شبیه سازی، شناسایی عملکردی و تجزیه و تحلیل بیان کالکون سنتاز از سیستانش توبولوزا

چکیده: هدف

برای مطالعه عملکردکالکون سنتاز از Cistanche tubulosaو الگوی بیان ژن CtCHS در گلهای سفید، قرمز و بنفش.

مواد و روش هاژن CtCHS توسط RT-PCR کلون شد و تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک انجام شد. پلاسمید pET{1}a-CtCHS برای القای بیان پروتئین توسط IPTG به اشریشیا کلی منتقل شد. پروتئین نوترکیب CtCHS با سوبستراهای p-coumaroyl CoA و malonyl CoA انکوبه شد و محصولات توسط HPLC و MS شناسایی شدند. پلاسمید pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS به پروتوپلاست آرابیدوپسیس تالیانا منتقل شد تا محلی‌سازی درون سلولی پروتئین CtCHS را مشاهده کند. الگوی بیان ژن CtCHS در گلهای C. tubulosa با سه رنگ با استفاده از qRT-PCR شناسایی شد.

نتایجیک ژن CtCHS کلون شد. طول قاب خواندن باز (ORF) 1173 جفت باز بود که 390 اسید آمینه را کد می کرد و وزن مولکولی پروتئین 42 8000 بود.

عصاره ارگانیک سیستانچ با 30% اکیناکوزید و 12% آکتئوزید

CtCHS حاوی بقایای کاتالیزوری Cys164، His303، Asn336 بود که در کالکون سنتاز حفظ شدند. پروتئین CtCHS در E. coli بیان شد و برای به دست آوردن پروتئین نوترکیب خالص شد. پروتئین CtCHS می تواند p-coumaroyl CoA و malonyl CoA را کاتالیز کند تا نارینژنین کالکون تولید کند. پروتئین CtCHS عمدتاً در سیتوپلاسم قرار داشت. بیان ژن CtCHS در گل‌های بنفش و قرمز بسیار زیاد بود و میزان بیان نسبی آن به ترتیب 44/8 و 21/3 برابر بیشتر از گل‌های سفید بود.

نتیجه گیری یک ژن CtCHS از گل C. tubulosa کلون شد و پروتئین بیان شد. پروتئین CtCHS دارای عملکرد کالکون سنتاز است و بیان ژن CtCHS در گل های تیره تر بیشتر است، که نشان می دهد ژن CtCHS ممکن است رنگ گل C. tubulosa را تنظیم کند، که پایه ای برای تحقیقات بیشتر در مورد مکانیسم تنظیم رنگ گل C ایجاد می کند. توبولوزا.

کلید واژه ها: Cistanche tubulosa (شنک) موجود زنده; کالکون سنتاز؛ تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم؛ محلی سازی درون سلولی؛ تجزیه و تحلیل بیان

سیستانچ توبولوزا(SCHENK) WIGHT جنس گیاه Pyreal است که به طور طبیعی در جنوب سین کیانگ [1] در منطقه Hetian سین کیانگ [2] پراکنده شده است. گل های پیپ ارزش دارویی بالایی دارند. ساقه های گوشت آن یکی از منابع نسخه 2020 "فارماکوپه چینی[3] تحقیقات روی ساقه‌های گوشت کوردونوس گل‌های پیپ افزایش یافته است، اما تحقیقات بیولوژیکی نسبتاً کمی روی گل‌های آن انجام شده است. دوره گلدهی گل‌های لوله از آوریل تا اردیبهشت است [4]، عمدتاً سه رنگ سفید وجود دارد. گلهای پیپ از نظر رنگ غنی هستند، اما مکانیسم تنظیم رنگ گل آنها به نوع، محتوا، محتوا و توزیع ساختار بافت گلبرگ، رنگدانه و تنظیم عوامل محیطی گزارش نشده است. و فاکتورهای ژنتیکی [5] رنگدانه در گلهای گیاهی عمدتاً شامل سه دسته می شود: فلاونوئیدها، کاروتن و چغندر، که وسیع ترین طیف رنگی است [7] به عنوان سه گونه Paeonia Lactiflora Pall.

به صورت سفید به نظر می رسد و رنگ اصلی رنگ حاوی رنگ قرمز است و صلاحیت زیبایی باعث می شود که گل ها به صورت ارغوانی - قرمز ظاهر شوند [8]. رنگ گل یکی از ویژگی های مهم بسیاری از گیاهان زینتی است و همچنین عامل اصلی جذب حشرات صورتی است [9]. مطالعات نشان داده است که انتقال می یابد بیشترین فراوانی بازدید از حشرات گیاه سیستانچ بنفش تیره است [10]. برای تحقیقات بیولوژیکی در مورد تحقیقات ژنتیکی سیستانوئیدها در گل لوله سیستانوساروس، برای روشن شدن مکانیسم کنترل رنگ‌بندی حلقه گل لوله، ارائه مبنای نظری برای بهبود رنگ فناوری مهندسی ژنتیک، ترویج رنگ‌های غنی‌تر آن، افزایش بازدید، مفید است. گسترش دامنه برنامه ها

مسیر بیوسنتزی ازفلاونوئیدهابا شروع می شودمسیر فنیل پروپانوئید. فنیل آلانین ابتدا تحت اثر فنیل آلانین آمونیالاز (PAL) به اسید سینامیک تبدیل می شود و اسید سینامیک توسط اسید سینامیک 4-هیدروکسیله می شود. آنزیم (سینامیک اسید-4-هیدروکسیلاز، C4H) و 4-کومارات کوآنزیم A لیگاز (4-کومارات کوآنزیم A لیگاز، 4CL) واکنش را کاتالیز می‌کنند تا 4-کومارول-CoA تولید کنند. [11]. یک مولکول 4-کوماروئیل-CoA و سه مولکول مالونیل-CoA توسط کالکون سنتاز (CHS) کاتالیز می شوند تا نارینگنین کالکون تولید کنند.ترکیبات فلاونوئیدیاسکلت اساسی کالکون ایزومراز، فلاوانون{0}هیدروکسیلاز، دی هیدروفلاوونول 4-ردوکتاز و غیره انواع فلاونوئیدها مانند ایزوفلاون ها، فلاونول ها، آنتوسیانین ها و غیره را تولید می کند [12]. به عنوان یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتزی فلاونوئید، CHS محتوای فلاونوئیدها را در گیاهان تنظیم می کند و همچنین نقش مهمی در تنظیم رنگ گل گیاه دارد [13]. به عنوان مثال، خاموش کردن ژن پس از رونویسی Gentiana scabra Bunge CHS می‌تواند بیوسنتز آنتوسیانین‌ها را مهار کند و باعث سفید شدن خاص لوب‌های کرولا شود [14]. خاموش کردن ژن CHS Actinidia eriantha Benth. CHS باعث کاهش محتوای آنتوسیانین در گلبرگ ها می شود و باعث روشن شدن رنگ گلبرگ های قرمز می شود [15]. بنابراین، در این مطالعه، یک ژن CtCHS از گل‌های Cistanche deserticola شبیه‌سازی شد و برای بررسی عملکرد CtCHS، آنالیز بیوانفورماتیک، بیان و خالص‌سازی پروکاریوتی، تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیمی، آنالیز محلی‌سازی درون سلولی و آنالیز بیان در سه رنگ گل روی آن انجام شد. پروتئین و الگوی بیان ژن CtCHS برای بررسی اولیه رابطه بین CtCHS و رنگ گل Cistanche deserticola مورد استفاده قرار گرفت، که پایه و اساس مطالعه مکانیسم تنظیمی رنگ گل Cistanche deserticola را گذاشت.

1 مواد و ابزار

1.1 مواد

گل‌های سیستانچ توبروسا از شهرستان یوتیان، استان هوتان، سین‌کیانگ در ماه مه 2018 جمع‌آوری شدند. در طول نمونه‌برداری از اصل تصادفی پیروی شد و گل‌های سیستانچ توبروسا با وضعیت فیزیولوژیکی خوب و ارتفاع بوته ثابت انتخاب شدند. سه سویه Cistanche deserticola با سه رنگ گل سفید، قرمز و بنفش توسط پروفسور Tu Pengfei از دانشکده داروسازی دانشگاه پکن گرفته شد و به عنوان Cistanche tubulosa (Schenk) Wight شناسایی شد. آنها به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند، روی یخ خشک ذخیره شدند و به پکن منتقل شدند. سلول‌های E. coli DH5 از نظر شیمیایی از شرکت Nanjing Novezan Biotechnology، Ltd. و E. coli BL21 (DE3) از نظر شیمیایی از Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. خریداری شد. pET{4}}a، pCAMBIA1300-35S-GFP این وکتور از ووهان ترانسدوکشن آزمایشگاه بیولوژی شرکت، آموزشی ویبولیتین خریداری شد. -کالکون از Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. و naringenin از Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd. خریداری شد.

1.2 ابزار

اسپکتروفتومتر Nanodrop 2000C (شرکت Thermo Fisher، ایالات متحده); ابزار گرادیان PCR (شرکت اپندورف، آلمان)؛ دستگاه PCR کمی فلورسانس CFX 96، تصویرگر ژل UVP، دستگاه الکتروفورز ژل، دستگاه الکتروفورز پروتئین (شرکت BioRad، ایالات متحده آمریکا)؛ EnSpire

میکروپلیت خوان (شرکت پرکین المر، ایالات متحده آمریکا)؛ انکوباتور دمای ثابت (شرکت تجهیزات آزمایشی شانگهای جینگونگ، آموزشی ویبولیتین)؛ نوسان ساز درجه حرارت کامل با ظرفیت بالا DHZ-D (کارخانه تجهیزات آزمایشی Taicang)؛ THZ-82نوسانگر دمای ثابت حمام آب (شرکت ابزار دقیق جیانگسو ککسی، آموزشی ویبولیتین); میز کار فوق العاده تمیز AIRTECH (سوژو آنتای هوا فناوری شرکت، آموزشی ویبولیتین)؛ دستگاه ضدعفونی کننده بخار با فشار بالا (شرکت TOMY، ژاپن)؛ ابزار آب خالص Milli Q (میلیپور، ایالات متحده); LC{6}}کروماتوگرافی فاز مایع با راندمان بالا (شرکت شیمادزو، ژاپن). UPLC-Q-Exactive-Orbitrap طیف سنجی جرمی با وضوح بالا (شرکت Thermo Fisher، ایالات متحده); میکروسکوپ کانفوکال لیزری FV1200 (شرکت المپوس ژاپن).

2 روش های تجربی

2.1 استخراج RNA و سنتز cDNA. گل‌های سیستانش دسرتیکولا در نیتروژن مایع آسیاب شدند و سپس تحت آزمایش استخراج RNA قرار گرفتند.

RNA کل با استفاده از کیت (Norgen، Cat 17200) استخراج شد، غلظت و کیفیت RNA توسط NanoDrop 2000C شناسایی شد و نمونه‌های RNA با نسبت A260/A280 بین 1.8 و 2.1 برای سنتز رونویسی معکوس cDNA انتخاب شدند. ترانس کریپتاز معکوس M-MLV (Promega، M170B) برای رونویسی معکوس RNA کل واجد شرایط به cDNA استفاده شد. عملیات آزمایشی طبق دستورالعمل انجام شد.

2.2 شبیه سازی ژن CtCHS

بر اساس داده‌های رونوشت گل Cistanche deserticola گروه تحقیقاتی ما [16]، یک CtCHS با یک قاب خواندن باز کامل غربال شد و از نرم‌افزار SnapGene برای طراحی پرایمرهای خاص بر اساس توالی ژن استفاده شد (جدول 1). تکثیر PCR با استفاده از cDNA گل Cistanche deserticola به عنوان الگو انجام شد. سیستم تقویت 2× Phanta Max Buffer 25 μL، dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL، پرایمرهای بالادست و پایین دست (10μmol/L) هر کدام 2μL، cDNA 2μL، Phanta Max Super-Fidelity بود.

DNA پلیمراز 1 میکرولیتر، ddH2O 17 میکرولیتر. شرایط واکنش عبارت بودند از: قبل از دناتوراسیون در 95 درجه به مدت 3 دقیقه. 25 چرخه دناتوراسیون در 95 درجه به مدت 15 ثانیه، بازپخت در 55 درجه به مدت 15 ثانیه، و گسترش در 72 درجه به مدت 1 دقیقه. و گسترش واکنش در 72 درجه به مدت 5 دقیقه. محصول PCR با الکتروفورز ژل آگارز 1% شناسایی شد و کیت خالص سازی DNA (نویزان، Cat DC{16}}) برای بازیابی ژل استفاده شد و سپس DNA بازیافت شده توسط کیت شبیه سازی سریع (Novizan, Cat) خالص شد. ج{17}}). قطعه DNA با وکتور pCE2 TA/Blunt-Zero پیوند داده شد، به سلول‌های مناسب Escherichia coli DH5 تبدیل شد و پس از کشت یک شبه در دمای 37 درجه، سویه‌های تک کلون انتخاب و برای تعیین توالی به شرکت فرستاده شد.

جدول 1 توالی پرایمر

2.3 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

از نرم افزار آنلاین ProtParam برای تجزیه و تحلیل خواص فیزیکی و شیمیایی پروتئین استفاده کنید. از ابزار آنلاین Prot Scale برای تجزیه و تحلیل آب دوستی/آب گریز بودن پروتئین استفاده کنید. از ابزار آنلاین SOPMA برای پیش بینی ساختار ثانویه پروتئین استفاده کنید. استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل آنلاین SWISS-MODEL برای پیش بینی ساختار سوم پروتئین. استفاده از نرم افزار آنلاین TMHMM پیش بینی ساختار غشایی پروتئین. از نرم افزار DNAMAN برای مقایسه همسانی CtCHS با توالی اسید آمینه CHS سایر گونه ها استفاده کنید. استفاده از نرم افزار MEGA-X برای ساخت درخت فیلوژنتیک با استفاده از اتصال همسایه (NJ) و تصحیح پواسون فاصله تکاملی با استفاده از روش بوت استرپ محاسبه می شود و تعداد تکرارهای بوت استرپ 1000 بار است.

برای تشخیص بیشتر از UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS استفاده شد. شرایط فاز مایع عبارت بودند از: ستون Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1.7 μm)، دمای ستون 40 درجه، نارینگنین ، چالکون و نارینگنین. حجم بارگذاری ماده کنترل 4 میکرولیتر و حجم بارگیری محصول واکنش آنزیمی 7 میکرولیتر است. آب (A) - استونیتریل (B) به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. گرادیان شستشو: 0 تا 5 دقیقه، 30% B. 5 تا 15 دقیقه 30%~60% B; 15 ~ 20 دقیقه، 60٪ ~ 100٪ B; 20 تا 25 دقیقه، 100% B; 25~31 دقیقه، 100%~30% B. سرعت جریان حجمی 0.3 میلی لیتر در دقیقه است. شرایط طیف سنجی جرمی منبع یون الکترواسپری، نیتروژن به عنوان گاز حامل، فشار گاز غلاف 3.5 مگاپاسکال، فشار گاز کمکی 1.0 مگاپاسکال، فشار اسپری 3500 ولت، دمای مویرگی 350 درجه، دمای گرمایش گاز کمکی 200 درجه، حالت های یون مثبت و منفی، اسکن است. محدوده یون m/z 100-1500 است، وضوح کامل MS 35 000، وضوح dd-MS2 17 500 است، (N)

CE/stepped nce روی 35، 60 تنظیم شد.

2.6 محلی سازی درون سلولی پروتئین CtCHS

بر اساس توالی CtCHS و اصل شبیه‌سازی بدون درز، پرایمرهایی با مکان‌های برش آنزیمی Kpn Ⅰ و BamH Ⅰ طراحی شدند و قطعات هدف مربوطه با PCR تکثیر شدند. پلاسمید pCAMBIA1300-35S-GFP با اندونوکلئازهای محدود Kpn Ⅰ و BamH Ⅰ هضم شد و قطعه هدف و ناقل از طریق کیت شبیه‌سازی بدون درز (Novizan, Cat C115-01) به هم متصل شدند و سپس منتقل شدند. به سلول های E. coli DH5 صالح. ، سویه های تک کلون را برای توالی یابی انتخاب کنید و پلاسمیدها را از سویه های صحیح استخراج کنید. پلاسمیدهای pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS و pCAMBIA 1300-35S-GFP با استفاده از PEG4000 به پروتوپلاست های Arabidopsis thaliana تبدیل شدند و به مدت 8 تا 10 ساعت در نور کم کشت داده شدند. محلی سازی درون سلولی پروتئین CtCHS در زیر میکروسکوپ کانفوکال لیزری مشاهده شد.

2.7 تجزیه و تحلیل الگوی بیان CtCHS

بر اساس توالی CtCHS، DNAMAN برای طراحی پرایمرهای کمی فلورسانس بلادرنگ، با F-box به عنوان ژن مرجع داخلی استفاده شد. توالی های پرایمر در جدول 1 نشان داده شده است. بیان نسبی CtCHS در گل های Cistanche deserticola با رنگ های مختلف توسط PCR کمی فلورسانس بلادرنگ شناسایی شد. از TransStart Green qPCR SuperMix (طلایی کامل، AQ{4}}) برای اندازه گیری با روش رنگ فلورسنت سبز SYBR، سیستم واکنش: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL، پرایمرهای بالادست و پایین دست (10)

μmol/L) {{0}}.2 میکرولیتر هر کدام، الگوی cDNA 0.5 میکرولیتر، آب بدون نوکلئوتیداز 4.1 میکرولیتر، از روش دو مرحله‌ای برای واکنش استفاده شد و فرآیند واکنش بر اساس روش انجام شد. از دونگ شیانجوان و همکاران. [18]. هر نمونه شامل 3 تکرار بیولوژیکی بود و آزمایش سه بار تکرار شد. داده های تجربی با استفاده از Excel to 2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت

بیان نسبی CtCHS با استفاده از روش -ΔΔCt محاسبه شد و GraphPad Prism 8 برای انجام تجزیه و تحلیل معناداری و رسم هیستوگرام استفاده شد.