طراحی SiRNA های تیروزیناز با الگوریتم های پیش بینی چندگانه و ارزیابی اثرات ضد ملانوژنیک آنها

خلاصه

ملانین رنگدانه ای است که از تیروزین در ملانوسیت ها تولید می شود. اگرچه ملانین نقش محافظتی در برابر آسیب های ناشی از اشعه UVB دارد، اما با ایجاد ملانوم و رنگ پوست تیره تر نیز همراه است. تیروزیناز یک آنزیم حیاتی در سنتز ملانین است که مرحله محدود کننده سرعت را در طی تبدیل تیروزین به DOPA و دوپاکینون تنظیم می کند. برای توسعه درمان‌های موثر تداخل RNA، ما یک مخزن siRNA ملانین را با استفاده از برنامه‌های پیش‌بینی متعدد برای کاهش سطح تیروزیناز انسانی طراحی کردیم.

ابتدا، 272 siRNA ارزیابی دسترسی هدف را با استفاده از برنامه RNAxs پشت سر گذاشتند. سپس 34 توالی siRNA با ΔG بزرگتر یا مساوی -34.6 کیلوکالری در مول، مقدار i-Score بزرگتر یا مساوی 65، و امتیاز مقیاس های siRNA کمتر یا مساوی 30 انتخاب کردیم. siRNA ها به صورت طراحی شدند. 19-bp RNA دوبلکس با یک برآمدگی نامتقارن 3' در انتهای 3' رشته آنتی سنس. ما آزمایش کردیم که آیا این siRNA ها به طور موثر بیان ژن تیروزیناز را با استفاده از qRT-PCR کاهش می دهند و دریافتیم که 17 توالی siRNA موثرتر از siRNA تجاری موجود هستند. سه siRNA که بیشتر مورد آزمایش قرار گرفتند، تغییر رنگ بصری موثری را در سلول‌های انسانی MNT{12} بدون اثرات سیتوتوکسیک نشان دادند، که نشان می‌دهد این توالی‌ها ضد ملانوژن هستند. مطالعه ما نشان داد که siRNA‌های تیروزیناز انسانی را می‌توان با استفاده از الگوریتم‌های پیش‌بینی متعدد طراحی کرد.

در تحقیقات ما مشخص شد که گیاه سیستانچ دسرتیکولا دارای اثر سفید کنندگی است، روش تهیه عصاره سل و مواد آرایشی سفیدکننده و ضد پیری، روش تهیه عصاره سیستانچ دسرتیکولای سل شامل خرد کردن، استخراج خام، سانتریفیوژ و جمع آوری می باشد. عصاره خام، و پس از ایستادن، شستشو و خشک کردن، عصاره سیستانچ سیستانچ به دست می آید. روش تهیه ساده و بدون آلودگی است، محتوای اکیناکوزید در عصاره بیشتر یا مساوی 25 درصد، محتوای ورباسکوزید بیشتر یا مساوی 55 درصد و محتوای گلیکوزید کل بیشتر یا مساوی است. 80 درصد؛ پس از آزمایش فعالیت آنتی اکسیدانی و غیره، ثابت شد که عصاره گیاه سیستانش دسرتیکولا دارای اثرات ضد اکسیداسیون، سفید کنندگی و ضد پیری است. برای تهیه لوازم آرایشی سفید کننده و ضد پیری به لوازم آرایشی اضافه می شود و مواد آرایشی از نظر سمیت سلولی و ایمنی آزمایش می شوند و تأیید می شود که مواد آرایشی ایمن و غیر تحریک کننده هستند و اثر سفید کنندگی خوبی دارند.

روی فواید سلامتی سیستانچ کلیک کنید

کلید واژه ها:

تیروزیناز، ملانین، siRNA، ملانوسیت ها، سفید کننده.

معرفی

رنگ پوست انسان عمدتاً توسط رنگدانه ملانین تعیین می شود که توسط ملانوسیت های اپیدرم تولید می شود. تولید ملانین با قرار گرفتن پوست در معرض اشعه ماوراء بنفش القا می شود و با واسطه وزیکول به کراتینوسیت ها منتقل می شود (Slominski et al., 2004). دو نوع ملانین، یوملانین و فئوملانین، از ال-تیروزین طی یک فرآیند چند مرحله ای تولید می شوند. Eumelanin یک پلیمر نامحلول تیره و قهوه ای سیاه است که مسئول رنگ تیره پوست است (Slominski et al., 2004). مرحله محدود کننده سرعت در ملانوژنز تبدیل L-تیروزین به L-دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) توسط تیروزیناز است (Lerner and Fitzpatrick, 1950; Hearing Tsukamoto, 1991). برای اهداف آرایشی و دارویی، بسیاری از عوامل بازدارنده تیروزیناز برای مدیریت رنگدانه های پوست ساخته شده اند، مانند هیدروکینون (1,{14}}دی هیدروکسی بنزن)، آربوتین، اسید آزلائیک (1،{16}}هپتان دی کربوکسیلیک اسید)، و دیگران (گیلبرو و اولسون، 2011). اگرچه اثرات ضد رنگدانه آنها به خوبی ثابت شده است، خطر عوارض جانبی باعث تردید برای استفاده مداوم از مهارکننده های تیروزیناز شده است، همانطور که فرمولاسیون هیدروکینون با غلظت بیش از 1 درصد نشان داده است که در اروپا ممنوع شده است (گیلبرو و اولسون، 2011). ).

تداخل RNA (RNAi) برای اولین بار به عنوان یک مکانیسم دفاعی ضد ویروسی در نماتد Caenorhabditis elegans کشف شد که در آن RNA های دو رشته ای (dsRNAs) باعث خاموش شدن ژن توالی های mRNA مکمل می شوند (Fire et al., 1998). پس از آن، RNA های تداخلی کوتاه مصنوعی (siRNA) در سلول های پستانداران پردازش می شوند (Elbashir et al., 2001a) مشاهده شد. پردازش RNAi از چند مرحله تشکیل شده است. تولید siRNA توسط برش dsRNA توسط Dicer، مونتاژ siRNA با کمپلکس خاموش کننده ناشی از RNA (RISC)، جداسازی رشته‌های siRNA (رشته‌های حسی (مسافر) و آنتی‌سنس (راهنما)، اتصال رشته آنتی‌سنس به mRNA با یک مکمل توالی، و تخریب mRNA توسط Argonaute 2 (Ago2) (Enges, 2013).

ویژگی های ساختاری siRNA برای دهه ها مورد مطالعه قرار گرفته است. ساختار کلاسیک siRNA ها به طول دوبلکس مناسب، اورهانگ 3' و ساختار نامتقارن نیاز دارد. از یک مطالعه در Drosophila melanogaster، طرح استاندارد siRNA به‌عنوان dsRNA‌های رشته‌های حس/ضد حس 21 nt که یک ساقه dsRNA 19 جفت پایه (bp) با 2 nt 3' overhange در هر دو انتها را تشکیل می‌دهند (Elbashir et al., 2001b) پیشنهاد شد. ). با این حال، در سلول‌های پستانداران، مطالعات اخیر نشان داد که siRNA غیرمتعارف می‌تواند به اندازه siRNA‌های کلاسیک مؤثر باشد یا حتی می‌تواند با تغییرات طول، تقارن و اضافه‌آمدگی بهبود یابد. siRNA های بدون اورهانگ (های) 3' (Czauderna و همکاران، 2003؛ رز و همکاران، 2005؛ چانگ و همکاران، 2007)، و آنهایی که طولانی تر (کیم و همکاران، 2005) یا کوتاه تر (چو و رانا، 2008) ) بیش از 19 جفت باز نیز در خاموشی ژن در سلول های پستانداران موثر بودند. عدم تقارن در ساختار 3' overhang، تنها در رشته آنتی سنس، منجر به عملکرد بهتری نسبت به siRNAهای متقارن شد (Sano et al., 2008).

برای از بین بردن موثر و خاص اهداف mRNA، طراحی منطقی siRNA ها حیاتی است. الگوریتم های نسل اول برای طراحی siRNA بر اساس پایداری ترمودینامیکی (Schwarz et al., 2003)، ترجیح موقعیتی (Amarzguioui and Prydz, 2004؛ Reynolds et al., 2004؛ Ui-Tei et al., 2004) و منحصر به فرد بودن توسعه یافتند. توالی هدف (Pancoska و همکاران، 2004). این مطالعات نشان می‌دهد که siRNA‌های عملکردی در پایداری انتهای دوبلکس نامتقارن هستند، همانطور که توسط انتهای ناپایدار 5' رشته‌های راهنما دیده می‌شود، و این واقعیت که انتهای 5' رشته‌های راهنما، پایه‌های A یا U را ترجیح می‌دهند. علاوه بر این، ارزیابی محل هدف دسترسی بین siRNA و mRNA حیاتی است و بر اساس انرژی مورد نیاز برای باز کردن محل اتصال و تشکیل هیبریداسیون محاسبه می‌شود (Muckstein et al., 2006; Tafer et al., 2008). برای افزایش دقت پیش‌بینی، الگوریتم‌های نسل دوم از مدل‌های جدید با تعداد زیادی مشاهدات استفاده کردند. آنها از یک مدل شبکه عصبی مصنوعی (هوسکن و همکاران، 2005) یا یک مدل رگرسیون خطی (شابالینا و همکاران، 2006؛ ورت و همکاران، 2006؛ ایچیهارا و همکاران، 2007) استفاده کردند.

در این مطالعه، ما شرایط مختلفی را برای طراحی siRNA های تیروزیناز انسانی کارآمد در نظر گرفتیم. برای به حداکثر رساندن کارایی در طراحی siRNA، معیارهای شناخته شده را برای ارزیابی با استفاده از الگوریتم‌های طراحی siRNA متعدد (RNAxs، i-Score، و مقیاس‌های siRNA) ترکیب کردیم: دسترسی به سایت هدف، محتوای GC، پایداری ترمودینامیکی نسبی در هر دو انتها، و همچنین معیارهای دیگر. ما بیشتر اثر مهاری siRNA های انتخابی را بر تولید ملانین در سلول های ملانوم انسانی نشان دادیم.

مواد و روش ها

کاربرد ترکیبی الگوریتم‌های طراحی siRNA و سنتز

برای توالی mRNA تیروزیناز انسانی (TYR)، توالی مرجع (RefSeq id NM{{0}}) از پایگاه داده نوکلئوتیدی NCBI استفاده شد. برای ارزیابی دسترسی هدف، از ابزار طراحی RNAxs استفاده شد. RNAxs معیارهای عملکرد شناخته شده siRNA (عدم تقارن، خود تا شدن، آزاد) را با دسترسی به سایت هدف RISC ترکیب می کند (Tafer et al., 2008). 272 siRNA با پارامترهای پیش‌فرض ارسال شدند (آستانه دسترسی 8 nt؛ 0.01157، آستانه دسترسی 16 nt؛ 0.001002، انرژی خود تاشو؛ 0.9022، عدم تقارن توالی، 0.5، عدم تقارن انرژی؛ 0.4655، انتهای آزاد؛ 0.625) در تمامی معیارها و بر اساس امتیاز رتبه بندی شدند. مقیاس i-Score و siRNA بر اساس یک مدل رگرسیون خطی است و با استفاده از مجموعه داده Huesken آموزش داده شده است (Huesken et al., 2005). الگوریتم i-Score (امتیاز مهاری) مقادیر ΔG رشته‌های siRNA، دی نوکلئوتیدها در انتهای 5' و 3'، حداکثر طول کشش GC و محتوای GC را محاسبه می‌کند (Ichihara et al., 2007). این الگوریتم پایه ترجیحی هر موقعیت نوکلئوتیدی را با محاسبه امتیاز بازداری (i-Score) شناسایی می کند. همچنین، برای بهبود دقت طراحی امتیاز، siRNA‌های مقاوم‌تر در برابر حرارت با مقادیر ΔG کل بیشتر یا مساوی -34.6 کیلوکالری در مول انتخاب کردیم (Ichihara et al., 2007). مقیاس‌های siRNA پایداری انتهای 5' و 3' و محتوای کل GC را محاسبه می‌کنند (Matveeva و همکاران، 2007). فیلترهایی را برای امتیازهای iScore بیشتر یا مساوی 65 و مقیاس‌های siRNA کمتر یا مساوی 30 اعمال کردیم. همه siRNA‌ها برای TYR توسط Bioneer Inc. (Daejeon، کره) به‌عنوان 21-مر با 3 سنتز شدند. بر روی رشته آنتی سنس آویزان شود. برای لیست کامل siRNA ها به جدول 1 مراجعه کنید.

کشت سلولی

رده سلولی ملانوم انسانی بسیار رنگدانه MNT{{0}} با مهربانی توسط دکتر مینسو نو (دانشگاه ملی سئول، دانشکده داروسازی) ارائه شد. سلول ها در محیط حداقل ضروری (MEM) همراه با 20 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 10 درصد محیط عقاب اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و جنتامایسین (50 میکروگرم در میلی لیتر) نگهداری شدند. تریپسین (0.25 درصد) و اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) از Gigbco-BRL و 20 میلی مولار HEPES از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. سلول ها در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب 5 درصد CO2 در هوا نگهداری شدند.

انتقال siRNA

Lipofectamine 2000 (11668-027، Invitrogen، Waltham، MA، USA) یا DharmaFECT (T-2001-02، Thermo Scientific، Waltham، MA، USA) برای ترانسفکشن سلولی طبق پروتکل سازنده استفاده شد. 34 siRNA ضد تیروزیناز و siRNA غیر هدفمند از شرکت Bioneer خریداری شد. siRNA کنترل مثبت از سانتا کروز (#sc-36766، سانتا کروز، دالاس، TX، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. سلول‌های MNT{7}} تا 60 درصد تلاقی رشد کردند و بسته به پروتکل سازنده با لیپوفکتامین یا معرف DharmaFECT ترانسفکت شدند.

تجزیه و تحلیل ایمونوبلات

سلول‌های MNT{0}} آنالیز ایمونوبلات با بافر لیز (20 میلی‌مولار tris pH 7.5،5 میلی‌مولار EDTA، 10 میلی‌مولار Na4 P2 O7، 100 میلی‌مولار NaF، 2 میلی‌مولار Na3 VO4، 1 درصد NP{14}}، 1 لیز شدند. mM PMSF، 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر آپروتینین، و 10 میکروگرم در میلی‌لیتر لوپپتین) و 15 میکروگرم پروتئین در معرض SDS-PAGE قرار گرفتند و به غشای نیتروسلولز منتقل شدند. غشاها با یک آنتی بادی ضد تیروزیناز (#sc{21}}، سانتا کروز) انکوبه شدند. باندها با یک سیستم تصویربرداری ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) تجسم شدند و با نرم افزار ImageJ (نسخه 1.44p, NIH, USA) کمی سازی شدند.

اندازه گیری محتوای ملانین

محتوای ملانین همانطور که قبلاً توضیح داده شد (Hosoi et al., 1985) با برخی تغییرات اندازه گیری شد. به طور خلاصه، سلول‌های MNT{1} بر روی صفحات {2}چاهی (6×105 سلول/چاه) کاشته شدند و با siRNA ترانسفکت شدند. در 48 ساعت و 168 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول ها با سالین بافر فسفات (PBS) شسته و برداشت شدند. پس از شستشو با PBS، گلوله های سلولی در 1 میلی لیتر NaOH 1 N حاوی 10 درصد DMSO حل شده و به مدت 1 ساعت در دمای 80 درجه انکوبه شدند. جذب محلول در طول موج 450 نانومتر اندازه گیری شد. محتوای ملانین بر اساس منحنی استاندارد به دست آمده از ملانین مصنوعی محاسبه شد.

تست زنده ماندن سلولی (آزمون XTT)

سنجش XTT (cat# 11465015001, Roche, Pleasanton, CA, USA) طبق پروتکل سازنده انجام شد. به طور خلاصه، 6×105 سلول MNT1/چاهک در 6-صفحات چاهک قرار داده شد. در روز بعد، سلول ها با siRNA های فردی ترانسفکت شدند. پس از 24 ساعت، سلول‌ها به صورت پنج‌تایی در میکروپلیت‌های چاهک قرار گرفتند و سپس برای تعداد روزهای مشخص شده نگهداری شدند. برای سنجش XTT، 50 میکرولیتر از مخلوط برچسب‌گذاری XTT (معرف نشان‌دهنده XTT: معرف جفت‌کننده الکترون{10}:1 برای رسیدن به غلظت نهایی XTT 0.3 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به هر چاهک اضافه شد و صفحات انکوبه شدند. در دمای 37 درجه در اتمسفر 5 درصد CO2 به مدت 4 ساعت. جذب با یک صفحه خوان سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم در 450 نانومتر اندازه گیری شد.

جداسازی RNA و تجزیه و تحلیل کمی واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (PCR).

RNA کل با استفاده از یک کیت easy-BLUE (reagent TRIZol، iNtRON، Seongnam، کره)، طبق پروتکل سازنده از سلول ها استخراج شد. TRIzol با افزودن کلروفرم حذف شد و mRNA با ایزوپروپانول رسوب داده شد. رسوبات RNA با اتانول 75 درصد شسته شدند. چگالی نوری در 260 و 280 نانومتر با استفاده از طیف‌سنج UV برای ارزیابی کمیت و خلوص RNA اندازه‌گیری شد و یکپارچگی RNA با الکتروفورز ژل آگارز تأیید شد. پرایمرهای اختصاصی ژن برای تقویت تیروزیناز انسانی (TYR)، فاکتور نکروز تومور (TNF)، اینترلوکین 6 (IL6) و ژن خانه داری گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) برای کنترل داخلی طراحی شدند. جفت آغازگر زیر برای TYR (F: 5'-GCCAACGATCCTAT CTTCCTTC{10}}'، R: 5'-GTGCATTGGCTTCTGGATAAAC{13}}')، TNF (F: 5'-GAGGCCAAGCCCTGGTATG{10}) استفاده شد ′، R: 5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′)، IL6 (F: 5′-CTGGATTCAATGAGGAGAGACTTG-3" R: 5′-CACTACTCTCAAATCTGTTCTGG-3} و GAPDH (F: 5′ -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'، R: 5'-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3'). همه تکثیرها با استفاده از یک پیش مخلوط (20 میکرولیتر) حاوی 500 نانومول در لیتر پرایمرهای اختصاصی ژن و 2 میکرولیتر RNA الگو تحت شرایط زیر انجام شد: دناتوراسیون در دمای 95 درجه به مدت 1 دقیقه، به دنبال آن 45 سیکل 95 درجه برای 20 ثانیه، 58 درجه برای 20 ثانیه، و 72 درجه برای 25 ثانیه، با گسترش نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه.

تحلیل آماری

داده های گرافیکی به صورت میانگین ± SD ارائه می شوند. معنی‌داری آماری بین سه تکرار و بین گروه‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک یا دو طرفه (ANOVA) و پس از آن به ترتیب پس‌آزمون مقایسه‌های چندگانه بونفرونی یا t-test دانشجویی تعیین شد. اهمیت زمانی در نظر گرفته شد که p<0.05.

نتایج

طراحی siRNA های تیروزیناز انسانی

برای ساخت یک مخزن siRNA کارآمد با هدف قرار دادن تیروزیناز انسانی، از ابزارهای بیوانفورماتیکی با ترکیب چندین مدل پیش‌بینی پیشرفته استفاده کردیم. ما توالی مرجع mRNA (RefSeq id NM_000372) را از مجموعه داده نوکلئوتیدی NCBI برای تیروزیناز انسانی به‌دست آوردیم و مناطق 5'UTR و 3'UTR را از پیش‌بینی حذف کردیم، زیرا می‌توانند با عملکرد RISC تداخل داشته باشند (البشیر و همکاران، 2002). ابتدا، توالی برای دسترسی RISC به سایت هدف با استفاده از نرم افزار RNAxs مورد ارزیابی قرار گرفت، که عامل مهمی برای محدود کردن فعالیت اندونوکلئولیتیک RISC در نظر گرفته شد (Tafer et al., 2008). علاوه بر دسترسی به هدف، این الگوریتم همچنین انرژی تاشو و عدم تقارن توالی را برای محاسبه امتیازات ارزیابی می‌کند.

از این الگوریتم، 272 19-دنباله های دو رشته ای (17 درصد از 1572 دنباله) از آستانه پیش فرض عبور کردند. توالی‌ها همچنین توسط دو الگوریتم نسل دوم بر اساس مدل‌های رگرسیون خطی ارزیابی شدند: i-Score (نمره مهاری) (Ichihara و همکاران، 2007) و مقیاس‌های siRNA (Matveeva و همکاران، 2007). هر دو الگوریتم مقیاس i-Score و siRNA اولویت های وابسته به موقعیت نوکلئوتید را در نظر می گیرند. مقیاس‌های siRNA، پایداری دوبلکس موضعی و محتوای کل G/C را برای ارزیابی siRNA‌های عملکردی محاسبه می‌کنند. فیلترهایی را برای i-Score بزرگتر یا مساوی 65 و مقیاس‌های siRNA کمتر یا مساوی 30، با کل ΔG بزرگتر یا مساوی -34.6 کیلوکالری در مول اعمال کردیم. ما متوجه شدیم که i-Score سخت‌تر بود و ۱۹۱ توالی (۱۲ درصد) را عبور می‌داد، در حالی که مقیاس‌های siRNA سخت‌تر بودند و ۴۷ درصد توالی‌ها را رد می‌کردند. در نهایت، 71 siRNA به دست آمد که معیارهای هر سه الگوریتم طراحی siRNA را داشتند. هنگامی که محدودیت‌های کل ارزش ΔG اعمال شد، تنها 34 siRNA (2.2 درصد) در نهایت بدون اثرات خارج از هدف عبور کردند، همانطور که با استفاده از پایگاه داده نوکلئوتیدی NCBI (شکل 1A، 1B) تعیین شد. برای این مطالعه، ما دوبلکس‌های 19-bp RNA با یک برآمدگی نامتقارن 2-nt در انتهای 3' رشته آنتی‌سنس برای عملکرد بهتر همانطور که پیشنهاد شد (شکل 1C) طراحی کردیم (رز و همکاران، 2005). ؛ سانو و همکاران، 2008). توالی کامل siRNA در جدول 1 فهرست شده است.

ارزیابی اثربخشی تیروزیناز siRNA در رده سلولی ملانوم انسانی MNT-1

برای ارزیابی کارایی siRNA های انتخاب شده توسط ابزارهای طراحی siRNA، سلول های MNT{{{0}} را با 34 siRNA جداگانه ترانسفکت کردیم و بیان mRNA تیروزیناز (TYR) را با qRT-PCR اندازه گیری کردیم. همانطور که در طرح تجربی شرح داده شده در شکل 2A نشان داده شده است، سطح بیان mRNA تیروزیناز در روز 2 پس از ترانسفکشن اندازه گیری شد. 34 siRNA سطح mRNA تیروزیناز را به طور متوسط ​​57.8 درصد کاهش دادند (SD{8}}.141) در غربالگری اول. 13 siRNA موثرتر از siRNA تجاری موجود بودند که به عنوان یک کنترل مثبت (PC) با اهمیت استفاده شد (شکل 2B، جدول 2). ما mRNA تیروزیناز را برای تایید کارایی 6 موثرترین (#16، 17، 23، 26، 28، و 31) و 3 کم اثرترین (#2، 3 و 5) siRNA ها کمیت کردیم. با اولین غربالگری، 6 siRNA موثر بیان تیروزیناز را به طور موثری از بین بردند (0.{26}}برابر NC) و همچنین مؤثرتر از کنترل مثبت (0.{28}} برابر در مقابل NC). NC)، در حالی که 3 کمترین اثر siRNA کارایی مشابه یا کمتری را نشان دادند (شکل 3A، 3B).

در غربالگری دوم، حتی کمترین اثربخشی siRNAها بیان تیروزیناز را تقریباً 0 کاهش دادند.5- برابر. برای اینکه ببینیم آیا siRNA ها سطح پروتئین تیروزیناز را کاهش می دهند، ما یک تجزیه و تحلیل ایمونوبلات انجام دادیم. در نتیجه سطوح mRNA، سطح پروتئین تیروزیناز به طور موثر کاهش یافت (شکل 3C). به طور کلی، 6 موثرترین siRNA ها عملکرد بهتری نسبت به 3 کم اثرتر نشان دادند. با در نظر گرفتن شکست موثر ارائه شده توسط siRNA های ما حتی با بدترین عملکرد، نتایج ما از این ایده حمایت می کند که تولید siRNA با ترکیب الگوریتم های طراحی siRNA متعدد یک رویکرد کارآمد است.

اثر ضد ملانوژنیک siRNA ها در سلول های MNT{1}}

نتایج فوق نشان می دهد که siRNA هایی که ما طراحی کردیم می توانند سنتز ملانین را در سلول های تولید کننده ملانین کاهش دهند. برای آزمایش اثر siRNA‌های ما (#16، 17، 26) بر سنتز ملانین توسط تیروزیناز، محتوای ملانین را در سلول‌های MNT{5}} ترانسفکت‌شده با siRNA اندازه‌گیری کردیم. همانطور که در شکل 4A (بالا) نشان داده شده است، محتوای ملانین تنها در روز 2 پس از ترانسفکشن به مقدار کم تغییر کرد. با این حال، هنگامی که محتوای ملانین در روز 7 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، اثر ضد ملانوژنیک این siRNA ها شناسایی شد (شکل 4A، پایین تر). اندازه گیری رنگ سنجی این نمونه ها (روز 7) نشان داد که تمام siRNA ها به طور قابل توجهی محتوای ملانین را کاهش می دهند (p<0.001). siRNAs #16 and 17 were as effective as the positive control in reducing melanin content by approximately 0.55-fold (0.56-fold by P.C.) although siRNA #26 was less effective (~0.74-fold) (Fig. 4B). These data show that the siRNAs we designed are effective in reducing melanin synthesis in cells.

تاثیر siRNA ها بر زنده ماندن سلول

برخی از siRNA‌ها منجر به سمیت می‌شوند و با تأثیرات خارج از هدف مربوط به رشد، مرگ و سایر ویژگی‌های سلولی، روی زنده‌مانی سلول تأثیر می‌گذارند. برای شناسایی اینکه آیا این siRNA ها منجر به سمیت سلولی می شوند، ما زنده ماندن سلول را با مشاهده تغییرات در مورفولوژی سلول و با سنجش XTT در سلول های MNT{2}} ترانسفکت شده با siRNA تجزیه و تحلیل کردیم. در روز 1 یا 2 پس از ترانسفکشن siRNA (#16، 17، 26، و PC)، هیچ تغییر قابل توجهی در مورفولوژی سلول مشاهده نشد (شکل 5A). به‌علاوه، هیچ تغییر قابل‌توجهی در زنده‌مانی سلولی که با روش XTT اندازه‌گیری شد، مشاهده نشد (شکل 5B). ما بیشتر آزمایش کردیم که آیا این siRNAها می‌توانند با اندازه‌گیری سطوح mRNA TNF و IL، پاسخ ایمنی را القا کنند. siRNA #16 و 17 بر بیان mRNA TNF تأثیری نداشتند در حالی که #26 افزایش حدود 1 برابری را در شرایط برهنه و با لیپوزوم نشان داد (شکل 5C).

با این حال، سطح بالاتر از کنترل مثبت (PC) نبود. در مقابل، IL{0}} توسط هر سه siRNA در شرایط با لیپوزوم تنظیم شد در حالی که کنترل مثبت هیچ اثر مضری را نشان نداد. به خصوص، siRNA #26 و PC پاسخ های ایمنی را حتی در حالت برهنه ایجاد کردند، که در آن هیچ کاهش mRNA تیروزیناز مشاهده نشد. در مجموع، داده‌های ما نشان داد که ترکیب الگوریتم‌های طراحی siRNA یک رویکرد کارآمد برای توسعه توالی‌های siRNA جدید است. علاوه بر این، siRNA های انتخاب شده (#16 و 17) در سرکوب سنتز ملانین انسانی موثر بودند، که نشان می دهد این siRNA ها می توانند بیشتر به عنوان توالی های siRNA جدید برای استفاده در تحقیقات زیست پزشکی و زمینه های زیبایی توسعه یابند.

بحث

عوامل روشن کننده پوست برای اهداف آرایشی مفید هستند و بسیاری از این فرمولاسیون ها برای دهه ها ساخته شده اند. در حال حاضر، عوامل مختلفی در دسترس هستند، با مکانیسم‌های اثر متنوعی مانند مهار تیروزیناز (هیدروکینون، آزلائیک اسید، آربوتین)، تحریک گردش کراتینوسیت و کاهش انتقال ملانوزوم (رتینوئیدها)، cop-per chelation (اسید کوجیک و اسید اسکوربیک)، و مهار بلوغ ملانوزوم (آربوتین) (Sheth and Pandya، 2011). تیروزیناز یک آنزیم محدود کننده سرعت در تولید ملانین از ملانوسیت ها است (Lerner and Fitzpatrick, 1950; Hearing and Tsukamoto, 1991). در اینجا، ما به دنبال کاهش بیان تیروزیناز با استفاده از siRNA های تیروزیناز طراحی شده با استفاده از ابزارهای پیش بینی متعدد بودیم.

طراحی کارآمد siRNA بسیار مهم است، زیرا حتی تغییرات ظریف توالی ممکن است به طور قابل توجهی عملکرد را تغییر دهد. در حال حاضر، الگوریتم‌های طراحی siRNA متعددی توسعه یافته‌اند و این الگوریتم‌ها عوامل مختلفی را برای عملکرد حیاتی در نظر می‌گیرند، مانند دسترسی به هدف، ساختارهای mRNA ثانویه، و ترجیحات موقعیتی توالی siRNA. مطالعات اولیه در مورد قوانین الگوهای توالی siRNA ترجیحی پیشنهاد شد: N2SN17WN2 توسط قانون Ui-Tei (Ui-Tei و همکاران، 2004)، N4AN6TN2HN5WN2 توسط Reynolds (رینولدز و همکاران، 2004)، و غیره. این قوانین همچنین معمولاً نشان می‌دهند که یک ساختار siRNA نامتقارن حیاتی است: بازهای A/U بیشتری در انتهای 5' رشته آنتی‌سنس لازم است در حالی که بازهای G/C بیشتری در انتهای 5' رشته حس ضروری است. محتوای GC پایین در انتهای 5' رشته آنتی سنس به باز شدن و ادغام دوبلکس siRNA در کمپلکس RISC کمک می کند.

الگوریتم‌های مقیاس i-Score و siRNA اولویت نوکلئوتیدی را در هر موقعیت از siRNA علاوه بر عوامل دیگر محاسبه می‌کنند. به همین دلیل، نمرات الگوریتم‌های مقیاس i-Score و siRNA یک همبستگی خفیف تا متوسط ​​را نشان دادند (R2 =0.4309) (داده‌ها نشان داده نمی‌شوند)، و اکثر siRNA‌هایی که الزامات الگوریتم i-Score را گذرانده بودند شامل شدند. در مقیاس های siRNA نتایج ما همچنین نشان داد که آستانه پیش‌فرض ارائه شده توسط مقیاس‌های siRNA سخت‌تر از i-Score است (47 درصد در مقابل 12 درصد از کل).

مطالعات قبلی نشان داد که ساختار ثانویه siRNA کل مقادیر ΔG یک عامل تعیین کننده در کارایی siRNA است (Ichihara و همکاران، 2007؛ Ladunga، 2007). به‌ویژه، siRNA‌هایی با مقادیر ΔG کمتر از -34.6 کیلوکالری در مول، که از نظر ترمودینامیکی پایدار هستند، کارآیی ضعیفی از خود نشان دادند (Ichihara et al., 2007). هنگامی که ما ضریب همبستگی بین مقادیر ΔG و سطوح سرکوب را با استفاده از داده‌هایمان محاسبه کردیم، همبستگی معنی‌داری مشاهده نشد (داده‌ها نشان داده نشده است). با این حال، از آنجایی که ما فقط تعداد کمی از siRNA ها را بررسی کردیم، نمی توانیم نتیجه بگیریم که مقادیر ΔG از نظر آماری با کارایی siRNA ارتباطی ندارند. برای تعیین تأثیر مقادیر ΔG کل بر فعالیت siRNA، تعداد زیادی نمونه مورد نیاز است و siRNAهایی با مقادیر ΔG کل پایین‌تر باید برای مقایسه به آزمون اضافه شوند.

در مجموع، ما siRNA‌های تیروزیناز انسانی را با استفاده از الگوریتم‌ها و پارامترهای متعدد طراحی کردیم و siRNA‌های بسیار کارآمدی را شناسایی کردیم که ممکن است در زمینه آرایشی مفید باشند. بسیاری از siRNA ها در حال حاضر برای استفاده در زمینه های زیست پزشکی و زیبایی در نظر گرفته شده اند و در آزمایشات بالینی در سراسر جهان آزمایش شده اند. با این حال، برای استفاده گسترده از برنامه های مبتنی بر siRNA، برخی از موانع مانند مسائل مربوط به ایمنی، پایداری و تحویل باید حل شوند.

قدردانی

این مطالعه با کمک مالی Leaders Cosmetics، Samsung L&S Co., Ltd (#2015/05/20-31) و توسط برنامه تحقیقات علوم پایه از طریق بنیاد ملی تحقیقات کره (KRF) با بودجه وزارت آموزش (2016R1D1A1B01012515).

منابع

Amarzguioui, M. and Prydz, H. (2004) الگوریتمی برای انتخاب توالی siRNA عملکردی. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 316، 1050-1058.

Chang, CI, Hong, SW, Kim, S. and Lee, DK (2007) مطالعه رابطه ساختار-فعالیت siRNAها با تغییرات ساختاری. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 359، 997-1003.

چو، سی و رانا، TM (2008) RNAi قوی توسط محرک های RNA کوتاه. RNA 14، 1714-1719.

Czauderna, F., Fechtner, M., Dames, S., Aygun, H., Klippel, A., Pronk, GJ, Giese, K. and Kaufmann, J. (2003) تغییرات ساختاری و تغییرات تثبیت کننده siRNA های مصنوعی در سلول های پستانداران. Nucleic Acids Res. 31، 2705-2716.

Elbashir, SM, Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T. (2001a). طبیعت 411، 494-498.

Elbashir, SM, Harborth, J., Weber, K. and Tuschl, T. (2002) تجزیه و تحلیل عملکرد ژن در سلولهای پستانداران سوماتیک با استفاده از RNAهای تداخلی کوچک. روش 26، 199-213.

Elbashir, SM, Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W. and Tuschl, T. (2001b) آناتومی عملکردی siRNA ها برای واسطه گری RNAi کارآمد در لیزات جنین مگس سرکه ملانوگاستر. EMBO J. 20, 6877-6888.

انگلس، JW (2013) خاموش کردن ژن توسط siRNA های اصلاح شده شیمیایی. N. بیوتکنول. 30، 302-307.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, MK, Kostas, SA, Driver, SE and Mello, CC (1998) تداخل ژنتیکی قوی و خاص توسط RNA دو رشته ای در Caenorhabditis elegans. طبیعت 391، 806-811.

Gillbro, JM and Olsson, MJ (2011) ملانوژنز و مکانیسم های عوامل روشن کننده پوست{2}رویکردهای موجود و جدید. بین المللی J. Cosmet. علمی 33، 210-221.

شنوایی، VJ و Tsukamoto، K. (1991) کنترل آنزیمی رنگدانه در پستانداران. FASEB J. 5, 2902-2909.

Hosoi, J., Abe, E., Suda, T. and Kuroki, T. (1985) تنظیم سنتز ملانین سلولهای ملانوما B16 موش توسط 1 آلفا، 25-دی هیدروکسی ویتامین D3 و اسید رتینوئیک. سرطان Res. 45، 1474-1478.

Huesken، D.، Lange، J.، Mickanin، C.، Weiler، J.، Asselbergs، F.، Warner، J.، Meloon، B.، Engel، S.، روزنبرگ، A.، کوهن، D.، Labow, M., Reinhardt, M., Natt, F. and Hall, J. (2005) طراحی یک کتابخانه siRNA ژنومی با استفاده از یک شبکه عصبی مصنوعی. نات. بیوتکنول. 23، 995-1001.

Ichihara، M.، Murakumo، Y.، Masuda، A.، Matsuura، T.، Asai، N.، Jijiwa، M.، Ishida، M.، Shinmi، J.، Yatsuya، H.، Qiao، S.، Takahashi, M. and Ohno, K. (2007) ناپایداری ترمودینامیکی siRNA duplex یک پیش نیاز برای پیش‌بینی قابل اعتماد فعالیت‌های siRNA است. Nucleic Acids Res. 35، e123.

Kim, DH, Behlke, MA, Rose, SD, Chang, MS, Choi, S. and Rossi, JJ (2005) سوبستراهای مصنوعی dsRNA Dicer قدرت و کارایی RNAi را افزایش می دهند. نات. بیوتکنول. 23، 222-226.

Ladunga، I. (2007) خاموش کردن ژن کاملتر توسط siRNAهای کمتر: طراحی شفاف بهینه و امضای بیوفیزیکی. Nucleic Acids Res. 35، 433-440.

Lerner, AB and Fitzpatrick, TB (1950) بیوشیمی تشکیل ملانین. فیزیول. Rev. 30, 91-126.

Matveeva, O., Nechipurenko, Y., Rossi, L., Moore, B., Saetrom, P., Ogurtsov, AY, Atkins, JF and Shabalina, SA (2007) مقایسه رویکردها برای طراحی منطقی siRNA که منجر به یک جدید روش کارآمد و شفاف Nucleic Acids Res. 35، e63.

Muckstein, U., Tafer, H., Hackermuller, J., Bernhart, SH, Stadler, PF and Hofacker, IL (2006) ترمودینامیک اتصال RNA-RNA. بیوانفورماتیک 22، 1177-1182.

Pancoska, P., Moravek, Z. and Moll, UM (2004) تداخل RNA کارآمد به زمینه جهانی توالی هدف بستگی دارد: تجزیه و تحلیل کمی بازده خاموش کردن با استفاده از نمایش نمودار اویلری از siRNA. Nucleic Acids Res. 32، 1469-1479.

Reynolds, A., Leake, D., Boese, Q., Scaringe, S., Marshall, WS and Khvorova, A. (2004) طراحی منطقی siRNA برای تداخل RNA. نات. بیوتکنول. 22، 326-330.

Rose, SD, Kim, DH, Amarzguioui, M., Heidel, JD, Collingwood, MA, Davis, ME, Rossi, JJ and Behlke, MA (2005) قطبیت عملکردی با پردازش Dicer از RNAهای بستر کوتاه معرفی می شود. Nucleic Acids Res. 33، 4140-4156.

Sano, M., Sierant, M., M., M., Nakanishi, M., Takagi, Y. and Sutou, S. (2008) اثر ساختارهای انتهایی نامتقارن دوبلکس های RNA کوتاه بر فعالیت تداخل RNA و انتخاب رشته. Nucleic Acids Res. 36، 5812-5821.

Schwarz, DS, Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N. and Zamore, PD (2003) عدم تقارن در مونتاژ کمپلکس آنزیم RNAi. سلول 115، 199-208.

Shabalina, SA, Spiridonov, AN and Ogurtsov, AY (2006) مدل‌های محاسباتی با ویژگی‌های ترمودینامیکی و ترکیبی طراحی siRNA را بهبود می‌بخشند. BMC Bioinformatics 7، 65.

Sheth, VM and Pandya, AG (2011) Melasma: به روز رسانی جامع: قسمت دوم. مربا. آکادمی درماتول. 65، 699-714.

Slominski, A., Tobin, DJ, Shibahara, S. and Wortsman, J. (2004) رنگدانه ملانین در پوست پستانداران و تنظیم هورمونی آن. فیزیول. Rev. 84, 1155-1228.

Tafer, H., Ameres, SL, Obernosterer, G., Gebeshuber, CA, Schroeder, R., Martinez, J. and Hofacker, IL (2008) تأثیر دسترسی به سایت هدف بر طراحی siRNAهای مؤثر. نات. بیوتکنول. 26، 578-583.

Ui-Tei, K., Naito, Y., Takahashi, F., Haraguchi, T., Ohki-Hamazaki, H., Juni, A., Ueda, R. and Saigo, K. (2004) رهنمودهایی برای انتخاب توالی‌های siRNA بسیار مؤثر برای تداخل RNA پستانداران و جوجه Nucleic Acids Res. 32، 936-948.

Vert, JP, Foveau, N., Lajaunie, C. and Vandenbrouck, Y. (2006) یک مدل دقیق و قابل تفسیر برای پیش‌بینی اثربخشی siRNA. BMC Bioinformatics 7، 520.
Ok-Seon Kwon1،†، Soo-Jung Kwon1،†، Jin Sang Kim2، Gunbong Lee2، Han-Joo Maeng3، Jeongmi Lee4، Gwi Seo Hwang5، Hyuk-Jin Cha1،* و Kwang-Hoon Chun3،*.

گروه علوم زیستی، دانشگاه سوگانگ، سئول 04107.

2 شرکت آرایشی و بهداشتی رهبران، آموزشی ویبولیتین، Anseong 17599.

3 موسسه علوم دارویی گاچون، کالج داروسازی، دانشگاه گاچون، اینچئون 21936.

4 دانشکده داروسازی، دانشگاه Sungkyunkwan، Suwon 16419.

5 آزمایشگاه تحقیقات تمایز سلولی، کالج پزشکی کره ای، دانشگاه گاچون، سئونگنام 13120، جمهوری کره.

For more information:1950477648nn@gmail.com