نمایه سازی جامع فرمولاسیون ترشحی از سلول های بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی جنینی و پری ناتال

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

علاوه بر این، از نمودارهای میله‌ای در شکل‌های 5B و 6B، توزیع پروتئین متمایز بر اساس پیش‌شرطی‌سازی هیپوکسیک سلول ترشحی قابل‌توجه است. در این مورد، برای اطلاعات کامل، پروتئین هایی که از آستانه DAve و مجموعه DCI تجاوز نمی کنند نیز گزارش شدند. جنین دارای نتایج ترشحی غنی شده با پروتئین شوک حرارتی 60 کیلو دالتون (HSPD1، شکل 5B، پانل سمت چپ) در فرمول هیپوکسیک خود است، در حالی که همتای پری ناتال، میوزین تنظیم کننده انقباضی سلول عضله صاف [52] پلی پپتید سبک 9 (MYL9، شکل را به شدت بیان می کند. 5B، پانل سمت راست). به نظر می رسد سهم مهمی از تفاوت بین مراحل بارداری بیشتر به پیش شرط هیپوکسیک در hAFS بستگی دارد. خودروهای الکتریکی f-have-EVs به‌دست‌آمده از پرایمینگ سلولی هیپوکسیک غنی‌شده با عواملی از جمله Perlecan (HSPG2)، Agrin (AGRN)، زیر واحد لامینین -5، و -1(LAMA5 و LAMB1)، ترومبوسپوندین{17} یافت شد. }} (THBS1، شکل 6B، پانل سمت چپ). p-hAFS-EVهای هیپوکسیک حاوی زنجیره سنگین فریتین (FTH1)، پروتئین‌های داربست مانند Flotillin{23}}(FLOT1)، Fascin (FSCN1)، Annexin A6 (ANXA6)، مهارکننده گسستگی تولید ناخالص داخلی Rab بتا (GDI2)، همراه با Thy بودند. -1 گلیکوپروتئین غشایی (THY1)، نوروپیلین{31}}(NRP1) و ماتریکس متالوپروتئین 14 (MMP14، شکل 6B، پانل سمت راست).

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

پروتئین ها با فرکانس حداقل 2 در هر شرایط بررسی شده در f-hAFS یافت شدند. EVs و p-hAFS-EVs بیشتر با پایگاه داده Vesciclepedia [53] مقایسه شدند. همانطور که انتظار می رفت، اکثر پروتئین های شناسایی شده (96 درصد) قبلاً در EV و اگزوزوم ها در پایگاه داده مرجع توضیح داده شده اند (شکل S3A).مزایای سیستانچدر این راستا، تجزیه و تحلیل غنی سازی هستی شناسی ژن (GO) با استفاده از FunRich [54] انجام شد. فراوانی اصطلاحات GO در مجموعه داده با مقدار طبیعی آنها در پایگاه داده مرجع مقایسه شد تا گروه‌های پروتئینی که از نظر آماری بیش از حد نشان داده شده‌اند، با توجه به دخالت آنها در فرآیندهای بیولوژیکی، عملکرد مولکولی و اجزای سلولی (برای این جنبه آخر، داده‌ها نیستند) مقایسه شد. نشان داده شده است، اما در صورت درخواست موجود است). با توجه به تجزیه و تحلیل عملکردهای مولکولی مرتبط با پروتئین‌های شناسایی‌شده، فراکسیون‌های hAFS-CM غنی‌سازی را در یک ماده ساختاری ماتریکس خارج سلولی و اسکلت سلولی، اتصال پروتئین اسکلت سلولی و فعالیت مولکول ساختاری (شکل S2) نشان می‌دهند، در حالی که hAFS-EVs غنی‌شده بودند. اجزای تشکیل دهنده اسکلت سلولی و ریبوزوم، اتصال DNA و RNA و فاکتورهای اتصال GTPase و چاپرون (شکل S3C).

تجزیه و تحلیل غنی‌سازی فرآیندهای بیولوژیکی برای hAFS-CM و have-EVs نشان داد که اکثر پروتئین‌های تعدیل‌شده در بخش‌های ترشحی hAFS جنینی و پری ناتال به رشد/نگهداری سلول و متابولیسم پروتئین تعلق دارند (شکل‌های 5C و 6C). در hAFS-EVs ما متوجه شدیم که اصطلاح "مواد ساختاری ماتریکس خارج سلولی" منحصراً با f-hAF-EV های هیپوکسیک مرتبط است. اصطلاحات "اتصال یون کلسیم" و "فعالیت مولکولی ساختاری" عمدتاً در نمونه های هیپوکسیک f-hAFS و p-hAFS غنی شده بودند (شکل S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I و DCI (اطمینان بیان دیفرانسیل) بزرگتر یا مساوی I5I از فیلترها عبور کردند و به صورت متفاوت بیان شدند. برای فهرست کامل و پارامترهای دقیق پروتئین های گزارش شده به جدول S3 مراجعه کنید. (C) تجزیه و تحلیل غنی‌سازی فرآیندهای بیولوژیکی پروتئین‌های شناسایی شده با فرکانس حداقل 2 در f-hAFS-EVs (پانل سمت چپ) و p-hAFS-EVs (پانل سمت راست) پس از پیش‌شرطی کردن هیپوکسیک. بر اساس ابزار FunRich، اصطلاحات هستی شناسی ژن در نمودارهای میله ای نشان داده شده است که درصد ژن های غنی شده را برای هر دسته گزارش می دهد (نوارهای زرد تیره برای f-hAFS-EVsnormo، نوارهای قرمز برای f-hAFS-EVShypo، نوارهای سبز روشن برای p-hAFS -EVsnormo و نوارهای سبز تیره برای p-hAFS-EVShypo). فقط اصطلاحات هستی شناسی ژن با بونفرونی تصحیح شد*ص<0.05 are="">

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

2.6. پروفایل سیتوکین و کموکاین جنین در مقابل پری ناتال دارای CM و دارای EVs الگوهای توزیع مختلف را نشان داد

ما قبلا ظرفیت بازسازی f-hAFS-CMhypo را بر روی سلول های قلبی عروقی آسیب دیده از طریق اثرات پاراکرین تایید کرده ایم [34،35،49]. در اینجا ما محتوای سیتوکین و کموکاین f-hAFS-CMHypo را با همتای p-hAFS مربوطه مقایسه کردیم (شکل 7A، شکل S4A و جدول S4) و برخی از عوامل متمایز را یافتیم.

ANGIOGENIN، القاء کننده متالوپروتئیناز ماتریکس خارج سلولی (EMMPRIN)، اینترلوکین 8 (IL{1}})، و پروتئین جذب کننده شیمیایی مونوسیت-1 (MCP{3}}) به طور انحصاری غنی شده با inf-hAFS-CMNypo یافت شدند و نبودند در p-hAFS-CMhypo شناسایی شد. پروتئین متصل شونده به فاکتور رشد شبه انسولین 2 (IGFBP2) و Osteopontin (OPN) به طور قابل توجهی در f-hAFS-CMhypo نسبت به p-hAFS-CMHypo به میزان 3.{16}}و 3.{18} برابر افزایش یافت (" پ<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

در حالی که دارای-CM جنینی در مقایسه با پری ناتال بیان متفاوتی را در مشخصات سیتوکین و کموکاین خود نشان داد، همتایان EV جنینی در مقابل پری ناتال به طور همگن توزیع شدند، اگرچه با پروفایل های بیان پایین تر (شکل 7B، شکل S4B، و جدول S5). با این وجود، برخی از تفاوت ها را می توان قدردانی کرد: دی پپتیدیل-پپتیداز IV (DPPIV)، فاکتور رشد/تمایز 15 (GDF-15)، و IL-8 تنها توسط f-hAFS-EVSHypo بیان شد، اگرچه در پایین سطوح؛ ANGIOPOIETIN2، CD40 LIGAND و پروتئین متصل شونده به ویتامین D (VDBP) تنها در p-hAFS-EVShypo یافت شد، علیرغم اینکه بار دیگر در مقادیر کم شناسایی شد. سایر سایتوکاین‌ها مانند فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF)ENDOGLIN، FGF{17}}، پروتئین اتصال دهنده فاکتور رشد شبه انسولین 3 (IGFBP3)، IL{21}}a، MIF OPN، PTX3، فاکتور مشتق از استرومال {23}} آلفا (SDF-1a)، در هر دو f-hAFS-EVShypo و p-hAFS-EVSHvpo یافت شد، با PAI{29}} و EMMPRIN که بیان بیشتری دارند (شکل 7B)

BDNF، ENDOGLIN، IGFBP3، و SDF-lo به طور انحصاری در تمام دارای-EVهای هیپوکسیک در مقایسه با hAFS-CM مربوطه، صرف نظر از مرحله حاملگی، غنی شدند. علاوه بر این، در حالی که EMMPRIN در p-hAFS-CMhypo شناسایی نشد، در بخش مربوطه EV غنی شده بود. برعکس، OPN در f-have-CMhypo نسبت به f-have-EVShypo فراوان‌تر بود، در حالی که در میان بخش‌های ترشحی مربوطه p-hAFS قابل مقایسه بود. FGF{11}}، MIF، و PTX3 به طور مشابه در هر دو جنین و پری ناتال دارای-CM و در hAFS-EVs مربوطه بیان شد. PAI{16}} در بخش های ترشحی هیپوکسیک بسیار غنی بود.

شکل 7. پروفایل سیتوکین و کموکاین در فرمولاسیون ترشحی hAFS جنینی و پری ناتال. (الف) بیان سیتوکین‌ها و کموکاین‌های شناسایی‌شده در هیپوکسیک جنینی-در مقابل دارای-CM پری ناتال (f-hAFS-CMHypo در مقابل p-hAFS-CMHypo) در تراکم پیکسلی توسط واحد دلخواه [AU] گزارش می‌شود. مقادیر به عنوان میانگین ± نیم آزمایشات مستقل بیان شده و در جدول S4 گزارش شده است. در مقابل hAFS-EVs پری ناتال (f-hAFS-EVSHypo در مقابل p-hAFS-EVSHypo) و با تراکم پیکسل در واحدهای دلخواه [AU] بیان می شود.کلسترول سیستانچمقادیر به صورت میانگین±مجموع n{0}} آزمایش مستقل بیان شده و در جدول S5 گزارش شده است. CST3: سیستاتین C؛ EMMPRIN: القاء کننده متالوپروتئیناز ماتریکس خارج سلولی؛ FCFF-19: فاکتور رشد فیبروبلاست-19؛ IGFBP2: فاکتور رشد شبه انسولین (IGF) پروتئین اتصال 2؛ IL{8}}: اینترلوکین -8;IL-17a:اینترلوکین-17a; MCP{12}}: پروتئین جذب کننده شیمیایی مونوسیت-1;MIF: عامل بازدارنده مهاجرت ماکروفاژ. PTX3: Pentraxin 3; PAI{16}}: مهارکننده فعال کننده پلاسمینوژن-1؛ BDNF: فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز. DPPIV: دی پپتیدیل پپتیداز IV. GDF-15:فاکتور تمایز رشد-15;IGFBP3:فاکتور رشد شبه انسولین(IGF)پروتئین اتصال 3;SDF-1a: فاکتور مشتق از استرومال-1 آلفا. VDBP: پروتئین اتصال دهنده ویتامین D.

2.7. وسایل نقلیه الکتریکی جنینی و پری ناتال با اطلاعات RNA در محموله خود غنی شده اند

از آنجایی که RNA های کوچک غیر کدکننده به عنوان تنظیم کننده اصلی تأثیر پاراکرین EV بر روی سلول های هدف در نظر گرفته شده اند [4،55]، ما عمدتاً تجزیه و تحلیل توالی RNA را روی محتوای microRNA (miRNA) در f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs متمرکز کردیم. پروفایل RNA کوچک غنی‌سازی miRNA را در hAFS-EVs جنینی و پری ناتال (حدود 35-36 درصد) در مقایسه با کل مقدار RNA کوچک نشان داد (شکل 8A). جزء miRNA در واقع در میان دو گونه RNA که در هر دو فرمولاسیون EV، همراه با rRNA(***p) p < 0.0001)="" در="" میان="" دو="" گونه="" rna="" بود.="" mirna="" های="" زیر="" در="" نمونه="" های="" ev="" تجزیه="" و="" تحلیل="" شده="" بسیار="" غنی="" بودند:="" mir-31-5p;="" mir{14}}a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir{18}}a-5p;="" mir-27b-3p،="" let-7a-5p،="" let-7b-5p،="" let-7f{="" {27}}p,let-7i-5p,mir{30}}p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p،="" mir-125b-5p،="" mir-155-5p،="" mir-191-5p="" و="" mir-221-3p.="" قابل="" توجه،="" evهای="" جنینی="" و="" پری="" ناتال="" دارای="" اکثر="" mirna‌های="" مشترک="" هستند="" (یعنی="" let-7a-5p,let-7b-5p,let{47="" }}f-5p،="" let-7i-5p،="" mir-16-5p،="" mir-21-5p،="" mir-29a{54="" }}p,mir30a-5p،="" mir-125b-5p،="" mir-155-5p،="" mir-191-5p="" و="" mir-221-3p،="" شکل="" 7b).="" 15="" گونه="" mirna="" های="" غنی="" شده="" بیش="" از="" 60="" درصد="" از="" کل="" محتوای="" mirna="" را="" در="" هر="" نمونه="" پوشش="" دادند.="" از="" سوی="" دیگر،="" حدود="" 100="" mirna="" در="" 30="" درصد="" باقی="" مانده="" از="" محتوای="" mirna="" تاولی="" یافت="" شد="" (شکل="">

برای توصیف بیشتر محتوای miRNA در hAFS-EVs، بررسی کردیم که آیا مرحله حاملگی hAFS یا پیش‌شرطی‌سازی سلول‌های هیپوکسی در شرایط آزمایشگاهی می‌تواند بر غنی‌سازی miRNA‌های خاص تأثیر بگذارد. قوی‌ترین مدولاسیون بین مراحل بارداری پیدا شد، جایی که تقریباً تمام miRNA‌های مدوله‌شده با f-hAFS-EVs نسبت به همتای پری ناتال غنی شدند (شکل 9A و جدول 1). پیش شرط هیپوکسیک تأثیر ملایم تری بر محموله miRNA داشت، در حالی که در این مقایسه مدولاسیون در هر دو جهت بود، با برخی از miRNA ها در شرایط هیپوکسیک غنی شده و برخی دیگر در شرایط کنترل نرموکسیک (شکل 9A).

به عنوان یک تجزیه و تحلیل تکمیلی، ما بر شناسایی miRNA های بررسی شده با کمترین تنوع در بین دهنده های مختلف و پیش شرط کشت، برای EV های مشتق شده از هر دو مرحله حاملگی مورد بررسی تمرکز کردیم. miRNA های حاصل از این تجزیه و تحلیل از سطوح بیان بالا تا پایین را شامل می شود (شکل 9B). در پایدارترین هسته miRNA محموله hAFS-EVs، تعدادی miRNA مشترک بین f-hAFS-EV و p-hAFS-EV شناسایی شدند (miR-21-5p, miR-29a-3 p، miR-16-5p در سطح بالا؛ miR-221-3p، miR-221-5p و miR{12}}p در سطح کم، جدول 2).

شکل 9. تجزیه و تحلیل غنی سازی افتراقی miRNA ها در hAFS-EV های جنینی و پری ناتال. (الف) طرح‌های آتشفشانی برای غنی‌سازی افتراقی محموله miRNA hAFS-EV با توجه به مرحله حاملگی (پانل سمت چپ) و پیش‌شرطی‌سازی هیپوکسیک در شرایط آزمایشگاهی سلول‌های ترشح کننده (پانل سمت راست). برای جزئیات miRNA، لطفاً به جدول 1 مراجعه کنید. (B) نمودار پراکندگی همبستگی بین تغییرپذیری (محور X) و سطح غنی‌سازی (محور Y) miRNA‌های پایدار در hAFS-EVs جنینی (پانل سمت چپ) و hAFS-EVs پری ناتال (پانل سمت راست) با توجه به بالا (نقاط زرد)، غنای کم (نقاط سبز) و کم (نقاط بنفش تیره). برای جزئیات miRNA، لطفاً به جدول 2.RPM: خواندن در میلیون مراجعه کنید.

3. بحث

نمونه‌های دور ریخته‌شده مایع آمنیوتیک انسانی به‌عنوان منبع ارزشمند سلول‌های استرومایی با پتانسیل امیدوارکننده در پزشکی احیاکننده و مهندسی بافت شناسایی شده‌اند. نگرانی‌های اخلاقی مرتبط با جداسازی آن‌ها بسیار کم است، زیرا می‌توان آن‌ها را از نمونه‌های باقیمانده از آمنیوسنتز غربالگری معمول پیش از تولد، در طول سه ماهه دوم بارداری (hAFS جنینی)، یا از مایع آمنیوتیک که به عنوان زباله بالینی در سزارین برنامه‌ریزی‌شده سه ماهه سوم دور ریخته می‌شود، به دست آورد. روش‌ها (hAFS پری ناتال). در سال‌های اخیر، hAFS به عنوان درمان بالقوه برای ترمیم و بازسازی بافت انسانی با توجه به شواهد دلگرم‌کننده به‌دست‌آمده از مدل‌های بیماری تجربی پیشنهاد شده‌است. جالب توجه است، آنها همچنین برای درمان رحمی بیماری‌های عصبی جنینی-نوزادی پیشنهاد شده‌اند. در واقع، مطالعات پیش بالینی نشان داد که hAFS که در دوران بارداری از طریق زایمان درون آمنیوتیک تجویز می‌شود، از طناب نخاعی در طول بارداری از طریق فعالیت پاراکرین در یک مدل موش میلومننگوسل [56-58] محافظت می‌کند و آسیب روده در معرض در معرض گاستروشیزیس جوندگان را کاهش می‌دهد[59] ]. از منظر ترجمه، پیوند داخل رحمی hAFS را می توان با تجویز مناسب ترین آماده سازی ترشحات آنها (hAFS-CM یا hAFS-EVs) جایگزین کرد.عوارض جانبی cistanche deserticolaاین استراتژی با غلبه بر محدودیت‌های سلول درمانی متعارف (به عنوان مثال، زمان‌بر گسترش سلول‌های آزمایشگاهی) و در عین حال ارائه فرمول‌های دارویی آماده و آماده برای استفاده، مداخله سریع و به‌موقع در دوران بارداری را ممکن می‌سازد.

توسعه اخیر تکنیک‌های تشخیصی پیش از تولد کمتر تهاجمی ممکن است منجر به کاهش روش‌های آمنیوسنتز در آینده نزدیک شود، بنابراین از hAFS پری ناتال به عنوان گزینه در دسترس‌تر حمایت می‌کند. با این وجود، از آنجایی که hAFS جنینی از نظر رشدی نابالغ تر است، ممکن است پتانسیل پاراکرین موثرتری را در خود جای دهد. در این سناریو، در اینجا ما c-KITt hAFS جنینی و پری ناتال را با هم مقایسه کردیم و روی پروفایل‌سازی بخش‌های ترشحی آنها تمرکز کردیم. ما تمایزات مربوطه را برجسته کردیم که باید برای ترجمه بالینی احتمالی ظرفیت پاراکرین آنها در نظر گرفته شود.

در توافق با مطالعات مستقل قبلی، نشان می‌دهیم که مرحله حاملگی بر مورفولوژی ناهمگن hAFS و پروفایل آنتی ژن مزانشیمی آن‌ها تأثیری ندارد [25،26]. سپس پارامترهایی را ارزیابی کردیم که احتمالاً بر فعالیت ترشحی و پاراکرین سلولی فراتر از ایمونوفنوتیپ استرومایی متعارف تأثیر می‌گذارند. به طور قابل‌توجهی، اخیراً نشان داده شده است که وجود یک زیرجمعیت CD{2} مثبت با CD107a بالا در اجداد مزانشیمی مغز استخوان با فعالیت پاراکرین تعدیلی و درمانی قابل توجهی مرتبط است [47]. در اینجا ما نشان دادیم که hAFS جنینی و پری ناتال به شدت با این امضای مولکولی مشخص می شود که از قدرت ترشحی آنها با پیامدهای ترجمه مرتبط پشتیبانی می کند. علاوه بر این، hAFS جنینی با متابولیسم هوازی ناکارآمد مشخص شد، در حالی که آنهایی که بالغ‌تر بودند، میزان مصرف اکسیژن و سنتز ATP بالاتری را نشان دادند. این ممکن است نمایانگر پروفایل متابولیکی نابالغ تر hAFS سه ماهه دوم باشد که شبیه سلول های استرومای بند ناف نوزادان نارس است که همین روند را نشان داده اند [60].

به منظور تحریک پتانسیل پاراکرین، hAFS در معرض پرایمینگ هیپوکسیک بدون سرم 24 ساعته قرار گرفتند، استراتژی که ما قبلاً با موفقیت [34،35،37] برای سلول های جنینی توسعه داده بودیم و در اینجا برای اولین بار روی همتای پری ناتال آنها بررسی کردیم. آماده سازی hAFS جنینی و پری ناتال تحت هیپوکسی منجر به یک روند مثبت در افزایش غلظت ترشحات آنها و در مقدار EVهای آزاد شده شد، در حالی که مرحله حاملگی هیچ تأثیری بر بازده ترشحات سلولی و همچنین بر مورفولوژی و توزیع اندازه EV نداشت.

به طور قابل‌توجه، توصیف محموله پاراکرین hAFS با توجه به شرایط مختلفی که ارزیابی کردیم، تفاوت‌های خاصی را نشان داد. پروفایل پروتئومی ترشحات hAFS جنینی، توزیع فاکتورهای قابل تشخیص را بر اساس مرحله حاملگی و پیش شرط هیپوکسیک سلولی نشان داد. این نشان می‌دهد که پتانسیل پاراکرین hAFS می‌تواند در طول بلوغ از سه ماهه بارداری Ⅱ تا Ⅲ هویت مشخصی به دست آورد که به نوبه خود می‌تواند با تحریک سلول‌های ترشح کننده در شرایط آزمایشگاهی تعدیل شود. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی فرآیندهای بیولوژیکی hAFS-CM و hAFS-EVs نشان داد که بیشتر پروتئین‌های تعدیل‌شده ممکن است با رشد/نگهداری سلول و متابولیسم پروتئین مطابقت داشته باشند، بنابراین از اثرات مفید پاراکرین سلولی که تاکنون گزارش شده‌اند حمایت می‌کنند. به طور خاص، ترشح کل هیپوکسیک جنین hAFS غنی شده با پروتئین شوک حرارتی HSPD1 (HSP60) یافت شد، که نشان داده شد که از بهبود زخم در مدل آسیب پوستی موش دیابتی پشتیبانی می کند و انحراف ماکروفاژها را به سمت فنوتیپ M2 ترویج می کند [61] . به همین ترتیب، hAFS-EV های هیپوکسیک جنین برای عواملی که باعث رشد نوروژنز می شوند (HSPG2 [62]، خود نوسازی سلولی، و رشد مغز و قلب و عروق (LAMA5 [63] و LAMB1 [64] و مهاجرت (THBS1 [2]) غنی شدند. AGRN همچنین در EV ها به دنبال پرایمینگ هیپوکسیک hAFS جنینی یافت شد.دوز cistanche redditیافته‌های ما مطابق با شواهد قبلی دال بر تنظیم مثبت AGRN در پروتئوم سلول‌های استرومایی مزانشیمی تحت محرک‌های آموزنده التهابی و هیپوکسیک است[65]. همچنین نشان داده شده است که AGRN در سیگنال دهی سیناپس ایمنی نقش دارد [66] و با بازسازی قلب موش نوزادی مطابقت دارد [67]، بنابراین از استعداد بارز hAFS جنین جوان نسبت به اثرات پاراکرین احیا کننده حمایت می کند. علاوه بر این، تایید شد که hAFS جنین به پیش‌شرطی‌سازی هیپوکسیک پاسخ بیشتری می‌دهد، همانطور که با غنی‌سازی پیش‌بینی‌کننده‌های اثر بازسازی عروقی، مانند ANGIOGENIN، EMMPRIM، IL{3}}، و MCP{4}} سیتوکین[68]، نشان داده شد. رسانه شرطی شده آنها این از شواهد قبلی در مورد قدرت پاراکرین hAFS-CM جنینی در تقویت نئوآرتریوژنز درون زا در مدل‌های جوندگان پیش بالینی انفارکتوس میوکارد، ایسکمی اندام عقبی، و فلپ فاسیوکتانئوس ایسکمیک حمایت می‌کند [34،{10}}]علاوه بر این، AFS، سکرتوم کل به طور قابل توجهی غنی‌تر از IGFBP2 و OPN در مقایسه با دوره پری ناتال یافت شد، بنابراین نمایه تعدیل‌کننده پیش‌حل‌کننده و ضد پیری بارزتر را نشان می‌دهد[{14}}]. دارای CM پری ناتال، در حالی که در فاکتورهای پاراکرین کمتر افزایش یافته بود، به طور مشابه با عوامل نوروتروفیک و تعدیل کننده ایمنی، مانند CST3 [76،77] و MIF [78] تکمیل شد.

در مقایسه با کل hAFS-CM، همتایان هیپوکسیک جنینی و پری ناتال- EV مربوطه بیان کمتری از سیتوکین ها و کموکاین ها را نشان دادند، به استثنای واسطه بازسازی عروق EMMPRIN [79] که بیشتر در محفظه وزیکول غنی شده بود. مشخصات قلبی فعال و پیش‌سازنده hAFS-EVهای جنینی[34،37] که قبلاً گزارش شده بود، در اینجا با شواهدی مبنی بر بیان انحصاری IL{9}} [80] و GDF{11}} محافظ قلبی آنها تأیید شده است، یک فاکتور پاراکرین کلیدی که نوروژنز هیپوکامپ بالغ درون زا را تحریک می کند [81،82]، و همچنین با سمیت قلبی ناشی از آنتراسایکلین مقابله می کند [78]. هر دو hAFS-EVs جنینی و پری ناتال بیان مشابهی را برای تنظیم‌کننده قاچاق سلول‌های بنیادی SDF-1 [{19}}] نشان دادند. آنالیز پروتئومی افزایش بیان پروتئین‌های مرتبط با رگ‌زایی، مانند NRP1 [86] و MP14[87] را در hAFS-EVs پری ناتال هیپوکسیک گزارش کرد. چنین پروفایل تحریکی ممکن است نتایج قبلی را در مورد خواص بازسازی اندوتلیال hAFS سه ماهه Ⅲ در یک مدل موش پیش بالینی آسیب ایسکمیک عضله اسکلتی [25] توضیح دهد، علیرغم شواهدی مبنی بر اینکه hAFS-CM آنها نسبت به جنین متناظر آن رگ زایی کمتری دارد. به طور قابل‌توجه، فاکتور رشد عصبی BDNF در محموله‌های EV جنینی و پری ناتال، اگرچه در مقادیر کم، یافت شد، بنابراین یک فعالیت نوروتروفیک فرضی برای hAFS-EVs در بقای نورون‌ها و فرآیندهای رشد عصبی را نشان می‌دهد، همانطور که برای وزیکول‌های خارج سلولی ترشح شده از استخوان انسان نیز مشاهده شد. مغز و خون بند ناف-MSC[8889]. هر دو فرمولاسیون ترشحی از hAFS جنینی و پری ناتال که تحت تحریک هیپوکسیک قرار می‌گیرند، با PAI غنی شده‌اند، تسهیل‌کننده فعال‌سازی اندوتلیال [90] که همچنین در پلاریزاسیون ماکروفاژهای M2 در قلب نقش داشته و دارای محافظ قلبی است. و پتانسیل ضد فیبروتیک [91].

MicroRNA ها (miRNA ها) به طور گسترده به عنوان تنظیم کننده های حیاتی فعالیت پاراکرین سلول های استرومایی سلول های بنیادی و مزانشیمی مورد توجه قرار گرفته اند [92،93]. در اینجا ما دریافتیم که 15 گونه miRNA غنی شده در hAFS-EVs بیش از 60 درصد از کل محتوای miRNA در هر نمونه را پوشش می دهند. گزارش شده است که این miRNA ها محموله مولکولی سلول های استرومایی مزانشیمی را مشخص می کنند (بگذارید-7a-5p [4,95])، با تأثیر بر بازسازی عروقی و مهار فیبروز، از ایسکمی میوکارد محافظت می کنند. -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p و miR-155-5p [96,97])، تبلیغ بهبود زخم با تنظیم عملکرد کراتینوسیت (miR{20}}p [98]) و مقابله با مرگ عصبی پس از ایسکمی مغزی جلویی (miR-29a-3p [99,100]). از سوی دیگر، حدود 1000 miRNA در 30 درصد باقیمانده محتوای miRNA تاولی یافت شد. چنین توزیع نامتعادلی با مطالعات قبلی [4] مطابقت دارد و miRNA های عمدتا غنی شده را به عنوان آنهایی که مسئول اصلی فعالیت بیولوژیکی hAFS-EVs هستند برجسته می کند. جالب توجه است که hAFS-EV های جنینی و پری ناتال اکثریت 15 miRNA را به اشتراک می گذارند. قابل ذکر است، ما همچنین مشاهده کردیم که هم hAFS-EVهای جنینی و هم آنهایی که در دوران بارداری هستند دارای مجموعه‌ای از miRNA‌های بسیار پایدار در سطوح مختلف غنی‌سازی هستند. چنین شواهدی ممکن است طیف وسیعی از نامزدهای "خانه داری" را برای استفاده به عنوان یک کنترل مرجع داخلی در آزمایش های qPCR بر روی hAFS-EV ها نشان دهد. علاوه بر این، یک زیر مجموعه ثابت از چنین miRNA های پایدار (miR{35}}p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR{41}}p) بین دو مرحله حاملگی مشترک است و با 15 مرحله عمدتاً غنی شده همپوشانی دارد، که نشان‌دهنده یک رفتار ثابت‌تر و یک امضای مولکولی پیش‌تحلیل قابل اعتماد است([96،{45] }}]). شایان ذکر است، اخیراً چند کاندید در چنین هسته متمایزی به عنوان miRNA مرجع در EVهای محافظ عصبی به‌دست‌آمده از سلول‌های استرومایی مزانشیمی مشتق از مایع آمنیوتیک سه ماهه دوم (miR{47}}a-3p و miR{{{{{ 49}}p[95]). با این وجود، ما همچنین متوجه شدیم که سن حاملگی ممکن است محموله miRNA را بیشتر از پیش شرط هیپوکسیک تعدیل کند. EVهای نوجوانی بیشتری که از hAFS سه ماهه سوم جنین به دست آمده بودند با miRNA هایی که قبلا نشان داده شده بود برای حمایت از زنده ماندن سلول های بنیادی جنینی (miR{51}}p [101])، تکثیر سلولی، و تمایز استخوانی سلول های استرومایی مغز استخوان (miR) غنی شده بودند. -217 [102])، در حالی که پتانسیل سرکوبگر تومور را نیز در خود جای داده است (miR-302-3p[103,104]); miR-383-5p[105,106].

بر اساس نتایج ما، در اینجا تأیید می‌کنیم که hAFS جنینی و پری ناتال ممکن است منابع پاراکرین جذابی را برای استفاده در پزشکی احیاکننده نشان دهد. در حالی که نوع فنو و فعالیت ترشحی آنها مشابه بود، ما برخی از جنبه های عجیب و غریب در فرمول های ترشحی آنها را به عنوان بینش مفید برای ترجمه درمانی آینده آنها برجسته کرده ایم.

4. مواد و روش ها

4.1. جداسازی سلول های بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی و کشت آزمایشگاهی

سلول‌های بنیادی مایع آمنیوتیک انسانی (hAFS) از نمونه‌های باقی‌مانده مایع آمنیوتیک (AF) جمع‌آوری‌شده با غربالگری معمول قبل از تولد از طریق آمنیوسنتز Ⅱ سه ماهه (جنین hAFS، f-hAFS)، یا به‌عنوان ضایعات بالینی در طول زایمان سزارین برنامه‌ریزی‌شده در طول سه ماهه دوم بارداری جدا شدند. (hAFS، p-hAFS پری ناتال) در واحد تشخیص قبل از تولد و پزشکی پری ناتال، بیمارستان IRCCS San Martino، در بخش پزشکی و جراحی جنین و پری ناتال و آزمایشگاه ژنتیک انسانی در بیمارستان IRCCS Istituto Gaslini (جنووا، ایتالیا). رضایت کتبی آگاهانه از همه اهداکنندگان طبق مجوز کمیته اخلاقی محلی (پروتکل PR428REG2015) و مطابق با دستورالعمل‌های اعلامیه هلسینکی اخذ شد. نمونه‌های AF جنین سه ماهه دوم از اهداکنندگان زن با میانگین سنی حدود 0.32 ± 37.42 سال (n{10}} در محدوده سنی 36-تا 41 سال) به‌دست آمد. اهداکنندگان زن با میانگین سنی 1.31±34.25 سال (n{17}} از 26- تا 42 سال). hAFS جنینی و پری ناتال از نمونه‌های تایید شده برای کاریوتیپ طبیعی و جداسازی با مرتب‌سازی ایمونومغناطیسی برای بیان c-KIT (کیت CD117 MicroBead، Miltenyi Biotechnology، بولونیا، ایتالیا) از سلول‌های استرومایی مزانشیمی AF به دست آمد [16].فواید عصاره سیستانچc-KIT* hAFS در محیط حداقل ضروری (MEM) -آلفا با 15 درصد FBS (سرم جنین گاوی، Gibco-Thermo Fisher Scientific، Monza، ایتالیا)، 18 درصد Chang B و 2 درصد محیط Chang C (Irvine Scientific کشت داده شد. سانتا آنا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) با 1 درصد ال-گلوتامین و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy)، در انکوباتور در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 و 20 درصد اتمسفر اوز و کشت. به 5 پاساژ در شرایط آزمایشگاهی قبل از استفاده برای جداسازی ترشحات آنها.

4.2. ارزیابی بیوشیمیایی متابولیسم hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) برای هر آزمایش از سلول ها استفاده شد. برای ارزیابی تنفس پایه، hAFS با 0.03 میلی‌گرم در میلی‌لیتر دیژیتونین به مدت 10 دقیقه نفوذپذیر شد و در بافر فسفات سالین (PBS) معلق شد. 10 میلی‌مولار پیرووات به اضافه 5 میلی‌مولار مالات یا 20 میلی‌مولار سوکسینات برای تحریک مسیر اضافه شد. -راه‌هایی که به ترتیب توسط مجتمع‌های I، II و IV یا مجتمع‌های Ⅱ و IV تشکیل شده‌اند [60].

برای ارزیابی سهم نسبی در تنفس گلوتامین، اکسیداسیون اسیدهای چرب با زنجیره بلند و گلوکز، پس از نفوذپذیری دیژیتونین، سلول‌ها در محیط رشد و 4 میکرومولار BPTES، 4 میکرومولار Etomoxir و 4 uM UK5 معلق شدند{22} }99 به ترتیب برای مهار گلوتامیناز، کارنیتین پالمیتویل ترانسفراز 1A (CPT1A)، یا حامل پیروات میتوکندری (MPC) اضافه شدند. فعالیت Fi-F.ATP سنتاز (ATP synthase) با اندازه گیری تولید ATP با روش بسیار حساس لوسیفرین/لوسیفراز شناسایی شد. سنجش ها در دمای 37 درجه به مدت 2 دقیقه انجام شد و داده ها هر 3{29}} ثانیه جمع آوری شد. در اولین مجموعه آزمایش‌ها، سلول‌های 1{38}} درجه به مدت 1{49}} دقیقه در محیطی حاوی 50 میلی‌مولار KCl، 1 میلی‌مولار KCl، 1 میلی‌مولار KCl، 1 میلی‌مولار KCl، 2 میلی‌متر MEDTA، 5 mMKH2PO4، 2mMMgC12، 0.6 میلی‌مولار موابائین، 1 میلی‌مولار P1P{26}Di انکوبه شدند. (آدنوزین{27}}') پنتا فسفات، 0.040 میلی گرم در میلی لیتر آمپی سیلین، و 10 میلی مولار تریس-HCl pH7.4. پس از آن، سنتز ATP با افزودن بسترهای تنفسی (10 میلی‌مولار پیروات به علاوه 5 میلی‌مولار مالات یا 20 میلی‌مولار سوکسینات) و 0.1 میلی‌مولار ADP القا شد. واکنش با استفاده از کیت سنجش بیولومینسانس لوسیفرین/لوسیفراز ATP CLSII (روش، بازل، سوئیس) در یک لومینومتر (GloMax 20/20 لومینومتر، پرومگا، میلان، ایتالیا) محلول‌های استاندارد ATP (روش، بازل، سوئیس) اندازه‌گیری شد. 42}}/M برای کالیبراسیون استفاده شد. در مجموعه دوم آزمایشات، سنتز ATP در حضور 4 میکرومولار BPTES، 4 میکرومولار Etomoxir یا 4 میکرومولار UK5099 مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مورد، 10 سلول به مدت 10 دقیقه در محیط رشد در غیاب یا حضور یک انکوبه شدند. مهارکننده متابولیسم، و سنتز ATP با 0.1 میلی مولار ADP القا شد. بازده OxPhos (فسفوریلاسیون اکسیداتیو) (نسبت P/O) به عنوان نسبت بین غلظت ATP تولید شده و مقدار اکسیژن مصرفی در حضور بستر تنفسی و ADP محاسبه شد. هنگامی که مصرف اکسیژن به طور کامل به تولید انرژی اختصاص داده می شود، نسبت P/O باید تقریباً 2.5 و 1.5 پس از افزودن پیروات به اضافه مالات یا سوکسینات باشد [48] برای ارزیابی سهم گلیکولیز بی هوازی در متابولیسم hAFS، غلظت گلوکز و لاکتات ارزیابی شد. در محیط رشد مصرف گلوکز توسط سیستم جفت هگزوکیناز (HK) و گلوکز{56}فسفات دهیدروژناز (G6PD) به دنبال کاهش NADP در 340 نانومتر ارزیابی شد. محیط سنجش حاوی 100 میلی‌مولار Tris-HCl، pH7.4، 2 میلی‌مولار ATP، 10 میلی‌مولار MNADP، 2 میلی‌مترgC12، 2 واحد بین‌المللی هگزوکیناز و 2 واحد بین‌المللی گلوکز{69}فسفات دهیدروژناز بود. انتشار لاکتات به دنبال کاهش NAD به علاوه در 340 نانومتر مورد سنجش قرار گرفت. محیط سنجش حاوی 100 میلی‌مولار Tris-HCl (pH8)، 5 میلی‌مولار NAD پلاس، و 1 واحد بین‌المللی در میلی‌لیتر لاکتات دهیدروژناز بود. نمونه‌ها قبل و بعد از افزودن 4 میکروگرم لاکتات دهیدروژناز خالص آنالیز شدند. در هر دو مورد، داده ها به تعداد سلول نرمال شد و به ترتیب به صورت mM گلوکز/سلول 10 درجه یا میلی مولار لاکتات آزاد شده/سلول 10 درجه بیان شد[107].

4.3. فلوسیتومتری مشخصه hAFS

صد هزار (1{14}}5) سلول جنینی و p-hAFS جدا شده و با موش anti-human-CD107a-Alexa Fluor 647-و CD anti-human146-FITC- انکوبه شدند. آنتی بادی های کونژوگه (eBioscience، Thermo Fisher Scientific، Monza، ایتالیا). آپوپتوز سلولی با استفاده از کیت تشخیص آپوپتوز FITC Annexin V (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italy) طبق دستورالعمل سازنده ارزیابی شد. رویدادها بر روی یک مرتب کننده و آنالایزر BD Bioscience FACS Aria II، مجهز به نرم افزار FACS Diva (BD Bioscience، Bec-ton Dickinson، میلان، ایتالیا) به دست آمد. داده ها با استفاده از نرم افزار FlowJo V9.0 (BD Bioscience، Becton Dickinson، Milan) تجزیه و تحلیل شدند. ، ایتالیا). 4.4. رنگ آمیزی پیری

فنوتیپ پیری hAFS کشت شده تا پاساژ 5 در شرایط آزمایشگاهی استاندارد با کیت رنگ‌آمیزی سنسنس - گالاکتوزیداز (تکنولوژی سیگنال‌دهی سلولی، Danvers، MA، ایالات متحده آمریکا) مورد ارزیابی قرار گرفت: p-hAFS f-hand با محلول ثابت کننده 1x در 70 درصد تثبیت شد. مطابق دستورالعمل سازنده یک شبه در دمای 37 درجه برای SA{6}} gal رنگ آمیزی شد. رویدادهای پیر در میکروسکوپ Leica DMil (مجهز به نرم‌افزار Leica Acquire V3.4.4، Leica Microsystems، میلان، ایتالیا) جمع‌آوری شد و به عنوان درصدی از سلول‌های SA{11}گال مثبت نسبت به کل سلول‌ها در هر میدان ارزیابی شد.

4.5. جداسازی و تمرکز فراکسیون های ترشحی hAFS

f-hAFS و p-hAFS به مدت 24 ساعت در محیط بدون سرم (SF) در 1 درصد هیپوکسی O2 در مقابل 20 درصد O2 normoxia (شاهد) کشت داده شدند، که دومی به عنوان مرجع پایه استفاده شد. همانطور که قبلاً گزارش کردیم [34،35،37،49]، این استراتژی پیش شرطی برای افزایش آزادسازی عوامل پاراکرین فعال زیستی مورد استفاده قرار گرفت. hAFS به مدت 24 ساعت در محیط بدون سرم (SF) (محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco با گلوکز بالا، DMEM، با 1 درصد ال-گلوتامین و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین، همه از Gibco-Thermo Fisher Scientific، Monza، ایتالیا)، تحت normox کشت داده شدند. (20 درصد O2 و 5 درصد CO2 در 37 درجه) یا هیپوکسیک (1 درصد O2 و 5 درصد CO2 در 37 درجه در انکوباتورهای CellXpert C170i و Galaxy 48R CO2، از Eppendorf، میلان، ایتالیا) شرایط.

f-hAFS-CM و p-hAFS-CM جمع آوری و در دمای 4 درجه در 3{40}}0x گرم به مدت 10 دقیقه و 2000×g به مدت 20 دقیقه برای حذف بقایای سلولی سانتریفیوژ شدند. hAFS-CM با استفاده از غشاهای اولترافیلتراسیون با یک برش انتخابی 3 کیلو دالتون (Amicon Ultra{12}}، Merck Millipore Darmstadt، آلمان) در 4 درجه در 3000× گرم به مدت 90 دقیقه متمرکز شد و سپس بیشتر در 4 متمرکز شد. درجه در 3{38}}× گرم به مدت 30 دقیقه. hAFS-EVs با اولتراسانتریفیوژ سریال از hAFS-CM جدا و متمرکز شدند. به طور خلاصه، hAFS-CM جمع آوری شد و در دمای 4 درجه در 300 × g به مدت 10 دقیقه و 2000 x g به مدت 20 دقیقه برای حذف بقایای سلولی سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی در 10000 × گرم به مدت 40 دقیقه پردازش شد. گلوله دور ریخته شد و مایع رویی با اولتراسانتریفیوژ در Optima L{30}}K (Beckmann Coulter، میلان، ایتالیا) در 10000×g به مدت 120 دقیقه با استفاده از روتورهای سانتریفیوژ SW55Ti سطل نوسانی Beckman Coulter پردازش شد. گلوله حاوی hAFS-EVs ناهمگن در PBS با سانتریفیوژ نهایی در 100000 × گرم به مدت 120 دقیقه شسته شد و سپس در PBS فیلتر شده با یک غشای فیلتر منافذ 0.22 میکرونی معلق شد. غلظت پروتئین در hAFS-CM و روی سطح hAFS-EVs با استفاده از روش BiCinchoninic Acid (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) اندازه‌گیری شد. نمونه‌ها بر روی یک میکروپلیت ریدر Gen5 در 570 نانومتر برای ارزیابی بازده hAFS-CM و hAFS-EVs بر حسب ug از محلول/10 درجه سلول‌های تولیدکننده به دست آمد.

4.6. شناسایی hAFS-EVs با میکروسکوپ الکترونی انتقالی و تجزیه و تحلیل ردیابی نانوذرات

تجزیه و تحلیل میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) روی میکروسکوپ هیتاچی TEM (سری HT78{8}}0، Hitachi High Technologies، Monza، ایتالیا) انجام شد. تصاویر دیجیتال با دوربین Mega view 3 و نرم افزار Radius (EMSIS، Muenster، آلمان) گرفته شد. f-hAFS و p-hAFS در محلول 3.7 درصد پارافورمالدئید (PA) رقیق شده 1:1 با محیط کامل hAFS تثبیت شدند، در بافر کاکودیلات 0.1 مولار شسته شدند و سپس بلافاصله به مدت 1 ساعت در دمای اتاق در انکوبه شدند. بافر کاکودیلات 0.1 مولار حاوی 2.5 درصد گلوتارآلدئید (علم میکروسکوپی الکترونی، هاتفیلد، PA، ایالات متحده آمریکا). گلوله های سلولی به مدت 1 ساعت در تتروکسید اسمیم و به مدت 1 ساعت در محلول 1 درصد اورانیل استات تثبیت شدند. نمونه ها به مدت 24 ساعت در دمای 42 درجه و 48 ساعت در دمای 60 درجه از طریق یک سری اتانول درجه بندی شده آبگیری شدند و در رزین اپوکسی (Poly-Bed؛ Polysciences Europe GmbH، مینیاپولیس، آلمان) جاسازی شدند. مقاطع بسیار نازک (50 نانومتر) با میکروتوم لایکا اولتراکات (Leica Microsystems، میلان، ایتالیا) برش داده شد و با اورانیل استات 5 درصد در محلول اتانول 50 درصد رنگ آمیزی شد. f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs در 20 uL محلول PBS معلق شدند و با افزودن حجم مساوی 2 درصد پارافورمالدئید در محلول بافر فسفات 0.1 مولار (pH7.4) ثابت شدند. سپس EVها به مدت 10 دقیقه روی شبکه‌های مسی پوشش‌داده‌شده با کربن با شناور کردن شبکه‌ها روی قطره‌های 5 میکرولیتری روی پارافیلم جذب شدند. متعاقباً، شبکه‌هایی با EVs چسبیده در PBS شستشو داده شدند و با محلول اورانیل استات 2 درصد به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق رنگ‌آمیزی منفی شدند. شبکه های رنگ آمیزی شده در 2.5 درصد متیل سلولز برای نگهداری بهتر تعبیه شد و قبل از آزمایش در هوا خشک شد. تجزیه و تحلیل مورفومتری hAFS-EVs بر روی 10 میکروگراف به طور تصادفی در 40 اندازه‌گیری شد.{46}}× g بزرگنمایی. اندازه با استفاده از تابع خط دلخواه تعبیه شده در کادر محاوره ای اندازه گیری نرم افزار Radius (EMSIS، Muenster آلمان) محاسبه شد. برای تجسم توزیع اندازه hAFS-EVs، نتایج به صورت نمودار نقطه پراکنده و به عنوان توزیع فرکانس ترسیم شد که در آن هر اندازه به عنوان یک نقطه همراه با خطوطی برای مقدار میانه و محدوده نمایش داده می‌شود.

f-hAFS-EVs و p-hAFS-EVs نیز توسط آنالیز ردیابی نانوذرات (NTA) برای ارزیابی ذرات آزاد شده توسط سلول‌های 10 درجه آنالیز شدند. hAFS-EVs 1:100 در محلول PBS رقیق شدند و روی NanoSight LM10 (Malvern Instruments، Malvern، UK) که حداقل 3 فریم مختلف هر کدام 60 ثانیه را ضبط کرد، به دست آمدند. سه اکتساب مختلف از هر نمونه با استفاده از گزینه Batch Process در نرم افزار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. 4.7.LC-MS/MS تجزیه و تحلیل hAFS-CM و hAFS-EVs 4.7.1. هضم در محلول

آنالیز پروتئومی روی 3 تکرار بیولوژیکی hAFS-CM و hAFS انجام شد. EVs از f-hAFS و p-hAFS پس از پیش‌شرطی‌سازی نرموکسیک یا هیپوکسیک (n=24 شرایط مختلف). معرف SF (Waters Co, Milford, MA, USA) در غلظت نهایی 0.25 درصد (w/v). سوسپانسیون های به دست آمده در حین هم زدن در 100 درجه به مدت 2{{40}} دقیقه انکوبه شدند. هضم بر روی هر نمونه با افزودن تریپسین اصلاح شده با درجه توالی (Promega Inc, Madison, WI, USA) با نسبت آنزیم به سوبسترا 1:50 (وزن بر وزن) در طول شب در دمای 37 درجه در 0.1 مولار NH4HCO3 pH7.9 انجام شد. بافر با 10 درصد CHSCN. یک مقدار اضافی از تریپسین (1:100 w/w) در صبح اضافه شد و هضم به مدت 4 ساعت ادامه یافت. علاوه بر این، افزودن 0.5 درصد اسید تری فلورواستیک (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA) واکنش آنزیمی را متوقف کرد و انکوباسیون بعدی در دمای 37 درجه به مدت 45 دقیقه هیدرولیز اسید RapiGest را تکمیل کرد[108]. محصولات تخریب غیرقابل اختلاط با آب با سانتریفیوژ در 13.{37}} دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه حذف شدند. در نهایت، مخلوط‌های هضم تریپتیک با استفاده از ستون‌های چرخشی PierceTM C{39}} (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) طبق پروتکل سازنده نمک‌زدایی شدند و در اسید فرمیک 0.1 درصد مجدداً معلق شدند (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) در آب (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, USA) در غلظت 0.1 ug/μL.

4.7.2. کروماتوگرافی مایع

مخلوط های هضم شده تریپسین با استفاده از یک پلت فرم متشکل از یک سیستم کروماتوگرافی نانو مایع، Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D System (Eksigent، بخشی از AB SCIEX Dublin, Dublin, CA, USA) که در حالت trap-lute پیکربندی شده است، تجزیه و تحلیل شدند. همراه با یک طیف سنج جرمی با وضوح بالا. به طور خلاصه، نمونه‌ها (0.8 میکروگرم تزریق شده) ابتدا روی یک تله پپتیدی بارگذاری شدند (200 um × 500 um ChromXP C{10}} CL,3 um,120 A) و با پمپ بارگیری که در حالت ایزوکراتیک کار می کند با 0.1 درصد اسید فرمیک در آب به مدت 10 دقیقه با جریان 3 میکرولیتر در دقیقه شسته می شود. سوئیچینگ خودکار یک شیر ده پورت سپس مخلوط محبوس شده را روی یک ستون فاز معکوس نانو (75 um × 15 سانتی متر ChromXP C{21}}CL,3 um,120 A) از طریق یک گرادیان 150 دقیقه ای شوینده B شستشو داد. (شوینده A، 0.1 درصد اسید فرمیک در آب؛ شوینده B، 0.1 درصد اسید فرمیک در استونیتریل) با سرعت جریان 300 nL/min. در عمق، گرادیان عبارت بود از: از 5-10 درصد Bin 3min،10-40 درصد Bin 130min،40-95 درصد Bin 10min و نگه داشتن در 95 درصد B برای 7min. 4.7.3. طیف سنجی جرمی

آنالیزهای MS/MS بر روی یک طیف سنج جرمی LTQ-OrbitrapXL (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) مجهز به منبع یونی نانو اسپری انجام شد. ولتاژ مویرگی اسپری روی 1.7 کیلو ولت و دمای مویرگی انتقال یون در 22{11}} درجه تنظیم شد. طیف MS کامل در محدوده 400-1600 m/z در حالت یون مثبت، با قدرت تفکیک 60000 (عرض کامل در نیمه حداکثر) و سرعت اسکن 2 طیف در ثانیه ثبت شد. این مرحله با پنج رویداد MS/MS با وضوح پایین دنبال شد که به صورت متوالی به روشی وابسته به داده بر روی پنج یون برتر انتخاب شده از طیف کامل MS (در 35 درصد انرژی برخورد)، با استفاده از حذف دینامیکی 0.5 دقیقه برای ایجاد شد. تجزیه و تحلیل MS/MS توابع اسکن طیف‌سنج جرمی و شیب حلال کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا توسط سیستم داده Xcalibur نسخه 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) کنترل شدند.

4.7.4. پردازش داده پروتئومی و داده کاوی

تمام داده های تولید شده با استفاده از موتور جستجوی Sequest HT موجود در نرم افزار Thermo Scientific Proteome Discoverer، نسخه 2.1 جستجو شدند. طیف‌های تجربی MS/MS با توالی‌های پپتید تریپتیک در مقایسه با طیف‌های جرمی نظری به‌دست‌آمده از هضم سیلیسی پایگاه‌داده پروتئوم Uniprot Homo Sapiens (74600 ورودی)، که در 2 ژانویه دانلود شد، مرتبط شد. 020 (www.uniprot.org، مشاهده شده در 1{36}} 2 مارس021). معیارهای زیر برای شناسایی توالی‌های پپتیدی و پروتئین‌های مرتبط مورد استفاده قرار گرفت: تریپسین به‌عنوان یک آنزیم، سه شکاف از دست رفته در هر پپتید، تحمل جرم 50 ± ppm برای یون‌های پیش‌ساز و 0.8 ± Da برای یون‌های قطعه. گره پرکولاتور با استراتژی فریب هدف برای ارائه نرخ کشف نادرست نهایی (FDR) در سطح تطابق طیف پپتیدی (PSM) 0.01 (سخت) بر اساس مقادیر q، با در نظر گرفتن حداکثر deltaCN 0.05 استفاده شد [109]. فقط پپتیدهایی با حداقل طول پپتید شش اسید آمینه و رتبه 1 در نظر گرفته شدند. گروه بندی پروتئین و اصول صرفه جویی دقیق اعمال شد. داده‌های MS از طریق مخزن شریک PRIDE [10] به کنسرسیوم ProteomeXchange سپرده شده است (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/، در 10 مارس 2021 به دست آمده است). ، و بدون برچسب مقایسه شده است. یک الگوریتم داخلی، یعنی نقشه پروتئین الگوریتم چند بعدی (MAProMa) برای این هدف با استفاده از میانگین منطبق‌های طیف پپتیدی (aPSM) [111,112] که با میانگین تمام طیف‌های شناسایی‌شده برای یک پروتئین و در نتیجه مطابقت دارد، استفاده شد. ، به فراوانی نسبی آن، در هر شرایط تحلیل شده. در عمق، برای انتخاب پروتئین‌های بیان شده متفاوت، زیرگروه‌ها (برای هر دو جنینی در مقابل پریناتال-hAFS-CM و hAFS-EV، با در نظر گرفتن تحریک پیش‌شرطی سلول‌های هیپوکسیک)، با اعمال آستانه‌ای 0.4 و 5 روی دو MAProMa مقایسه شدند. شاخص های DAve (میانگین دیفرانسیل) و DCI (شاخص اطمینان دیفرانسیل)، به ترتیب. DAve که تغییرات در بیان پروتئین را ارزیابی می کند، به عنوان (XY)/(X＋Y)/0.5 تعریف شد، در حالی که DCI که اطمینان بیان دیفرانسیل را ارزیابی می کند، به عنوان (X به علاوه Y)× (XY) / 2 X و Y تعریف شد. شرایط نشان دهنده PSM یک پروتئین معین در دو نمونه مقایسه شده است. علاوه بر این، لیست‌های پروتئین متوسط، به‌دست‌آمده از هر شرایط مورد بررسی، تحت آنالیز تفکیک خطی (LDA) و پروتئین‌هایی با بیشترین نسبت F (بیشتر یا مساوی 4.5) و کوچک‌ترین مقدار p (کمتر یا مساوی) قرار گرفتند. 001/0) با استفاده از روش وارد و متریک فاصله اقلیدسی با استفاده از نرم افزار JMP 15.2 حفظ و پردازش شدند. به طور خاص، نسبت F نشان‌دهنده میانگین مربعات مدل تقسیم بر میانگین مربعات خطا است، در حالی که p-value نشان‌دهنده احتمال به دست آوردن مقدار F بزرگ‌تر از محاسبه‌شده است، اگر در واقعیت، تفاوتی بین میانگین‌های گروه جمعیت وجود نداشته باشد. 4.8. پروفایل سیتوکین و کموکاین hAFS-CM و have-EVs

پروفایل سیتوکین و کموکاین hAFS-CM و have-EVs بدست آمده توسط f-hAFS و p-hAFS پس از پیش شرطی سازی هیپوکسیک با استفاده از کیت آرایه سیتوکین Proteome ProfilerTM Human XL (R&D System, Minneapolis, MN, USA) با توجه به دستورالعمل سازنده 20 میکروگرم از نمونه‌های hAFS-CM و hAFS-EVs استفاده شد. تصاویر غشاء توسط یک Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge، UK) به دست آمد، محتوای سیتوکین/کموکاین خاص با کمی کردن شدت پیکسل مثبت (با استفاده از واحد دلخواه) برای هر سیتوکین قابل تشخیص با استفاده از نرم افزار ImageJ (موجود در https ارزیابی شد: //imagej.nih.gov/ij/، قابل دسترسی در 10 مارس 2021 [13]). 4.9. استخراج RNA از hAFS-EVs و Next

توالی نسل

RNA از f-hAFS-EV و p-have-EV با miRNeasy Micro Kit (Qiagen، میلان، ایتالیا) طبق دستورالعمل سازنده جدا شد. یکپارچگی و توزیع اندازه RNA با استفاده از کیت Agilent Small RNA با تراشه RNA غیر کد کننده کوچک به منظور ارزیابی محتوای RNA های کوچک در محدوده 6 تا 150 نوکلئوتید (NT) مورد ارزیابی قرار گرفت. کیت سنجش میکروRNA کیوبیت (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) برای تعیین کمیت محتوای microRNA (miRNAs) طبق دستورالعمل‌های سازنده استفاده شد. کتابخانه های توالی یابی miRNA با استفاده از کیت کتابخانه miRNA QIAseq (Qiagen، میلان، ایتالیا) با استفاده از 18.5ng از miRNA های جدا شده به عنوان ورودی و پیروی از دستورالعمل های سازنده، تهیه و تقویت شدند. کتابخانه‌ها پس از بررسی کیفیت و تعیین کمیت توسط TapeStation (Agilent Technologies، Foster City، CA، USA) با استفاده از Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape ادغام شدند. کتابخانه‌های تلفیقی برای کنترل کیفیت توسط qPCR بلادرنگ و به دنبال راهنمای «توالی‌یابی کتابخانه qPCR کمی‌سازی» (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) مورد ارزیابی قرار گرفتند و توسط پلتفرم Illumina NextSeq با استفاده از High Output Hit v2.5 (75 چرخه) توالی‌یابی شدند. Illumina Inc، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده). فراخوانی پایه با گردش کار پیش‌فرض Illumina NextSeq500 انجام شد.

4.10. تجزیه و تحلیل داده های بیوانفورماتیک توالی یابی miRNA

فایل های Fastq ابتدا با برش آداپتور 3 و پایه های با کیفیت پایین با استفاده از Cutadapt [114] پردازش شدند. پس از پیرایش، توالی‌های درج و توالی‌های UMI شناسایی شدند. خواندن بدون دنباله آداپتور، خواندن با دنباله‌های درج کمتر از 16 جفت باز، و خواندن‌هایی با دنباله‌های UMI کمتر از 10 جفت باز کنار گذاشته شد. برای حاشیه‌نویسی توالی‌های درج، خوانده‌ها با استفاده از Bowtie با مجموعه ژنوم انسانی GRCh38 تراز شدند [15] برای هر نمونه، تمام خوانده‌های اختصاص داده شده به یک miRNA خاص شمارش شد و UMI‌های مرتبط برای شمارش مولکول‌های منحصربه‌فرد تجمیع شدند. تجزیه و تحلیل ثانویه توسط اسکریپت های R سفارشی موجود بر اساس درخواست معقول انجام شد. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی افتراقی با استفاده از بسته‌های Limma [116] و EdgeR Bioconductor [117] انجام شد.

4.11. تحلیل های آماری

نتایج به صورت میانگین ± نیم حداقل سه (n{0}}) آزمایش مستقل ارائه شده است. مقایسه ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و سپس آزمون مقایسات چندگانه توکی پس از مرگ یا با آزمون تی دانشجویی انجام شد. تجزیه و تحلیل ها با استفاده از Graph-Pad Prism نسخه 8.0.2 (نرم افزار GraphPad، https://www.graphpad.com، دسترسی به 10 مارس 2021) با معنی داری آماری در * p انجام شد.<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

در نتیجه، hAFS جنینی و پری ناتال از نظر فنوتیپی معادل با قدرت ترشحی قابل مقایسه و غنی‌سازی EV در اندازه و توزیع یافت شد. با این حال برخی از تمایزات در مشخصات ترشحی آنها قابل قدردانی است. به طور خاص، مشخصات نابالغ hAFS جنینی را می‌توان با فرمول‌های ترشحی آن‌ها که دارای سکرتوم تقویت‌کننده عروق، پیش‌سازنده و جوان‌کننده بارزتر است، خلاصه کرد. با این حال، hAFS پری ناتال همچنان مشخصات پاراکرین مربوطه را از طریق بیان عوامل مرتبط با مهاجرت سلول های اندوتلیال، تعدیل کننده ایمنی، ضد التهابی و پتانسیل نوروتروفیک مشابه با hAFS جنین حفظ می کند. این یافته‌ها ممکن است بینش‌های مفیدی را برای حمایت از درمان پاراکرین در آینده از بیماری‌های مرتبط با آسیب و التهابی/ایسکمیک ارائه دهد. بنابراین، انتخاب hAFS جنینی یا پری ناتال به عنوان ایده آل ترین منبع سلولی باید با توجه به سناریوی بالینی خاص ارزیابی شود.

این مقاله از Int استخراج شده است. جی. مول. علمی 2021، 22، 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms