فلاوانول های کاکائوی رژیمی عملکرد میتوکندری را در ماهیچه های اسکلتی تقویت می کنند و متابولیسم کل بدن را در موش های سالم اصلاح می کنند.

برای اطلاعات بیشتر تماس بگیرید:tina.xiang@wecistanche.com

خلاصه: اختلال عملکرد میتوکندری به طور گسترده در بیماری های مختلف گزارش شده و در پاتوژنز آنها نقش دارد. ما تأثیر آن را ارزیابی کردیمفلاوانول های کاکائومکمل روی عملکرد میتوکندری و کل متابولیسم، و ما بررسی کردیم که آیا میتوکندری داستیلاز سیرتوئین-3 (Sirt3) دخیل است یا خیر. ما اثرات 15 روز مکمل CF را در نوع وحشی و Sirt{3}}/موش بررسی کردیم. متابولیسم کل بدن با کالریمتری غیرمستقیم ارزیابی شد و یک تست تحمل گلوکز خوراکی برای ارزیابی انجام شد.متابولیسم گلوکز. عملکرد تنفسی میتوکندری در الیاف نفوذ پذیر ارزیابی شد و محتوای نوکلئوتیدهای پیریدین (NAD plus و NADH) اندازه‌گیری شد. در نوع وحشی، مکمل CF به طور قابل توجهی متابولیسم کل بدن را با ترویج استفاده از کربوهیدرات و بهبود تحمل گلوکز تغییر داد. مکمل CF باعث افزایش قابل توجه توده میتوکندری شد، در حالی که سازگاری کیفی قابل توجهی برای حفظ تولید H2O2 و استرس اکسیداتیو سلولی رخ داد. مکمل CF باعث افزایش قابل توجهی در NAD پلاس و محتوای NADH شد. تمام جلوه‌های ذکر شده در بالا در موش‌های Sirt{3}}کاهش شد. در مجموع، مکمل CF متابولیسم NAD را تقویت کرد که متابولیسم سیرتوئین ها را تحریک می کند و عملکرد میتوکندری را بهبود می بخشد، که احتمالاً به سازگاری مشاهده شده متابولیسم کل بدن کمک می کند، با توانایی بیشتر در استفاده از کربوهیدرات ها، حداقل تا حدی از طریق Sirt3.

کلید واژه ها: فلاوانول های کاکائو؛ متابولیسم NAD؛ توده میتوکندری؛ متابولیسم گلوکز؛ عضله اسکلتی

برای دریافت اطلاعات بیشتر کلیک کنید

1. مقدمه

میتوکندری ها اندامک های درون سلولی هستند که در عملکردهای سلولی متعددی مانند انتقال انرژی از طریق فسفوریلاسیون اکسیداتیو میتوکندری و تولید پراکسید هیدروژن میتوکندری یا فعال سازی مرگ سلولی با واسطه میتوکندری نقش دارند [1-3]. شواهد در حال ظهور نشان می دهد که اختلال عملکرد میتوکندری در بسیاری از آسیب شناسی ها دخیل است و نقش اصلی را در پاتوژنز آنها ایفا می کند [4]. گروه ما اختلال میتوکندری را در بیماران مبتلا به دیابت نوع 1 بسیار قبل از عوارض بالینی گزارش کردند [5]. علاوه بر این، کاهش ظرفیت اکسیداتیو میتوکندری با افزایش سن حتی در افراد سالم نیز رخ می دهد [6]. بنابراین، شناسایی استراتژی‌هایی برای کاهش این اختلالات یا افزایش توده میتوکندری فرصت‌هایی برای پیشگیری یا حداقل کاهش بروز بسیاری از اختلالات یا افزایش ظرفیت هوازی افراد سالم است.

در این زمینه، شناسایی ترکیبات ایمن و طبیعی که عملکرد میتوکندری و متابولیسم کل بدن را با یا بدون عوارض جانبی محدود افزایش می‌دهند، مورد توجه است. در میان ترکیبات طبیعی،فلاوانول های کاکائو(CF) مولکول‌های امیدوارکننده‌ای در نظر گرفته می‌شوند، زیرا نشان داده شده است که مصرف آنها بر سلامت قلبی عروقی، مقاومت به انسولین یا عملکرد سیستم ایمنی تأثیر مثبت دارد [7]. در واقع نشان داده شد که CF متابولیسم گلوکز را بهبود می‌بخشد و تجویز کوتاه‌مدت CF با افزایش حساسیت به انسولین، حتی در بیماران مبتلا به فشار خون بالا که تحمل گلوکز دارند، به دنبال دارد [8،9].

در میان فلاوانول‌ها، (-)-اپیکاتچین (EPI) متداول‌ترین مونومر در CF است و EPI به عنوان مولکول زیست‌در دسترس و فعال زیستی اصلی CF در نظر گرفته می‌شود [10]. مجموعه ثابتی از شواهد نشان می دهد که مکمل EPI عملکرد و/یا محتوای میتوکندری را در عضله اسکلتی بهبود می بخشد [11]. مکمل EPI مسیرهای متعددی را تحریک می‌کند که روی گیرنده فعال‌کننده گاما 1-آلفا(PGCl) و مجتمع‌های رونویسی هسته‌ای فعال شده با تکثیر پراکسی‌زومی همگرا می‌شوند. EPI به طور مستقیم تولید اکسید نیتریک را افزایش می دهد، که بیوژنز میتوکندری را تحریک می کند [11]. همزمان، سیرتوئین های 1 و 3 نیز توسط مکمل EPI تحریک می شوند [11]. استفاده از پروآنتوسیانیدین ها، الیگومریکفلاونوئیدهاکه حاوی EPI هستند، نشان داده شد که سطوح داخل سلولی نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید (NAD plus ) را از طریق افزایش چندین پیش ساز برای بیوسنتز NAD و تنظیم مثبت سطوح mRNA sirtuin-1 در کبد موش صحرایی [12]. خانواده sirtuin (Sirt)، یک دی استیلاز وابسته به NAD، شامل هفت عضو است که با توزیع درون سلولی، ویژگی بستر، و عملکرد سلولی متفاوت هستند [13]. Sirt1، یکی از اعضای این خانواده که به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است، بیوژنز میتوکندری را با ترویج استیل زدایی PGCl تحریک می کند و در نتیجه فعالیت رونویسی آن را افزایش می دهد [14]. سیرت، یک حسگر متابولیک کلیدی، پس از تجویز EPI تحریک شد [12،{7}}]. با این حال، تأثیر EPI بر سایر سیرتوئین ها مورد بررسی قرار نگرفته است. ارزیابی اثر EPI به‌ویژه در مورد سیرتوئین‌های واقع در میتوکندری (Sirt3، Sirt 4، و Sirt5) جالب خواهد بود که به تعدیل فعالیت چرخه کربس و آنزیم‌های زنجیره تنفسی معروف هستند [18]. Sirt3، که در بافت‌هایی با گردش متابولیک بالا و محتوای میتوکندری بیان می‌شود، به دلیل نقش حیاتی آن در حفظ عملکرد طبیعی میتوکندری از طریق داستیلاسیون پروتئین لیزین برگشت‌پذیر از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است [19-21]علاوه بر این، Sirt3 نقش مهمی در تنظیم متابولیسم کل بدن [20. نشان داده شد که Sirt3 در عضله اسکلتی مدل های دیابت نوع 1 و 2 و بیماری های قلبی عروقی تغییر می کند [22،23]. علاوه بر این، پیشنهاد شد که فعال شدن Sirt3 ممکن است یک استراتژی درمانی امیدوارکننده برای بهبود عملکرد و متابولیسم میتوکندری باشد [23،24]. بنابراین، تعیین اینکه آیا Sirt3 زمینه ساز بخشی از اثرات مفید مکمل CF بر متابولیسم کل بدن و عملکرد میتوکندری است یا خیر، مورد توجه است.

در این مطالعه، ما از یک رویکرد یکپارچه برای بررسی تأثیر یک 15-روزه مکمل CF در موش‌ها استفاده کردیم. ما فرض کردیم که مکمل CF: (1) متابولیسم کل بدن را تغییر می‌دهد ومتابولیسم گلوکز، (ب) افزایش عملکرد میتوکندری در عضله اکسیداتیو و گلیکولیتیک در فیبرهای نفوذپذیر، و (ب) افزایش متابولیسم NAD. ما همچنین دخالت احتمالی Sirt3 در بیوژنز میتوکندری و متابولیسم کل بدن ناشی از CF را بررسی کردیم. فرضیه‌های ما این بود که اثرات CF بر متابولیسم کل بدن و توده میتوکندریایی در موش‌های Sirt{4}}کم خواهد شد.

2. روش ها

2.1. حیوانات و رژیم غذایی

برای این مطالعه، موش‌های نر 129S1/SvlmJ 10- هفته‌ای از آزمایشگاه‌های جکسون (بار هاربر، ME، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. برای تعیین اینکه آیا سیرتوئین ها در توده و عملکرد میتوکندری ناشی از تجویز CF نقش دارند یا خیر، ما همچنین از 10-موش های نر یک هفته ای Sirt3 که تمام بدن ناکام بودند در همان سویه نوع وحشی استفاده کردیم [25]. Sirt3/موش برای بررسی نقش Sirt3 در بیوژنز میتوکندریایی ناشی از CF و سازگاری متابولیسم کل بدن استفاده شد. موش‌ها در اتاقی با دمای تنظیم‌شده 23-25 درجه و روشنایی کنترل‌شده (12- ساعت چرخه نور و تاریکی) نگهداری شدند. حیوانات به طور آزاد به غذای جوندگان و آب لوله کشی دسترسی داشتند.

پس از حداقل یک هفته عادت کردن در مرکز حیوانات، حیوانات آزمایشی مکمل CF را از طریق گاواژ خوراکی عصاره طبیعی (302.1 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن دو بار در روز به مدت 15 روز) دریافت کردند که در یک کربوکسی متیل سلولز (Sigma-Aldrich, St. ، مو، ایالات متحده آمریکا). ترکیب پودر کاکائو در جدول 1 توضیح داده شده است و از Naturex (Quart de Poblet، اسپانیا) به دست آمده است. ترکیب با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا ایجاد شده است و 100 میلی گرم از عصاره معادل به طور متوسط ​​475 میلی گرم دانه خشک کاکائو است. موش های کنترل یک وسیله نقلیه متشکل از محتوای مشابه تئوبرومین و کافئین محلول در کربوکسی متیل سلولز توسط گاواژ خوراکی دریافت کردند. دوز روزانه با توجه به راهنمایی های صنعت که دوز انسانی را به دوزهای معادل حیوان بر اساس سطح بدن تبدیل می کند، تعیین شد و ما دوز انسان را در 12.3 ضرب کردیم [26]. گاواژ دهان توسط تکنسین مجرب انجام شد.

2.2. مجموعه بافت 1

24 ساعت پس از آخرین گاواژ خوراکی، حیوانات ناشتا با استفاده از کتامین و زایلازین (به ترتیب mg/kg 100 و 100) بیهوش شدند. جمع آوری بافت ها بلافاصله پس از بیهوشی انجام شد. کف پا و قسمت سفید گاستروکنمیوس برداشته شد. نمونه ها یا بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد شدند و در درجه{3}} برای تجزیه و تحلیل بعدی ذخیره شدند یا برای تهیه فیبرهای عضلانی پوست استفاده شدند.

2.3. ارزیابی متابولیک و فعالیت بدنی

کالری سنجی غیرمستقیم و فعالیت بدنی خود به خود با استفاده از سیستم پایش حیوانات آزمایشگاهی جامع (CLAMS؛ Columbus Instruments، Columbus، OH، USA) اندازه گیری شد. موش ها به صورت جداگانه در اتاقک ها در دمای 28 درجه، با نور از 07 ساعت00 تا 19 ساعت00 و دسترسی آزادانه به غذای جوندگان و آب لوله کشی قرار گرفتند. موش‌ها سه روز قبل از روز اول جمع‌آوری داده‌ها به قفس‌های متابولیک عادت کردند. جمع آوری داده ها در روز پانزدهم تکمیل مکمل انجام شد. مصرف اکسیژن (VO2)، تولید دی اکسید کربن (VCO2) و نسبت تبادل تنفسی (RER) با جریان هوای L/min 5.5 0 و هوای نمونه 0.4 لیتر در دقیقه اندازه گیری شد. دقیقه درصد فراوانی تجمعی نسبی (PCRF) RER در طی یک دوره 24- ساعتی همانطور که قبلا توسط ریچی و همکاران توضیح داده شد، تعیین شد. (2{17}}04). به طور خلاصه، PCRF با افزودن فرکانس هر نقطه داده به دنباله افزایش قبلی (از 0.65 تا 1.20 با افزایش 0.01) تعیین شد[27]. انعطاف پذیری متابولیک توسط شیب تپه (H value) و صدک 50 (EC50) منحنی PRCF و با اندازه گیری دامنه RER در 24 ساعت تعیین شد (Riachi et al.2004). فعالیت بدنی عمومی با استفاده از یک سیستم حسگر با پرتو مادون قرمز که فعالیت محور x و z را شناسایی می‌کرد، بررسی شد. هر دو شمارش کل (هر بار شکسته شدن یک پرتو) و شمارش سرپایی (هر بار که یک پرتو جدید شکسته شد) ارزیابی شد. شمارش X-total (X-TOT) زمانی ثبت می‌شود که حیوان بیش از 0.5 اینچ به صورت افقی حرکت کند و نشان‌دهنده فعالیت‌های تکراری در مقیاس کوچک، مانند خراشیدن و نظافت باشد. شمارش X-Ambulatory (X-AMB) حرکت واقعی را با ثبت شمارش تنها زمانی که حیوان پرتو جدیدی را می شکند، اندازه گیری می کند. تعداد Z-Total (Z-TOT) زمانی ثبت می شود که 1.5 اینچ حرکت عمودی رخ دهد، یعنی پرورش (Abreu-Vieira 2016). برای تخمین کربوهیدرات و چربیاکسیداسیوناز VO2 و VCO2، ما از جدول ضریب تنفسی غیر پروتئینی Péronnet و Massicotte استفاده کردیم که قبلاً در موش استفاده می شد [28،29].

2.4. توده کل بدن و چربی

توده چربی کل و توده بدون چربی کل در موش های بیهوش نشده با آنالیز تداخل رزونانس کمی با استفاده از آنالایزر تشدید مغناطیسی کل بدن EchoMRI (سیستم پزشکی اکو، هیوستون، TX، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد. توده چربی کل نشان دهنده مجموع کل چربی در بدن است. کل توده بدون چربی شامل عضله و اندام های داخلی بود. شناخته شده است که توده عضلانی اسکلتی بیشترین بخش از کل توده بدون چربی را تشکیل می دهد.

2.5. تست تحمل گلوکز خوراکی (OGTT)

قند خون با استفاده از یک قطره خون جمع آوری شده از دم با گلوکومتر (Accu-Chek Performa، Roche، آرژانتین) اندازه گیری شد. OGTT روی موش هایی که 5 تا 6 ساعت ناشتا بودند انجام شد. اندازه گیری در آخرین روز مصرف مکمل CF انجام شد. پس از اندازه‌گیری گلیسمی پایه (زمان O)، محلول 20 درصد گلوکز در آب استریل با دوز 1.5 گرم گلوکز بر کیلوگرم وزن بدن تزریق شد. گلیسمی در 15، 30، 60، 90 و 120 دقیقه پس از تزریق محلول گلوکز اندازه گیری شد. سپس سطح افزایشی منحنی گلوکز به عنوان معیار تحمل گلوکز محاسبه شد.

2.6.qRT-PCR آنالیز

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA از RNA کل (2 میکرولیتر) با استفاده از سوپرمیکس رونویسی معکوس iScript برای RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA) سنتز شد. محصولات کل RT با واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (PCR) با استفاده از 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG مطابق با مشخصات سازنده (Invitrogen Lige Technologies، برلینگتون، کانادا) آنالیز شدند. دوچرخه‌سواری در یک دوچرخه‌سوار CFX96 انجام شد (Biorad، هرکول، کالیفرنیا؛ شرایط: 95 درجه سانتی‌گراد برای 10 دقیقه و 40 چرخه 95 درجه برای 30 ثانیه، 55 درجه برای 45 ثانیه و 72 درجه برای 45 ثانیه). در پایان هر اجرا، عدم تشکیل پرایمر-دایمر و وجود یک آمپلیکون منحصر به فرد با استفاده از منحنی ذوب تایید شد. مقادیر چرخه آستانه (Ct) به دنبال روش 2-A△Ct برای تجزیه و تحلیل داده‌های qPCR، با ß-Actin یا HPRT1 به‌عنوان یک ژن خانه‌دار 【30】 استفاده شد. مقادیر کمی RT-PCR مربوط به مقادیر گروه کنترل بود که روی 1 تنظیم شد.

2.7. فعالیت های آنزیمی

اندازه گیری فعالیت ویژه کمپلکس های زنجیره انتقال الکترون و سیترات سنتاز به روش اسپکتروفتومتری همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد [31]. ماهیچه های گاستروکنمیوس سفید منجمد پودر شده (30 میلی گرم) با هموژنایزر میکروبید ارتعاشی در 500 میکرولیتر بافر همگن سازی (120 میلی مولار KCl، 20 میلی مولار HEPES، 2 میلی مولار از MgCl2، 1 میلی مولار EGTA، و 5 میلی گرم B·mL-I همگن شدند. ، pH7.4) و به دنبال آن 500 میکرولیتر محیط هیپوتونیک (25 میلی مولار فسفات پتاسیم و 5 میلی مولار MgCl، pH 7.2) اضافه شد. نمونه ها سپس به سه دور چرخه انجماد و ذوب در نیتروژن مایع ارسال شدند. نمونه ها به مدت 10 دقیقه در 600×g در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند و مایع رویی تا زمان تجزیه روی یخ نگه داشت. محتوای پروتئین در مایع رویی در سه تکرار با استفاده از کیت سنجش پروتئین Pierce BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) تعیین شد.

فعالیت سیترات سنتاز (CS) به روش اسپکتروفتومتری در طول موج 412 نانومتر به دنبال کاهش 2 میلی مولار 5،5'-دیتیو-بیس (2-نیتروبنزوئیک اسید) در حضور 0.1 میلی مولار استیل تعیین شد. -CoA و 12 میلی‌مولار اسید اگزالواستیک در بافر 2{27}}{39}} میلی‌مولار Tris (pH 7.4). سنجش حساس به روتنون NADH-دسیلوبی کینون اکسیدوردوکتاز (کمپلکس I) در 340 نانومتر با استفاده از گیرنده 2،{18}}دی متوکسی{19}}متیل{20}}n-دسیل-14-بنزوکینون （ انجام شد. 80 میکرومولار) و NADH به عنوان دهنده الکترون (200 میکرومولار) در بافر تریس 10 میلی مولار (pH 8.0). افزودن 4μM روتنون برای تعیین کمیت فعالیت حساس به روتنون استفاده شد. فعالیت سیتوکروم اکسیداز (کمپلکس IV) در طول موج 550 نانومتر با استفاده از سیتوکروم c احیا شده 10 میکرومولار به عنوان دهنده و 2.5 میلی مولار n-دودسیل-β-مالتوزید برای نفوذپذیری هر دو غشای میتوکندریایی در 100 میلی‌متر Hp.

تمام سنجش های آنزیمی در سه تکرار تعیین شد و نتایج مربوط به گروه کنترل بود که روی 100 تنظیم شد.

2.8. ارزیابی میتوکندری

تنفس میتوکندری و تولید H2O2 میتوکندری در محل در فیبرهای نفوذپذیر ساپونین با استفاده از عضلات گاستروکنمیوس سفید و سولئوس|1] مورد مطالعه قرار گرفت. به طور خلاصه، الیاف زیر میکروسکوپ دوچشمی در محلول A در دمای 4 درجه (در mM: 2.77 CaK2 EGTA، 7.23 K، EGTA، 6.56 MgCl2، 2{13}} تورین،0}.5 DTT،5{ {5{58}}}} K-متان سولفونات، 20 ایمیدازول، 5.7 Na2 ATP و 15 کراتین فسفات، pH 7.1) و در محلول A با 50 ug·mL-Iof ساپونین به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه نفوذ پذیر شد. عملکرد تنفسی میتوکندری در یک اکسیمتر مجهز به الکترود نوع کلارک (Oxygraph، Hansatech Instruments، Glasgow) تعیین شد. محفظه با 1 میلی لیتر محلول B (در mM: 2.77 CaK، EGTA، 7.23 K، EGTA، 6.56 MgCl، 20 تورین، 0.5 DTT، 50 K-متان سولفونات، و 20 ایمیدازول، pH 7.1) پر شد. محتوای اولیه اکسیژن در محفظه، یک بسته نرم افزاری 1-2 میلی گرم وزن خشک میوفیبر نفوذپذیر در محفظه قرار داده شد، که سپس بسته شد. پس از قرائت‌های پایه، اضافات زیر به‌طور متوالی انجام شد: پالمیتول کارنیتین و مالات (160 میکرومولار ∶5 میلی‌مولار)، گلوتامات (10 میلی‌مولار)، سوکسینات (25 میلی‌مولار)، روتنون (0.5 میکرومتر) -A (8 uM) و N، N'، N'-تترا متیل-p-p-phenylenediamine dihydrochloride و آسکوربات (0.9:9 میلی مولار). تنفس در دمای 23 درجه تحت هم زدن مداوم اندازه گیری شد. در پایان هر آزمایش، الیاف به دقت از سلول زایلوگرافی خارج شده، لکه شده و حداقل 24 ساعت در دمای 80 درجه سانتیگراد برای تعیین وزن فیبر خشک شدند. میزان مصرف O2 (JO2) بر حسب نانومول O2 دقیقه{67}} بیان شد. (میلی گرم وزن خشک) -I. همه اندازه‌گیری‌ها حداقل به صورت تکراری انجام شد.

انتشار خالص H2O2 توسط میتوکندری تنفسی در بسته‌های فیبر نفوذپذیر با پروب فلورسنت Amplex Red (20 میکرومولار∶انتشار تحریک∶{4}} نانومتر) اندازه‌گیری شد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد [32]. پس از آماده سازی الیاف نفوذ پذیر، نمونه ها

اندازه‌گیری‌های H2O2 سه بار در بافر Z (در mM: 11{12}} K-Mes، 35 KCl، 1 EGTA، 5 K2HPO4، 3MgCl،6H2O، و 0.5 میلی‌گرم: میلی‌لیتر{18} شسته شد. {14}} BSA، pH7.3 در 4 درجه). بسته‌های فیبر ({{2{31}}}}.3-1.0 میلی‌گرم وزن خشک) در دمای 37 درجه در میکروکووت کوارتز با هم‌زن مغناطیسی مداوم در 600 uL بافر Z (pH 7.3 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد) انکوبه شدند. مکمل با 1.2 U·mL-I پراکسیداز ترب کوهی. قرائت پایه فلورسانس در غیاب هر گونه بستر تنفسی اگزوژن گرفته شد. سپس افزودنی‌های زیر به‌طور متوالی ساخته شدند: گلوتامات (5 میلی‌مولار)، سوکسینات (5 میلی‌مولار)، روتنون (0.5 میکرومولار)، ADP (10 میلی‌مولار)، و آنتی‌مایسین-A (8 میکرومولار). برای تعیین وزن فیبر، به دقت از کووت خارج شده، لکه زده و خشک می شود. نرخ تولید H2O2 بر حسب AU·min{38}}. (میلی گرم وزن خشک) -I و در ظرفیت oxphos بیان شد که با حداکثر تنفس میتوکندریایی تحت حالت فسفوریلاسیون مطابقت داشت. همه اندازه‌گیری‌ها حداقل به صورت تکراری انجام شد.

ظرفیت نگهداری کلسیم میتوکندری (CRC) در فیبرهای ارواح عضله گاستروکنمیوس سفید همانطور که قبلاً توضیح داده شد ارزیابی شد [33]. به طور خلاصه، الیاف در یک میکروکووت کوارتز تحت هم زدن مداوم در 6{4}} 0 میکرولیتر بافر CRC (در mM∶250 ساکارز، 10 MOPS، 0.005 EGTA، و 10P؛-Tris، pH7.3) انکوبه شدند. سپس فیبرها در معرض یک پالس 20 نانومولار Ca2 پلاس قرار گرفتند. تغییرات در غلظت کلسیم اکسترامیتوکندری با استفاده از کلسیم سبز 5N (1 میلی‌مولار: تحریک-انتشار: 505-535 نانومتر) به روش فلورومتری بررسی شد. حساسیت منافذ انتقالی نفوذپذیری (PTP) با اندازه‌گیری زمان مورد نیاز برای باز شدن PTP ارزیابی شد و CRC به عنوان کل کلسیم انباشته‌شده توسط میتوکندری قبل از انتشار آن در نظر گرفته شد. در پایان هر آزمایش، الیاف به دقت از کووت خارج شده، لکه دار شده و برای تعیین وزن فیبر خشک می شوند. مقادیر CRC در nM از Ca2 به علاوه در هر میلی گرم وزن خشک بیان شد.

2.9. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

پروتئین‌های حاصل از ماهیچه‌های گاستروکنمیوس سفید و سولئوس در بافر Laemmli رقیق شدند و روی ژل‌های پلی آکریل آمید پیش ساخته 10 درصدی Mini-PROTEAN TGX Stain-free (Biorad) جدا شدند. یک استاندارد داخلی روی هر ژل بارگذاری شد. جداسازی الکتروفورتیک در 2{11}}0 ولت به مدت 35 دقیقه در بافر مهاجرت (25 میلی‌مولار TrisBase،0.2 مولار گلیسین، و 1 درصد SDS (p/v)) انجام شد. فناوری بدون لکه (SF) حاوی ترکیب اختصاصی تری هاله است که با پروتئین ها واکنش نشان می دهد و آنها را از طریق قرار گرفتن در معرض UV قابل تشخیص می کند. تصویربرداری SF با استفاده از نرم‌افزار ChemiDoc MP Imager و Image Lab4.{45}}.1 (Biorad، Hercules، California، USA) با زمان فعال‌سازی رنگ‌آمیزی 5- دقیقه انجام شد و الگوهای پروتئین کل بنابراین مشاهده شدند. سپس پروتئین ها با استفاده از سیستم انتقال توربو Trans-Blot (Biorad) روی یک ورقه نیتروسلولز 0.2 um منتقل شدند. کیفیت انتقال توسط غشاهای تصویربرداری با استفاده از فناوری SF کنترل شد. پس از مرحله انتقال، پروتئین‌های کربونیل با دی‌نی‌تروفنیل هیدرازین رقیق‌شده در 2N HCL مشتق شدند و در نهایت به طور گسترده با متانول شسته شدند. غشاها با 5 درصد شیر خشک بدون چربی در سالین تریس بافر حاوی Tween مسدود شدند 1 ساعت در دمای اتاق. سپس غشاها در دمای 4 درجه یک شبه یا 2 ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی های اولیه زیر انکوبه شدند: آنتی بادی اولیه پروتئین کربونیل (Anti-DNP؛ #STA{33}}، ​​Cell Biolabs) و SOD2 (#Ab13533، Abcam). پس از سه شستشو 10 دقیقه‌ای در TBST، غشاها با آنتی‌بادی‌های ثانویه برای پروتئین کربونیل (HRP-conjugate;#STA{38}}، Cell Biolabs) و SOD2 (IgG-HRP مرتبط با خرگوش، #7074، سیگنال‌دهی سلولی) بررسی شدند. در محلول مسدود کننده به مدت 2 ساعت در دمای اتاق و در نهایت به طور گسترده با TBST شسته شدند. رقت آنتی بادی های اولیه و ثانویه برای هر آنتی بادی بهینه شد. تشخیص نورتابی شیمیایی با استفاده از ECL Clarity (Biorad) و ضبط تصاویر با ChemiDocMP انجام شد. تمامی تصاویر با استفاده از نرم افزار Image Lab 4.0.1 تجزیه و تحلیل شدند. عادی سازی شدت سیگنال پروتئین به دنبال کمی سازی سطوح پروتئین کل مربوطه بر روی تصاویر SF، کنترل نمونه و استانداردهای داخلی انجام شد.

2.10. اندازه گیری NAD

سطح کل NAD و NADH در گاستروکنمیوس سفید هموژنیزه شده با استفاده از کیت تجاری (#K337-100، Biovision، USA) و پیروی از دستورالعمل‌های سازنده اندازه‌گیری شد. به طور خلاصه، کل مجموعه NAD (NADt= NADt و NADH) استخراج شد. برای هر یک از نمونه های استخراج شده، نیمی از نمونه به مدت 30 دقیقه تا 60 درجه حرارت داده شد تا NADt تجزیه شود و NADH دست نخورده بماند. هر دو نمونه NADt و NADH با آنزیم چرخه NAD مخلوط شدند و جذب در 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. NADt و NADH با مقایسه با منحنی استاندارد NADH و نرمال شدن به میلی گرم پروتئین اندازه گیری شد. در نهایت، نسبت NAD به علاوه (NADt-NADH) به NADH محاسبه شد. تمام سنجش ها در سه تکرار انجام شد.

2.11. آمار

داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) گزارش می شوند. نرمال بودن داده ها با استفاده از آزمون نرمال بودن D'Agostino-Pearson ارزیابی شد. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از آزمون تی دانشجویی و آنالیز واریانس دو طرفه (گروهی و زمان) برای اندازه گیری های مکرر و سپس آزمون تعقیبی بونفرونی با استفاده از Prism8.4.1 (نرم افزار GraphPad، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. یک سطح دو طرفه 5 درصد برای خطای نوع I اعمال شد.

3. نتایج

3.1. ترکیب بدن و متابولیسم کل بدن

پانزده روز مصرف مکمل CF، در موش‌های نوع وحشی (WT)، وزن بدن را تغییر نداد (p{1}}.091)، توده بدون چربی (p{3}}).{{24} }73) و توده چربی توسط EchoMRI ارزیابی شد (p{5}}.89؛ شکل 1A). نرخ مصرف O2 بیان شده به ازای هر توده بدون چربی در چرخه تاریکی به طور قابل توجهی بالاتر بود (8±8 درصد، p{11}}.{26}}42)، در حالی که در چرخه نور مشابه باقی ماند (p{13}} .392؛ شکل 1B.). هیچ تغییری در فعالیت حرکتی وجود نداشت (داده‌ها نشان داده نشده است). موش‌های CF افزایش قابل توجهی در مصرف انرژی کل بدن به میزان 15±15 درصد نشان دادند (p =0).042؛ شکل 1C) و در مصرف غذا (0.01±0.08 در مقابل 0.01±0.11 گرم به ازای هر وزن بدون چربی بدن، به ترتیب گروه CF و WT، p=0}.013، شکل 1D).

مکمل CF به طور قابل توجهی متابولیسم کل بدن را تغییر داد: اثر اصلی RER بالاتر در گروه CF در 24 ساعت مشاهده شد (p=0.023، شکل 2A) و میانگین RER در طول 12 ساعت بیشتر بود در گروه CF در چرخه روشنایی و تاریکی (به اضافه 3±5 درصد، p=0.{47}}به ترتیب 35 و به علاوه 4±9 درصد، p{12}}.026). علاوه بر این، مکمل CF باعث افزایش مصرف کربوهیدرات (CHO) شد (13 ± 51 درصد از مصرف انرژی به اکسیداسیون CHO در گروه CF در مقابل 12 ± 37 درصد در گروه کنترل در طول چرخه نور بستگی داشت، p{18}}.108 و 21±71 درصد در گروه CF در مقابل 24±47 درصد در گروه کنترل در طول چرخه تاریکی، p{24}}.004؛ شکل 2B.). با این حال، وقتی بر حسب کیلوژول بیان شد، هیچ تفاوتی در اکسیداسیون CHO و اکسیداسیون اسیدهای چرب وجود نداشت (CHOoxidation: 3.7±1.4 kcal·d{31}} در گروه شاهد در مقابل 1.7±4.4 kcal. توده بدن بدون چربی{36}}. d{37}} در CF، p{38}}.33 و اکسیداسیون اسیدهای چرب: 2.3±1.0 kcal·d-Iin کنترل در مقابل 0.87±2.6 kcal. توده بدون چربی بدن-1.d{{ 50}}در CF,p=0.608. تجزیه و تحلیل PRCF از RER افزایش مقادیر EC50 را در گروه CF نشان داد (p{54}},009؛ شکل 2D) به این معنی که CF باعث تغییر می شود. برای استفاده بیشتر از کربوهیدرات ها کاهش شیب تپه در گروه CF مشاهده شد (مقادیر H: 4.44±25.16 در گروه شاهد در مقابل 12.79±3.96 در گروه CF، p.<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. بیوانرژیک میتوکندریایی

ما تأثیر مکمل CF را بر انرژی میتوکندری در عضله گاستروکنمیوس سفید و کف پا در موش‌های WT آزمایش کردیم. تنفس میتوکندریایی بالاتر با استفاده از بسترهای پیچیده IV در عضلات گاستروکنمیوس سفید و کف پا مشاهده شد (به ترتیب p{0}}.004 و p{2}}.028، شکل 3A، B). هیچ تغییری در نسبت‌های تنفسی CII/CI و CIV/CI مشاهده نشد (p =0.899 و p =0.701 برای گاستروکنمیوس سفید و p{9}}.693 و p{{ 11}}.912 برای عضلات کف پا، به ترتیب، داده ها نشان داده نشده است). علاوه بر این، فعالیت های پیچیده، I، IV و سیترات سنتاز به طور قابل توجهی در عضله گاستروکنمیوس سفید افزایش یافت (به ترتیب: به علاوه 27 ± 31 درصد، p{15}}.004؛ به علاوه 38 ± 28 درصد، p{19}} 0.027؛ به علاوه 35±38 درصد، p= 0.009؛ به علاوه 14±13 درصد، p{27}}.040؛ شکل 3C). گاستروکنمیوس سفید (به علاوه 12±24 درصد، p =0.096؛ شکل 3D)، در حالی که هیچ تفاوتی در کف پا مشاهده نشد (p =0.363). نرخ نسبی تنفس تحریک شده با پالمیتویل کارنیتین در عملکرد تنفس پیچیده I بدون تغییر بود (11±62 در گروه کنترل در مقابل 20±64 در گروه CF در گاستروکنمیوس سفید و 70±18 در مقابل 16±72 در کف پا). در مرحله بعد، ما حساسیت به باز شدن PTP ناشی از کلسیم به علاوه در گاستروکنمیوس سفید را بررسی کردیم. همانطور که در شکل 3E نشان داده شده است، نه زمان باز شدن PTP و نه ظرفیت نگهداری Ca2 به دنبال مکمل CF تغییر نکردند (به ترتیب p{50}}.608 و p{52}}.943).

ارزیابی mRNA ژن‌های دخیل در بیوژنز میتوکندری 70 درصد افزایش mRNA NRF1 را نشان داد، در حالی که هیچ تفاوتی برای PGCl، Tfam، CS، ND1، ND2، SDHa و Cox2 گزارش نشد (جدول 3). ما بر روی چند نمونه اثر مکمل CF را بر روی ابر مجتمع‌های میتوکندری بررسی کردیم (شکل S1، مواد تکمیلی). تجزیه و تحلیل تراکم سنجی نشان می دهد که مکمل CF باعث افزایش محتوای کلی ابر مجتمع ها بدون انطباق یا بازآرایی کیفی می شود. در واقع، تراکم تنفسی 58 درصد با استفاده از پروب های پیچیده I و پیچیدهⅡ و 93 درصد با استفاده از پروب پیچیده I بهبود یافت. به طور مشابه، محتوای پیچیده I و Complex III در سوپرمپلکس‌ها در گروه CF بالاتر بود.

مکمل CF انتشار ROS میتوکندری را کاهش می دهد. در حالی که انتشار H2O2 هم در گاستروکنمیوس سفید و هم در سولئوس بدون تغییر باقی ماند که به ازای وزن خشک بیان شد (شکل 4A، B، به ترتیب)، نرخ ها با بیان در هر محتوای میتوکندری کاهش یافت (شکل 4C). اثر مثبت اصلی مکمل CF در شرایط مختلف در گاستروکنمیوس سفید مشاهده شد (ص<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. نشانگرهای استرس اکسیداتیو در عضلات اسکلتی

سطح استرس اکسیداتیو پروتئین سلولی در موش‌های WT تحت تأثیر مکمل‌سازی CF قرار نگرفت زیرا محتوای سلولی SOD2 در گروه‌های آزمایش و کنترل در گاستروکنمیوس سفید و سولئوس مشابه بود (شکل 4E). علاوه بر این، هیچ تفاوتی در کربونیلاسیون پروتئین در گاستروکنمیوس سفید و سولئوس مشاهده نشد (شکل 4F). علاوه بر این، هیچ تفاوتی در بیان mRNA کاتالاز و MnSod پس از مکمل CF مشاهده نشد (جدول 3).

3.4. متابولیسم NAD

مجموع نوکلئوتیدهای پیریدین به دنبال مصرف مکمل CF به میزان 33±36 درصد افزایش یافت (012.0=0). به طور خاص، محتوای NAD و NADH در گاستروکنمیوس سفید افزایش یافت (به ترتیب 60±69 درصد، p{6). }}.026 و 42±29 درصد، p اثر قابل توجهی برای mRNA Sirt3 (p=0.096)، NMNAT mRNA (p=0.094) و Sirt1 mRNA (p =0) مشاهده شد.869؛ جدول 3. ).

3.5. پاسخ متابولیسم کل بدن و سلولی به دنبال مکمل CF در Sirt3-/ موش

ما تأثیر مکمل CF را در موش‌های Sirt{{0}} بررسی کردیم. ترکیب بدن به عنوان وزن، توده بدون چربی و توده چربی بین گروه CF و گروه کنترل تفاوتی نداشت (به ترتیب p{1}}.52، p=0.66، p=0.45). شکل 6A). به طور مشابه، مصرف انرژی روزانه تحت تأثیر مکمل CF قرار نگرفت ({{10}}.38±0.{{40}}1 کیلو کالری بدن بدون چربی جرم-1.day-1 در کنترل‌ها در مقابل 0.39 ± 0.01 کیلو کالری توده بدن-1. روز{19}} در CF، p{20}}.502؛ شکل 6B). RER بین هر دو گروه در چرخه روشنایی و تاریکی مشابه بود (p{23}}.301؛ شکل 6C)، و اکسیداسیون بستر تحت تأثیر مکمل CF قرار نگرفت (44 ± 17 درصد از مصرف انرژی به اکسیداسیون CHO در محیط بستگی داشت. گروه کنترل در مقابل 11 ± 50 درصد در گروه CF در فاز روشن، p{30}}.209. 65±19 درصد در گروه کنترل در مقابل 21±77 درصد در گروه CF در مرحله تاریک، p.=0.395؛ شکل 6D). انعطاف پذیری متابولیک ارزیابی شده با دامنه RER طی 24 ساعت بین دو گروه مشابه باقی ماند (0.05±0.19 در کنترل در مقابل 0.03±0.20 در CF، p{48}}.604)، در حالی که شیب PRCF در گروه CF کاهش یافت. (H مقادیر: 4.38±17.77 در کنترل در مقابل 3.93±12.79 در CF، p{58}}.039).

در مرحله بعد، ما اثر مکمل CF را بر فعالیت آنزیم میتوکندری مقایسه کردیم. مکمل CF نتوانست فعالیت آنزیمی کمپلکس I، I، IV و CS را در Sirt3-/موش افزایش دهد، همانطور که قبلاً در WT مشاهده شد (به ترتیب: p=0.623,p{3}} 0.629، p=0.283، و p=0.791، شکل 6E). به ترتیب:p=0.027 و P{13}}.045)

4. بحث

در این مطالعه، ما یک تجزیه و تحلیل یکپارچه از اثر مصرف CF ارائه می دهیم. ما مشاهده کردیم که مصرف مزمن CF باعث بهبود تنفس میتوکندری و کاهش تولید H2O2 می‌شود که در محیط میوفیبر آنها ارزیابی شد، در حالی که حساسیت باز شدن PTP بدون تغییر بود. مصرف CF متابولیسم NAD را افزایش داد و از دخالت مسیرهای سیرتوئین در سازگاری‌های میتوکندریایی مشاهده‌شده حمایت کرد. ما همچنین تغییرات متابولیسم کل بدن را به سمت توانایی بیشتر در استفاده از کربوهیدرات‌ها به عنوان بستر اصلی مشاهده کردیم که نشان می‌دهد سازگاری‌های میتوکندری احتمالاً به سازگاری متابولیسم کل بدن کمک می‌کند.

4.1. متابولیسم

تجویز رژیم غذایی فلاوانول های کاکائو به عنوان یک استراتژی موثر برای کاهش عدم تحمل گلوکز شناخته شده است که فرصت هایی را برای بهبود بیماری های متابولیک فراهم می کند [34]. نتایج ما مطابق با مطالعات قبلی است که افزایش تحمل گلوکز را به دنبال مصرف فلاوانول ها گزارش کرده بودند [35،36]. مکانیسم های پیشنهادی برای این اثر شامل افزایش انتقال GLUT4 به سمت غشای سلولی، افزایش فسفوریلاسیون AMPK و تنظیم بالا بیان ژن UCP{5}} در عضله اسکلتی است [8،37] . علاوه بر این، مصرف CF با بهبود حساسیت به انسولین در انسان همراه بود[8]. پس از 15 روز مصرف شکلات تلخ، کاهش ارزیابی مدل هموستاز شاخص مقاومت به انسولین در افراد سالم به طور همزمان با افزایش شاخص بررسی کمی حساسیت به انسولین و شاخص حساسیت به انسولین مشاهده شد [8]. ما همچنین افزایش همزمان تحمل گلوکز و انعطاف پذیری متابولیک را در موش های WT مشاهده کردیم که به ظرفیت ارگانیسم برای تطبیق اکسیداسیون سوخت با در دسترس بودن سوخت اشاره دارد [38]. جالب توجه است، در حالی که اختلال در ظرفیت اکسیداتیو میتوکندری و اکسیداسیون سوبسترا مرتبط با مقاومت به انسولین 39 مرتبط بود، تمرینات ورزشی استقامتی محتوای میتوکندری، حساسیت به انسولین و انعطاف‌پذیری متابولیک را افزایش داد [38]. بنابراین، نتایج حاضر مختص مکمل CF هستند و تحت تاثیر فعالیت خود به خودی نیستند.

تأثیر مثبت CF بر انعطاف‌پذیری متابولیک، و همچنین افزایش فعالیت کمپلکس‌های میتوکندری، در موش‌های Sirt کم‌رنگ شد، که نشان می‌دهد اثرات مثبت CF حداقل تا حدی از طریق Sirt3 رخ می‌دهد. این نتایج از یافته های قبلی و نقش محوری Sirt3 در تنظیم انعطاف پذیری متابولیک [24] حمایت می کند. نتایج ما نشان می دهد که افزایش عملکرد میتوکندری ممکن است انعطاف پذیری متابولیک را افزایش دهد. با این حال، علاوه بر عملکرد میتوکندری، ضریب تنفسی پایه، سرعت دفع گلوکز، ظرفیت ذخیره سازی چربی بافت چربی و غلظت اسیدهای چرب آزاد پلاسما نیز به عنوان عوامل تعیین کننده انعطاف پذیری متابولیک شناسایی شدند و باید در نظر گرفته شوند [40]. مطالعات آتی باید عوامل تعیین‌کننده سلولی انعطاف‌پذیری متابولیک را عمیق‌تر ارزیابی کنند تا درک ما از علل زمینه‌ای افزایش انعطاف‌پذیری متابولیک به دنبال مکمل CF را عمیق‌تر کنند.

ارزیابی متابولیسم کل بدن افزایش در اکسیداسیون نسبی CHO را به دنبال مکمل CF نشان داد. این نتیجه با مطالعه قبلی که افزایش لیپولیز را به دنبال مصرف حاد فلاوانول یا مکمل دو هفته ای فلاوان{2}}ولز در موش گزارش کرده بود، در تضاد است [36]. علاوه بر تفاوت‌های ترکیب عصاره، این یافته‌های متناقض ممکن است ناشی از اثرات پلیوتروپیک NO باشد. به خوبی پذیرفته شده است که مصرف CF باعث تحریک تولید یا فراهمی زیستی متابولیسم NO می شود [7]. از یک طرف، NO انتقال و جذب گلوکز را در عضلات اسکلتی تحریک می کند. تحریک تولید NO در میوتوب های مشتق شده از رده سلولی توسط انسولین یا پراکسید هیدروژن منجر به افزایش جابجایی GLUT4 شد که با مهار nNOS کاهش یافت [41]. علاوه بر این، NO می‌تواند انتقال گلوکز را در یک مسیر مستقل از انسولین افزایش دهد که منجر به افزایش سطوح GMP حلقوی و AMPK [42] می‌شود، که اکسیداسیون گلوکز را در عضله اسکلتی موش بدون در دسترس بودن اسید چرب و اکسیداسیون [43] ترویج می‌کند. از طرف دیگر، NO با کاهش سطح مالونیل-CoA از طریق مهار استیل-کوآ کربوکسیلاز و فعال سازی مالونیل-کوآ دکربوکسیلاز در ماهیچه های اسکلتی، اکسیداسیون اسیدهای چرب را تقویت می کند. در حالی که ما یک تغییر به سمت نسبت نسبی کمتری برای استفاده از اسید چرب به عنوان سوبسترا با CF مشاهده کردیم، هیچ تفاوتی در مورد مقادیر مطلق بیان شده در کیلوژول وجود نداشت. این نشان می دهد که افزایش مصرف انرژی مشاهده شده با مکمل CF به افزایش اکسیداسیون گلوکز بستگی دارد. بنابراین، این نتایج از این ایده حمایت می کند که مصرف CF حساسیت به انسولین را افزایش می دهد و اکسیداسیون گلوکز را بدون تأثیر همزمان بر ظرفیت اکسیداسیون اسیدهای چرب ترویج می کند. این نتایج این سوال را در مورد ارتباط استفاده از فلاوانول های کاکائو در زمینه یک رژیم غذایی پرچرب مطرح می کند. مطالعات آینده باید اثرات مضر احتمالی ارتباط مکمل CF و رژیم غذایی پرچرب را ارزیابی کنند.

4.2. عملکرد میتوکندری

نشان داده شده است که تجویز رژیم غذایی فلاوانول های کاکائو عملکرد میتوکندری را بهبود می بخشد، از جمله (i) تنفس میتوکندری و فعالیت آنزیم های زنجیره انتقال الکترون؛ (i) انتشار H2O2 میتوکندری که منعکس کننده تولید گونه های اکسیژن فعال میتوکندری (ROS) است. و (i) ظرفیت نگهداری کلسیم میتوکندری که منعکس کننده حساسیت به باز شدن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری (mPTP) است (برای بررسی به [11] مراجعه کنید. نتایج ما مطابق با مطالعات قبلی است؛ با این وجود، مطالعه ما اولین مطالعه ای بود که اثر مکمل CF بر روی عملکرد میتوکندری در محل فیبر نفوذپذیر و در انواع مختلف ماهیچه ارزیابی شد. اختلال در طی فرآیند جداسازی میتوکندری [32].بنابراین، مطالعه عملکرد میتوکندری در آماده سازی بافتی که در آن ساختار میتوکندری حفظ می شود، مهم است و تمام مخزن میتوکندری برای ارزیابی بهتر پاسخ به درمان نشان داده می شود.

مطالعات قبلی انجام شده در کشت سلولی یا in vivo در موش نشان داده است که مکمل با EPI، که مولکول فعال زیستی اصلی در CF در نظر گرفته می شود، حداکثر تنفس تحریک شده توسط ADP (به عنوان مثال، تنفس حالت 3) را هنگامی که میتوکندری ها با ترکیبی از انرژی انرژی می گیرند، افزایش می دهد. بسترهایی که مکان های مختلف را در امتداد زنجیره تنفسی تغذیه می کنند [45-49]. مطابق با این نتایج، ما یک اثر اصلی مکمل CF را بر تنفس میتوکندری در عضلات اکسیداتیو و گلیکولیتیک مشاهده کردیم. برای تعیین اینکه آیا این افزایش به افزایش توده میتوکندری یا بازسازی مجتمع‌های تنفسی میتوکندری مربوط می‌شود، ما ابر مجتمع‌های میتوکندری را از عضله چهار سر ران ارزیابی کردیم. تصور می‌شود که این ساختارهای فوق مولکولی باعث کاهش تولید ROS، تثبیت یا کمک به تجمع کمپلکس‌های فردی، تنظیم فعالیت زنجیره تنفسی و جلوگیری از تجمع پروتئین در غشای میتوکندری داخلی غنی از پروتئین می‌شوند [50-52]. علیرغم تعداد محدودی از اقدامات، تجزیه و تحلیل بصری نتایج (مواد تکمیلی) نشان می دهد که مکمل CF باعث افزایش توده میتوکندری می شود، همانطور که با افزایش در همه گونه های ابرکمپلکس منعکس می شود، نه سازماندهی مجدد پیچیده زنجیره تنفسی خاص. در مجموع، این نتایج نشان می دهد که CF باعث افزایش توده میتوکندری بدون انطباق کیفی ترتیبات پیچیده زنجیره تنفسی می شود.

در طی تنفس میتوکندری، مقادیر متغیری از سوپراکسید تشکیل می‌شود و می‌تواند برای تشکیل انواع دیگر ROS متابولیزه شود [53]. اگرچه تولید بیش از حد ROS از میتوکندری در طیف گسترده ای از آسیب شناسی ها دخیل است، غلظت های فیزیولوژیکی پایین ROS می تواند اثرات مفیدی مانند محافظت در برابر عوامل عفونی و مشارکت در سیگنال دهی سلولی داشته باشد [2،54]. مطالعات قبلی در داخل بدن در جوندگان و انسان ها و مدل های کشت سلولی، اثرات مفید مکمل CF را بر تولید ROS و سیستم های مختلف آنتی اکسیدانی گزارش کردند [11]. به عنوان مثال، گاواژ خوراکی با EPI به مدت 15 روز باعث افزایش فعالیت SOD2 و کاتالاز در عضلات چهارسر ران موش می شود [17]. در حالی که تولید ROS میتوکندری به طور گسترده مورد ارزیابی قرار نگرفته است، ما مشاهده کردیم که سطوح تولید ROS زمانی که مقادیر به ازای وزن عضله بیان می شد مشابه بود، در حالی که تولید کاهش می یافت وقتی که در هر توده میتوکندری بیان می شد، که نشان می دهد سازگاری های کیفی برای حفظ غلظت فیزیولوژیکی ROS رخ می دهد. علاوه بر این، ما هیچ اثری از CF بر روی SOD2 یا آسیب‌های ناشی از ROS ارزیابی شده توسط کربونیلاسیون پروتئین مشاهده نکردیم. در حالی که CF استخرهای پروتئین آنتی اکسیدانی را افزایش می دهد، از جمله سطوح SOD2 و کاتالاز به طور گسترده گزارش شده [16،17،55]، این سازگاری همیشه با کاهش آسیب های ناشی از ROS همراه نبود [{14}}]. این داده ها از این نظریه حمایت می کنند که سطوح پایین تولید ROS برای هموستاز سلولی طبیعی مورد نیاز است [2]. در مجموع، این نتایج نشان می دهد که همزمان با افزایش توده میتوکندری، CF سازگاری کیفی میتوکندری را برای افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی و حفظ سطوح پایین تولید ROS ارتقا می دهد.

4.3. بیوژنز میتوکندری

توده میتوکندریایی نتیجه تعامل بین بیوژنز میتوکندری و میتوفاژی است. مطالعه ما بر روی بیوژنز میتوکندری فعال شده توسط مصرف پلی فنل ها متمرکز شد [60]. بیوژنز میتوکندری فرآیند سلولی است که توده میتوکندری را بهبود می بخشد. این فرآیند پیچیده و بسیار تنظیم‌شده شامل چندین فاکتور رونویسی، گیرنده‌های هورمون هسته‌ای و فعال‌کننده‌های رونویسی است که به طور جمعی برای هماهنگ کردن تغییرات در بیان ژن‌های کدگذاری شده DNA هسته‌ای و میتوکندریایی عمل می‌کنند [61]. مطالعات قبلی تلاش کرده اند تا مشخص کنند کدام مسیر(های) ممکن است زمینه ساز بیوژنز میتوکندریایی ناشی از مکمل CF باشد. تحریک سیگنالینگ وابسته به NO به عنوان یک مسیر مرکزی درگیر در بیوژنز میتوکندری ظاهر شده است. مکمل CF با مهار آنزیم تجزیه کننده آرژنین آرژیناز، تولید NO را افزایش می دهد، که در دسترس بودن ال-آرژنین برای بیوسنتز NO را افزایش می دهد [62،63]. علاوه بر این، با استفاده از یک مهارکننده eNOS، اثر تحریکی اپی کاتچین بر بیوژنز میتوکندری تا حدی کمرنگ شد [17]. این نتایج نشان دهنده دخالت سایر مسیرهای سیگنالینگ برای تحریک بیوژنز میتوکندری است.

اخیراً آراگونس و همکاران. (2016) گزارش کرد که پروآنتوسیانیدین های رژیم غذایی، اعضای خانواده پلی فنول ها، متابولیسم کبدی NAD را با افزایش مسیر بیوسنتز و فعالیت سیرت به روشی وابسته به دوز در موش ها افزایش می دهند [12]. علاوه بر این، کبد پیش‌سازهای NADt را به سایر اندام‌ها، مانند ماهیچه‌های اسکلتی، که ظرفیت کمتری برای سنتز NAD دارند، صادر می‌کند و امکان گسترش اثرات مشاهده شده در کبد را به کل ارگانیسم افزایش می‌دهد [64]. در حالی که برخی از مطالعات اثر مکمل CF را بر محتوای پروتئین Sirt1، فعالیت یا mRNA گزارش کردند [12،{6}}،65،66]، دخالت متابولیسم NAD در بیوژنز میتوکندری به دنبال مکمل CF با از دست دادن یا افزایش عملکرد هرگز آزمایش نشده است. در حالی که یک ناک اوت خاص عضلانی نسبت به موش‌های Sirt3 KO تمام بدن مورد استفاده در مطالعه ما ترجیح داده می‌شود، نتایج ما نشان می‌دهد که CF متابولیسم NAD را بهبود می‌بخشد و Sirt3 در بهبود فعالیت زنجیره انتقال الکترون میتوکندری ناشی از مکمل‌سازی نقش دارد. اثرات مثبت مشاهده شده بر فعالیت کمپلکس‌های میتوکندریایی پس از مکمل‌سازی CF با استفاده از موش‌های Sirt مشاهده نشد و فعالیت بیشتر فعالیت‌های کمپلکس I و IV پس از مکمل‌سازی CF تنها در WT مشاهده شد. این مشاهدات کارهای قبلی را گسترش می دهد که نشان می دهد Sirt3 نقشی محوری در عملکرد میتوکندری ایفا می کند.]67. در مجموع، این یافته‌ها نشان می‌دهند که سیرتوئین‌ها، از طریق مدولاسیون متابولیسم NAD، در بهبود توده میتوکندریایی که پس از مکمل‌سازی CF مشاهده می‌شود، نقش دارند. 4.4. محدودیت ها

دانه های کاکائو از مخلوطی از فلاوانول های مونومر، الیگومری و پلیمری تشکیل شده اند. در میان فلاوانول‌ها، به نظر می‌رسد EPI فراوان‌ترین مونومر پلی‌فنولی موجود در محصولات کاکائو است که تا 35 درصد از محتوای پلی‌فنل را نشان می‌دهد [68]. EPI به عنوان اصلی ترین مولکول فعال زیستی مزایای اساسی مرتبط با مکمل کاکائو و شکلات ایجاد شد [47،69]. با این حال، متابولیت های EPI (EPIm) ممکن است در اثرات بیولوژیکی ناشی از EPI مشاهده شده در مطالعات in vivo دخیل باشند. EPIm می تواند به غلظت های پلاسمایی بالاتری نسبت به EPI [70] برسد. علاوه بر این، تفاوت‌های عمده در EPIm در بین گونه‌ها مشاهده شد. در واقع، 80 درصد از EPIM موجود در انسان در موش‌ها شناسایی نشد، در حالی که شباهت بین موش و انسان کمی مطلوب‌تر بود زیرا دو متابولیت اصلی انسانی شناسایی شدند [70]. ما از عصاره CF غنی شده حاوی پنج برابر EPI بیشتر از دانه های کاکائو تخمیر نشده استفاده کردیم[71]. علاوه بر این، محتوای EPI با تخمیر 10-20 درصد کاهش یافت و به روشی وابسته به دما در طول بو دادن کاهش یافت [71،72]. در مجموع، این داده‌ها نشان می‌دهند که هنگام ارزیابی مزایای مکمل EPI بر سلامت انسان، فقط باید به محتوای EPI توجه شود، و نتایج حاضر باید قبل از برون‌یابی مکانیسم‌های اساسی مشاهده‌شده در انسان با احتیاط در نظر گرفته شوند.

5. نتیجه گیری ها

مکمل CF روزانه به مدت 15 روز منجر به بهبود عملکرد میتوکندری در عضلات اکسیداتیو و گلیکولیتیک می شود. نتایج حاضر نشان می‌دهد که افزایش تنفس میتوکندریایی منجر به افزایش توده میتوکندری می‌شود در حالی که سطح سلولی تولید ROS حفظ می‌شود، که نشان‌دهنده سازگاری کیفی در میتوکندری است. همزمان با اثر سلولی بر متابولیسم NO که قبلاً توضیح داده شد [73]، CF متابولیسم NAD را تعدیل می کند، که فعالیت سیرتوئین ها را تحریک می کند. Sirt3 نقش اصلی را در سازگاری میتوکندری و انعطاف پذیری متابولیک به دنبال مکمل CF ایفا می کند. از آنجایی که سیرتوئین ها اهداف اخیر در پاتوژنز بیماری های مختلف، مانند دیابت یا آسم هستند [74,75l، مطالعات بیشتر علاقه بالقوه استفاده از CF را به عنوان یک فعال کننده طبیعی سیرتوئین ها بررسی خواهد کرد.

منابع

1. کوزنتسوف، AV; وکسلر، وی. گلریچ، FN; ساکس، وی. مارگریتر، آر. Kunz، WS تجزیه و تحلیل عملکرد میتوکندری در محل در فیبرهای عضلانی، بافت‌ها و سلول‌های نفوذپذیر. نات. پروتکل 2008، 3، 965-976. [CrossRef]

2. سنا، لس آنجلس; چندل، نقش های فیزیولوژیکی NS گونه های اکسیژن فعال میتوکندری. مول. سلول 2012، 48، 158-167. [CrossRef]

3. Wacquier، B. کامبتس، ال. Van Nhieu، GT; Dupont، G. تعامل بین Ca2 داخل سلولی به علاوه نوسانات و Ca2 به علاوه متابولیسم میتوکندری تحریک شده. علمی Rep. 2016, 6, srep19316. [CrossRef]

4. Suomalainen-Wartiovaara، A.; Battersby، BJ بیماری های میتوکندری: سهم پاسخ های استرس اندامک به آسیب شناسی. نات. کشیش مول. سلول بیول. 2018، 19، 77–92. [CrossRef]

5. هیمن، ای. داوسین، اف. ویچورک، وی. کایازو، آر. ماتران، ر. برتون، پی. Aucouturier، J.; برتوین، اس. دسکاتور، ا. لکلر، ای. و همکاران تامین و استفاده از اکسیژن عضلانی در دیابت نوع 1، از هوای محیط تا زنجیره تنفسی میتوکندری: آیا یک مرحله محدود کننده وجود دارد؟ مراقبت از دیابت 2020، 43، 209-218. [CrossRef]

6. داوسین، FN; بولانجر، ای. لنسل، اس. از میتوکندری تا سارکوپنی: نقش التهاب و دلالت محوری لیگاند RAGE. انقضا جرونتول. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz، DL; دوغتی، ک. علی، ا. کاکائو و شکلات در سلامت و بیماری انسان. آنتی اکسیدان سیگنال ردوکس 2011، 15، 2779-2811. [CrossRef] 8. Grassi، D.; لیپی، سی. نکوزیون، اس. دسیدری، جی. Ferri, C. تجویز کوتاه مدت شکلات تلخ به دنبال افزایش قابل توجه حساسیت به انسولین و کاهش فشار خون در افراد سالم است. صبح. جی. کلین. Nutr. 2005، 81، 611-614. [CrossRef] [PubMed]

9. گراسی، دی. دسیدری، جی. نکوزیون، اس. لیپی، سی. کازال، آر. پروپرزی، جی. بلومبرگ، جی بی. فری، سی. فشار خون کاهش می‌یابد و حساسیت به انسولین در افراد مبتلا به فشار خون بالا و عدم تحمل گلوکز پس از 15 روز مصرف شکلات تیره با پلی فنول بالا افزایش می‌یابد. جی. نوتر. 2008، 138، 1671-1676. [CrossRef]

10. اوتاویانی، جی. مامان، TY; هیس، سی. کویک-اوریبه، سی. شروتر، اچ. Keen، CL پیکربندی استریوشیمیایی فلاوانول ها بر سطح و متابولیسم فلاوانول ها در انسان و فعالیت بیولوژیکی آنها در داخل بدن تأثیر می گذارد. رادیک آزاد. Biol. پزشکی 2011، 50، 237-244. [CrossRef] [PubMed]