سیکلوپنتانون در ملانوما B16F10 فعالیت های ضد ملانوژنز و ضد چروک دارد.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

هی جین جونگ 1، آ کیونگ لی 1،2، یئو جین پارک 1،2، سانگوون لی 1،2، دونگوان کانگ 1،2، یانگ سوک جونگ 1،2، هه یانگ چانگ 1،2 و هیونگ ریونگ مون 1، 2،*

خلاصه:قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش (UV) علت اصلی پیری پوست است که منجر به پرپیگمانتاسیون و چین و چروک پوست می شود. در این مطالعه، ما اثر سفید کنندگی (2E,5E)-2،5-bis(3-هیدروکسی-4-متوکسی بنزیلیدن) سیکلوپنتانون (BHCP) را بر روی ملانوم B16F10 و ضد آن بررسی کردیم. فعالیت چین و چروک روی سلول های فیبروبلاست Hs27 مشخص شد که BHCP به شدت تیروزیناز را با غلظت 50 درصد مهاری (IC50) 1.10 میکرومولار و 8.18 میکرومولار فرمیکوفنولات (L-تیروزین) و دیفنولاز (L-DOPA) مهار می‌کند، و مطالعه سینتیک آنزیم نشان داد که BHCP-Tyhiebi-Rosity رقابتی است. . علاوه بر این، BHCP به طور قابل‌توجهی محتوای ملانین و فعالیت تیروزیناز سلولی را مهار کرد و سطوح فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF)، سطوح فسفریله‌شده پروتئین متصل‌کننده به عنصر پاسخ cAMP (CREB) و تیروزیناز در -ملانوسیت محرک هورمون (MSH) را کاهش داد. سلول های ملانوما B16F10. علاوه بر این، BHCP فسفوریلاسیون p65 و بیان متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMP{28}}، MMP{29}}، MMP{30}}، و MMP-13) را در فیبروبلاست های Hs27 مهار کرد. تحریک شده با اشعه ماوراء بنفش. بنابراین، نتایج ما نشان می دهد که BHCP ممکن است کاندیدای خوبی برای توسعه عوامل درمانی برای بیماری های مرتبط با هایپرپیگمانتاسیون و چین و چروک باشد.

کلمات کلیدی: (2E،5E)-2،5-بیس(3-هیدروکسی-4-متوکسی بنزیلیدین) سیکلوپنتانون (BHCP); مهارکننده تیروزیناز؛ ضد ملانوژنز. ضد چروک

سیستانچ استضد چروک

1. مقدمه

پیری پوست یک فرآیند پیچیده و پیشرونده است که منجر به تغییرات عملکردی و زیبایی شناختی در پوست می شود و عوامل درونی و بیرونی مسئول آن هستند [1]. پیری خارجی پوست در اثر عوامل محیطی متجاوز مانند اشعه ماوراء بنفش (UV)، استرس یا سیگار کشیدن ایجاد می شود. با این حال، عمدتاً ناشی از قرار گرفتن مکرر در معرض اشعه ماوراء بنفش خورشید است که پیری نوری نامیده می شود. پیری پوست با چین و چروک های درشت و عمیق، ضخامت، ناهمواری، بدرنگی و تغییرات بافتی مشخص می شود [2-4].

تیروزیناز (EC 1.14.18.1)، که به عنوان پلی فنل اکسیداز نیز شناخته می شود، یکی از آنزیم های چند منظوره حاوی مس است که در سنتز ملانین نقش دارد و به طور گسترده در طبیعت یافت می شود [5]. تیروزیناز معمولاً در اکثر میکروارگانیسم ها، گیاهان، وجود دارد. و حیوانات در گیاهان، تیروزیناز با اکسید کردن مونوفنول ها به دی فنل ها (فعالیت مایکوفنول) عمل می کند و در اکسیداسیون o-دیفنول ها به o-quinones (فعالیت دی فنولاز) و به دنبال آن اکسیداسیون کینون ها به رنگدانه های قهوه ای تیره نقش دارد [6].

ملانوژنز تبدیل L-تیروزین به 3،4-دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) است که به موجب آن L-DOPA به DOPA کینین تبدیل می شود [7]. از این رو، تیروزیناز نقش مهمی در تولید ملانین در ملانوسیت ها ایفا می کند و مهار تیروزیناز یک هدف جذاب برای بهبود اختلالات مرتبط با رنگدانه و ایجاد عوامل سفید کننده است [8،9]. سنتز ملانین توسط چندین محرک، مانند UV و مواد شیمیایی از جمله ایزوبوتیل متیل گزانتین (IBMX) و هورمون محرک آلفا ملانوسیت (-MSH) القا می شود. -MSH به گیرنده ملانوکورتین 1 خود (MC1R) متصل می شود و متعاقباً سطح AMP حلقوی سیتوپلاسمی (cAMP) را افزایش می دهد. افزایش سطح cAMP پروتئین کیناز A (PKA) را فعال می‌کند، که بیان فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) را از طریق فسفوریلاسیون پروتئین متصل شونده به عنصر cAMP (CREB) القا می‌کند. MITF بیان تیروزیناز، پروتئین مربوط به تیروزیناز (TRP){18}} و TRP{19}} را القا می‌کند که در نهایت منجر به افزایش سنتز ملانین می‌شود [10]. MITF یک عامل کلیدی رونویسی ملانوژنز در نظر گرفته می شود. بنابراین، مطالعات زیادی برای کنترل بیان MITF برای مهار ملانوژنز انجام شده است [11].

شناخته شده است که تشکیل چین و چروک ارتباط نزدیکی با تخریب ماتریکس خارج سلولی پوست دارد و اشعه ماوراء بنفش فاکتور هسته ای-κB (NF-kB) را فعال می کند، در نتیجه تولید تکه تکه شدن کلاژن و متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) را افزایش می دهد [2]. MMP ها اندوپپتیدازهای وابسته به روی هستند که در بازسازی ساختار ماتریکس خارج سلولی در پوست مهم هستند. بنابراین، تخریب بیش از حد کلاژن و ماتریکس توسط MMP های ناشی از اشعه ماوراء بنفش یک ویژگی مشخصه پوست آسیب دیده است و MMP ها به عنوان نشانگر اصلی پیری نور ناشی از UV و همچنین التهاب پوست استفاده می شوند [12].

مشتقات اسکلت دیاریل هپتانوئیدی شبیه کورکومین شامل آنتی اکسیدان ها، ضد سرطان گزارش شده، فعالیت ها. داربست ها، از جمله (2E,5E)-2،5-بیس(3-هیدروکسی-4-متوکسی بنزیلیدین) سیکلوپنتان بوده است. (BHCP) (شکل 1)،برای نشان دادن طیف گسترده ای از ضد التهاب، ضد ملانوژنز، به ویژه، Leow et al. [19] در فعالیت‌های زیستی و ضد تیروزیناز [13-18] دی‌بنزیلیدین-سیکلوپنتانون 2014 گزارش شده است که ممکن است از طریق تنظیم مسیر سیگنال‌دهی Wnt/-catenin به اثرات محافظتی روی استئوسارکوم انسانی کمک کند. با این حال، اثرات ضد ملانوژنز و ضد چین و چروک BHCP هنوز کشف نشده است و مکانیسم‌های مولکولی زیربنای فعالیت آن هنوز به وضوح مشخص نشده است.

شکل 1. ساختار (2E,5E)-bis(3-هیدروکسی-4-متوکسی بنزیلیدین) سیکلوپنتانون (BHCP).

در مطالعه حاضر، پتانسیل ضد ملانوژنز و ضد چروک BHCP را بررسی کردیم و به دنبال شناسایی مکانیسم درگیر، به ویژه با توجه به محتوای ملانین و فعالیت تیروزیناز سلولی، که با استفاده از روش مهار تیروزیناز و تجزیه و تحلیل سینتیک‌های آنزیم مورد بررسی قرار گرفتند، بودیم. علاوه بر این، ما نشان دادیم که BHCP یک اثر بازدارنده بر ملانوژنز و چین و چروک‌ها اعمال می‌کند که با کاهش CREB/MITF/tyrosinase در سلول‌های ملانوم موش B16F10 ناشی از MSH و مهار فسفوریلاسیون p65 و بیان فیبروادوک MMP در UV2-in انسانی مرتبط است.

گیاه اژدها سیستانچ

2. نتایج و بحث

2.1. سنتز (2E،5E)-2،5-بیس(3-هیدروکسی-4-متوکسی بنزیلیدین) سیکلوپنتانون (BHCP)

محلولی از {{0}}هیدروکسی-4-متوکسی بنزآلدئید (100 میلی‌گرم، 0.66 میلی‌مول، ایزووانیلین) و سیکلوپنتانون (0.03 میلی‌لیتر، 0.33) میلی مول) در محلول 1 N HCl-اسید استیک (0.02 میلی لیتر) در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت هم زده شد. پس از 1 روز ماندن، مخلوط واکنش با آب سرد در حضور مقدار کمی متانول تیمار شد، فیلتر شد و با آب سرد شسته شد تا BHCP (65.9 میلی گرم) با عملکرد 56.9 درصد تولید شود. BHCP با روش های طیف سنجی از جمله شناسایی شد. 1H و 13C-NMR، و همچنین با مقایسه با داده های طیفی منتشر شده و تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) [19]. ساختار در شکل 1 نشان داده شده است.

BHCP: پودر آمورف زرد (CHCl3)؛ 1H-NMR (5{18}}{27}} مگاهرتز، DMSO-d6) δ: 9.25 (s، 2H، 2 × OH)، 7.28 (s،2H،2×vinylicH)، 7.14 (d، 2H , J=2.0 هرتز، 2 × 2- ساعت، 7.11 (dd، 2H، J=8.5، 2.0 هرتز، 2×6- H)، 7.01 (d، 2H، J=8.5 هرتز، 2 × 5-H)، 3.81 (s، 6H، 2 × OMe)، 3.01 (s، 4H، 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 مگاهرتز، DMSO-d6) δ: 195.5، 149.9، 147.2، 136.0، 133.1، 129.1، 124.3، 117.5، 112.8، 56.3، 26. ESI-MS: m/z 351 (M - H)-.

2.2. اثر مهاری BHCP بر فعالیت تیروزیناز قارچ

همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، BHCP تیروزیناز را با مقادیر IC50 0.12 ± 1.10 و 0.44 ± 8.18 میکرومولار مهار کرد، در حالی که اسید کوجیک (کنترل مثبت) دارای مقادیر IC50 18.68 ± 18.8 ± 1.9 ± 1.6 میکرومولار بود. میکرومولار برای مونوفنولاز و دیفنولاز به ترتیب. در مطالعه قبلی خود در مورد مهارکننده‌های بالقوه مصنوعی تیروزیناز، مکانیسمی را از طریق مطالعات مدل‌سازی مولکولی پیدا کردیم که به‌وسیله آن گروه‌های {{19}هیدروکسی و 4-متوکسی بنزیلیدین تمایلات اتصال زیادی به محل فعال تیروزیناز داشتند [20]. از نتایج این مطالعه، نشان داده شد که گروه‌های عملکردی آن (گروه‌های 3-هیدروکسی و 4-متوکسی) با افزایش قابل‌توجهی در فعالیت مهاری تیروزیناز مرتبط بودند.

جدول 1. فعالیت مهاری تیروزیناز و تجزیه و تحلیل جنبشی آنزیم BHCP.

علاوه بر این، مکانیسم مسئول مهار تیروزیناز توسط BHCP توسط آنالیز سینتیکی آنزیم در مطالعه حاضر مورد بررسی قرار گرفت (جدول 1 و شکل 2). نمودارهای Lineweaver-Burk با استفاده از داده‌های به‌دست‌آمده از مطالعات جنبشی، و ثابت بازداری (Ki) از نمودارهای دیکسون به‌دست آمد. نمودارهای متقابل دوگانه Lineweaver-Burk نشان دهنده بازداری از نوع رقابتی است. همانطور که در شکل 2a-c نشان داده شده است، BHCP به عنوان یک بازدارنده رقابتی L-تیروزین و L-DOPA عمل می کند. برای تعیین انواع ثابت های بازدارنده آنزیم (Ki) برای کمپلکس آنزیم-بازدارنده [21،22]، که در آن مقدار محور thex مقدار -Ki را نشان می دهد، استفاده می شود. همانطور که در شکل 2b-d نشان داده شده است، مقادیر Ki BHCP به ترتیب 1.7 μM و 10.5 میکرومولار به عنوان سوبسترا برای L-tyrosine و L-DOPA بود. از آنجایی که مقدار Ki نشان دهنده غلظت مورد نیاز برای تشکیل یک کمپلکس آنزیم-بازدارنده است، مقدار Ki پایین تر نشان دهنده مهار موثرتری در برابر تیروزیناز است.

شکل 2. نمودارهای Lineweaver-Burk (a,c) و Dixon (b,d) برای مهار آنزیم تیروزیناز توسط BHCP.

2.3. اثرات BHCP بر زنده ماندن سلولی ملانوم B16F10 و سلول های فیبروبلاست Hs27

قبل از تعیین اینکه آیا BHCP فعالیت های ضد ملانوژنز و ضد چین و چروک را اعمال می کند، ما سمیت سلولی BHCP به سلول های B16F10 و سلول های Hs27 را با تیمار با غلظت های مختلف BHCP برای فواصل زمانی مختلف بررسی کردیم و زنده ماندن سلول ها با روش EZ-Cytox اندازه گیری شد. همانطور که در شکل 3a،b نشان داده شده است، تا 10 میکرومولار BHCP برای 48 ساعت، بقای سلول های B16F10 یا سلول های Hs27 را کاهش نداد. پس از آن، مطالعات آزمایشگاهی بیشتری در مورد فعالیت های ضد ملانوژنز و ضد چروک BHCP با 1، 5 و 10 میکرومولار انجام شد.

2.4. مهار BHCP در برابر محتوای ملانین و فعالیت تیروزیناز سلولی در سلول های ملانوما B16F10

برای تعیین اینکه آیا BHCP پتانسیل مهاری روی محتوای ملانین سلول های B16F10 القاء شده با MSH اعمال می کند، سلول ها با غلظت های مختلف نشان داده شده (1، 5 و 10 میکرومولار) BHCP یا کوجیک اسید (5 میلی مولار) به مدت 24 ساعت پیش تیمار شدند و سپس تحریک شدند. با -MSH به مدت 48 ساعت. همانطور که در شکل 4a نشان داده شده است، محتوای ملانین در سلول های تیمار شده با BHCP در حضور -MSH به روشی وابسته به غلظت کاهش می یابد، که 113 درصد در 1 میکرومولار، 106 درصد در 5 میکرومولار، و 102 درصد در 10 میکرومولار در مقایسه با گروه کنترل تنها با -MSH (186 درصد) تحت درمان قرار گرفتند. جالب توجه است که BHCP (1 میکرومولار) محتوای ملانین را قوی‌تر از اسید کوجیک (5 میلی‌مولار) مهار می‌کند. علاوه بر این، یک سنجش فعالیت تیروزیناز سلولی برای اندازه‌گیری اثر مهاری BHCP بر روی سلول‌های B16F10 انجام شد. همانطور که در شکل 4b نشان داده شده است، BHCP به صورت وابسته به غلظت با فعالیت تیروزیناز به میزان 120 درصد در 1 میکرومولار، 116 درصد در 5 میکرومولار، و 105 درصد در 10 میکرومولار کاهش یافت، در مقایسه با گروه کنترل که فقط با -MSH درمان شده بود (181). درصد). اثر مهاری BHCP بسیار قوی تر از اسید کوجیک بود. مهار BHCP در 1 میکرومولار نسبت به اسید کوجیک در 5 میلی مولار (131 درصد) برتر بود. این نتایج نشان می‌دهد که BHCP با مهار بیوسنتز ملانین و سنتز تیروزیناز درون سلولی در ملانوسیت‌های B16F10، یک اثر سفیدکننده دارد.

شکل 4. مهار محتویات ملانین (a) و فعالیت تیروزیناز سلولی (b) BHCP بر روی سلول های ملانوما B16F10.

2.5. اثرات BHCP بر بیان MITF/Tyrosinase و CREB فسفریله شده در سلول های B16F10

MITF، یک فاکتور رونویسی خاص، نقش اساسی در فعال‌سازی مؤثر ژن‌های ملانوژن، از جمله تیروزیناز، کاتالیزور مرحله محدودکننده سرعت در بیوسنتز ملانین ایفا می‌کند: TRP-1، و TRP-2. بیان MITF می‌تواند با فسفوریلاسیون CREB [23] افزایش می یابد. CREB یک پروموتور مهم MITF است [24،25]، و فسفوریلاسیون CREB در ملانوسیت ها بیان MITF را با اتصال به CREB (پروتئین اتصال دهنده عنصر پاسخ c-AMP) در ملانوسیت ها افزایش می دهد [26]. برای روشن کردن مسیرهای مولکولی مسئول اثر ضد ملانوژنیک BHCP بر روی سلول‌های B16F10، ما سطوح پروتئین مولکول‌های کلیدی، از جمله CREB و MITF را که نقش مهمی در ملانوژنز بازی می‌کنند، با آنالیز وسترن بلات بررسی کردیم. سلول ها با BHCP یا اسید کوجیک تیمار شدند و سپس توسط -MSH به مدت 48 ساعت تحریک شدند. فاصله زمانی اندازه گیری ها از روش توصیف شده در مطالعات قبلی پیروی می کند [27]. همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، سطوح تیروزیناز و MITF با -MSH افزایش یافت، اما BHCP این سطوح پروتئین را کاهش داد. علاوه بر این، فسفوریلاسیون CREB به طور قابل توجهی توسط BHCP سرکوب شد. تنظیم فسفوریلاسیون CREB ناشی از -MSH به طور بالقوه در تنظیم رنگدانه مهم است [28]. این نتایج نشان می‌دهد که اثرات ضد ملانوژنیک BHCP ناشی از کاهش MITF و تیروزیناز از طریق کاهش CREB فسفریله است. مطالعه حاضر نشان می دهد که روشن شدن مکانیسم مهار BHCP بر تیروزیناز و ملانوژنز بسیار مهم است و باید در آینده مورد بررسی قرار گیرد. اگرچه رده سلولی ملانوم B16F10 به طور کلی برای بررسی مکانیسم های سیگنال دهی در شرایط آزمایشگاهی مناسب تر است، رده سلولی B16F10 از ملانوم جوندگان است. بنابراین، مطالعات بیشتر بر روی ملانوسیت های انسانی برای تأیید یافته ها ضروری است.

2.6. اثر BHCP بر فعال‌سازی NF-kB p-p65 ناشی از اشعه ماوراء بنفش در سلول‌های Hs27

ما بعداً تأثیر BHCP را بر بیان ناشی از UV واسطه‌های التهابی با استفاده از فیبروبلاست‌های Hs27 بررسی کردیم. قبلاً گزارش شده است که فسفوریلاسیون p65 (Ser536) برای ظرفیت آن برای فعال سازی ژن ها ضروری است [29]. بنابراین، سطح پروتئین p-p65 (Ser536) و p65 در بخش هسته با وسترن بلات بررسی شد. همانطور که در شکل 6a،b نشان داده شده است، در سلول های Hs27، UV سطوح پروتئین p-p65 (Ser536) را در هسته افزایش داد، در حالی که درمان BHCP باعث کاهش سطح پروتئین p-p65 هسته (Ser536) شد. به همین ترتیب، مقدار کل p65 در سیتوپلاسم توسط UV کاهش یافت و توسط BHCP بازیابی شد (شکل 6c,d). اگرچه سطح بیان پروتئین p65 در سیتوپلاسم کاهش و در هسته پس از القای UV افزایش یافت، پیش تیمار با BHCP این روندها را به صورت وابسته به دوز معکوس کرد. بنابراین، این نتایج نشان می دهد که مهار p-p65 توسط BHCP ممکن است به اثرات محافظتی بر روی رنگدانه پوست و تخریب کلاژن در برابر UV کمک کند.

شکل 6. اثرات BHCP بر سطح بیان p-p65 (Ser536) در سلول های فیبروبلاست انسانی Hs27 ناشی از UV.

2.7. اثر BHCP بر بیان MMP ها در سلول های Hs27

MMP ها نقش حیاتی در پیری پوست دارند. تابش اشعه ماوراء بنفش بافت همبند پوست را با تنظیم مثبت بیان MMP ها تغییر می دهد [30،31]. MMP{2}} یک آنزیم تجزیه کننده کلاژن است که تجزیه کلاژن سنتز شده از پروکلاژن نوع I را تسریع می کند. MMP{4}} آنزیمی تجزیه کننده ژلاتین است که فیبرهای کلاژن بریده شده توسط MMP-1 را تجزیه می‌کند و باعث افزایش تولید چین و چروک و کاهش خاصیت ارتجاعی می‌شود. برای بررسی اثر ضد چروک BHCP در برابر القای UV، سطوح پروتئین MMP-1 و MMP-9 را با وسترن بلات تعیین کردیم. علاوه بر این، سلول‌های ناشی از اشعه ماوراء بنفش سطح قابل‌توجهی از MMP{11}} را نشان دادند که باعث تخریب کلاژن نوع I و III به جای MMP می‌شود [32]. ما افزایش MMPs (MMP1، MMP9، MMP12، و MMP13) را پس از درمان سلول‌های Hs27 ناشی از UV با BHCP در 1 و 10 میکرومولار بررسی کردیم. همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است، سطوح بیان MMP-1، MMP{24}}، MMP-12، و MMP{26}} پس از القای UV افزایش یافت؛ اما، درمان BHCP بیان را در یک دوز کاهش داد. -روش وابسته نتایج ما نشان می‌دهد که BHCP ممکن است با کاهش تولید غیرطبیعی MMPs ناشی از قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش به جلوگیری از تشکیل چین و چروک کمک کند. این نتایج نشان می دهد که BHCP بیان MMP را در فیبروبلاست های Hs27 مهار می کند تا از تجزیه کلاژن و در نتیجه تولید چین و چروک جلوگیری کند. بنابراین، BHCP پتانسیل استفاده به عنوان یک داروی پیشگیرانه و درمانی بیماری های مرتبط با پوست را نشان می دهد.

فواید ساقه سیستانچ

3. مواد و روش ها

3.1. مواد شیمیایی و ابزار دقیق

قارچ تیروزیناز (EC 1.14.18.1)، -MSH، L-تیروزین، 3،4-دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA)، دی متیل سولفوکسید (DMSO) و اسید کوجیک از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده). محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM)، سرم جنین گاوی، استرپتومایسین، و آمفوتریسین از Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad، CA، USA) خریداری شد. آنتی بادی علیه MITF، CREB، p-CREB، p-p65 (Ser536)، p65، تیروزیناز، MMP{15}}، MMP{16}}، MMP{17}}، MMP-13، TFIIB و اکتین از بیوتکنولوژی سانتا کروز (سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) از شرکت Millipore (بدفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. ظروف استریل پلاستیک برای کشت بافت از SPL Labware (سئول، کره) خریداری شد. منبع نور UV توسط 6 لامپ (8 وات/لامپ) Crosslinker 800 series (UVP, CA, USA) ارائه شد. کروماتوگرافی لایه نازک و سیلیکاژل 60 (مش 230–400) بر روی سیلیکاژل F انجام شد{27} }صفحات از پیش روکش شده از Merck Millipore (دارمشتات، آلمان). طیف NMR با استفاده از ابزار Varian Unity INOVA 400 (400 مگاهرتز برای 1H، 100 MHz برای 13C) و Varian Unity AS 500 (500 MHz برای 1H) ثبت شد. مقادیر جابجایی شیمیایی (δ) با ارجاع به پیک‌های حلال باقیمانده یا دوتره مربوطه گزارش می‌شوند (δH 2.50 و δC 39.51 برای DMSO). داده های طیف سنجی جرمی با وضوح پایین با یک طیف سنج جرمی Expression CMS (Advion، Ithaca، NY، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد.

3.2. سنجش مهار تیروزیناز قارچ

فعالیت مهاری تیروزیناز قارچ با استفاده از هر دو سوبسترای L-تیروزین و L-DOPA بر اساس روش توصیف شده توسط Jung و همکاران تعیین شد. [23]. به طور خلاصه، 190 میکرولیتر آنزیم تیروزیناز (1000 واحد رقیق شده با بافر تیروزیناز قارچ، شامل 1 میلی مولار L-تیروزین و محلول L-DOPA) در حضور یا عدم حضور ترکیبات (غلظت نهایی در محدوده 1 تا 20 میکرومولار، محلول در 100 درصد DMSO)، به هر چاه 96-صفحه چاهی، تا حجم نهایی 200 میکرولیتر ارائه شود. پلیت در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. فعالیت تیروزیناز با اندازه گیری جذب در 492 نانومتر با استفاده از میکروپلیت خوان (TECAN، سالزبورگ، اتریش) و درصد مهار (درصد) از معادله زیر به دست آمد:

درصد بازداری=(Ac - As)/Ac × 100 (1)

که در آن Ac جذب کنترل و As جذب نمونه است. مقادیر IC50 از منحنی‌های لگ خطی و معادلات آنها محاسبه شد. میانگین نتایج برای سه تعیین نشان داده شده است. اسید کوجیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

3.3. تجزیه و تحلیل جنبشی مهار تیروزیناز

برای تعیین مکانیسم‌های جنبشی، از دو روش جنبشی (نقشه‌های لاین‌ویور-برک و دیکسون) به طور مکمل استفاده شد [21،22،33]. برای نمودارهای متقابل دوگانه Lineweaver-Burk (نقاط 1/سرعت آنزیم (1/V) در مقابل 1/غلظت سوبسترا (1/[S]))، نوع مهار با استفاده از غلظت‌های مختلف L-تیروزین تعیین شد (1، 2، و 4 میلی‌مولار) و L-DOPA ({12}}.5، 1 و 2 میلی‌مولار) به عنوان سوبسترا در حضور غلظت‌های مختلف BHCP. غلظت BHCP به شرح زیر بود: 0، 0.5، 1.{{20}}، و 2.0 میکرومولار برای L-تیروزین. و 0، 2.5، 5، و 10 میکرومولار برای L-DOPA. نمودار دیکسون یک روش گرافیکی (نقاط 1/سرعت آنزیم (1/V) در برابر غلظت بازدارنده (I)) برای تعیین نوع مهار آنزیم است و برای تعیین ثابت تفکیک یا Ki برای کمپلکس آنزیم-بازدارنده استفاده شد. نمودارهای دیکسون (نقاط متقابل منفرد) مهار در حضور بستر ال-تیروزین در 1، 2، و 4 میلی‌مولار و {{4{42}}}}، 0.5، 1 به دست آمد. {47}}، و 2.{49}} میکرومولار برای BHCP. و L-DOPAsubstrate در {{50}}.5، 1.0، و 2.0 میلی‌مولار و 0، 2.5، 5.0 و 10.0 میکرومولار برای BHCP.

گیاه سیستانچیک مهار کننده تیروزیناز است.

3.4. خطوط سلولی و کشت سلولی

سلول های ملانوما B16F10 موش از بانک خط سلولی کره به دست آمد. رده سلولی فیبروبلاست پوست انسان Hs27 از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC، Manassas، VA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. این سلول‌ها در DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی، 100 واحد بر میلی‌لیتر پنی سیلین و 100 میلی‌گرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در انکوباتور 5 درصد CO2 مرطوب شده با دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. فیبروبلاست های پوستی روی یک ظرف 100 میلی متری با BHCP تیمار شدند و در معرض 50 mJ/cm2UV در DMEM بدون سرم (منبع نور UV، UVP) قرار گرفتند. سلول های Hs27 در یک صفحه با قطر 100 میلی متر تا 70 تا 80 درصد تلاقی کشت داده شدند و بین پاساژ شماره 5 و 15 مورد استفاده قرار گرفتند.

3.5. سنجش زنده ماندن سلولی

زنده ماندن سلول ها با استفاده از روش کیت EZ-Cytox ارزیابی شد. به طور خلاصه، سلول‌های B16F1{10}} و فیبروبلاست‌های Hs27 در یک صفحه چاهی با چگالی 1 × 104 سلول در چاه کاشته شدند و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سلول ها با DMEM تازه و بدون سرم که حاوی غلظت های مختلف (0، 1، 2، 5، و 10 میکرومولار) از BHCP بود تغذیه شدند و به مدت 24 و 48 ساعت انکوبه شدند. پس از آن، 10 میکرولیتر محلول EZ-Cytox در هر چاه بارگذاری شد و سلول ها به مدت 2 تا 4 ساعت انکوبه شدند. اندازه گیری جذب سلول ها در غیاب هر گونه تیمار به عنوان بقای سلولی 100 درصد در نظر گرفته شد. هر تیمار به صورت سه بعدی انجام شد و هر آزمایش سه بار تکرار شد.

3.6. تعیین محتویات ملانین سنجش

اثر BHCP بر ملانوژنز ناشی از MSH در سلول های B16F10 بر اساس روشی است که قبلاً با تغییرات جزئی استفاده شده بود [34]. به طور خلاصه، سلول‌های B16F10 (5 × 104 سلول/چاه) در 6-صفحه‌های چاه اجازه رشد تا 70 تا 80 درصد تلاقی داشتند. سپس سلول ها با غلظت های مختلف BHCP (1، 5 و 10 میکرومولار) یا کوجیک اسید (5 میلی مولار) به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و سپس با -MSH (5 میکرومولار) به مدت 48 ساعت تحریک شدند. پس از درمان، سلول‌ها دو بار با PBS سرد شسته شدند، در 90 میکرولیتر محلول NaOH 1 مولار شامل DMSO (5 درصد) در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت حل شد و جذب در 405 نانومتر با اسپکتروفتومتر میکروپلیتی (TECAN، Salzburg) اندازه‌گیری شد. ، اتریش). برای اندازه‌گیری میزان ملانین در آزمایش، میزان مهار در گروه‌های تیمار از جذب غلظت‌های شناخته‌شده ملانین مصنوعی محاسبه شد که به مقدار کل پروتئین موجود در مایع رویی لیزهای سلولی تصحیح شد. جذب سلول های تیمار نشده در سه برابر اندازه گیری شد.

3.7. سنجش فعالیت تیروزیناز سلولی

سنجش فعالیت تیروزیناز سلولی با اندازه گیری میزان اکسیداسیون L-DOPA [35] انجام شد. سلول های B16F1{19}} با تراکم 5 × 104/سلول ها در 6-ظروف چاهک قرار گرفتند و یک شبه انکوبه شدند. سپس سلول ها با غلظت های مختلف BHCP (1، 5 و 10 میکرومولار) یا کوجیک اسید (5 میلی مولار) به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و سپس با -MSH (5 میکرومولار) به مدت 48 ساعت تحریک شدند. سلول ها با PBS شسته شده و در محلولی حاوی 100 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی مولار (pH 6.5)، 0.1 میلی متر فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF) و 1 درصد تریتون ایکس لیز شدند. سپس سلول ها به مدت 30 دقیقه در دستگاه فریزر عمیق (80- درجه سانتیگراد) قرار گرفتند. پس از یخ‌زدایی سلول‌ها، عصاره‌های سلولی با سانتریفیوژ در 12،{26}} دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد خالص شدند. در مجموع 80 میکرولیتر مایع رویی و 20 میکرولیتر L-DOPA (2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به صفحه چاهی اضافه شد و جذب در طول موج 492 نانومتر هر 10 دقیقه در طول 1 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد. C با صفحه خوان الایزا (TECAN، سالزبورگ، اتریش).

3.8. تهیه عصاره سیتوزولی و هسته ای سلول های Hs27

سلول های Hs27 با PBS سرد یخ شسته و برداشت شدند. بافری حاوی 1{4}} میلی‌مولار Tris (pH 8.{9}})، 1.5 میلی‌مولار MgCl2، 1 میلی‌مولار DTT، 0.1 درصد NP{11}} و مهارکننده‌های پروتئاز برای استخراج فراکسیون‌های سیتوزولی توسط سانتریفیوژ در 12،{13}} دور در دقیقه در 4 ◦C به مدت 15 دقیقه، و بخش‌های هسته‌ای از گلوله‌ها با استفاده از بافری حاوی 10 میلی‌مولار تریس، 50 میلی‌مولار KCl، 100 میلی‌مولار NaCl و بازدارنده‌های پروتئاز، استخراج شد، که روی یخ 30 انکوبه شده بود. و سپس در 13،{21}}×g به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا بخشهای هسته ای به دست آید.

3.9. وسترن بلاتینگ

نمونه های لیز به مدت 10 دقیقه در بافر بارگیری ژل (125 میلی مولار Tris-HCl، 4 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS)، 10 درصد 2-مرکاپتواتانول، و 0.2 درصد برموفنل جوشانده شدند. آبی؛ pH 6.8) با نسبت حجمی 1:1. کل معادل های پروتئین برای هر نمونه با استفاده از ژل الکتروفورز SDS-پلی آکریل آمید (PAGE) با استفاده از ژل های آکریل آمید بر اساس روشی که توسط Laemmli [36] توضیح داده شد، جدا شد و با استفاده از سیستم انتقال مرطوب به غشاهای PVDF در ولتاژ 80 ولت به مدت 2 ساعت منتقل شد. غشاها بلافاصله در یک بافر مسدود کننده (شیر بدون چربی 5 درصد) در 10 میلی مولار تریس، pH 7.5، mMNaCl 100 و 0.1 درصد توئین قرار داده شدند. لکه ها برای جلوگیری از اتصال غیراختصاصی در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت مسدود شدند. متعاقباً، غشاها با یک آنتی بادی اولیه خاص در دمای 4 درجه سانتیگراد در طول شب انکوبه شدند و سپس با آنتی بادی ثانویه کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی در دمای 25 درجه سانتیگراد در دمای 25 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. . برچسب گذاری آنتی بادی با افزایش نورتابی شیمیایی مطابق با دستورالعمل های سازنده تشخیص داده شد. کمی سازی پروتئین با استفاده از سیستم تصویربرداری Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence CAS{33}}SM (Core Bio، سئول، کره) انجام شد. برای تعیین وزن مولکولی از نشانگرهای پروتئینی رنگ آمیزی شده استفاده شد.

3.10. تحلیل آماری

تمام داده‌ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می‌شوند. مقدار offp < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

4. نتیجه گیری

به طور خلاصه، یافته های مطالعه حاضر نشان داد که BHCP دارای یک اثر سفید کننده پوست از طریق مهار تیروزیناز است که آنزیم کلیدی برای بیوسنتز ملانین در ملانوسیت های B16F10-MSH القا شده است. علاوه بر این، BHCP بیان سطوح پروتئین MMP را در فیبروبلاست های ناشی از اشعه ماوراء بنفش کاهش داد، که انتظار می رود اثر ضد چین و چروک داشته باشد. تحقیقات بیشتری برای تایید اثرات سفید کنندگی و ضد چروک BHCP از طریق مطالعات حیوانی و بالینی مورد نیاز است. در نهایت، BHCP دارای اثرات سفید کننده و ضد چروک است، که نشان دهنده پتانسیل آن برای توسعه عوامل درمانی برای بیماری های مرتبط با هایپرپیگمانتاسیون و چین و چروک است.

سیستانچ چیست

برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید.