تشخیص سطح بالای تتراهیدروبیوپترین در نمونه های سرم بیماران ME/CFS مبتلا به عدم تحمل ارتواستاتیک: یک مطالعه مقدماتی

خلاصه:آنسفالومیلیت میالژیک یا سندرم خستگی مزمن (ME/CFS) یک بیماری مزمن چند سیستمی است که با خستگی شدید عضلانی، درد، سرگیجه و مه مغزی مشخص می شود. بسیاری از بیماران مبتلا به ME/CFS عدم تحمل ارتواستاتیک (OI) را تجربه می کنند که با سرگیجه مکرر، سبکی سر و احساس ضعف در حالی که حالت ایستاده خود را حفظ می کنند، مشخص می شود. با وجود تحقیقات شدید، مکانیسم مولکولی این وضعیت ناتوان کننده هنوز ناشناخته است. OI اغلب با تغییرات قلبی عروقی، مانند کاهش جریان خون مغزی، کاهش فشار خون، و کاهش ضربان قلب آشکار می شود. فراهمی زیستی تتراهیدروبیوپترین (BH4)، یک کوفاکتور ضروری آنزیم نیتریک اکسید سنتاز (eNOS) اندوتلیال، به شدت با سلامت قلب و عروق و گردش خون همراه است. برای بررسی نقش BH4 در ME/CFS، نمونه‌های سرمی بیماران CFS (n=32)، بیماران CFS فقط با OI (n=10؛ CFS + OI) و بیماران CFS با هر دو OI و پلی نوروپاتی فیبر کوچک (n=12؛ CFS + OI + SFN) تحت الایزا BH4 قرار گرفتند. جالب توجه است، نتایج ما نشان داد که بیان BH4 در بیماران CFS، CFS + OI، و CFS + OI + SFN در مقایسه با گروه کنترل همسان با سن/جنس به طور قابل‌توجهی بالا است. در نهایت، یک سنجش تولید ROS در سلول‌های میکروگلیال کشت‌شده و به دنبال آن آمار همبستگی پیرسون نشان داد که BH4 بالا در نمونه‌های سرمی بیماران CFS + OI ممکن است با پاسخ استرس اکسیداتیو مرتبط باشد. این یافته ها نشان می دهد که تنظیم متابولیسم BH4 می تواند یک هدف امیدوارکننده برای درک مکانیسم مولکولی CFS و CFS با OI باشد.

سیستانچ می تواند به عنوان یک ضد خستگی و تقویت کننده استقامت عمل کند و مطالعات تجربی نشان داده اند که جوشانده سیستانچ توبولوزا می تواند به طور موثری از سلول های کبدی و سلول های اندوتلیال آسیب دیده در موش های شناگر محافظت کند، بیان NOS3 را افزایش دهد و گلیکوژن کبدی را تقویت کند. سنتز، در نتیجه اعمال اثر ضد خستگی. عصاره Cistanche tubulosa غنی از گلیکوزید فنیل اتانوئید می تواند به طور قابل توجهی سطح کراتین کیناز، لاکتات دهیدروژناز و لاکتات سرم را کاهش دهد و سطح هموگلوبین (HB) و گلوکز را در موش ICR افزایش دهد و این می تواند با کاهش آسیب عضلانی نقش ضد خستگی ایفا کند. و به تاخیر انداختن غنی سازی اسید لاکتیک برای ذخیره انرژی در موش. قرص Cistanche Tubulosa به طور قابل توجهی زمان شنای تحمل وزن را طولانی کرد، ذخیره گلیکوژن کبدی را افزایش داد و سطح اوره سرم را پس از ورزش در موش کاهش داد و اثر ضد خستگی آن را نشان داد. جوشانده سیستانچی می تواند استقامت را بهبود بخشد و خستگی را در موش های ورزشکار تسریع کند و همچنین می تواند افزایش کراتین کیناز سرم را بعد از تمرین بارگذاری کاهش دهد و فراساختار ماهیچه های اسکلتی موش ها را پس از ورزش نرمال نگه دارد که نشان دهنده تأثیر آن است. افزایش قدرت بدنی و ضد خستگی Cistanchis همچنین به طور قابل توجهی زمان بقای موش های مسموم با نیتریت را طولانی کرد و تحمل در برابر هیپوکسی و خستگی را افزایش داد.

روی Over fatigue کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

کلید واژه ها:ME/CFS؛ تتراهیدروبیوپترین؛ عدم تحمل ارتواستاتیک؛ پلی نوروپاتی فیبر کوچک؛ NOS اندوتلیال؛ گونه های اکسیژن واکنش پذیر

1. معرفی

انسفالومیلیت میالژیک/سندرم خستگی مزمن (ME/CFS) یک بیماری مزمن چند سیستمی است که با خستگی عضلانی ناتوان کننده، درد، سرگیجه و مه مغزی مشخص می شود [1،2]. زیرمجموعه ای از بیماران ME/CFS افت فشار خون شدید ارتواستاتیک [3] را نشان می دهند که با کاهش قابل توجه فشار خون که باعث سرگیجه و غش در حالت ایستاده در حالت ایستاده می شود، مشخص می شود [4]. این وضعیت اغلب عدم تحمل ارتواستاتیک (OI) نامیده می شود. زیر مجموعه ای از بیماران OI همچنین معیارهای تشخیصی پلی نوروپاتی فیبر کوچک [5،6] را دارند که با استفاده از رنگ آمیزی قرمز کنگو برای آمیلوئیدوز در نمونه های بیوپسی پوست تشخیص داده می شود [7]. با وجود تحقیقات شدید، مکانیسم مولکولی OI شناخته شده نیست.

BH4 یک کوفاکتور مهم متابولیسم اسید آمینه است [8]. اسیدهای آمینه مانند فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان با عمل آنزیم های هیدروکسیلاز به مواد واسطه سلولی مهم تبدیل می شوند. BH4 به عنوان یک کوفاکتور ضروری تمام این آنزیم های هیدروکسیلاز عمل می کند [9-11]. بر این اساس، فراهمی زیستی BH4 برای سنتز انتقال دهنده های عصبی مانند دوپامین و سروتونین حیاتی است [10]. جدا از این آنزیم های هیدروکسیلاز، BH4 همچنین عملکرد آنزیم های نیتریک اکسید سنتاز را تنظیم می کند و تولید اکسید نیتریک (NO) را در اندوتلیوم کنترل می کند [12]. تولید اندوتلیال NO پاسخ گشادکننده عروق را افزایش می دهد، فشار خون را کاهش می دهد و به آرامش عضلانی کمک می کند [13،14]. از سوی دیگر، در حضور استرس اکسیداتیو، BH4 از تولید NO ناشی از eNOS [15] جدا می شود و به طور مستقیم پاسخ استرس میتوکندری را در بافت قلب [16] و عضله اسکلتی [17] افزایش می دهد. بنابراین، تنظیم متابولیسم BH4 برای عملکرد قلب و عروق و سلامت گردش خون حیاتی است. از آنجایی که گزارش شده است که بیماران OI ناهنجاری های قلبی عروقی را نشان می دهند، ما علاقه مندیم که بررسی کنیم آیا بیماران OI متابولیسم BH4 را تغییر داده اند یا خیر. تا به حال، هیچ مطالعه ای وجود نداشته است که نقش متابولیسم BH4 را در CFS بررسی کند. علاوه بر این، مطالعه ما همچنین بررسی می‌کند که آیا بیماران CFS مبتلا به OI بیوسنتز BH4 را تغییر داده‌اند یا خیر.

نمونه‌های سرمی 66 نفر با n=32 CFS و n=34 کنترل وارد مطالعه شدند. یک ELISA کمی دوسوکور برای مقایسه سطوح BH4 بین افراد سالم و بیماران CFS انجام شد. جالب توجه است، ما مشاهده کردیم که تنظیم مثبت BH4 در بیماران CFS در مقایسه با افراد سالم وجود دارد. در حالی که سطح BH4 را بین بیماران CFS با OI (n=10) و گروه کنترل همسان با سن/جنس (n=10) مقایسه کردیم، همچنین مشاهده کردیم که بیماران CFS با OI به طور قابل‌توجهی سطح بالاتری از OI داشتند. BH4 در سرم در مجموع، نسخه خطی فعلی ما نشان می‌دهد که افزایش BH4 سرم در بیماران CFS می‌تواند نقش مهمی در پاتوژنز OI ایفا کند.

2. نتایج

افراد شرکت‌کننده در مطالعه: برای تعیین کمیت سطح BH4 در نمونه‌های سرم، در مجموع 66 فرد انسانی وارد مطالعه شدند. جدول 1 خلاصه ای از سن، جنسیت، قومیت و شرایط از قبل موجود این افراد را نشان می دهد. چهار نفر از گروه کنترل دارای عوارض مرتبط با سرطان بودند و بنابراین از تجزیه و تحلیل نهایی حذف شدند. حداقل، میانه و حداکثر سن گروه کنترل به ترتیب 18، 64.5 و 82 سال است. برای گروه CFS، این مقادیر 26، 59 و 76 سال است. نمودار توزیع فراوانی سن در هر دو گروه چولگی مشابهی را نشان داد و پس از آن آزمون تحلیل بلند-آلتمن نشان داد که میانگین تفاوت‌ها نزدیک به صفر است که نشان می‌دهد هیچ سوگیری در مورد سن وجود ندارد. گروه کنترل شامل 44 درصد مرد و 56 درصد زن، در حالی که گروه CFS شامل 41 درصد مرد و 59 درصد زن بود. همه بیماران قفقازی بودند و در منطقه جغرافیایی نوادای شمالی و کالیفرنیا زندگی می کردند.

جمعیت بیماران ME/CFS بر اساس معیارهای کانادایی 2003 و فاکودا برای ME/CFS وارد مطالعه شدند. آنها همچنین معیارهای تشخیصی SCID (نام جدید ME/CFS که توسط موسسه پزشکی ایجاد شده است) را برآورده کردند. گروه کنترل سن/جنس با افراد CFS که همراه با بیماران در کلینیک داخلی دکتر پترسون دعوت شده بودند مطابقت داشتند.

زیرمجموعه‌های CFS + OI و CFS + OI_SFN از طریق سوابق آزمایش تشخیصی (بازبینی نمودار پزشکی - کامل) و همبستگی بالینی ایجاد شدند. برای مثال، افراد مبتلا به OI با یک تست لاغری ناسا مثبت اصلاح شده (نمایش OI) به مطب مراجعه کردند و همه درمان افزایش حجم IV (سالین) را دریافت کردند. بیماران SFN نمونه بیوپسی داشتند. برای افراد شامل CFS + OI + SFN، گزارش بیمارستان عمومی Mass ثبت شد که در آن رنگ‌آمیزی قرمز کنگو برای شمارش تراکم نوریت در بافت عضلانی جانبی مچ پا انجام شد.

سطح BH4 در نمونه‌های سرمی بیماران ME/CFS بالا است: در مجموع، 32 CFS و 34 فرد کنترل در مطالعه (جدول 1) برای اندازه‌گیری سطح سرمی BH4 توسط ELISA رقابتی وارد شدند. منحنی استاندارد BH4 ELISA یک منحنی نمایی شیب منفی بود که از شش غلظت فزاینده استانداردهای BH4 (5, 1{21}}, 25, 5{0, 1{47}}{{52) به دست آمد. }} و 150 نانوگرم در میلی لیتر). شیب و برش منحنی استاندارد برای اندازه گیری سطوح مطلق BH4 از مقدار OD استفاده شد. رقت سریال نمونه‌های سرم و به دنبال آن روش BH4 ELISA نشان داد که رقت 1:2 سرم بیشترین نتایج را در مقایسه با بلانک یا پس‌زمینه ارائه می‌دهد. بنابراین، تمام نمونه های سرم تحت رقت 1:2 قرار گرفتند. جالب توجه است، یک تجزیه و تحلیل ELISA دوسوکور به دنبال آزمون ناپارامتریک Mann-Whitney U [* p <0.05 (=0.033). U=304.5] نشان داد که سطوح BH4 در n=32 بیمار CFS در مقایسه با n=28 فرد کنترل به طور قابل توجهی بالاتر بود (شکل 1A). چهار آزمودنی (n=4) در گروه کنترل به دلیل سرطان های از پیش موجود از مطالعه خارج شدند. از آنجایی که افراد بدون در نظر گرفتن سن و جنس به طور تصادفی وارد شدند، در مرحله بعد می‌خواهیم همبستگی سطح BH4 را با سن و جنسیت افراد مورد تجزیه و تحلیل قرار دهیم. بر این اساس، یک تجزیه و تحلیل ناپارامتری همبستگی اسپیرمن (شکل 1B) نشان داد که هیچ ارتباطی بین سطح BH4 و سن افراد وجود ندارد (Spearman r=-0.1657؛ p=0.1835). در مرحله بعد، سطح BH4 را بین افراد مرد و زن مقایسه کردیم (شکل 1C). برای ارزیابی اهمیت بین مرد و زن (اثر شماره 1 جنسیت است)، و همچنین بین کنترل و CFS (اثر شماره 2 وضعیت سلامتی است)، تجزیه و تحلیل ANOVA دو طرفه انجام شد. بر این اساس، آزمودنی‌های مرد و زن هیچ تفاوت معنی‌داری در سطوح BH4 نشان ندادند (05/0>p؛ 3496/0. =0). با این حال، تفاوت معنی داری در BH4 بین افراد کنترل و CFS وجود داشت (05/0p <؛ 0375/0. =0) صرف نظر از تفاوت جنسیتی.

از آنجایی که گروه کنونی به شدت تحت یک منطقه جغرافیایی، قومیت، و از روی یک پزشک منفرد محدود شده است، تجزیه و تحلیل مقایسه زوجی BH4 بین موارد و گروه‌های کنترل مطابق با سن و جنسیت قطعی‌تر خواهد بود. در مجموع 15 جفت با هم مقایسه شدند (شکل 1D). یک آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار جفت همسان ویلکاکسون غیرپارامتری نشان داد که بیماران CFS به طور قابل‌توجهی BH4 بالاتری داشتند (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >آلفا ({{0}}.05)]. از آنجایی که تمام نمونه‌های CFS و شاهد با سن و جنس مطابقت داشتند، تجزیه و تحلیل مقایسه‌ای دو به دو انجام شد. آزمون t زوجی بعدی (t1,{4}}.834; ** p <0.{7}}.004) نشان داد که نمونه‌های سرم CFS + OI به طور قابل‌توجهی BH4 بالاتری نسبت به نمونه‌های سرم کنترل داشتند (شکل 2C ). یک آزمون آماری ستون تجمعی (شکل 2D) بیشتر نشان داد که 7 نفر از 10 بیمار CFS + OI سطوح BH4 به طور قابل توجهی بالاتر از میانه ({17}}.63 نانوگرم در میلی لیتر) داشتند. از سوی دیگر، از هر 10 آزمودنی کنترل تنها 2 نفر BH4 بالاتر از مقدار متوسط ​​داشتند. در مجموع، این داده ها نشان می دهد که بیماران CFS + OI BH4 به طور قابل توجهی بالاتر از افراد کنترل داشتند.

زیرمجموعه ای از بیماران CFS (n=12) هم OI و هم SFN دارند. مقایسه سطوح BH4 (شکل 3A) بین افراد کنترل سالم و افراد CFS + OI + SFN نشان داد که بیماران CFS + OI + SFN سطح قابل توجهی بالاتری از BH4 داشتند [t1,{9}}.371. * پ<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

هنگام مقایسه سطوح BH4 بین CFS به تنهایی و بیماران CFS + OI، مشاهده کردیم که نمونه های سرمی بیماران CFS + OI (n=14) دارای سطوح بالاتری از BH4 (شکل 4A) در مقایسه با افراد کنترل (n {{ 6}}). تجزیه و تحلیل نمودار QQ نشان می دهد که توزیع داده ها در هر دو گروه نرمال است (شکل 4B)، نشان می دهد که آزمون پارامتری می تواند برای مقایسه میانگین ها اتخاذ شود. بر این اساس، آزمون t-paired برای تجزیه و تحلیل معنی‌داری میانگین بین گروه‌ها تفاوت شدیدی را نشان داد [t1,{11}}.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. آمار ستونی گروه انتخابی (n=22) نشان داد که 9 نفر از 14 بیمار CFS + OI سطوح سرمی BH4 بالاتری نسبت به میانگین 119.7 نانوگرم در میلی لیتر داشتند (شکل 4C). روی هم رفته، نتایج ما نشان می‌دهد که بیماران CFS مبتلا به OI سطح BH4 در سرم بالا دارند. در مجموع، نسخه خطی فعلی ما BH4 را به عنوان یک نشانگر زیستی بالقوه انتقال خون برای بیماران CFS + OI و CFS + OI + SFN شناسایی می‌کند.

سطوح بالا BH4 ممکن است با افزایش استرس اکسیداتیو مرتبط باشد: برای درک اهمیت عملکردی افزایش BH4 در سرم، توانایی القای ROS نمونه‌های سرمی بیماران CFS با OI (n=10) را بررسی کردیم. سلول های میکروگلیال تزریق شده با DCFDA با نمونه های سرم رقیق شده 1:2 از 10 CFS + OI و 10 گروه کنترل همسان سن/جنس به مدت 90 دقیقه تحت درمان قرار گرفتند و سپس تولید ROS با استفاده از صفحه خوان فلورسانس اندازه گیری شد (مثلاً: Em { {12}} نانومتر/535 نانومتر) همانطور که در بخش مواد و روش توضیح داده شده است. همانطور که قبلاً گزارش کردیم [18]، یک تجزیه و تحلیل هیستوگرام نشان داد که ظرفیت تولید ROS نمونه های سرم CFS + OI به طور قابل توجهی بالاتر از نمونه های سرم کنترل بود (شکل 5A) [t1,{19}}.541; p <0.05 ({23}}.0205)]. از آنجایی که تمام نقاط داده در هر دو گروه به طور نرمال توزیع شده بودند (شکل 5B)، ما یک آزمون پارامتریک برای مطالعه معنی‌داری میانگین بین گروه‌ها انجام دادیم. جالب توجه است، تجزیه و تحلیل آماری همبستگی پیرسون در این گروه نشان داد که یک همبستگی نسبتاً مثبت بین سطوح BH4 و تولید ROS وجود دارد، که نشان می‌دهد که سطوح بالا BH4 در نمونه‌های سرم CFS + OI ممکن است با افزایش پاسخ اکسیداتیو مرتبط باشد (شکل 5C).

روی هم رفته، نسخه خطی کنونی ما نشان می‌دهد که بیماران CFS با سطوح بالای BH4 در سرم مرتبط هستند و این تنظیم مثبت در بیماران CFS مبتلا به OI به طور قابل‌توجهی مشاهده شد. علاوه بر این، BH4 بالا ممکن است با پاسخ استرس اکسیداتیو مرتبط باشد که نقش بالقوه متابولیسم BH4 را در پاتوژنز CFS و CFS با OI برجسته می کند (شکل 5D).

3. بحث

بیوسنتز Tetrahydrobiopterin (BH4) یک فرآیند متابولیک کاملاً تنظیم شده در سلامت است و بیان غیر طبیعی آن با یک سری بیماری مرتبط است. کمبود آن منجر به کمبود متابولیک متابولیسم اسیدهای آمینه [19،20]، اختلال در تنظیم دوپامین [21] و اختلال در جریان خون [22،23] می شود و با فشار خون بالا، دیابت، تصلب شرایین، پیری، و سایر اختلالات متابولیک از سوی دیگر، بیوسنتز BH4 تنظیم شده تولید انرژی میتوکندری را مختل می کند [24]، استرس اکسیداتیو [25] را القا می کند و اختلال اتوفاژی را افزایش می دهد [26]. افزایش BH4 همچنین با کاهش فشار خون [27] با القای پاسخ گشادکننده عروق از طریق فعال شدن NOS اندوتلیال مرتبط است [28]. بنابراین، بیوسنتز تنظیم شده BH4 ممکن است مستقیماً باعث کاهش فشار خون یا افت فشار خون شود. یک مطالعه نشان می دهد که کمبود BH4 افت فشار خون ناشی از LPS را در موش ها کاهش می دهد [23]. تا به حال، نقش متابولیسم BH4 در بیماران CFS، به ویژه بیماران CFS مبتلا به OI بررسی نشده است. بنابراین، هدف ما ارزیابی بیان BH4 سرم در این جمعیت بیمار بود. با کمال تعجب، تجزیه و تحلیل ELISA ما نشان داد که نمونه‌های سرم بیماران CFS در مقایسه با افراد کنترل سالم همسان با سن و جنس، سطوح بالاتری از BH4 داشتند. بر این اساس، آمار همبستگی اسپیرمن نشان داد که هیچ ارتباط معنی‌داری با تنظیم مثبت BH4 در مورد سن و جنس وجود ندارد، که احتمال اختلالات مربوط به سن یا جنسیت در بیوسنتز BH4 را در این بیماران باطل می‌کند.

در مرحله بعد، مشاهده کردیم که نمونه‌های سرم بیماران CFS + OI نیز در مقایسه با نمونه‌های سرم گروه کنترل همسان با سن و جنس، افزایش شدید BH4 را نشان دادند. آمار ستون تجمعی ما نشان داد که 7 نفر از 10 بیمار CFS + OI سطوح بالایی از BH4 داشتند، که نشان می دهد که افزایش سرمی BH4 ممکن است با پاتوژنز OI مرتبط باشد. نتیجه زمانی که زیرمجموعه ای از بیماران CFS + OI مبتلا به پلی نوروپاتی فیبر کوچک (SFN) نیز بیان بالایی از BH4 را در نمونه های سرم خود در مقایسه با گروه کنترل همسان با سن و جنس نشان دادند، بیشتر تأیید شد. جالب توجه است، مقایسه سطح سرمی BH4 بین تنها CFS و بیماران CFS مبتلا به OI نشان داد که سطوح BH4 به طور قابل توجهی در بیماران OI افزایش یافته است.

چگونه BH4 بالا به پاتوژنز ME/CFS کمک می کند؟ مسیرهای متعددی وجود دارد که از طریق آنها افزایش BH4 می تواند مستقیماً به پاتوژنز ME/CFS کمک کند (شکل 5D). اول، گزارش شده است که تنظیم BH4 باعث اختلال در متابولیسم انرژی میتوکندری از طریق مهار کمپلکس I و IV از زنجیره انتقال الکترون می شود که منجر به کاهش پتانسیل غشای میتوکندری، آزاد شدن سیتوکروم C و آپوپتوز می شود [24]. همچنین گزارش شده است که قرار گرفتن در معرض BH4 باعث استرس اکسیداتیو می شود [29]. اگرچه از نظر فیزیولوژیکی BH4 از تولید NO اندوتلیال با فعال سازی eNOS پشتیبانی می کند، اکسیداسیون BH4 توسط سوپراکسید آن را از eNOS جدا می کند، که استرس اکسیداتیو را به بافت قلب وارد می کند و بر سلامت قلب و عروق تأثیر می گذارد (شکل 5C). در حمایت، نتایج ما نشان داد که سطوح بالا BH4 در نمونه‌های سرم CFS + OI با توانایی‌های القای ROS همبستگی مثبت داشت. علاوه بر این، BH4 همچنین اهداف پستانداران راپامایسین کمپلکس 1 (mTORC1) کیناز را فعال می کند تا اتوفاژی را مختل کند. قبلا، ما گزارش دادیم که فعال شدن mTORC1 و متعاقب آن اختلال اتوفاژی ممکن است با پاتوژنز ME/CFS مرتبط باشد. گزارش شده است که هر دو اختلال اتوفاژی وابسته به mTORC [18] و کمبود میتوکندریایی متابولیسم انرژی [30] در پاتوژنز ME/CFS نقش دارند. بنابراین، افزایش سطح BH4 در نمونه‌های سرمی بیماران ME/CFS می‌تواند باعث استرس اکسیداتیو و افزایش جداسازی eNOS و به دنبال آن استرس قلبی عروقی، افت فشار خون، سمیت میتوکندری و اختلال اتوفاژی در بیماران CFS شود.

4. مواد و روش ها

اکتساب نمونه: اکتساب نمونه، شناسایی شناسایی و طرح ذخیره سازی قبلاً مورد بحث قرار گرفت [18]. به طور خلاصه، نمونه خون و داده های پرسشنامه تحت نظارت دکتر دانیل پترسون (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, USA) (Western IRB) #20201812 جمع آوری شد. نمونه‌های خون سانتریفیوژ شدند و نمونه‌های سرم به صورت جزئی تقسیم شدند و سپس بلافاصله در دمای 80- درجه سانتیگراد منجمد شدند. به هر نمونه یک شماره شناسایی منحصربفرد داده شد و در دفترچه یادداشت و مایکروسافت اکسل با تاریخ و امضای پروتکل تایید شده توسط IRB ثبت شد. سپس نمونه ها در طول شب روی یخ خشک به مرکز تحقیقاتی ما در ویسکانسین تحویل داده شدند. پس از دریافت، نمونه ها بلافاصله پردازش و مورد سنجش قرار گرفتند. پرسشنامه و داده های بالینی شناسایی نشده در یک پایگاه داده سرور Redcap با دسترسی محدود و ایمن ذخیره می شود که توسط کارکنان پژوهشی و همکار بالینی در Sierra Internal Medicine مدیریت می شود. سوابق بیمار توسط دستورالعمل‌های خط‌مشی حفظ حریم خصوصی که توسط Sierra Internal Medicine تنظیم شده بود نگهداری می‌شد. زیرمجموعه های بیماران ME/CFS در گروه OI و OI + SFN با استفاده از بررسی نمودار کور ایجاد شدند و تجزیه و تحلیل پس از آزمایشگاه توسط PI بالینی تایید شد. چهار بیمار سرطانی کورکورانه در این تجزیه و تحلیل گنجانده شدند و به عنوان کنترل مثبت بیماری عمل کردند.

معیارهای تشخیصی OI شامل یافته های مربوطه (نتایج جدول شیب قلبی) از بررسی نمودار بالینی بود. علاوه بر این، در زمان جمع‌آوری خون، همکار بالینی آنالیز لاغری ناسا را ​​تکمیل کرد. تشخیص SFN از طریق بررسی نمودار بالینی و بررسی بافت‌شناسی بیوپسی پانچ پوست جمع‌آوری‌شده از ناحیه قبل از تیبیا ایجاد شد. بیوپسی های پوست به طور مستقل در بیمارستان عمومی ماساچوست برای اندازه گیری مورفومتریک انتهای عصب اپیدرمی برای مطالعه تراکم نوریت سطح پوست مورد ارزیابی قرار گرفت.

BH4 Competitive ELISA: سطح BH4 در نمونه‌های سرمی بیماران ME-CFS و کنترل‌های سالم همسان با سن بر اساس دستورالعمل‌های سازنده اندازه‌گیری و اندازه‌گیری شد (کیت ELISA رقابتی انسانی BH4؛ فروشنده: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA؛ Cat. # MBS733839). این کیت در آزمایشگاه ما (Perkin Elmer Victor X3 multimodal plate-reader, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) تایید شد و دارای منحنی استاندارد (R{9}}.98) و حساسیت کمتر از 1 نانوگرم در میلی لیتر بود. تمرکز در مورد کنترل مثبت به طور خلاصه، نمونه‌های سرم با رقیق‌کننده سنجش (یا 1× PBS) رقیق شدند و سپس روی یک میکروپلیت که از قبل با آنتی‌بادی پلی کلونال ضد BH4 پوشانده شده بود، پیپت شدند. پس از 30 دقیقه انکوباسیون با نمونه، کونژوگه BH{17}}HRP به صفحه اضافه شد و به مدت 1 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. نمونه‌های سرم باقی‌مانده تخلیه شده و با استفاده از یک پیپت چند کاناله، سه بار به مدت پنج دقیقه با بافر شستشوی 1× (به طور متناوب، با 1× PBS-T) روی صفحه شسته شدند. پس از شستشو، هر چاهک به مدت 10 دقیقه در تاریکی با بستر TMB واکنش داده شد. ایجاد رنگ پس از 10 دقیقه انکوباسیون بستر در شرایط تکان دادن صورت می گیرد. مزدوج BH{26}HRP با سرم BH4 برای اتصال به آنتی بادی اولیه پوشش داده شده رقابت می کند. بنابراین، هر چه BH4 سرم در یک نمونه بیشتر باشد، اتصال BH{30}HRP کمتر اتفاق می‌افتد و در نتیجه رنگ کمتری تولید می‌شود. در مجموع 66 نمونه سرم (34 بیمار کنترل + 32 ME-CFS) (جزئیات در بخش "اکتساب نمونه") با دستورالعمل های نظارتی مناسب سازمانی به دست آمد و تحت شرایط GLP تجزیه و تحلیل شد. همانطور که در بخش "توجیه اندازه نمونه" توضیح داده شد، توزیع نمونه تصادفی بود، و سنجش دوسوکور بود.

توجیه حجم نمونه و تحلیل آماری: حجم نمونه با استفاده از رابطه زیر توجیه شد. اندازه نمونه {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/{15}}.{12}}. Z امتیاز z است که 1.28 برای توان 0.8 است. p نسبت جمعیت است. برای یک فاصله اطمینان 95٪، p خواهد بود {{2{22}}}}.95. ε حاشیه خطا است که 0.05 است. بنابراین، برای دستیابی به معنی‌داری در تفاوت میانگین بین گروه‌ها در p <0.05، در مجموع n=32 نمونه در هر گروه وارد شد. برای مقایسه بین بیماران کنترل و CFS + OI، n=10 نمونه در هر گروه وارد شد. حجم نمونه مشابهی در هنگام مقایسه گروه کنترل و کنترل + OI + SFN گنجانده شد. محاسبه حجم نمونه بر اساس ε=0.05. و p=0.99 انجام شد. یک آزمون ناپارامتریک Mann-Whitney U برای آزمایش معنی‌داری میانگین بین دو گروه هر زمان که دو گروه توزیع داده‌های یکسان و نرمال را نشان دادند، اتخاذ شد. در غیر این صورت، آزمون t پارامتریک جفت نشده انجام شد. برای تجزیه و تحلیل زوجی بین گروه ها، در صورتی که نقاط داده از هر دو گروه به طور معمول توزیع شده بود، یک آزمون t زوجی پارامتریک انجام شد. در غیر این صورت، آزمون رتبه‌بندی ویلکاکسون برای ارزیابی معنی‌داری بین گروه‌ها انجام شد. ANOVA دو طرفه با Bonferroni یا Tukey post hoc برای آزمایش معنی‌داری میانگین در بیش از دو گروه با در نظر گرفتن جنسیت (مذکر یا زن) و سلامت (سالم یا CFS) به‌عنوان تأثیرگذار استفاده شد. تمامی تجزیه و تحلیل های آماری در نرم افزار GraphPad Prism نسخه 9.5.1 (733) (Boston, MA 02110, USA) انجام شد.

سنجش ROS:سلول‌های میکروگلیال جنینی انسان HMC3 رشد کرده و با محیط DMEM کامل منتقل شدند. به طور خلاصه، سلول‌های HMC3 در یک صفحه 96 چاهی برای مطالعه فلورومتری ROS قرار گرفتند. سلول ها تا 75 تا 80 درصد تلاقی رشد کردند و با یک پروب DCFDA (Cat# ab113851؛ Abcam، کمبریج، انگلستان) به مدت 45 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد در تاریکی انکوبه شدند. محیط استاندارد با 100 میکرولیتر (رقت 1:2=50 میکرولیتر سرم + 50 میکرولیتر محیط زیست) از محیط های مکمل سرم به مدت 90 دقیقه برای دستیابی به مقدار فلورسانس بهینه جایگزین شد. در پایان دوره جوجه کشی، محیط آسپیره شد و سپس با استفاده از مجموعه فیلترهای 485 نانومتر و 535 نانومتر در صفحه خوان PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) در میزان انتشار تحریک اندازه گیری شد.

مشارکت نویسنده:AR ایده را تصور کرد، طراحی کرد، تحقیقات انجام داد و نسخه خطی را نوشت. CGG تحقیقاتی انجام داد و دستنوشته را نوشت. RW به جمع آوری نمونه خون و نگهداری سوابق بیماران کمک کرد. DP یک PI بالینی است که مسئول جمع آوری نمونه های زیستی، پرسشنامه ها و تایید IRB بود. همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

منابع مالی:این کار توسط Simmaron Research Inc.، یک سازمان تحقیقاتی غیرانتفاعی 501C، Incline Village، NV 89451، در نتیجه سرمایه‌گذاری از جایزه Ramsay 2023 به AR توسط Solve ME ابتکار و بنیاد Hesse Sibylla، کبک، QC، کانادا پشتیبانی شد.

بیانیه هیئت بررسی نهادی:هیچ بخشی از این مقاله پژوهشی، اعم از تصاویر و متون، قبلاً در هیچ کتاب، مقاله یا ادبیات منتشر شده دیگری منتشر یا تکثیر نشده بود. تصاویر اصلی هستند و از هیچ منبع دیگری کپی نشده اند. این یک کارآزمایی بالینی نیست بلکه یک مطالعه مشاهده ای سازمانی است. مجموعه‌ای از نمونه‌های زیستی، دستورالعمل‌های پرسشنامه، نگهداری سوابق، و تولید شماره‌های شناسایی منحصربه‌فرد توسط IRB غربی، پروتکل #20201812 (تاریخ تمدید فعلی # 7/21/23) انجام شد.

بیانیه رضایت آگاهانه:همه نویسندگان رضایت خود را برای انتشار این مقاله مروری ارائه کردند.

بیانیه در دسترس بودن داده ها:هیچ برگه اطلاعات الکترونیکی مرتبط با این مقاله وجود ندارد. هیچ داده ای در یک مخزن الکترونیکی وجود ندارد.

تضاد علاقه:AR، CGG، RW، و DP کارمندان Simmaron Research INC، یک سازمان تحقیقاتی غیرانتفاعی 501C هستند. نویسندگان هیچ تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

اختصارات

ME/CFS=آنسفالومیلیت میالژیک یا سندرم خستگی مزمن؛ OI=عدم تحمل ارتواستاتیک؛ SFN=پلی نوروپاتی فیبر کوچک. BH4=تتراهیدروبیوپترین؛ eNOS=اندوتلیال نیتریک اکساید سنتاز. NO=اکسید نیتریک. ROS=گونه‌های فعال اکسیژن. ME/CFS=آنسفالومیلیت میالژیک یا سندرم خستگی مزمن. OI=عدم تحمل ارتواستاتیک؛ SFN=پلی نوروپاتی فیبر کوچک. BH{10}} تتراهیدروبیوپترین؛ eNOS=اندوتلیال نیتریک اکساید سنتاز. NO=اکسید نیتریک. و ROS=گونه‌های فعال اکسیژن.

منابع

1. لیم، ای جی; Ahn، YC; جانگ، ES; لی، SW; لی، SH; پسر، CG مرور سیستماتیک و متاآنالیز شیوع سندرم خستگی مزمن / آنسفالومیلیت میالژیک (CFS/ME). J. Transl. پزشکی 2020، 18، 100. [CrossRef]

2. پسر، C.-G. بررسی شیوع خستگی مزمن در سراسر جهان. J. کره پزشکی. 2012، 33، 25-33.

3. Natelson، BH; Lin, J.-MS; بلیت، م. خان، س. چن، ی. Unger، ER ارزیابی فیزیولوژیکی عدم تحمل ارتواستاتیک در سندرم خستگی مزمن. J. Transl. پزشکی 2022، 20، 95. [CrossRef]

4. بیتمن، ال. Bested، AC; بونیلا، HF; Chheda، BV; چو، ال. کرتین، جی.ام. دمپسی، تی تی; دیموک، من؛ داول، TG; Felsenstein، D. آنسفالومیلیت میالژیک / سندرم خستگی مزمن: ضروریات تشخیص و مدیریت. در مجموعه مقالات کلینیک مایو؛ الزویر: آمستردام، هلند، 2021؛ ص 2861-2878.

5. Basantsova، NY; استارشینووا، AA; دری، ع. زینچنکو، YS؛ Yablonskiy، PK؛ تعریف، تشخیص و درمان نوروپاتی فیبر کوچک، شوئنفلد، ی. نورول. علمی 2019، 40، 1343-1350. [CrossRef]

6. شونفلد، ی. ریابکووا، ویرجینیا؛ Scheibenbogen، C. شعبه، ال. مارتینز-لاوین، ام. ایکدا، اس. هایدکه، اچ. وطاد، ع. Bragazzi، NL; چاپمن، جی. سندرم های پیچیده درد مزمن، خستگی، و اختلال شناختی مرتبط با دیساآتونومی خودایمنی و نوروپاتی فیبر کوچک. کلین. ایمونول. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. لئوناردی، ال. آدام، سی. بودونت، جی. بووایس، دی. کوکیل، سی. نه، A. مرسی، ا. بنمالک، ا. تراسارد، او. EchanizLaguna، A. و همکاران رسوبات آمیلوئید پوست و از دست دادن فیبر عصبی به عنوان نشانگرهای شروع و پیشرفت نوروپاتی در آمیلوئیدوز ترانس تیرتین ارثی. یورو جی. نورول. 2022، 29، 1477-1487. [CrossRef] [PubMed]

8. ایچینوز، اچ. نومورا، تی. Sumi-Ichinose، C. متابولیسم تتراهیدروبیوپترین: ارتباط آن در نورون های مونوآمینرژیک و اختلالات عصبی. شیمی. ضبط 2008، 8، 378-385. [CrossRef] [PubMed]

9. شیا، تی. خاکستری، DW; Shiman، R. تنظیم فنیل آلانین هیدروکسیلاز کبد موش. III. کنترل کاتالیز توسط (6R) - تتراهیدروبیوپترین و فنیل آلانین. جی بیول. شیمی. 1994، 269، 24657-24665. [CrossRef]

10. ناگاتسو، تی. ناگاتسو، I. تیروزین هیدروکسیلاز (TH)، کوفاکتور آن تتراهیدروبیوپترین (BH4)، دیگر آنزیم های مرتبط با کاتکول آمین، و ژن های انسانی آنها در مورد داروها و درمان های ژنی بیماری پارکینسون (PD): مروری تاریخی و چشم انداز. J. انتقال عصبی. 2016، 123، 1255-1278. [CrossRef]

11. سواده، م. سوگیموتو، تی. ماتسورا، اس. Nagatsu, T. (6R)-Tetrahydrobiopterin فعالیت تریپتوفان هیدروکسیلاز را در برش های رافه موش افزایش می دهد. جی. نوروشیم. 1986، 47، 1544-1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; چن، L.-Y.; Xie، J.-B. شو، سی. یانگ، تی. ژو، اس. یوان، اچ. چن، AF Tetrahydrobiopterin تنظیم عملکرد اکسیداسیون و کاهش eNOS. Curr. فارم. دس 2014، 20، 3554-3562. [CrossRef] [PubMed]

13. هیگاشی، ی. ساساکی، اس. ناکاگاوا، ک. کیمورا، م. نوما، ک. هارا، ک. جیتسویکی، دی. گوتو، سی. اوشیما، تی. Chayama، K. Tetrahydrobiopterin از طریق افزایش تولید اکسید نیتریک، اختلالات مرتبط با افزایش سن در اتساع عروق وابسته به اندوتلیوم را بهبود می بخشد. آترواسکلروز 2006، 186، 390-395. [CrossRef]

14. وانگ، WZ; نیش، XH; استفنسون، LL; خیابانی، ک.ت. زامبونی، WA اثرات مکمل BH4 پس از ایسکمی طولانی مدت در عضله اسکلتی. Microsurgery 2007, 27, 200-205. [CrossRef]

15. یانگ، ی.-م. هوانگ، آ. کالی، جی. Sun، D. eNOS uncoupling و اختلال عملکرد اندوتلیال در عروق پیر. صبح. J. Physiol.-Heart Circ. فیزیول. 2009، 297، H1829–H1836. [CrossRef]

16. کرباچ، س. ونزل، پی. ویزمن، ا. مونزل، تی. Daiber، A. eNOS uncoupling در بیماری های قلبی عروقی - نقش استرس اکسیداتیو و التهاب. Curr. فارم. دس 2014، 20، 3579-3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; دلپ، دکتر ریس، آر. وو، جی. Muller-Delp، JM اثرات پیری و تمرین ورزشی بر جداسازی eNOS در شریان‌های مقاومت عضلانی اسکلتی. جی. فیزیول. 2009، 587، 3885-3897. [CrossRef]

18. Gottschalk، G. پترسون، دی. ناکس، ک. مینارد، ام. Whelan، RJ; روی، A. افزایش ATG13 در سرم بیماران مبتلا به ME/CFS، پاسخ استرس اکسیداتیو در سلول‌های میکروگلیال را از طریق فعال‌سازی گیرنده محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته (RAGE) تحریک می‌کند. مول. سلول. نوروسک. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. بلاو، ن. تونی، بی. اسپادا، م. Ponzone، A. Tetrahydrobiopterin و هیپرفنیل آلانینمی های ارثی. ترک. J. Pediatr. 1996، 38، 19-35. [PubMed]

20. بیرنباخر، آر. Scheibenreiter، S. بلاو، ن. بیگلمایر، سی. فریش، اچ. Waldhauser, F. Hyperprolactinemia، ابزاری در درمان کمبود تتراهیدروبیوپترین: مطالعات غدد درون ریز در یک دختر مبتلا. اطفال Res. 1998، 43، 472-477. [CrossRef]

21. هایلند، ک. قاسم، س. ایگامی، ک. آرنولد، ال. کمبود جناح، H. تتراهیدروبیوپترین و از دست دادن دوپامین در مدل ژنتیکی موش بیماری لش-نیهان. J. ارث ببر. متاب. دیس 2004، 27، 165-178. [CrossRef]

22. لی، ال. چن، دبلیو. رضوان، ع. جو، اچ. کمبود Harrison، DG Tetrahydrobiopterin و جداسازی نیتریک اکسید سنتاز به آترواسکلروز ناشی از جریان مختل کمک می کند. عروقی. ترومب. Vasc. Biol. 2011، 31، 1547-1554. [CrossRef]

23. چوایفیچای، س. استار، ا. ناندی، م. شانون، KM؛ McNeill, E. کمبود تتراهیدروبیوپترین سلول های اندوتلیال، اختلال عملکرد عروقی و افت فشار خون ناشی از LPS را کاهش می دهد. Vasc. فارماکول. 2016، 77، 69-79. [CrossRef] [PubMed]

24. چوی، HJ; لی، سی. چو، ی. نه، اچ. کیم، SW; Hwang, O. Tetrahydrobiopterin باعث اختلال عملکرد میتوکندری در سلول های دوپامینرژیک می شود: پیامدهای بیماری پارکینسون. نوروشیمی. بین المللی 2006، 48، 255-262. [CrossRef] [PubMed]

25. لی، سی. ماه، ی. هی چوی، دی. جین چوی، اچ. Hwang، O. آسیب پذیری خاص نورون های دوپامینرژیک مزانسفالی موش به تتراهیدروبیوپترین: ارتباط با بیماری پارکینسون. نوروبیول. دیس 2007، 25، 112-120. [CrossRef]

26. کواک، اس.اس. سوک، جی. چوی، جی اچ. یانگ، اس. کیم، جی دبلیو. سون، اس. چانگ، جی اچ. هنگ، YH; لی، دی اچ. Ahn، JK; و همکاران القای اتوفاژی توسط کمبود تتراهیدروبیوپترین. اتوفاژی 2011، 7، 1323-1334. [CrossRef] [PubMed]

27. پورکرت، م. شر، اس. ردی، یو. چیما، اف. نیسنر، سی. کلم، پی. جونز، DP; هوپر، سی. تیلور، WR; هریسون، دی. و همکاران تتراهیدروبیوپترین: یک درمان جدید ضد فشار خون. جی. هوم. فشار خون بالا 2008، 22، 401-407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon، K. Tetrahydrobiopterin: تنظیم کننده اندوتلیال نیتریک اکسید سنتاز در بیماری عروقی. گرایش های قلبی عروقی پزشکی 2004، 14، 323-327. [CrossRef]

29. فنگ، ی. فنگ، ی. گو، ال. لیو، پی. کائو، جی. ژانگ، اس. نقش مهم متابولیسم تتراهیدروبیوپترین (BH4) در تعدیل حساسیت پرتوی: محور BH4/NOS به عنوان یک فرشته یا یک شیطان. جلو. اونکول. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. ماندارانو، ق. مایا، جی. ژیلوتو، ال. پترسون، دی.ال. مینارد، ام. Gottschalk، CG; هانسون، MR آنسفالومیلیت میالژیک/بیماران مبتلا به سندرم خستگی مزمن، متابولیسم سلول های T و ارتباطات سیتوکین را تغییر می دهند. جی. کلین. تحقیق کنید. 2020، 130، 1491-1505. [CrossRef] [PubMed]

سلب مسئولیت/یادداشت ناشر:اظهارات، نظرات، و داده های موجود در همه نشریات صرفاً متعلق به نویسنده(ها) و مشارکت کننده(ها) است و نه MDPI و/یا ویرایشگر(ها). MDPI و/یا ویرایشگر(های) مسئولیت هرگونه آسیب به افراد یا دارایی ناشی از هر ایده، روش، دستورالعمل، یا محصولاتی را که در محتوا ذکر شده است، سلب می‌کنند.

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】