مهارکننده‌های تیروزیناز که برای استفاده در محصولات آرایشی (به عنوان مثال، آربوتین، آلوئزین، اسید کوجیک) مجاز هستند [2،3]. این گروه دوم، با این حال، هنوز با عوارض جانبی بالقوه قابل توجه مشخص می شود. مطالعات بالینی روی اسید کوجیک در واقع مواردی از اریتم، احساس سوزش و اگزمای تماسی را پس از مصرف مشخص کرده است. به طور مشابه، کمیته علمی اروپا در مورد ایمنی مصرف کننده نگرانی هایی را در مورد استفاده از آربوتینا یک ماده آرایشی [2]، به دلیل هیدرولیز بالقوه پیوند گلیکوزیدی آن که هیدروکینون آزاد می کند، مطرح کرده است. بنابراین نیاز به الگوهای مولکولی جدید و/آمیخته‌های ترکیبات فعال زیستی برای درمان هایپرپیگمانتاسیون وجود دارد.

گیاهان منابع ارزشمندی از عوامل سفید کننده پوست بوده اند، و از هر پنج عاملی که بیشترین استفاده را دارند، سه عامل، هم از نظر پزشکی و هم از نظر آرایشی، متابولیت های تخصصی گیاهی (مانند هیدروکینون، آربوتین، آلوئزین) هستند. تا به امروز، ترکیبات فنلی عمدتاً به عنوان پتانسیل مورد بررسی قرار گرفته اندتیروزینازمهارکننده‌ها، و اینها شامل فلاونوئیدها (مثلاً کوئرستین [4])، استیلبن‌ها (مانند رسوراترول [1])، فنیل پروپانوئیدها (مانند سینامالدئید [5] و اوژنول [6])، و اسیدهای فنولیک (مانند اسید آنیزیک و بنزوئیک اسید [7]). علاقه فورتپنوئیدها به طور قابل توجهی کمتر بوده است و آنها به عنوان عوامل ضد تیروزیناز نسبتاً مورد بررسی قرار نگرفته اند.

سیترال از جمله مشتقات محدود ترپنوئیدی با خواص ضد تیروزیناز است که مورد مطالعه قرار گرفته است. این ترکیبی از دو ایزومر سیس و ترانس-3،7-دی متیل-2،6-اکتادینال (یعنی نرال و ژرانیال) است که ثابت شده است فعالیت آنزیمی قارچ در شرایط آزمایشگاهیتیروزیناز[8]. سیترال علاوه بر اهمیت آن به عنوان یک ماده معطر در نوشیدنی ها، غذاها و لوازم آرایشی، فعالیت های بیولوژیکی امیدوارکننده ای از جمله اثرات ضد قارچی، ضد باکتریایی، آنتی اکسیدانی و ضد التهابی را نشان داده است [9-11]. علاوه بر این، مطالعات اخیر نشان داده اند. تاکید کرد که سیترال دارای اهمیت درمانی بالقوه به عنوان شل کننده عضلات صاف و بی حس کننده موضعی است، زیرا باعث آرامش در عضلات صاف نای، رحم و آئورت می شود و تحریک پذیری عصبی را در مدل های حیوانی مهار می کند [12-15].

سیترال از اسانس (EOs) چندین گونه گیاه شناسی، از جمله Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng.، Litsea cubeba (Lour.) Pers.، Melissa officinalis L. و Verbena officinalis L. به دست می آید. دانش، فقط L. cubeba EO برای آن مورد بررسی قرار گرفته استتیروزینازفعالیت بازدارنده [16]. بنابراین، این مطالعه با هدف ارزیابی فعالیت‌های مهاری تیروزیناز EOs C. schoenanthus، L. cubeba، M. officinalis، و V.officinalis، با استفاده از یک روش رنگ‌سنجی آزمایشگاهی، ارزیابی می‌کند که آیا ترکیبات شیمیایی مختلف بر فعالیت‌های بازدارنده EO کلی از طریق هر کدام تأثیر می‌گذارند. تعاملات هم افزایی، افزودنی و/یا رقابتی ممکن بین اجزای آنها. این مطالعه از روش تقسیم‌بندی هدایت‌شده با روش سنجی برای ارزیابی جامع اجزای EOs و انانتیومرهای آن‌ها، در صورت کایرال، استفاده می‌کند که به فعالیت بازدارنده EO در برابر منبع قارچی تیروزیناز کمک می‌کند، که یک سیستم مدل خوب برای غربالگری اولیه است.تیروزینازمهارکننده ها [17].

2. نتایج و بحث

2.1. ترکیب شیمیایی و محتوای سیترال اسانس مورد بررسی

در تلاش ما برای توصیف جامع همه اجزای EO بالقوه که به فعالیت بیولوژیکی در نظر گرفته شده کمک می کنند، EO های مورد بررسی توسط GC، با تشخیص FID و MS هر دو تجزیه و تحلیل شدند. فراوانی درصد نسبی نرمال شده (محاسبه شده از نواحی مطلق نرمال شده به استاندارد داخلی C13 با استفاده از ضرایب پاسخ [18،19]) همه ترکیبات شناسایی شده تعیین و برای مقایسه ترکیبات EO مورد استفاده قرار گرفت. شکل 1 نمایه GC-MS EO های مورد بررسی را گزارش می کند که با یک ستون معمولی تحلیل شده اند. جدول 1، برای هر EO مورد بررسی، ترکیباتی را فهرست می‌کند که درصد فراوانی نرمال‌شده را بالاتر از 0.1 نشان می‌دهند، در حالی که ترکیبات شیمیایی EO کامل در مواد تکمیلی گزارش شده‌اند (جدول S1-S5).

همه EO های مورد بررسی غنی از neral (cis{0}}،7-dimethyl-2،6-octadienal) و neral (trans-3،{) هستند. {5}}دی متیل-2،6-octadienal)، که فراوان‌ترین ترکیبات هستند. نسبت Theneral/Geranial در همه EOهای مورد بررسی بسیار مشابه بود و با 0.05 ± 74.740 مطابقت داشت. EO های C. schoenanthus و L. cubeba بالاترین محتوای نرال و ژرانیال را نشان می دهند که به طور متوسط ​​60 درصد از کل ترکیبات EO آنها را تشکیل می دهد که 1.{14}}برابر بیشتر از V. officinalis EO و در سه EO M. officinalis (به عنوان مثال، نمونه 1، 2، و 3). ترکیبات اکسیژن دار اضافی که در همه EO ها مشترک است عبارتند از6-متیل{19}}هپتن{20}}، لینالول و سیترونلال. مورد دوم به طور قابل توجهی در M. officinalis EO 1 بیشتر از EO های دیگر مورد بررسی، از جمله M. officinalis EO2 و 3 است.

فراوانی کسر هیدروکربن به طور قابل توجهی در EOs مختلف متفاوت است.M. officinalis EO 1 تنها حاوی ترانس- -کاریوفیلن و -هومولن به عنوان هیدروکربن‌های sesquiterpene است که به ترتیب 2.7 درصد و 0.13 درصد از کل EO را تشکیل می‌دهند. C.schoenanthus EO یک کسر هیدروکربنی کمی غنی‌تر از M. officinalis EO 1 (یعنی 7.0 درصد) ارائه می‌کند که حاوی هر دو مونوترپن (یعنی کامفن، سیس{{1{2{37}} است. }}}}ocimene، limonene، -pinene،trans- -ocimene، -tujene) و sesquiterpenes (به عنوان مثال، trans{14}}caryophyllene, -cadinene, δ-cadinene, germacrene D, -elemene) در حد متوسط مقادیر در EOs L. cubeba و V.officinalis، کسر هیدروکربنی 20 درصد از کل EO را تشکیل می‌دهد و لیمونن فراوان‌ترین ترکیب است (به ترتیب 15.0 و 10.9 درصد)، و پس از آن -pinene، pinene قرار دارند. ، سابینن، ترانس- -کاریوفیلن، -میرسن، کامفن، و -کوپن. در نهایت، M.officinalis EO 2 و 3 با بالاترین محتوای کسر هیدروکربنی (به ترتیب 38.8 درصد و 31.8 درصد از کل EO) مشخص می شوند. در هر دو نمونه، کسر هیدروکربنی عمدتاً شامل سسکوی ترپن‌ها، یعنی ترانس{33}کاریوفیلن (به ترتیب 27.8 درصد و 20.0 درصد) و -هومولن (3.0 درصد و 2.6 درصد) و یک بخش مونوترپن کاهش یافته است که عمدتاً توسط لیمونن مشخص می‌شود. به ترتیب 4.2 درصد و 3.2 درصد).

سه نمونه از L. cubeba، V. officinalis، و C. schoenanthus EOS تولید شده در سال‌های مختلف و همچنین سه نمونه از M. officinalis EOs از تولیدکنندگان متمایز مورد بررسی قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل GC-MS از C. schoenanthus، L. cubeba، M. officinalis، و V. officinalis تفاوت های کیفی و کمی قابل توجهی را در ترکیب شیمیایی سه نمونه از سال های مختلف تولید نشان نداد. این ممکن است به شرایط ذخیره سازی بهینه نسبت داده شود، به عنوان مثال، در یک ظرف شیشه ای کهربایی در دمای 4 درجه سانتیگراد در تاریکی با فضای سر ناچیز. از سوی دیگر، تجزیه و تحلیل GC-MS تفاوت های قابل توجهی را در فراوانی سیترونلال و ترانس نشان داد{4 }}کاریوفیلن در سه EO M. officinalis مورد بررسی قرار گرفت. سیترونلالاما در M. officinalis EO 1، 2 و 3 به ترتیب به 19.6 درصد، 0.26 درصد، و 0.31 درصد رسید. برعکس، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، ترانس{14}کاریوفیلن به میزان قابل توجهی نسبت به M. officinalis EOs 2 و 3 بیشتر از M. officinalis EO 1 است. که تفاوت های قابل توجهی را در فراوانی سیترال، سیترونلال و ترانس{19}کاریوفیلن در EOهای به دست آمده از 22 ژنوتیپ منتخب M. officinalis که از باغ های گیاه شناسی اروپا سرچشمه می گیرند، برجسته کردند [20].

یک کمی سازی واقعی با کالیبراسیون استاندارد خارجی برای ارزیابی دقیق فراوانی ترکیبات تخصصی زیست فعال بالقوه (یعنی نرال، ژرانیال، لیمونن، میرسن و سیترونلال) انجام شد. جداول 2 و 3 یون های تشخیصی (m/z) مورد استفاده برای سیم کارت را گزارش می کنند. کمی سازی MS ترکیبات نشانگر تحت بررسی همراه با محدوده کالیبراسیون، معادله منحنی کالیبراسیون، مقادیر همبستگی و خطای استاندارد رگرسیون هر آنالیت و نتایج کمی به ترتیب.

2.2. فعالیت بازدارنده در شرایط آزمایشگاهی اسانس های مورد بررسی در برابر قارچ تیروزیناز

همانطور که قبلاً توضیح داده شد، EOs C. schoenanthus، M. officinalis، L. cubeba، و V.officinalis سطوح بالایی از سیترال دارند که با فعالیت مهاری غیر رقابتی در برابر یک منبع قارچی تیروزیناز مشخص می شود [8،16،21] . این مطالعه با هدف بررسی شرایط آزمایشگاهی انجام شدتیروزینازفعالیت های بازدارنده این EO ها برای بررسی اینکه آیا می توان فعالیت بازدارندگی آنها را فقط به محتوای سیترال آنها نسبت داد، یا اینکه آیا ترکیبات زیست فعال دیگری وجود دارند که بر اثرات بازدارندگی EOs تأثیر می گذارند.

قارچتیروزینازدر اینجا به دلیل همسانی بالای آن با هومانتیروزیناز، هزینه نسبتاً کم و در دسترس بودن آماده استفاده شد که آن را به یک سیستم مدل خوب برای غربالگری اولیه مهارکننده‌های تیروزیناز تبدیل می‌کند [17]. دقت in vitroتیروزینازآزمون بازداری از نظر تکرارپذیری (با انجام آزمون مهار آنزیمی پنج بار در یک روز) و دقت متوسط ​​(با تکرار روش مهار آنزیمی پنج بار هر چهار هفته در یک دوره شش ماهه) ارزیابی شد. جدول 4 ضریب تغییرات (CV) را برای آزمایش های بازداری انجام شده با اسید کوجیک که به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و با L. cubeba EO گزارش می کند. نتایج رضایت‌بخش بود زیرا CV هرگز از 7 درصد برای تکرارپذیری و 10 درصد برای دقت متوسط ​​تجاوز نکرد. جدول 4 ضریب تغییرات را برای آزمایش های بازداری انجام شده با اسید کوجیک، به عنوان کنترل مثبت و با L. cubeba EO گزارش می کند. مقادیر دقت مشابهی برای همه EO های آزمایش شده به دست آمد.

منحنی غلظت-پاسخ سیترال با رسم فعالیت بازدارندگی مشاهده شده به عنوان تابعی از غلظت آن در مخلوط واکنش مورد مطالعه قرار گرفت. همه EO ها در غلظت 166.7 میکروگرم بر میلی لیتر آزمایش شدند، که صرف نظر از EO، غلظت سیترال حاصل را در محدوده خطی منحنی غلظت-پاسخ (y=0.3956x به علاوه 1.8094, R{{7}) ارائه کرد. }.9951، خطای رگرسیون: 2.08448، محدوده خطی: 6.7-166.7 میکروگرم بر میلی لیتر) و مشکلات حلالیت را در مخلوط واکنش ایجاد نکرد.

نمودار جعبه گزارش شده در شکل 2 درصد را نشان می دهدتیروزینازمهار برای هر EO برای L. cubeba، V. officinalis، و C. schoenanthus EOs، نتایج گزارش شده در شکل 2 مربوط به فعالیت مهاری قارچ تیروزیناز EOs 2020 است، زیرا تجزیه واریانس هیچ تفاوت آماری معنی داری بین EOsهای مختلف نشان نداد. سال تولید (p> 0.05). در مورد EOs L. cubeba و C. schoenanthus، این نتایج با نتایج به‌دست‌آمده از تجزیه و تحلیل‌های کمی GCMS که مقدار سیترال تقریباً یکسانی را در EOs سال‌های مختلف تولید نشان می‌دهد، مطابقت خوبی دارد. دسته 2020 V. officinalis EO حاوی مقدار سیترال کمی بالاتر از دسته های 2019 و 2018 است. با این حال، با توجه به منحنی غلظت-پاسخ سیترال، مازاد سیترال در دسته 2020 برای تعیین درصد معنی دار آماری بالاتری از مهار تصادفی آنزیمی کافی نیست. خطای مربوط به اندازه گیری ها برای جزئیات بیشتر، شکل S1 را در مواد تکمیلی ببینید. از سوی دیگر، آنالیز واریانس (ANOVA) و به دنبال آن توسط Tukey-Kramer پس‌آزمون نشان داد که سه EO M. officinalis آزمایش‌شده، ارائه‌شده توسط تولیدکنندگان مجزا، قارچ را مهار می‌کنند.تیروزینازبه درجات مختلف که در پاراگراف های بعدی بیشتر توضیح داده خواهد شد. بیشترین فعالیت بازدارنده برای EOs L.cubeba، M. officinalis 1 و V. officinalis مشاهده شد که 6 ± 59 درصد، 7 ± 55 درصد و 6 ± 52 درصد را مهار کردند.تیروزینازفعالیت، به ترتیب، زمانی که در غلظت 166.7 میکروگرم بر میلی لیتر آزمایش شد. از نظر آماری معنی‌دار (05/0p < 0)="" فعالیت‌های="" کمتری="" برای="" eos="" c.="" schoenanthus="" و="" m.officinalis="" 2="" و="" 3="" مشاهده="" شد="" که="" فعالیت="" مهاری="" آنزیمی="" آنها="" 5±42="" درصد،="" 5±40="" درصد="" و="" 6±38="" بود.="" درصد،="" به="" ترتیب.="" جدول="" 5="" غلظت="" بازدارنده="" را="" نشان="" می="" دهد="" که="" فعالیت="" آنزیم="" را="" در="" شرایط="" تجربی="" داده="" شده="" (ic50)="" برای="" هر="" بازدارنده="" مورد="" بررسی="" (یعنی="" eos،="" تک="" ترکیبات="" و="" اسید="" کوجیک)="" به="" نصف="" کاهش="" می="" دهد.="" همه="" eos="" به="" طور="" موثری="" تیروزیناز="" قارچ="" را="" مهار="" کردند="" و="" یک="" فعالیت="" بازدارنده="" را="" نشان="" دادند="" که="" به="" طور="" متوسط="" ​​100-برابر="" کمتر="" از="" کوجیکاسید="" بود="" که="" به="" عنوان="" کنترل="" مثبت="" استفاده="">

2.3. شناسایی اجزای فعال زیستی اضافی، علاوه بر سیترال، توسط شکنش هدایت‌شده با سنجش هیستوگرام گزارش‌شده در شکل 3، درصد مهارهای آنزیمی اندازه‌گیری‌شده تجربی را با مقادیری مقایسه می‌کند که اگر نورال و ژرانیال (به عنوان مجموع، یعنی سیترال در نظر گرفته می‌شوند) انتظار می‌رود. فقط ترکیبات فعال در EOs مورد بررسی قرار گرفت. این مقادیر از طریق درون یابی از منحنی غلظت-پاسخ سیترال اندازه گیری شد. همانطور که می توان اشاره کرد، C. schoenanthus، M. officinalis 2، و M. officinalis 3 فعالیت های بازدارنده ای را نشان دادند که در راستای محتوای سیترال آنها بود، در حالی که EOs L. cubeba، M. officinalis 1 و V. officinalis قارچ را مهار کردند. تیروزیناز به میزان بیشتری از حد انتظار. یک رویکرد هدایت‌شده زیستی برای شناسایی ترکیبات اضافی که به فعالیت سیترال کمک می‌کنند، اتخاذ شد. بخش‌های اکسیژن‌دار و هیدروکربنی EOs L. cubeba، M. officinalis 1، و V. officinalis با کروماتوگرافی فلش جدا شده و به‌صورت جداگانه برای قارچ آن‌ها آزمایش شدند.تیروزینازفعالیت های بازدارنده فراکسیون‌های فیتوهمیکال برای فعالیت‌های مهارکننده تیروزیناز قارچی خود مورد آزمایش قرار گرفتند. فراکسیون‌های فیتوهمیکال در همان غلظت به‌دست‌آمده در هنگام آزمایش 7/166 میکروگرم بر میلی‌لیتر از EO مربوطه آزمایش شدند (به بخش مواد و روش‌ها در بخش 3.2 مراجعه کنید). جدول 6 غلظت نرال، ژرانیا، سیترونل، لیمونن، و -myrcene در بخش اکسیژن و هیدروکربنی EOs تکه تکه شده.

همانطور که برای L. cubeba و V. officinalis EOs، هر دو بخش اکسیژن و هیدروکربن تیروزیناز قارچ مهار، هر چند به درجات مختلف. فعالیت فراکسیون های اکسیژن دار (به ترتیب 3 ± 53 درصد و 5 ± 44 درصد) بیشتر EOsanti- را تشکیل می دهند.تیروزینازبالقوه و در خط با محتوای سیترال مربوطه بودند، نشان می‌دهد که ترکیباتی که به فعالیت سیترال کمک می‌کنند متعلق به بخش‌های هیدروکربنی هستند. لیمونن (به ترتیب 68.4 و 50.3 درصد)، ترانس- -کاریوفیلن (به ترتیب 12.0 و 7.8 درصد)، -پینن (به ترتیب 1.7 و 7.5 درصد)، -پینن (به ترتیب 2.5 و 12.9 درصد)، سابینن (به ترتیب 2.7 و 3.8) و -myrcene (به ترتیب 2.0 و 2.4 درصد) فراوان ترین ترکیبات در هر دو بخش هستند و در مقادیر تقریباً مشابهی وجود دارند، به جز برای -پینن و -پینن که در بخش هیدروکربنی V. officinalis EO وجود دارد.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 درصد در هر دو EOs)، لیمونن (97 و 94 درصد در L. cubeba و V. officinalis EO، به ترتیب) و سابینن (87 درصد در هر دو EOs)، در حالی که بیش از حد انانتیومرهای مختلف برای -pinene ((-)- مشاهده شد. انانتیومر: 38 درصد در L. cubebaEO و 73 درصد در V. officinalis EO) و -pinene ((-)-enantiomer: 67 درصد در L. cubeba EO و 88 درصد در V. officinalis EO). در هر دو EO، (-)-لیمونن بیش از 50 درصد از کل بخش را تشکیل می دهد. با این حال، اگرچه مطالعات قبلی یک فعالیت بازدارنده بر ضد تیروزیناز قارچ را به دلیل فراوانی آن گزارش کرده‌اند [22،23]، لیمونن (-) در اینجا فعالیت مهاری تیروزیناز را نشان نمی‌دهد. نتایج مشابهی برای (+)-لیمونن، مخلوط راسمیک، و ترکیبات (-)-ترانس- -کاریوفیلن، (±){25}}پینن، و (±){26}}پینن به دست آمد. . سابینن آزمایش نشد زیرا قبلاً ثابت شده بود که قارچ ناچیز داردتیروزینازاثرات بازدارنده [8]. در توافق با یافته های قبلی [8]، میرسن فعالیت تیروزیناز قارچ را کاهش داد. هنگامی که در غلظت مشاهده شده در 7/166 میکروگرم در میلی لیتر از L. cubeba و V. officinalis EOs مورد آزمایش قرار گرفت، فعالیت -myrcene شکاف بین اثرات بازدارندگی مورد انتظار EOs را در صورتی که سیترال تنها ترکیب فعال بود و نتایج تجربی پل زد. برخلاف مشاهدات ماتسورا و همکاران. [8]، -myrcene ثابت کرد که مهارکننده تیروزیناز قارچ قوی تری نسبت به سیترال است، زیرا IC50 آن تقریباً ده برابر کمتر بود (13.3 میکروگرم در میلی لیتر در مقابل 121.8 میکروگرم بر میلی لیتر). این تفاوت ممکن است به بسترهای مختلف مورد استفاده نسبت داده شود. ماتسورا و همکاران فقط فعالیت دیفنولاز تیروزیناز قارچ را بررسی کردند، زیرا از L-DOPA به عنوان بستر استفاده کردند، در حالی که در این مطالعه از L-تیروزین استفاده شد. یافته‌های کنونی نشان می‌دهد که میرسن ممکن است در مهار فعالیت مونوفنولاز تیروزیناز قارچ مؤثرتر از دی فنولاز باشد.

M. officinalis EO 1 یک کسر هیدروکربنی کوچک را نشان می دهد که کمتر از 3 درصد کل را تشکیل می دهد و هیچ فعالیت مهاری تیروزیناز ندارد. با این حال، کسر اکسیژن دار M. officinalisEO 1، تیروزیناز قارچ را به میزان بیشتری نسبت به محتوای سیترال آن مهار می کند (شکل 3). این بخش حاوی مقادیر قابل توجهی سیترونل علاوه بر نرال و ژرانیال است و آنالیز کایرال خلوص بالای آنتیومری سیترونلال را به نفع انانتیومر (3/98 درصد) نشان داد. هنگامی که به طور مستقل مورد آزمایش قرار گرفت، در غلظت 166.7 میکروگرم بر میلی لیتر، سیترونلال (به علاوه) قارچ تیروزیناز را تا حد ناچیزی مهار کرد، اگرچه فعالیت آن در ترکیب با سیترال به طور قابل توجهی افزایش یافت. این نتایج ممکن است تفاوت های مشاهده شده در درصد قارچ را توضیح دهدتیروزینازمهار در M. officinalis EOs مختلف. M.officinalis EO 2 و 3 دارای محتوای سیترونل بسیار کم هستند که ممکن است دلیل این باشد که فعالیت بازدارندگی آنها به طور قابل توجهی کمتر از M. officinalis EO 1 است.

3. مواد و روشها

3.1. معرف ها

دی متیل سولفوکسید (DMSO)، تیروزیناز قارچ از Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach، L-تیروزین، اسید کوجیک، سیترال، سیترونلال، -میرسن، (به علاوه)-لیمونن، (-)-لیمونن، (±)-لیمونن، ( ±)-، و پینن از Merck Life Science Srl (میلان، ایتالیا) خریداری شد. Litsea cubeba، Verbena officinalis، و Cymbopogon schoenanthus EOs توسط Erboristeria Magentina Srl (Poirino، ایتالیا) عرضه شدند. سه دسته از سال های مختلف (یعنی 2020، 2019، 2018) برای هر کدام آزمایش شدند. سه نمونه از Melissa officinalis EOs مورد بررسی قرار گرفت؛ یکی توسط Agronatura (Spigno Monferrato، Alessandria)، یکی توسط ErboristeriaMagentina Srl، در حالی که آخرین نمونه از یک فروشگاه محلی خریداری شد و از SpecchiasolS.rl (Bussolengo، ایتالیا) بود. در متن، نویسندگان EO های مختلف Melissaofficinalis را به ترتیب M. officinalis EOs 1، 2 و 3 نامیده اند. EO های ارائه شده طبق روش هایی که در فارماکوپه اروپایی [24] توضیح داده شده است، به دست آمدند. Melissa officinalis و Verbena officinalis EOs به ترتیب با تقطیر با آب از برگ‌ها و قسمت‌های هوایی گیاهان تولید شدند. به طور مشابه، Litsea cubeba و Cymbopogon schoenanthus EOs به ترتیب با تقطیر بخار میوه‌های تازه و قسمت‌های هوایی تازه به دست آمدند. هر EO به‌محض خرید/ارائه توسط سازنده مربوطه، هر سال ذخیره‌سازی، و درست قبل از مطالعه فعالیت مهارکننده قارچ تیروزیناز آن، به‌صورت جداگانه توسط GC-MS آنالیز شد.

3.2. روش In Vitro Tyrosinase Inhibitory Assay

اینتیروزینازفعالیت های بازدارنده EOs و ترکیبات جدا شده در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از یک سنجش آنزیمی مبتنی بر بازخوانی رنگ سنجی بهینه شده توسط Zengh و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. [25]، با تغییرات جزئی. فعالیت‌های مهاری تیروزیناز EOs، و همچنین فراکسیون‌های هیدروکربنی و اکسیژن‌دار مربوطه و ترکیبات خالص آن‌ها در استفاده از یک روش آنزیمی مبتنی بر بازخوانی رنگ‌سنجی که توسط Zengh و همکاران بهینه‌سازی شده بود، مورد بررسی قرار گرفت. [25]، با تغییرات جزئی: سنجش در دمای اتاق وتیروزینازمهار با در نظر گرفتن کنترل و جذب نمونه پس از 6 دقیقه انکوباسیون، به جای بعد از 20 دقیقه، اندازه گیری شد تا تحت بخش خطی واکنش آنزیمی عمل کند، که نتایج بازداری دقیق تری را ارائه می دهد [26،27]. قارچ تیروزیناز از Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach برای این مطالعه انتخاب شد. L-تیروزین به عنوان بستر مورد استفاده قرار گرفت، به این معنی که فعالیت کلی بازدارندگی تیروزیناز بدون تمایز بین فعالیت تیروزیناز منوفنولاز و دیفنولاز مورد بررسی قرار گرفت. محلول‌های مهارکننده‌های بالقوه مورد بررسی (EOs، فراکسیون‌های EO، ترکیبات فردی EO و کوجیکاسید) در DMSO تهیه شدند. جدول 7 غلظت های آزمایش شده را برای هر بازدارنده بالقوه بررسی شده گزارش می کند. قارچتیروزینازمحلول 20{16}} U/mL (27.9 میکروگرم بر میلی‌لیتر) در بافر فسفات سدیم (PH 6.8) تهیه شد و مقادیر 9 میلی‌لیتری در دمای 18- درجه سانتیگراد ذخیره شد و درست قبل از آزمایش ذوب شد. محلول تیروزین 0.1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر در بافر فسفات سدیم (pH 6.8) تهیه شد و روزانه تجدید شد. اجزای مخلوط واکنش به ترتیب زیر در ویال قرار گرفتند: 1 میلی لیتر محلول تیروزیناز قارچ 200 U/ml. 1 میلی لیتر محلول بافر فسفات سدیم؛ 10 میکرولیتر محلول EO/تک پوند/کوجیک اسید. و در نهایت، 1 میلی لیتر محلول تیروزین 0.1 میلی گرم در میلی لیتر. درصد نهایی DMSO در مخلوط واکنش 0.3 درصد بود. سنجش در یک ویال 4 میلی لیتری مهر و موم شده برای جلوگیری از از دست دادن هر گونه اجزای EO در محیط اطراف و به حداقل رساندن انتشار آنها در فضای سر بالای مخلوط واکنش انجام شد. مخلوط واکنش در حمام آب ترموستاتیک در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 6 دقیقه انکوبه شد. پس از آن، جذب در 475 نانومتر ثبت شد، زیرا این طول موج امکان شناسایی دوپاکروم را فراهم می کند. جذب مربوط به 100 درصد فعالیت تیروزیناز با جایگزینی محلول EOs/ترکیب منفرد/ محلول کوجیک اسید با 10 میکرولیتر DMSO خالص اندازه‌گیری شد. محلول کوجیک اسید/DMSO و 1 میلی لیتر محلول تیروزین 0.1 میلی گرم در میلی لیتر. درصد مهار تیروزیناز با توجه به رابطه زیر اندازه گیری شد: درصد مهار=∆A (کنترل) - ∆A (نمونه) / ∆A (کنترل) × 100،∆A (کنترل) یا (نمونه) {{ 33}} A475 (Control) یا (Sample) - A475 (Control Blank) یا (Sample Blank).

3.3. فلش ستون کروماتوگرافی

شکنش EO بر روی یک سیستم کروماتوگرافی ستون فلاش PuriFlash450 توسط Sepachrom (رو، میلان، ایتالیا)، مجهز به آشکارسازهای UV و ELSD انجام شد. مقدار EO تقسیم شده: 900.0 میلی گرم. فاز ثابت: ذرات سیلیکاژل کروی، 50 میکرومتر، 25 میلی گرم (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) از سپاکروم بود. فاز متحرک: نفت (A) و اتیل استات (B)؛ سرعت جریان 25 میلی لیتر در دقیقه شستشوی گرادیان خطی از 100 درصد A به 80 درصد A و 20 درصد B در مدت 20 دقیقه اتخاذ شد.

3.4. شرایط تجزیه و تحلیل

محلول‌های EOs و فراکسیون‌های مربوطه آن‌ها در سیکلوهگزانات با غلظت 5.{1}} میلی‌گرم در میلی‌لیتر تهیه و توسط GC-MS آنالیز شدند. سیترال، سیترونلال، میرسن و لیمونن در هر EO و فراکسیون های جدا شده مربوطه با استفاده از روش کالیبراسیون استاندارد خارجی اندازه گیری شد. سطوح کالیبراسیون مناسب این سیکلوهگزان تهیه و توسط GC-MS آنالیز شد. Tridecane (C13) 1.{7}} mg/ml به عنوان استاندارد داخلی برای عادی سازی سیگنال های آنالیت استفاده شد. جدول 2 محدوده غلظت در نظر گرفته شده برای هر ترکیب کمی را خلاصه می کند.

آنالیزهای GC-MS با استفاده از نمونه‌بردار چند منظوره Gerstel MPS (Mülheim an der Ruhr، آلمان) نصب شده بر روی Agilent 689{14}} N GC همراه با MSD 5975 و مجهز به ChemStation نسخه E انجام شد. 02.{47}}سیستم پردازش داده 2.1431 (AgilentTechnologies، Santa Clara، CA، USA). شرایط GC: دمای انژکتور: 250 ◦C; حالت تزریق: تقسیم. نسبت: 1/20; گاز حامل: هلیوم; سرعت جریان ثابت: 1 میلی لیتر در دقیقه. ستون ها: Mega5 (95 درصد پلی دی متیل سیلوکسان، 5 درصد فنیل) df 0.25 میکرومتر، dc 0.25 میلی متر، طول 25 متر، از MEGA (Legnano، ایتالیا). برنامه دما: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C (5 دقیقه). شرایط MSD: MS در حالت EI (70 eV) کار می کند. محدوده اسکن: 35 تا 350 amu. زمان ماندن 40 میلی ثانیه; دمای منبع یون: 230 ◦C; دمای چهار قطبی: 150 ◦C; دمای خط انتقال: 280 ◦C. نشانگرهای EO با مقایسه شاخص‌های احتباس خطی (ITs)، محاسبه‌شده در مقابل مخلوط هیدروکربنی C{32} و طیف جرمی آن‌ها در برابر نمونه‌های معتبر یا از کتابخانه‌های طیفی گسترده تجاری شناسایی شدند (آدامز، 2007). آنالیزهای کایرال EO با اتخاذ شرایط آنالیز یکسان بر روی 2،{36}}دی-O-متیل{39}}Ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0.25 میکرومتر، dc انجام شد. 0.25 میلی متر، طول 25 متر از MEGA. برنامه های دما: 40 ◦C (1 دقیقه)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 دقیقه).

تجزیه و تحلیل GC-FID بر روی همان ابزار انجام شد. شرایط GC: دمای انژکتور: 250 ◦C; حالت تزریق: تقسیم. نسبت: 1/20; گاز حامل: هیدروژن؛ سرعت جریان: 1 میلی لیتر در دقیقه برنامه های دما: 40 ◦C (1 دقیقه)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 دقیقه).

4. نتیجه گیری

هدف از این تحقیق (1) بررسی جامع قارچ در محیط آزمایشگاهی بودتیروزینازفعالیت های بازدارنده Cymbopogon schoenanthus، Litsea cubeba، Melissa officinalis، و Verbena officinalis EOs و (2) برای تعیین اینکه آیا فعالیت بیولوژیکی آنها فقط به محتوای سیترال آنها نسبت داده می شود یا اینکه آیا مونوترپن های زیست فعال اضافی وجود دارد که با استفاده از یک روش تجزیه زیستی هدایت شده این مطالعه نشان داد که در EOs L. cubeba و V. officinalis، -myrcene علیرغم مقدار کمی که دارد به فعالیت های بازدارنده EOs کمک می کند و نشان داده شده است که قدرت بازدارندگی بیشتری نسبت به سیترال دارد. دومین یافته اصلی این بود که سیترونلال قارچ سیترال را افزایش دادتیروزینازقدرت بازدارندگی، به طور بالقوه برهمکنش انرژیکی چون هیچ فعالیتی به خودی خود نشان نداد. یافته اخیر توضیح داد که چرا در M. officinalis EOs که دارای مقادیر ناچیز سیترونل (بعلاوه) هستند، فعالیت های بازدارنده با محتوای سیترال آنها همخوانی داشت در حالی که برعکس برای M. officinalis EO با فراوانی سیترونلال نسبتاً بالا (به علاوه) صادق بود. حتی اگرچه مطالعات بیشتری برای تعریف دقیق نوع فعل و انفعالات بین -میرسن و سیترال و بین سیترونلال و سیترال و ارزیابی فعالیت های بازدارنده این EOs و ترکیبات منفرد روی انسان مورد نیاز است.تیروزینازنتایج این مطالعه ممکن است به طراحی منطقی مخلوط‌هایی از EOs یا EOs غنی شده کمک کند که کارایی بیولوژیکی آنها را بهبود بخشد و پتانسیل آنها را به عنوان کمکی در درمان هایپرپیگمانتاسیون افزایش دهد.

منابع

1. پیلایار، ت. مانیکام، م. Namasivayam، V. عوامل سفید کننده پوست: دیدگاه شیمی دارویی مهارکننده های تیروزیناز. آنزیم مهار کردن پزشکی شیمی. 2017، 32، 403-425. [CrossRef]

2. دسمدت، بی. کورسل، پی. De Beer, JO; راجیرز، وی. گروسبر، ام. دکونینک، ای. De Paepe, K. مروری بر عوامل سفید کننده پوست با بینشی از بازار غیرقانونی لوازم آرایشی در اروپا. J. Eur. آکادمی درماتول. Venereol. 2016، 30، 943-950. [CrossRef] [PubMed]

3. دسمدت، بی. ون هوک، ای. راجیرز، وی. کورسل، پی. De Beer, JO; دی پیپه، ک. Deconinck, E. خصوصیات مواد آرایشی سفید کننده پوست غیرقانونی مشکوک. جی. فارم. بیومد. مقعدی 2014، 90، 85-91. [CrossRef] [PubMed]

4. کوبو، آی. Ikuyo، KH فلاونول از گل زعفران: فعالیت مهاری تیروزیناز و مکانیسم بازدارندگی. جی. آگریک. Food Chem.1999, 47, 4121-4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; چانگ، W.-LL; Hsu، J.-CC; شیه، ی. Chou, S.-TT ترکیب شیمیایی و فعالیت بازدارنده تیروزیناز اسانس دارچین کاسیا. ربات گل میخ. 2013، 54، 2-8. [CrossRef]

6. گارسیا-مولینا، MDM; Muñoz-Muñoz، JL; گارسیا-مولینا، اف. گارسیا-روئیز، PA; گارسیا-کانواس، F. اثر فنل های جایگزین شده با تیروزیناز: تأثیر احتمالی بر قهوه ای شدن و ملانوژنز. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2012، 60، 6447-6453. [CrossRef]

7. کوبو، آی. Kinst-Hori، I. مهارکننده های تیروزیناز از زیره سبز. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 1998، 46، 5338-5341. [CrossRef]

8. ماتسورا، ر. اوکدا، اچ. Sawamura، M. Tyrosinase فعالیت مهاری اسانس مرکبات. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2006،54، 2309-2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn، P. Taweechaisupapong، S. آرومدی، سی. Khunkitti, W. بیولوژیکی در شرایط آزمایشگاهی اسانس های مورد استفاده برای کنترل آکنه. بین المللی J. آروماتر. 2006، 16، 43-49. [CrossRef]

10. بوزنا، ح. حفایض، ن. Giroux-Metges, M.-A.; الفکی، ع. تالارمین، H. خواص بیولوژیکی سیترال و اثرات محافظتی بالقوه آن در برابر سمیت سلولی ناشی از آسپرین در سلول های IEC{3}}. بیومد. داروساز. 2017، 87، 653-660. [CrossRef]

11. لی، اچ جی; جئونگ، اچ اس. کیم، دی جی؛ نه، YH; یوک، دی. Hong, JT اثر مهاری سیترال بر تولید NO با سرکوب بیان iNOS و فعال‌سازی NF-kB در سلول‌های RAW264.7. قوس. فارم. Res. 2008، 31، 342-349. [CrossRef]

12. کاروالیو، PMM; Macêdo، CAF; ریبیرو، تی اف. سیلوا، AA; داسیلوا، RER; de Morais، LP; Kerntopf، MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. اثر اسانس Lippia alba (Mill.) NE قهوه ای و ترکیبات اصلی آن، سیترال و لیمونن، بر عضله صاف نای موش صحرایی. بیوتکنول. 2018، 17، 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L. سیلوا، AdA; دا سیلوا، RER; کاستا، RHSd؛ مونتیرو، Á.B. باربوسا، CRdS؛ آموریم، TdS; deMenezes، IRA; Kerntopf، MR; باربوسا، R. فعالیت توکولیتیک اسانس Lippia alba و ترکیبات اصلی آن، سیترال و لیمونن، بر روی رحم جدا شده موش صحرایی. شیمی. Biol. تعامل داشتن. 2019، 297، 155-159. [CrossRef]

14. داسیلوا، RER; de Morais، LP; سیلوا، AA; باستوس، CMS؛ Pereira-Gonçalves، Á. Kerntopf، MR; منزز، IRA; Leal-Cardoso, JH; باربوسا، R. اثر شل کننده عروق اسانس لیپیا آلبا و ترکیب اصلی آن، سیترال، بر انقباض آئورت جدا شده. بیومد. داروساز. 2018، 108، 792-798. [CrossRef] [PubMed]

15. سوزا، DG; سوزا، SDG; سیلوا، RER; سیلوا-آلوز، KS; فریرا-دا-سیلوا، FW; Kerntopf، MR; منزز، IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. اسانس لیپیا آلبا و ماده اصلی تشکیل دهنده آن سیترال تحریک پذیری اعصاب سیاتیک موش صحرایی را مسدود می کند. براز J. Med.Biol. Res. 2015، 48، 697-702. [CrossRef] [PubMed]

16. هوانگ، X.-W. فنگ، Y.-C.; هوانگ، ی. لی، اچ.-ال. کاربرد آرایشی بالقوه اسانس استخراج شده از میوه Litsea cubeba از چین. جی اسنت. Oil Res. 2013، 25، 112-119. [CrossRef]

17. ذوالقدری، س. بهرامی، ع. حسن خان، MT; مونوز-مونوز، ج. گارسیا-مولینا، اف. گارسیا کانواس، اف. Saboury، AA مروری جامع بر مهارکننده‌های تیروزیناز. J. آنزیم. مهار کردن پزشکی شیمی. 2019، 34، 279–309. [CrossRef]

18. بیکی، سی. لیبرتو، ای. ماتئودو، ام. اسگوربینی، بی. موندلو، ال. Zellner, Bd; کاستا، آر. Rubiolo، P. تجزیه و تحلیل کمی روغن‌های ضروری: یک کار پیچیده. طعم عطر. J. 2008, 23, 382-391. [CrossRef]

19. روبیولو، پ. اسگوربینی، بی. لیبرتو، ای. کوردرو، سی. Bicchi، C. اسانس ها و مواد فرار: آماده سازی و تجزیه و تحلیل نمونه. یک بررسی. طعم Fragr. J. 2010, 25, 282-290. [CrossRef]

20. سیدلر-لوزیکوفسکا، ک. بوسیانوفسکی، جی. Król, D. ارزیابی تنوع صفات مورفولوژیکی و شیمیایی ژنوتیپ‌های انتخاب شده بادرنجبویه (Melissa officinalis L.). محصولات تولیدی صنعتی 2013، 49، 515-520. [CrossRef]

21. کوبو، آی. Kinst-Hori، I. فعالیت مهاری تیروزیناز ترکیبات طعم دهنده روغن زیتون. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 1999، 47، 4574-4578. [CrossRef] [PubMed]

22. فیوکو، دی. آرچیولی، م. آرنا، نماینده مجلس؛ بنونوتی، اس. Gallone, A. ترکیب شیمیایی و پتانسیل ضد ملانوژنی اسانس های مختلف. طعم عطر. J. 2016, 31, 255-261. [CrossRef]

23. هو، جی جی; لی، ایکس. لیو، XH; Zhang, WP اثر مهاری اسانس لیمو بر فعالیت تیروزیناز قارچ در شرایط آزمایشگاهی. مد. FoodSci. تکنولوژی 2015، 31، 97-105. [CrossRef]

24. شورای اروپا. فارماکوپه اروپایی، ویرایش دهم. شورای اروپا: استراسبورگ، فرانسه، 2020؛ شابک 978-92-871-8921-9.

25. ژنگ، ز.پ. قهوهای مایل به زرد، HY; چن، جی. Wang, M. خصوصیات مهارکننده های تیروزیناز در شاخه های Cudrania tricuspidata و مطالعه رابطه ساختار-فعالیت آنها. فیتوتراپیا 2013، 84، 242-247. [CrossRef] [PubMed]

26. ویلیامز، KP; اسکات، طراحی آنزیم JE برای غربالگری با توان عملیاتی بالا. در غربالگری با توان عملیاتی بالا. روش‌ها در زیست‌شناسی مولکولی (روش‌ها و پروتکل‌ها). Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, USA, 2009; جلد 565، ص. 107-126.

27. بروکس، اچ بی; Geeganage، S. Kahl، SD; مونتروز، سی. سیتمپالام، اس. اسمیت، ام سی; ویدنر، JR مبانی سنجش آنزیمی برای HTS. در راهنمای سنجش؛ Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds. Eli Lilly & Company و مرکز ملی برای پیشرفت علوم ترجمه: Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا، 2004