شبیه سازی، شناسایی عملکردی و تجزیه و تحلیل بیان کالکون سنتاز از سیستانش توبولوزا

چکیده: هدف مطالعه عملکرد کالکون سنتاز از Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosaو الگوی بیان ژن CtCHS در گلهای سفید، قرمز و بنفش.

روش ها: ژن CtCHS با روش RT-PCR کلون شد و آنالیز بیوانفورماتیکی انجام شد. پلاسمید pET{1}a-CtCHS برای القای بیان پروتئین توسط IPTG به اشریشیا کلی منتقل شد. پروتئین نوترکیب CtCHS با سوبستراهای p-coumaroyl CoA و malonyl CoA انکوبه شد و محصولات توسط HPLC و MS شناسایی شدند. پلاسمید pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS به پروتوپلاست آرابیدوپسیس تالیانا منتقل شد تا محلی سازی درون سلولی پروتئین CtCHS را مشاهده کند. الگوی بیان CtCHSgene در گلهایC. tubulosaبا سه رنگ توسط qRT-PCR شناسایی شد.

نتایج یک ژن CtCHS کلون شد. طول قاب خواندن باز (ORF) 1173 جفت باز بود که 390 اسید آمینه را کد می‌کرد و وزن مولکولی پروتئین 42 8000 بود. پروتئین CtCHS در E. coli بیان شد و برای به دست آوردن پروتئین نوترکیب خالص شد. پروتئین CtCHS می تواند p-coumaroyl CoA و مالونیل CoA را کاتالیز کند تا نارینژنین کالکون تولید کند. پروتئین CtCHS عمدتاً در سیتوپلاسم قرار داشت. بیان ژن CtCHS در گل‌های بنفش و قرمز بسیار زیاد بود و میزان بیان نسبی آن به ترتیب 44/8 و 21/3 برابر بیشتر از گل‌های سفید بود.

ConclusionA ژن CtCHS از گل کلون شدC. tubulosaو پروتئین بیان شد. پروتئین CtCHS دارای عملکرد کالکون سنتاز است و بیان ژن CtCHS در گل‌های تیره‌تر بیشتر است، که نشان می‌دهد CtCHSgene ممکن است رنگ گل C. tubulosa را تنظیم کند، که پایه‌ای برای تحقیقات بیشتر در مورد این گیاه است.مکانیسم تنظیم رنگ گل C. tubulosa.

کلید واژه ها:Cistanche tubulosa (شنک) موجود زنده; کالکون سنتاز؛ تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم؛ محلی سازی درون سلولی؛ بیان تحلیلی

برای دریافت عصاره طبیعی سیستانچ ارگانیک با 30% اکیناکوزید و 12% اکتئوزید اینجا را کلیک کنید

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https://www.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

بیوسنتزیمسیر فلاونوئیدهابا مسیر فنیل پروپانوئید شروع می شود.فنیل آلانینابتدا در زیر به اسید سینامیک تبدیل می شوداثر فنیل آلانین آمونیالاز(PAL)، و اسید سینامیک توسط اسید سینامیک 4-هیدروکسیله می‌شود. آنزیم (سینامیک اسید-4-هیدروکسیلاز، C4H) و 4-کوماراتکوآنزیم A لیگاز (4-کوماراتکوآنزیم A لیگاز، 4CL) واکنش را کاتالیز می‌کنند تا 4-کومارول-CoA تولید کنند [11] ]. یک مولکول 4-کوماروئیل-CoA و سه مولکول مالونیل-CoA توسط کالکن سنتاز (CHS) کاتالیز می‌شوند تا نارینژنین کالکون تولید کنند که دارای ترکیبات فلاونوئیدی است. دی هیدروفلاوونول 4-ردوکتاز و غیره انواع فلاونوئیدها مانند ایزوفلاون ها، فلاونول ها، آنتوسیانین ها و غیره را تولید می کند [12]. به عنوان یک آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتزی فلاونوئید، CHS محتوای فلاونوئیدها را در گیاهان تنظیم می کند و همچنین نقش مهمی در تنظیم رنگ گل گیاه دارد [13]. به عنوان مثال، خاموش کردن ژن پس از رونویسی Gentiana scabra Bunge CHS می‌تواند بیوسنتز آنتوسیانین‌ها را مهار کند و باعث سفید شدن خاص لوب‌های کرولا شود [14]. خاموش کردن ژن CHS Actinidia erianthaBenth. CHS محتوای آنتوسیانین در گلبرگ ها را کاهش می دهد و گلبرگ ها را قرمز می کند. رنگ گلبرگ ها روشن تر می شود[15]. بنابراین، در این مطالعه، یک ژن CtCHS از گل‌های Cistanche tubulosa شبیه‌سازی شد و برای بررسی عملکرد CtCHS، آنالیز بیوانفورماتیک، بیان و خالص‌سازی پروکاریوتی، تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیمی، آنالیز محلی‌سازی درون سلولی و آنالیز بیان در سه رنگ گل روی آن انجام شد. پروتئین و الگوی بیان ژن CtCHS برای بررسی اولیه رابطه بین CtCHS و رنگ گل Cistanche tubulosa مورد استفاده قرار گرفت، که پایه و اساس مطالعه مکانیسم تنظیمی را ایجاد کرد.رنگ گل Cistanche tubulosa.

1 مواد و ابزار

1.1 مواد

گل‌های سیستانچ توبولوزا از شهرستان یوتیان، استان هوتان، سین‌کیانگ در ماه مه 2018 جمع‌آوری شد. در طول نمونه‌برداری از اصل تصادفی پیروی شد و گل‌های سیستانچ توبولوزا با وضعیت فیزیولوژیکی خوب و ارتفاع بوته ثابت انتخاب شدند. سه سویه Cistanche tubulosa با سه رنگ گل سفید، قرمز و بنفش گرفته شد و توسط پروفسور Tu Pengfei از دانشکده داروسازی دانشگاه پکن به عنوان Cistanche tubulosa (Schenk) Wight شناسایی شد. آنها به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند و سپس در انبار یخ خشک به پکن منتقل شدند. سلول‌های E. coli DH5 از نظر شیمیایی از شرکت Nanjing Novezan Biotechnology، Ltd. و E. coli BL21 (DE3) از نظر شیمیایی از Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. خریداری شد. pET{4}}a، pCAMBIA1300-35S-GFP این وکتور از ووهان ترانسدوکشن آزمایشگاه بیولوژی شرکت، آموزشی ویبولیتین خریداری شد. -کالکون از Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. و naringenin از Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd. خریداری شد.

1.2 ابزار

اسپکتروفتومتر Nanodrop 2000C (شرکت Thermo Fisher، ایالات متحده); ابزار گرادیان PCR (شرکت اپندورف، آلمان)؛ دستگاه PCR کمی فلورسانس CFX 96، تصویرگر ژل UVP، دستگاه الکتروفورز ژل، دستگاه الکتروفورز پروتئین (شرکت BioRad، ایالات متحده آمریکا)؛ EnSpire

میکروپلیت خوان (شرکت پرکین المر، ایالات متحده آمریکا)؛ انکوباتور دمای ثابت (شرکت تجهیزات آزمایشی شانگهای جینگونگ، آموزشی ویبولیتین)؛ نوسان ساز درجه حرارت کامل با ظرفیت بالا DHZ-D (کارخانه تجهیزات آزمایشی Taicang)؛ THZ-82نوسانگر دمای ثابت حمام آب (شرکت ابزار دقیق جیانگسو ککسی، آموزشی ویبولیتین); میز کار فوق العاده تمیز AIRTECH (سوژو آنتای هوا فناوری شرکت، آموزشی ویبولیتین)؛ دستگاه ضدعفونی کننده بخار با فشار بالا (شرکت TOMY، ژاپن)؛ ابزار آب خالص Milli Q (میلیپور، ایالات متحده); LC{6}}کروماتوگرافی فاز مایع با راندمان بالا (شرکت شیمادزو، ژاپن). UPLC-Q-Exactive-Orbitrap طیف سنجی جرمی با وضوح بالا (شرکت Thermo Fisher، ایالات متحده); میکروسکوپ کانفوکال لیزری FV1200 (شرکت المپوس ژاپن).

2 روش های تجربی

2.1 استخراج RNA و سنتز cDNA.

گلهای سیستانچ توبولوزا در نیتروژن مایع آسیاب شدند و سپس تحت آزمایش استخراج RNA قرار گرفتند.

RNA کل با استفاده از کیت (Norgen، Cat 17200) استخراج شد، غلظت و کیفیت RNA توسط NanoDrop 2000C شناسایی شد و نمونه‌های RNA با نسبت A260/A280 بین 1.8 و 2.1 برای رونویسی معکوس برای سنتز cDNA انتخاب شدند. ترانس کریپتاز معکوس M-MLV (Promega، M170B) برای رونویسی معکوس RNA کل واجد شرایط به cDNA استفاده شد. عملیات آزمایشی طبق دستورالعمل انجام شد.

2.2 شبیه سازی ژن CtCHS

بر اساس داده‌های رونوشت گل Cistanche tubulosa گروه تحقیقاتی ما [16]، یک CtCHS با یک قاب خواندن کامل باز غربال‌گری شد و از نرم‌افزار SnapGene برای طراحی پرایمرهای خاص بر اساس توالی ژن استفاده شد (جدول 1). تکثیر PCR با استفاده از cDNA گل Cistanche tubulosa به عنوان الگو انجام شد. سیستم تقویت 2× Phanta Max Buffer 25 μL، dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL، پرایمرهای بالادست و پایین دست (10μmol/L) هر کدام 2μL، cDNA 2μL، Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL بود. ddH2O 17 میکرولیتر. شرایط واکنش عبارت بودند از: قبل از دناتوراسیون در 95 درجه به مدت 3 دقیقه. 25 چرخه دناتوراسیون در 95 درجه به مدت 15 ثانیه، بازپخت در 55 درجه به مدت 15 ثانیه، و گسترش در 72 درجه به مدت 1 دقیقه. گسترش واکنش در 72 درجه به مدت 5 دقیقه. محصول PCR با الکتروفورز ژل آگارز 1% شناسایی شد و کیت خالص سازی DNA (نویزان، Cat DC{26}}) برای بازیابی ژل استفاده شد و سپس DNA بازیافت شده توسط کیت شبیه سازی سریع (Novizan, Cat) خالص سازی شد. ج{27}}). قطعه DNA با وکتور pCE2TA/Blunt-Zero پیوند داده شد، به سلول‌های با صلاحیت Escherichia coli DH5 تبدیل شد و پس از کشت یک شبه در دمای 37 درجه، سویه‌های تک کلون انتخاب و برای تعیین توالی به شرکت فرستاده شد.

جدول 1 توالی پرایمر

2.3 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

از نرم افزار آنلاین ProtParam برای تجزیه و تحلیل خواص فیزیکی و شیمیایی پروتئین استفاده کنید. از ابزار آنلاین Prot Scale برای تجزیه و تحلیل آب دوستی/آب گریز بودن پروتئین استفاده کنید. از ابزار آنلاین SOPMA برای پیش بینی ساختار ثانویه پروتئین استفاده کنید. استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل آنلاین SWISS-MODEL برای پیش بینی ساختار سوم پروتئین. استفاده از نرم افزار آنلاین TMHMM پیش بینی ساختار غشایی پروتئین. از نرم افزار DNAMAN برای مقایسه همسانی CtCHS با توالی اسید آمینه CHS سایر گونه ها استفاده کنید. استفاده از نرم افزار MEGA-X برای ساخت درخت فیلوژنتیک با استفاده از اتصال همسایه (NJ) و تصحیح پواسون فاصله تکاملی با استفاده از روش بوت استرپ محاسبه می شود و تعداد تکرارهای بوت استرپ 1000 بار است.

2.4 بیان و خالص سازی پروکاریوتی CtCHS

طراحی پرایمرهایی با مکان های محدود BamHⅠ و XhoⅠ بر اساس توالی CtCHS و PCR قطعات هدف مربوطه را تقویت می کند. ناقل pET{0}}و قطعه هدف با استفاده از اندونوکلئازهای BamHI هضم شدند و سویه کلون شده توالی یابی شد و پلاسمید پس از توالی یابی صحیح استخراج شد. پلاسمید pET{1}a-CtCHS تأیید شده توسط توالی یابی به سلول های ذیصلاح اشرشیاکلی BL21 (DE3) منتقل شد. رجوع به روش دینگ نینگ و همکاران شود. [17] با ایزوپروپیل

-D-تیوگالاکتوپیرانوسید (IPTG) برای القای بیان پروتئین در دمای پایین استفاده شد و از طریق ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni{2}} خالص شد (Cytiva, Cat 17531901). پروتئین با سانتریفیوژ در یک لوله اولترافیلتراسیون (Millipore, 30 000) تغلیظ و نمک زدایی شد. در بافر KPB 20 mmol/L (pH 8.0، حاوی 1 mmol/LEDTA) نگهداری کنید و در یخچال 80- درجه برای نگهداری طولانی مدت نگهداری کنید.

2.5 تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم CtCHS

سیستم واکنش آنزیمی CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 میکرولیتر، 1 میلی مول در لیتر مالونیل-CoA 10 میکرولیتر، 5 میلی مول در لیتر 4-کومارول-CoA 2 میکرولیتر، CtCHS نوترکیب پروتئین 20 میکرولیتر، در پس از واکنش در حمام آب در دمای 37 درجه به مدت 12 ساعت، مخلوط سه بار با 800 میکرولیتر اتیل استات استخراج شد، با جریان نیتروژن خشک شد و سپس در 100 میکرولیتر متانول حل شد. برای تشخیص محصول از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده کنید. شرایط عبارتند از: ستون نهایی LP-C18 (250 میلی متر × 4.6 میلی متر، 5 میکرومتر)، دمای ستون 30 درجه، حجم نمونه 10 میکرولیتر، و آب (A) و استونیتریل (B) به عنوان جریان. فاز، گرادیان شستشو: 0 تا 10

دقیقه، 30٪ B; 10 ~ 20 دقیقه، 30٪ ~ 60٪ B; 20~25 دقیقه، 60%~70% B; 25 ~ 30 دقیقه، 70٪ ~ 80٪ B; 30~35 دقیقه، 80%~100% B; 35-40 دقیقه، 100% B; 40-46 دقیقه، 100%-30% B. سرعت جریان حجمی 1 میلی لیتر در دقیقه است و تشخیص در طول موج 290 نانومتر است.

برای تشخیص بیشتر از UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS استفاده شد. شرایط فاز مایع عبارت بودند از: ستون Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm، 1.7 μm)، دمای ستون 40 درجه، naringenin- کنترل چالکون و نارینگنین حجم بارگذاری محصول 4 میکرولیتر و حجم بارگیری محصول واکنش آنزیمی 7 میکرولیتر است. آب (A) - استونیتریل (B) به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. گرادیان شستشو: 0 تا 5 دقیقه، 30% B. 5 تا 15 دقیقه، 30 %-60% B; 15-20 دقیقه، 60%-100% B; 20-25 دقیقه، 100% B; 25-31 دقیقه، 100%-30% B. سرعت جریان حجمی 0.3 میلی لیتر در دقیقه است. شرایط طیف سنجی جرمی منبع یون الکترواسپری، نیتروژن به عنوان گاز حامل، فشار گاز غلاف 3.5 مگاپاسکال، فشار گاز کمکی 1.0 مگاپاسکال، فشار اسپری 3500 ولت، دمای مویرگی 350 درجه، دمای گرمایش گاز کمکی 200 درجه، حالت های یون مثبت و منفی، اسکن است. محدوده یون m/z 100-1500، وضوح کامل MS 35 000، وضوح dd-MS2 17 500 است، (N)

CE/stepped nce روی 35، 60 تنظیم شد.

2.3 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

از نرم افزار آنلاین ProtParam برای تجزیه و تحلیل خواص فیزیکی و شیمیایی پروتئین استفاده کنید. از ابزار آنلاین Prot Scale برای تجزیه و تحلیل آب دوستی/آب گریز بودن پروتئین استفاده کنید. از ابزار آنلاین SOPMA برای پیش بینی ساختار ثانویه پروتئین استفاده کنید. استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل آنلاین SWISS-MODEL برای پیش بینی ساختار سوم پروتئین. استفاده از نرم افزار آنلاین TMHMM پیش بینی ساختار غشایی پروتئین. از نرم افزار DNAMAN برای مقایسه همسانی CtCHS با توالی اسید آمینه CHS سایر گونه ها استفاده کنید. استفاده از نرم افزار MEGA-X برای ساخت درخت فیلوژنتیک با استفاده از اتصال همسایه (NJ) و تصحیح پواسون فاصله تکاملی با استفاده از روش بوت استرپ محاسبه می شود و تعداد تکرارهای بوت استرپ 1000 بار است.

2.4 بیان و خالص سازی پروکاریوتی CtCHS

طراحی پرایمرهایی با مکان های محدود BamHⅠ و XhoⅠ بر اساس توالی CtCHS و PCR قطعات هدف مربوطه را تقویت می کند. ناقل pET{0}}و قطعه هدف با استفاده از اندونوکلئازهای BamHI هضم شدند و سویه کلون شده توالی یابی شد و پلاسمید پس از توالی یابی صحیح استخراج شد. پلاسمید pET{1}a-CtCHS تأیید شده توسط توالی یابی به سلول های ذیصلاح اشرشیاکلی BL21 (DE3) منتقل شد. رجوع به روش دینگ نینگ و همکاران شود. [17] با ایزوپروپیل

-D-تیوگالاکتوپیرانوسید (IPTG) برای القای بیان پروتئین در دمای پایین استفاده شد و از طریق ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni{2}} خالص شد (Cytiva, Cat 17531901). پروتئین با سانتریفیوژ در یک لوله اولترافیلتراسیون (Millipore, 30 000) تغلیظ و نمک زدایی شد. در بافر KPB 20 mmol/L (pH 8.0، حاوی 1 mmol/LEDTA) نگهداری کنید و در یخچال 80- درجه برای نگهداری طولانی مدت نگهداری کنید.

2.5 تجزیه و تحلیل فعالیت آنزیم CtCHS

سیستم واکنش آنزیمی CtCHS: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 میکرولیتر، 1 میلی مول در لیتر مالونیل-CoA 10 میکرولیتر، 5 میلی مول در لیتر 4-کومارول-CoA 2 میکرولیتر، CtCHS نوترکیب پروتئین 20 میکرولیتر، در پس از واکنش در حمام آب در دمای 37 درجه به مدت 12 ساعت، مخلوط سه بار با 800 میکرولیتر اتیل استات استخراج شد، با جریان نیتروژن خشک شد و سپس در 100 میکرولیتر متانول حل شد. برای تشخیص محصول از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده کنید. شرایط عبارتند از: ستون نهایی LP-C18 (250 میلی متر × 4.6 میلی متر، 5 میکرومتر)، دمای ستون 30 درجه، حجم نمونه 10 میکرولیتر، و آب (A) و استونیتریل (B) به عنوان جریان. فاز، گرادیان شستشو: 0 تا 10

دقیقه، 30٪ B; 10 ~ 20 دقیقه، 30٪ ~ 60٪ B; 20~25 دقیقه، 60%~70% B; 25 ~ 30 دقیقه، 70٪ ~ 80٪ B; 30~35 دقیقه، 80%~100% B; 35-40 دقیقه، 100% B; 40-46 دقیقه، 100%-30% B. سرعت جریان حجمی 1 میلی لیتر در دقیقه است و تشخیص در طول موج 290 نانومتر است.

برای تشخیص بیشتر از UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS استفاده شد. شرایط فاز مایع عبارت بودند از: ستون Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 mm × 3.0 mm، 1.7 μm)، دمای ستون 40 درجه، naringenin- کنترل چالکون و نارینگنین حجم بارگذاری محصول 4 میکرولیتر و حجم بارگیری محصول واکنش آنزیمی 7 میکرولیتر است. آب (A) - استونیتریل (B) به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. گرادیان شستشو: 0 تا 5 دقیقه، 30% B. 5 تا 15 دقیقه، 30 %-60% B; 15-20 دقیقه، 60%-100% B; 20-25 دقیقه، 100% B; 25-31 دقیقه، 100%-30% B. سرعت جریان حجمی 0.3 میلی لیتر در دقیقه است. شرایط طیف سنجی جرمی منبع یون الکترواسپری، نیتروژن به عنوان گاز حامل، فشار گاز غلاف 3.5 مگاپاسکال، فشار گاز کمکی 1.0 مگاپاسکال، فشار اسپری 3500 ولت، دمای مویرگی 350 درجه، دمای گرمایش گاز کمکی 200 درجه، حالت های یون مثبت و منفی، اسکن است. محدوده یون m/z 100-1500، وضوح کامل MS 35 000، وضوح dd-MS2 17 500 است، (N)

CE/stepped nce روی 35، 60 تنظیم شد.

2.6 محلی سازی درون سلولی پروتئین CtCHS

بر اساس توالی CtCHS و اصل شبیه‌سازی بدون درز، پرایمرهایی با مکان‌های برش آنزیمی Kpn Ⅰ و BamH Ⅰ طراحی شدند و قطعات هدف مربوطه با PCR تکثیر شدند. پلاسمید pCAMBIA1300-35S-GFP با اندونوکلئازهای محدود Kpn Ⅰ و BamH Ⅰ هضم شد و قطعه هدف و ناقل از طریق کیت شبیه‌سازی بدون درز (Novizan, Cat C115-01) به هم متصل شدند و سپس منتقل شدند. به سلول های E. coli DH5 صالح. ، سویه های تک کلون را برای توالی یابی انتخاب کنید و پلاسمیدها را از سویه های صحیح استخراج کنید. پلاسمیدهای pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS و pCAMBIA 1300-35S-GFP با استفاده از PEG4000 به پروتوپلاست های Arabidopsis thaliana تبدیل شدند و به مدت 8 تا 10 ساعت در نور کم کشت داده شدند. محلی سازی درون سلولی پروتئین CtCHS در زیر میکروسکوپ کانفوکال لیزری مشاهده شد.

2.7 تجزیه و تحلیل الگوی بیان CtCHS

پرایمرهای کمی فلورسنت بلادرنگ با استفاده از DNAMAN بر اساس توالی CtCHS، با F-box به عنوان ژن مرجع داخلی طراحی شدند. توالی پرایمر در جدول 1 نشان داده شده است. بیان نسبی CtCHS در گل های Cistanche tubulosa با رنگ های مختلف توسط PCR کمی فلورسنت بلادرنگ شناسایی شد. از TransStart Green qPCR SuperMix (طلایی کامل، AQ{4}}) برای اندازه گیری با روش رنگ فلورسنت SYBRGreen استفاده کنید. سیستم واکنش: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 میکرولیتر، پرایمرهای بالادست و پایین دست (10 میکرومول در لیتر) 0}.2 میکرولیتر هر کدام، الگوی cDNA 0.5 میکرولیتر، 4.1 میکرولیتر آب بدون نوکلئوتیداز استفاده شد. برای واکنش با استفاده از روش دو مرحله ای. روش واکنش بر اساس روش دونگ شیانجوان و همکاران بود. [18]. هر نمونه شامل 3 تکرار بیولوژیکی بود و آزمایش سه بار تکرار شد. داده های تجربی با استفاده از Excel تجزیه و تحلیل شدند، بیان نسبی CtCHS با استفاده از روش 2-ΔΔCt محاسبه شد، و GraphPadPrism 8 برای انجام تجزیه و تحلیل معناداری و رسم هیستوگرام استفاده شد.