عصاره Codonopsis Pilosula از ملانوسیت ها در برابر H2O محافظت می کند2-استرس اکسیداتیو ناشی از فعال کردن اتوفاژی

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:اخیراً با شناسایی نقش ضد پیری ملانین در پوست و مهار تولید ملانین، توسعه موادی که قادر به حفظ هموستاز پوست هستند توجهات را به خود جلب کرده است. در این مطالعه، ما بیشتر اثر ضد ملانوژنیک عصاره Codonopsis pilosula (CPE) و تحت استرس اکسیداتیو، اثر محافظت سلولی در ملانوسیت‌های Melan-a در معرض H2O2 را بررسی کردیم. اول، درمان CPE به طور قابل توجهی تولید ملانین را با مهار پروتئین های مرتبط با ملانوژنز، از جمله فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF)، تیروزیناز، و پروتئین مربوط به تیروزیناز 2 (TRP 2)، در نتیجه فسفوریلاسیون MAPK/JNK در ملان کاهش داد. -a سلول ها در مرحله بعد، برای بررسی اثرات محافظتی CPE بر آسیب پوستی ناشی از استرس اکسیداتیو و مکانیسم مولکولی آن، ما اثر CPE را پس از القای استرس اکسیداتیو با قرار دادن ملانوسیت ها در معرض H2O2 تعیین کردیم. CPE از سلول‌ها در برابر سمیت سلولی ناشی از H2O با کاهش بیان ژن کدکننده پروتئین پرو آپوپتوز Bax محافظت کرد، در حالی که ژن‌های کدکننده خانواده لنفوم سلول B (Bcl2) و MITF را که یک تنظیم‌کننده رونویسی است، القا کرد. که باعث تمایز ملانوسیت ها می شود. علاوه بر این، نتایج ما نشان می‌دهد که CPE تولید پروتئین‌های مرتبط با اتوفاژی مانند Beclin{21}} و زنجیره سبک 3 (LC3)Ⅱ را افزایش داد. این به طور قابل ملاحظه ای با پیش درمانی 3-متیل آدنین (MA، یک مهارکننده اتوفاژی) معکوس شد. در مجموع، یافته‌های ما نشان می‌دهد که درمان CPE نه تنها یک اثر ضد ملانوژنیک در ملانوسیت‌های طبیعی نشان می‌دهد، بلکه یک اثر محافظتی سلولی در ملانوسیت‌های تحت استرس اکسیداتیو با القای اتوفاژی و بیان MITF را نشان می‌دهد.اندازه آلت تناسلی،بنابراین، ما معتقدیم که CPE یک کاندید قوی برای نگهداری سلول در ملانوسیت ها است.

کلید واژه ها:Codonopsis pilosula; سلول های ملان-a; ملانوژنز؛ خویشتن خواری؛ استرس اکسیداتیو

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

پوست انسان بزرگترین عضو بدن انسان است و از بدن در برابر سموم محیطی، آلرژن ها و استرس اکسیداتیو محافظت می کند. ملانین که عمدتاً توسط ملانوسیت ها تولید می شود، نقش مهمی در پیشگیری از بیماری های پوستی دارد و در بافت های مختلف بدن انسان وجود دارد [1،2]. با این حال، تولید و تجمع بیش از حد گونه های فعال اکسیژن (ROS) به دلیل استرس، اشعه ماوراء بنفش (UV) و افزایش سن منجر به بسیاری از اختلالات پوستی مانند هیپرپیگمانتاسیون، ملاسما و در نهایت تخریب ملانوسیت ها می شود. چندین مطالعه در مورد درمان ملانوژنز بر تنظیم بیان فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) و فعالیت تیروزیناز متمرکز شده است [3-5]. علاوه بر این، مطالعات اخیر نشان داده اند که ملانوژنز پوست از طریق چندین مسیر سیگنال دهی ملانوژنیک، از جمله سیگنال دهی پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK)، پروتئین کیناز A (PKA) و مسیر با واسطه آدنوزین مونوفسفات حلقوی (cAMP) انجام می شود [6].

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

سیستم اتوفاژی سلولی به عنوان یک فرآیند خود هضم سلولی شناخته شده است که پروتئین های آسیب دیده را تجزیه می کند یا اندامک های ناکارآمد را در یک سلول جدا می کند و سپس آنها را در لیزوزوم تجزیه می کند تا هموستاز سلولی را حفظ کند [7،8]. مطالعات اخیر، اتوفاژی را به عنوان دخیل در عملکرد طبیعی ملانوسیت ها و تنظیم بیان فاکتور رونویسی سازنده ملانین MITF شناسایی کرده اند. بنابراین، عوامل ایجاد کننده اتوفاژی پتانسیل محدود کردن آسیب ناشی از اشعه ماوراء بنفش و اکسیداسیون لیپید و حفظ هموستاز در ملانوسیت ها و کراتینوسیت ها را دارند [9-11].پودر سیستانچ،با این حال، اطلاعات کمی در مورد استفاده از آماده سازی های طبیعی القا کننده اتوفاژی که از ملانوسیت ها در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کنند، وجود دارد.

Codonopsis pilosula ریشه Codonopsis pilosula (Fr.) Nanny.، متعلق به خانواده Campanula است. این گیاه در کوه‌های گانگوون-دو، کره، کشت یا کشت می‌شود و همچنین در مناطق شمالی و غربی چین، مانند مناطق گوانشی و شانشی، پراکنده می‌شود [12]. در طب عامیانه صدها سال است که از آن به عنوان جایگزینی برای جینسینگ استفاده می شود، زیرا دارای همان فعالیت های دارویی است، مانند انرژی بخشی تقویت کننده سیستم ایمنی، کاهش بیماری های گوارشی و تنظیم فشار خون، اما با قیمت پایین تر. تحقیقات فیتوشیمیایی نشان می دهد که C. pilosula حاوی مقادیر زیادی ساکارز، پلی ساکاریدها، تری ترپن ها، ساپونین ها، فیتوسترول ها، گلیکوزیدهای فنولیک، آلکالوئیدها و پلی استیلن ها است [13]. در میان آنها، لوبتیولین، استیلن اصلی C. pilosula، شناخته شده است که NF-kB را فعال می کند و دارای یک اثر تحریک کننده سیستم ایمنی است [14] علاوه بر این، طبق مطالعات اخیر بر روی اثر عصاره C. pilosula، یک عصاره اتانولی C. pilosula به طور قابل توجهی واکنش های آلرژیک ناشی از اووالبومین را مهار می کند، در حالی که یک عصاره آب سطح گلوکز پلاسما را کاهش می دهد و یک عصاره بوتانولی فعالیت مهار رادیکال های آزاد و اثر مهاری بر پراکسیداسیون لیپیدی در هموژن مغز موش را نشان می دهد[15-17] .

قبلاً مشخص شده بود که فعالیت آنتی اکسیدانی C.pildsula به دلیل تفاوت در محتوای پلی فنل بسته به حلال استخراج مورد استفاده متفاوت است [18]. بنابراین، ما اثر مهاری ملانوژنیک عصاره C. pilosula (CPE) را در شرایط عادی از طریق مسیرهای سیگنال دهی مکانیکی، و همچنین اثر محافظت سلولی در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از H2O در ملانوسیت‌های Melan-a بررسی کردیم.

2. مواد و روشها

2.1. معرف ها

RPMI 1640 و سرم جنین گاوی (FBS) از Welgene (Daegu، کره) خریداری شد.عصاره سالسا سیستانچپنی سیلین-استرپتومایسین از GibcoBRL (Eggenstein، آلمان) خریداری شد. فوربول 12-میریستات 13-استات (TPA) از TOCRIS (بریستول، انگلستان) خریداری شد. پراکسید هیدروژن (HaO2)،3-(4،5-دی متیل تیازول{{7} }yl)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT)، 4'،6-دیامیدینو{12}}فنیلندول (DAPI) و 3-MA از سیگما خریداری شدند آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا). تمام مواد شیمیایی و معرف های دیگر از درجه تجزیه ای بودند.

2.2. تهیه عصاره Codonopsis Pilosula

ریشه C.pilosula (CP) به سادگی خرد شد و 100 گرم CP در 1 Lof 50 درصد اتانول (w/v) غوطه ور شد. سپس سه بار با استفاده از امواج اولتراسونیک در دمای 30 درجه استخراج شد. پس از اینکه هر عصاره برای جمع آوری مایع رویی سانتریفیوژ شد، مایع رویی تغلیظ و خشک شد تا عصاره C.pilosula (CPE) تهیه شود.

2.3. کشت سلولی و تهیه انبار CPE

سلول های ملانوسیت ملان-a رشد کرده و در RPMI 1640 حاوی 10 درصد FBS، پنی سیلین (100 واحد در میلی لیتر)، استرپتومایسین (100 واحد بر میلی لیتر)، و 200 نانومولار فوربول 12-میریستات 13- نگهداری شدند. استات (TPA) و در دمای 37 درجه در انکوباتور 5 درصد CO2 نگهداری شد. پس از کشت 3×105 سلول در هر چاهک در یک صفحه شش چاهی، سلول‌های Melan-a به مدت 48 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند تا رنگ محیط به سیاه تبدیل شود. محلول‌های استوک (100 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) CPE در آب استریل حل و در درجه{17} نگهداری شد.

2.4. اندازه گیری زنده ماندن سلول

زنده ماندن سلولی CPE در سلول های Melan-a با استفاده از روش رنگ سنجی MT و فلوسیتومتری تعیین شد. سلول ها تا زمانی که به 8{3}} درصد تلاقی در پلیت های چاهی برسند نگهداری شدند و سپس با CPE و/یا 0.5 mMH2O2 به مدت 24 ساعت تیمار شدند. یک محیط سلولی با 10 میکرولیتر محلول MTT (5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) اضافه شد و سلول‌ها به مدت 4 ساعت دیگر انکوبه شدند. پس از انکوباسیون سلول ها، بلورهای نامحلول فورمازان در 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید حل شدند. میزان جذب در طول موج 540 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری با استفاده از میکروپلیت ریدر اندازه گیری شد. سلول های مرده با یک کیت تشخیص مرگ سلولی PI/Annexin V (EMD Millipore Corporation، Billerica، MA، ایالات متحده آمریکا) طبق پروتکل سازنده تعیین شدند. به طور خلاصه، سلول ها شسته و به مدت 15 دقیقه در RT در تاریکی حاوی FITC-Annexin V و PI انکوبه شدند. سپس سلول های مرده توسط دستگاه آنالایزر سلولی MuselM آنالیز شدند.

2.5. برآورد ملانین در شرایط آزمایشگاهی

تقریباً 2×105 سلول در چاهک در یک صفحه شش چاهی رشد داده شد. پس از درمان با CPE و/یا 0.5 میلی‌مولار H-Op همانطور که قبلاً توضیح داده شد [19]، سلول‌های شسته شده با PBS جمع‌آوری شدند، در 1× PBS حاوی 1 درصد Triton X لیز شدند و در دمای 4 درجه در دمای 13 سانتریفیوژ شدند. 000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه. محتوای ملانین سلولی با استفاده از 1 N NaOH حل شد. یک صفحه خوان ELISA برای تعیین کمیت ملانین با اندازه گیری جذب در 405 نانومتر استفاده شد. داده ها از سه آزمایش به دست آمد، و محتوای ملانین محاسبه شد و به عنوان تغییر برابر در مقایسه با سلول های کنترل نشان داده شد. 2.6. جداسازی پروتئین و تست وسترن بلات

نمونه های پروتئین همانطور که در کار قبلی ما توضیح داده شد استخراج شد [20]. سپس غلظت پروتئین لیزات سلولی با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) اندازه گیری شد. مقادیر معادل لیزات سلولی دناتوره شده (30 گرم لیزات سلولی در هر نمونه) با الکتروفورز ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید 10 درصد سدیم (SDS-PAGE) جدا شد و به غشای نیتروسلولزی منتقل شد. غشاء با آنتی بادی اولیه رقیق شده در 5 درصد پودر شیر بدون چربی در PBS حاوی 0.05 درصد Tween 20 (PBST) به مدت یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شد.

پس از انکوباسیون آنتی بادی اولیه، غشاها شسته و در آنتی بادی ثانویه کونژوگه با HRP رقیق شده در شیر بدون چربی 5 درصد در PBST به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. بیان پروتئین با استفاده از سیستم تشخیص لومینسانس شیمیایی (ECL) افزایش یافته (AI680، GE Healthcare، Uppsala، سوئد) آنالیز شد.

2.7. برآورد ROS داخل سلولی با رنگ آمیزی DCFH-DA

سطوح ROS سلولی در سلول‌های Melan-a تیمار شده با هوو با روش میکروسکوپ فلورسانس DCFH-DA برآورد شد [21]. سطوح فلورسانس DCF درون سلولی با ROS داخل سلولی تولید شده متناسب است. ابتدا سلول ها/ چاهک 105×2 با غلظت های جداگانه CPE و/یا H-O2 به مدت 24 ساعت تیمار شدند، سپس 2 ساعت قبل از پایان واکنش DCFH{9}}DA اضافه شد. داده ها از سه یا چند آزمایش مستقل جمع آوری شد. 2.8. پردازش آماری

تمام نتایج تجربی به عنوان میانگین ± انحراف معیار (SDs) سه تکرار بیولوژیکی ارائه شده است.ساقه سیستانچاهمیت آماری بین مقادیر میانگین چندگانه با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون مقایسه چندگانه دانکن با استفاده از SPSS 18 بررسی شد.{3}}(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) همانطور که در افسانه ها اشاره شده است. یک مقدار p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

3. نتایج

3.1. کاهش ملانوژنز در ملانوسیت ها توسط CPE

ملانوسیت ها ملانین را در پاسخ به محرک های خارجی مانند اشعه UV سنتز می کنند. عوامل عمده ای مانند هورمون محرک ملانوسیت (-MSH)، فاکتور سلول های بنیادی (SCF) و اندوتلین{3}}(ET{4}}) از ملانوسیت ها ترشح می شوند و بیان MITF را افزایش می دهند و در نتیجه ملانوژنز را افزایش می دهند. [22،23]. ابتدا، بررسی کردیم که آیا درمان CPE تولید ملانین و پروتئین‌های مرتبط با ملانوژنز را مهار می‌کند یا خیر.

تیمار CPE در 100200 و 300 میکروگرم در میلی لیتر به طور قابل توجهی تولید ملانین را در مقایسه با کنترل منفی کاهش داد. به طور خاص، تیمار با 300 میکروگرم در میلی‌لیتر CPE منجر به کاهشی مشابه با کاهش ناشی از تیمار آربوتین شد (شکل 1A، B). علاوه بر این، پروتئین‌های ملانوژنز تیروزیناز، TRP{5}}، TRP }} و MITF توسط وسترن بلاتینگ.مزایا و عوارض جانبی cistanche tubulosaدرمان با CPE در غلظت‌های 300 میکروگرم در میلی‌لیتر به طور قابل‌توجهی سطوح پروتئین‌های MITF، TRP{1}} و تیروزیناز را کاهش داد (شکل 1C). همانطور که تأیید شد که CPE بیان پروتئین های مرتبط با MITF را مهار می کند و تشکیل ملانین را مهار می کند، ما بیشتر بررسی کردیم که آیا CPE بر مسیر سیگنالینگ MAPK تأثیر می گذارد یا خیر. CPE فسفوریلاسیون MAPK را به روشی وابسته به دوز افزایش داد و به طور خاص فسفوریلاسیون JNK را القا کرد (شکل 1D). این نتایج نشان می‌دهد که مهار ملانوژنز توسط CPE ناشی از کاهش بیان MITF و تیروزیناز با القای فسفوریلاسیون JNK/MAPK است.

3.2. تأثیر CPE بر H2O{3}}مرگ سلولی القا شده در ملانوسیت ها

سلول های پوست مانند کراتینوسیت ها و ملانوسیت ها به ROS مانند پراکسید هیدروژن (HzOz) و آنیون سوپراکسید واکنش حساسی نشان می دهند تا وضعیت طبیعی خود را حفظ کنند. با این حال، عدم تعادل در وضعیت اکسیدان-آنتی اکسیدان به دلیل ROS بیش از حد سلولی می تواند منجر به تجمع پروتئین ها یا اندامک های آسیب دیده شود و در نهایت منجر به مرگ سلولی آپوپتوز شود [24،25]. اخیراً گزارش شده است که ملانین با تحریک تشکیل ملانین بسته به محیط خارجی پوست باعث پیری پوست می شود و همچنین سلامت پوست با حفظ محتوای ملانین درون سلولی حفظ می شود [26]. بنابراین، ما اثر عصاره CPE را بر سلول‌های تحت استرس اکسیداتیو از طریق تیمار H2O2 بررسی کردیم. سلول‌های تیمار شده با HzO در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده، 32.8 درصد کاهش زنده‌مانی سلولی را نشان دادند. با این حال، درمان CPE مهار زنده ماندن سلول را به روشی وابسته به غلظت تحت تیمار H-O2 کاهش داد. به طور خاص، CPE در 300 میکروگرم بر میلی‌لیتر، زنده‌مانی سلولی را به 91.9 درصد بازگرداند (شکل 2A). علاوه بر این، مرگ آپوپتوتیک سلول‌های تیمار شده با CPE و/یا H2O با رنگ‌آمیزی مضاعف با Annexin V- شناسایی شد. FITC/PI و سپس آنالیز فلوسایتومتری. پس از تیمار H2O2، درصد سلول های آپوپتوز به 34.5 درصد افزایش یافت، در حالی که در سلول های تیمار نشده 14.8 درصد بود. با این حال، تیمار CPE بطور قابل توجهی مرگ آپوپتوزی ناشی از H2O{27}را با درصد سلولهای رنگ آمیزی شده با Annexin V 22.2 درصد مهار کرد (شکل 2B). از آنجایی که این الگوی مشابه محتوای ROS را نشان می‌دهد، این نتایج نشان می‌دهد که CPE با مهار مرگ سلولی از طریق محافظت در برابر ROS القایی H2O{33}، زنده‌مانی سلول را حفظ می‌کند (شکل 2C).

3.3. تأثیر CPE بر مرگ سلولی القایی HzO{2} در ملانوسیت ها

همانطور که قبلا تایید شد، CPE با مهار افزایش آپوپتوز به دنبال درمان HzO2، زنده ماندن سلول را حفظ می کند. بنابراین، ما بعداً تأثیر CPE را بر بیان پروتئین‌های درگیر در مرگ سلولی و پروتئین MITF که تولید ملانین را در حضور H2O2 تنظیم می‌کند، بررسی کردیم. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، در سلول های تیمار شده با H2O2، بیان MITF اندکی کاهش یافت، از سوی دیگر، در سلول های تیمار شده با CPE، و بیان MITF تقریباً مانند سلول های تیمار نشده بود. علاوه بر این، H2O2 بیان پروتئین Bax القاکننده آپوپتوز را افزایش داد [27،28] اما بیان Bax را به روشی وابسته به غلظت در سلول های تیمار شده با CPE کاهش داد. در مقابل، H202 بیان پروتئین Bcl2 را کاهش داد که باعث بقای سلولی می شود [28،29]، اما بیان Bel2 با درمان CPE به روشی وابسته به غلظت افزایش یافت. وقتی بیان این دو پروتئین را برای تعیین نسبت Bax/Bcl2 محاسبه کردیم، همین تمایل مشاهده شد. بنابراین، تحت استرس اکسیداتیو ناشی از H2O، بیان MITF با القای مرگ سلولی کاهش یافت، در حالی که CPE یک اثر محافظتی قوی نشان داد، از مرگ سلولی ناشی از H2Oz جلوگیری کرد و بیان MITF را حفظ کرد.

3.4. تاثیر CPE بر فعال سازی اتوفاژی در ملانوسیت های ناشی از استرس اکسیداتیو

مطالعات اخیر نشان داده است که اتوفاژی و تنظیم کننده آن نقش مهمی در پاسخ آنتی اکسیدانی در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از ROS در سلول های انسانی ایفا می کند [26،30]. فنگ و همکاران.[31] نشان داد که عصاره برگ Apocymum venetum با کاهش فعال‌سازی اتوفاژی ناشی از ROS، از نورون‌های آسیب‌دیده در برابر آپوپتوز ناشی از H2O{5} محافظت می‌کند. از آنجایی که ارتباط بین مدولاسیون اتوفاژی و ضد ملانوژنز ایجاد شده است، نقش اتوفاژی در اثر محافظتی CPE در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از H-Oz در سلول‌های Melan-a مورد بررسی قرار گرفت. سطح LC3، یک پروتئین اتوفاگوزوم، به عنوان شاخص اتوفاژی استفاده شد. داده‌های وسترن بلات نشان داد که CPE به طور قابل‌توجهی بیان پروتئین‌های Pro-autophagic LC3-Ⅱ و Beclin را افزایش داد، که بیان آن‌ها با درمان H2O2 کاهش یافت. این نشان می دهد که CPE دارای یک اثر محافظت کننده سلولی از طریق نظم فعال سازی اتوفاژی استرس اکسیداتیو درون سلولی است (شکل 4A). سپس، رابطه درونی بین اثر سیتوپروتکتیو و اتوفاژی CPE در سلول‌های Melan-a تیمار شده با HzOz با استفاده از یک مهارکننده اتوفاژیک قوی، {20}}MA تجزیه و تحلیل شد. در مقایسه با داده‌های قبلی، سلول‌های پیش تیمار شده با 3-MA و CPE و تحریک شده با H2O2 کاهش سطح بیان LC3-II را نشان دادند (شکل 4B). به طور کلی، این داده‌ها حاکی از آن است که مهار اتوفاژی تأثیر منفی بر اثر محافظت سلولی CPE در سلول‌های تحت درمان با HzO{26}} دارد، که نشان می‌دهد اتوفاژی برای اثرات محافظت سلولی CPE ضروری است.

4. بحث

ما قبلاً روش استخراج بهینه را ایجاد کردیم که منجر به بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی و همچنین محتوای پلی فنل شد [18]. در این مطالعه، ما از روش استخراج اولتراسونیک با بازده بالا استفاده کردیم و دریافتیم که عصاره با فعال کردن اتوفاژی در شرایط استرس اکسیداتیو، و همچنین با مهار ملانوژنز در سلول‌های Melan-a، یک اثر محافظت سلولی از خود نشان می‌دهد.

ابتدا، ما بیشتر اثر ضد ملانوژنیک CPE.CPE را با کاهش بیان ژن‌های مرتبط با ملانوژنز، مانند MITF، تیروزیناز و TRP، کاهش دادیم. چندین مطالعه نشان داده‌اند که مکانیسم‌های بیوسنتزی ملانوژنز مربوط به بیان آنزیم توسط مسیرهای سیگنالینگ مختلف، از جمله پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK)، پروتئین کیناز A (PKA) و PI3K/Akt [32] انجام می‌شود. در میان آنها، فعال شدن مسیر سیگنالینگ MAPK، MITF را در سطح پایداری پروتئین، و همچنین سطح رونویسی، در ملانوسیت‌های اولیه انسان سرکوب کرد [33،34]. فسفوریلاسیون MAPK و آبشارهای سیگنال دهی کیناز پاسخگو خارج سلولی (ERK)، کیناز N ترمینال c-Jun (JNK) و p38 نیز تولید ملانین را تنظیم می کند. در میان آن‌ها، فعال‌کننده JNK، ملانوژنز را از طریق مهار فسفو بیان MITF وابسته به رونویسی 3 (CRTC3) تنظیم‌شده توسط CREB سرکوب می‌کند [35،36]. نتایج ما نشان می دهد که فسفوریلاسیون MAPK، به ویژه JNK، به طور موثری پس از درمان CPE در مقایسه با سلول های کنترل افزایش می یابد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که رنگ‌زدایی ناشی از CPE در ملانوسیت‌های Melan-a ممکن است توسط مسیرهای سیگنالینگ تنظیم‌شده با MITF/JNK رخ دهد.

ملانوسیت ها رنگدانه ملانین را تولید می کنند و آن را به کراتینوسیت ها منتقل می کنند، جایی که رنگدانه ها به محافظت از پوست در برابر عوامل استرس زای محیطی اکسیداتیو مانند آلاینده های هوا، محصولات شیمیایی و آسیب اشعه ماوراء بنفش کمک می کنند [37-39]. MITF یکی از تنظیم‌کننده‌های اصلی رونویسی است که مسئول ژن‌های کلیدی است که باعث رشد و تمایز ملانوسیت‌ها و همچنین تنظیم ملانوژنز می‌شود. علاوه بر این، MITF بیان ژن‌های خاصی را تنظیم می‌کند که هموستاز سلولی را حفظ می‌کنند، از جمله ژن‌هایی که پروتئین‌های دخیل در تکثیر (مانند CDK2) و آپوپتوز (مانند Bcl2) را کد می‌کنند[40-42]. Stein-Grimson و همکاران [43] موش‌های جهش یافته MITF را تحت تأثیر کاهش شنوایی و اختلالات رنگدانه‌ای در نتیجه از دست دادن ملانوسیت‌ها و همچنین استئوکلاست‌ها و ماست سل‌های معیوب شناسایی کردند. این نشان می دهد که MITF نقش مهمی در توسعه این انواع سلول ایفا می کند.

CPE مشتقی از داروهای گیاهی است که به دلیل اثرات ضد پیری و ضد حساسیت آن برای درمان بیماری های گوارشی و آلرژیک استفاده می شود. با این حال، اینکه آیا CPE می تواند از ملانوسیت ها در برابر استرس اکسیداتیو محافظت کند، ناشناخته باقی مانده است. برای تخمین اثر CPE بر بقای ملانوسیت در پاسخ به استرس اکسیداتیو، ابتدا مرگ سلولی را در ملانوسیت‌های در معرض H-O2 مشاهده کردیم. پس از درمان با 0.5 میلی مولار H-O2 به مدت 24 ساعت، زنده ماندن سلول در مقایسه با سلول های تیمار نشده کاهش یافت. با این حال، زنده ماندن سلول های تحت درمان با CPE با کاهش محتوای ROS بازسازی شد. سپس نسبت Bax/Bcl2 و بیان MITF برخلاف سلول‌های تیمار شده با H2O{14}} افزایش یافت.

اتوفاژی سیستم اصلی تخریب درون سلولی است که توسط آن آسیب لیزوزوم ها منجر به تخریب آنها می شود. میزوشیما و همکاران [45] نشان داد که در شرایط گرسنگی، التهاب یا استرس اکسیداتیو، فرآیند اتوفاژیک می‌تواند تخریب پروتئین‌ها و اندامک‌های آسیب‌دیده را در سلول‌ها تنظیم کند، به طوری که نوسازی سلولی و هموستاز می‌تواند به دست آید. پروتئین مرتبط با میکروتوبول 1 زنجیره سبک 3 (LC3) و Beclin{5}} نقش اصلی را در اتوفاژی پستانداران ایفا می کنند. LC3 به دو شکل وجود دارد، یعنی یک فرم سیتوزولی (LC3 I) و یک فرم کونژوگه با فسفاتیدیل اتانول آمین لیپیدی (LC3 III) که به هر دو غشای داخلی و خارجی اتوفاگوزوم در حال رشد وارد می شود [46،47] Zhang و همکاران. 48] از تبدیل LC3Ito LC3II به عنوان یک نشانگر بیوشیمیایی برای تجزیه و تحلیل وضعیت اتوفاژی در ملانوسیت ها استفاده کرد. تحقیقات بیشتر نشان داد که LC3 نشانگر تشکیل اتوفاگوزوم نهایی است، در حالی که Beclin-l در مرحله اولیه تشکیل اتوفاگوزوم نقش دارد و اتوفاژی را فعال می کند [49]. فعالیت اتوفاژیک سازنده نقش کلیدی در جلوگیری از آسیب اکسیداتیو در ملانوسیت ها ایفا می کند، اما مطالعات کمی در مورد مکانیسم های مولکولی تنظیم کننده اتوفاژی در ملانوسیت ها تحت استرس اکسیداتیو انجام شده است.

در نتیجه، ما مفهوم اتوفاژی با واسطه CPE را برای بقای سلولی در ملانوسیت‌های تحت استرس اکسیداتیو بررسی کردیم. نتایج ما نشان می‌دهد که پس از درمان CPE، اتوفاژی از طریق افزایش بیان Beclin-1 و تبدیل القایی LC3Ito LC3 II فعال شد. این نشان می‌دهد که CPE از طریق فعال‌سازی اتوفاژی در ملانوسیت‌هایی که تحت استرس اکسیداتیو قرار می‌گیرند، یک اثر محافظ سلولی اعمال می‌کند.

در نتیجه، مطالعه حاضر نشان داد که درمان CPE نه تنها دارای اثر ضد ملانوژنیک از طریق مسیر MITF/JNK در ملانوسیت‌های نرمال است، بلکه تحت استرس اکسیداتیو ناشی از HzOg، بقای سلولی را حفظ کرده و از طریق MITF محافظت سلولی را اعمال می‌کند که منجر به فعال‌سازی پایدار می‌شود. اتوفاژی در سلول های Melan-a.

این مقاله از Cosmetics 2021, 8, 67 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/cosmetics8030067 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics