سمیت مزمن کلیوی برموبنزن و متابولیت های واسطه آن در موش

برموبنزن (BB) به عنوان یک تهدید جدی برای سلامت انسان شناخته شده است. ما قبلاً نشان دادیم که BB دارای سمیت زمانی است، یعنی نوسانات روزانه در شدت سمیت کبدی ناشی از موش. اگرچه BB سمیت کلیوی خفیفی را نشان داد، اما نوسان روزانه در این سمیت مشاهده نشد. این ممکن است به این واقعیت نسبت داده شود که سمیت مزمن ناشی از BB فقط در کبد مشاهده می شود و نه در کبدکلیه هاو اینکه آسیب ناشی از BB در کبد برجسته است و نوسانات روزانه در سمیت کلیوی را پنهان می کند. برای تایید این دو احتمال، ما نوسانات روزانه در سمیت کلیوی ناشی از متابولیت های واسطه BB را که هدف قرار می دهند، بررسی کردیم.کلیه ها: 3-بروموفنول، بروموهیدروکینون و 4-بروموکاتکل. به موش‌ها 3-بروموفنول، بروموهیدروکینون یا 4-بروموکاتکول به صورت داخل صفاقی در شش نقطه زمانی مختلف در یک روز (زمان زیت‌گبر (ZT): ZT2، ZT6، ZT10، ZT14، ZT18 یا ZT22 تزریق شد. مرگ و میر برای 7 روز پس از تزریق تحت نظر قرار گرفت. موش ها به سمیت حاد این متابولیت ها در اطراف قرار گرفتن در معرض ZT14 (فاز تاریک) نسبت به قرار گرفتن در اطراف ZT2 (فاز نور) حساس تر بودند. علاوه بر این، موش‌هایی که دوز غیر کشنده بروموکاتکل دریافت کردند، افزایش قابل‌توجهی در سطح نیتروژن اوره پلاسما و نیتروژن اوره خون نشان دادند.کلیهمالون دی آلدئید در مواجهه با ZT14. علاوه بر این، گلوتاتیون پراکسیداز{1}}، یک شاخص فروپتوز، در قرار گرفتن در معرض ZT14 ضعیف شد. این نتایج نشان می‌دهد که سمیت متابولیت‌های BB در طول مواجهه با فاز تاریک بیشتر بوده است و دلیل عدم مشاهده تغییرات روزانه کلیوی توسط BB در گزارش قبلی ما این است کهکلیهخسارتبه دلیل آسیب شدید کبدی ماسک شده بود.

برای بیماری کلیوی قرص Cistanche tubulosa را کلیک کنید

کلیدواژه برموبنزن; تغییرات روزانه؛ ریتم شبانه روزی؛ سمیت مزمن؛کلیه

مقدمه

برموبنزن (BB) یک معرف صنعتی عمومی است که معمولاً به عنوان ماده اولیه برای سنتز داروها، رنگ‌ها و آفت‌کش‌ها استفاده می‌شود. 1،2) BB یک آلاینده آلی است که به محیط طبیعی آسیب می‌زند و سلامت انسان را تهدید می‌کند. . یک مطالعه بیان می کند که BB باعث ایجاد سمیت کبدی شدید و خفیف می شودکلیهسمیت در موش. 3) اگرچه خود BB، یک فرم غیر متابولیتی، دارای سمیت کم است، متابولیت های میانی آن اثرات سمی بر روی کبد وکلیه ها. CYP450s کبدی، مانند CYP1A2، CYP1B1، و CYP2E1، BB را به چهار متابولیت متابولیزه می‌کنند: 3-بروموفنول (3-BrP)، بروموهیدروکینون (BrHQ)، 4-بروموکاتکل ({10}} BrC)، و BB-3،4-اکسید. BB{13}}،4-اکسید سمیت کبدی بالایی از خود نشان می‌دهد و سایر متابولیت‌ها سمیت کلیوی نشان می‌دهند، 4-6) که نشان می‌دهد این متابولیت‌ها اندام‌های هدف متفاوتی دارند.

در این مطالعه، ما "کرونوتوکسیکولوژی" را هدف قرار دادیم، همانطور که قبلاً رابطه بین زمان تجویز و شدت سمیت مواد شیمیایی را پیشنهاد کرده بودیم. ، موشها نسبت به آسیب کبدی ناشی از BB در طول مواجهه با فاز تاریک (2:00) نسبت به فاز نور (14:{8}}) ​​تحمل بیشتری داشتند. 8) اگرچه BB سمیت کلیوی خفیفی نشان داد. ، سمیت مزمن در آن مشاهده نشدکلیه ها. بنابراین، سمیت زمانی ناشی از BB احتمالا فقط در کبد و نه در کبد مشاهده شد.کلیه ها. در مطالعه قبلی ما، استرپتومایسین، یک آنتی بیوتیک شناخته شده برای القای سمیت کلیوی مشخص، تغییرات روزانه واضحی را در سمیت کلیوی ناشی از موش نشان داد. راکلیه ها، بنابراین سمیت مزمن در اندام دوم را پنهان می کند. متابولیت های BB تولید شده از طریق مسیرهای متابولیکی مختلف در غلظت های پایین رخ می دهند و بنابراین ممکن است به آسیب کلیوی ناچیز کمک کنند. با توجه به این، سمیت کلیوی ناشی از متابولیت BB را نمی توان از نظر بالینی تخمین زد. در این مطالعه، ما تغییرات روزانه در سمیت کلیوی متابولیت های واسطه BB را بررسی کردیم: 3-BrP، BrHQ، و 4-BrC (شکل 1).

مواد و روش ها

درمان حیوانات

موش های نر ICR از Japan SLC Inc. (Shizuoka، ژاپن) خریداری شدند و تحت شرایط استاندارد دمای کنترل شده (1±24 درجه)، رطوبت (5±55 درصد) و نور (12: 12- ساعت) نگهداری شدند. چرخه روشنایی/تاریکی، چراغ‌ها در 08: 00)، با دسترسی رایگان به آب و غذا. تیمارهای آزمایشی با استفاده از حیوانات 7- هفته‌ای انجام شد. پس از اتمام آزمایش‌ها، موش‌های زنده‌مانده با استفاده از پنتوباربیتال قربانی شدند. تمام آزمایشات توسط کمیته مراقبت از حیوانات و آزمایشات دانشگاه Kinjo Gakuin تأیید شد.

پروتکل آزمایشی

برای سنجش مرگ و میر، {{0}}موش‌های نر ICR یک هفته‌ای یک تزریق داخل صفاقی (IP) 500 mg/kg از 3-BrP، 180 mg/kg دریافت کردند. BrHQ، یا 220 میلی‌گرم بر کیلوگرم 4-BrC (در حجم 0.1 میلی‌لیتر/10 گرم وزن بدن؛ توکیو کاسی شرکت، توکیو، ژاپن). این دوز با توجه به مقدار LD50 در برگه های اطلاعات ایمنی برای هر ماده شیمیایی تعیین می شود. برای تزریق هر متابولیت، موش ها به شش گروه 5 تایی تقسیم شدند. متابولیت‌های BB در شش نقطه زمانی مختلف (زمان ساعت: 10:{13}}، 14:00، 18:00، 22:00، 02: {{21} تجویز شدند. }}، و 06 : 00)، به ترتیب به عنوان زمان‌های زیت‌گبر (ZTs) توصیف می‌شوند: ZT2، ZT6، ZT10، ZT14، ZT18 و ZT22. موش های کنترل همان حجم سالین را دریافت کردند. مرگ و میر برای 7 روز پس از تزریق تحت نظر قرار گرفت.

برای تجزیه و تحلیل تغییرات شبانه روزی درکلیهصدمه، 7-موش‌های نر ICR یک هفته‌ای (9-5 موش) تزریق داخل صفاقی 165 میلی‌گرم بر کیلوگرم 4-BrC در ZT2 یا ZT14 دریافت کردند. موش های کنترل همان حجم سالین را که در بالا توضیح داده شد دریافت کردند. حیوانات با استفاده از پنتوباربیتال معدوم شدند و نمونه های پلاسمایی آنها 24 ساعت پس از تزریق جمع آوری شد. نمونه های پلاسمای به دست آمده در دمای 80- درجه نگهداری شدند. اینکلیه هااز همه حیوانات برداشت و در دمای 80- درجه نگهداری شد.

سطوح نیتروژن اوره خون پلاسما (BUN)، آسپارتات آمینوترانسفراز (AST) و مالون دی آلدئید کلیه (MDA)

سطوح BUN و AST پلاسما با استفاده از تست BUN Wako و ترانس آمیناز CII-Test Wako (FUJIFILM Wako Chemicals، اوزاکا، ژاپن)، طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد.کلیهسطوح MDA از طریق یک روش رنگ سنجی میکروپلیت (Oxford Biomedical Research، MI، USA)، طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

نمونه های پروتئین (50 میکروگرم) استخراج شده ازکلیه هااز طریق الکتروفورز ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید 10 درصد سدیم جدا شد. آنتی بادی مونوکلونال پراکسیداز 4 (GPX4) (سانتا کروز بیوتکنولوژی، دالاس، TX، ایالات متحده). آنتی بادی پلی کلونال کاسپاز{10}} شکافته شده خرگوش (فناوری سیگنالینگ سلولی)؛ و آنتی بادی مونوکلونال اکتین موش (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japan).

تحلیل آماری

مقایسه‌های چندگانه با استفاده از آزمون تعقیبی Tukey-Kramer انجام شد. تمامی تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار SPSS 25.{2}} (Chicago, IL, USA) انجام شد. نتایج با p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

نتایج و بحث

در این مطالعه، ما سمیت زمانی سه متابولیت واسطه BB (3-BrP، BrHQ و 4-BrC) را که به عنوان القا کننده شناخته شده‌اند، مقایسه کردیم.کلیهسمیت. ما برای اولین بار اثر زمان تزریق را بر مرگ و میر ناشی از متابولیت میانی BB بررسی کردیم. شکل 2 تعداد حیوانات زنده مانده و میانگین زمان بقا (MST) 7 روز پس از تزریق را نشان می دهد. وقتی 3-BrP در ZT10 و ZT14 تجویز شد، همه موش‌ها ({34}} درصد) در عرض 4 ساعت مردند (شکل 2A). در مقابل، وقتی 3-BrP در ZT6 و ZT22 تجویز شد، سه موش (60 درصد) زنده ماندند. هنگامی که در ZT2 و ZT18 تجویز شد، تعداد موش های زنده مانده به ترتیب یک و دو موش (20 و 40 درصد) بود. پس از تجویز BrHQ، مرگ موش ها تنها در عرض 4 ساعت پس از تجویز در تمام گروه های ZT مشاهده شد. در 7 روز پس از تجویز، هیچ موشی در گروه‌های ZT14 و ZT18 و سه موش (60 درصد) در گروه‌های ZT2 و ZT6 زنده ماندند. در گروه های ZT10 و ZT 22، تعداد موش های زنده مانده به ترتیب دو و یک موش (40 و 20 درصد) بود (شکل 2B). پس از تجویز 4-BrC، همه موش‌ها در مدت 3 روز با دوز ZT14 یا ZT18 (0 درصد) مردند و تنها یک یا دو موش (20 یا 40 درصد) در سایر گروه‌های ZT زنده ماندند (شکل 2C). MST تقریباً با تعداد موش های زنده مانده در همه گروه ها سازگار بود (شکل 2D-F). این نتایج نشان دهنده سمیت زمانی کشنده سه متابولیت واسطه BB است. پس از تجویز در ZT14 (فاز تاریک)، هر سه متابولیت سمیت بالایی نشان دادند. جالب توجه است که الگوهای سمیت زمانی این متابولیت‌های BB با متابولیت‌های خود BB متفاوت است، یعنی موش‌هایی که در فاز تاریک در معرض BB قرار گرفتند حساسیت کمتری نسبت به سمیت داشتند. قرار گرفتن در معرض فاز تاریک و کمتر سمی پس از قرار گرفتن در معرض فاز نور. 9) این یافته های مطالعات قبلی با نتایج مطالعه حاضر در تضاد نیست، و نشان می دهد که تفاوت در سمیت BB و سه متابولیت میانی BB به اندام های هدف آنها نسبت داده می شود. . BB کبد را هدف قرار می دهد، در حالی که متابولیت های میانی آن کبد را هدف قرار می دهدکلیه ها.

ما در مرحله بعد اثر زمان تزریق را بر شدت سمیت اندام با استفاده از دوز غیر کشنده 4-BrC (165 میلی گرم بر کیلوگرم) بررسی کردیم. از آنجایی که مرگ زودهنگام طی 4 ساعت با تزریق 3-BrP و BrHQ، که در بالا توضیح داده شد، مشاهده شد، ما فقط 4-BrC را برای آزمایش‌های بعدی انتخاب کردیم. برای راحتی تجربی، ZT2 و ZT14 را به عنوان زمان تزریق انتخاب کردیم. در گروه ZT2، سطح پلاسمایی BUN، شاخص سمیت کلیوی، به دنبال قرار گرفتن در معرض 4-BrC افزایش نیافت. با این حال، سطح BUN به طور قابل توجهی در گروه ZT14 افزایش یافت (شکل 3A). به موازات BUN، سطح AST پلاسما را که یک شاخص سمیت کبدی است، اندازه‌گیری کردیم. ما دریافتیم که 4-تجویز BrC ​​بر سطوح AST پلاسما در ZT2 و ZT14 تأثیری نمی‌گذارد (شکل 3B)، که نشان می‌دهد 4-BrC فقط برایکلیه ها. علاوه بر این، ما سطوح MDA را به عنوان یک شاخص استرس اکسیداتیو در تخمین زدیمکلیه ها. تجویز 4-BrC به طور قابل‌توجهی سطح MDA کلیه را در گروه‌های ZT14 و ZT2 افزایش داد. با این حال، سطح MDA در گروه تزریق ZT2 به طور قابل توجهی کمتر از گروه ZT14 بود (شکل 3C).

تا به امروز، مسیرهای مرگ سلولی مختلفی مانند آپوپتوز، نکروپتوز و فروپتوز گزارش شده است. 11) علاوه بر این، گزارش شده است که مرگ سلولی ناشی از 4-BrC عمدتاً از طریق نکروز انجام می شود. 6) برای بررسی نوع مرگ سلولی ناشی از 4-BrC، ما سطوح پروتئین‌های مرتبط با مرگ سلولی را تجزیه و تحلیل کردیم: کاسپاز بریده شده-3 برای آپوپتوز، RIP1/RIP3 برای نکروپتوز، و GPX4 برای فروپتوز. هیچ تغییر آشکاری در سطوح کاسپاز بریده شده-3، RIP1 و RIP3 در هیچ گروهی مشاهده نشد، که نشان می‌دهد آپوپتوز و نکروپتوز توسط 4-BrC القا نمی‌شوند (شکل 4). در مقابل، کاهش سطح GPX4 پس از تجویز 4-BrC در ZT14 مشاهده شد (شکل 4). ما نکروز کلیه ناشی از BrC ​​را با تجزیه و تحلیل هیستوپاتولوژیک مشاهده نکردیم (داده‌ها نشان داده نشده است). این نشان داد که غلظت 4-BrC مورد استفاده در این مطالعه باعث آسیب کلیوی خفیف شده و منجر به نکروز نمی شود. از این نتایج، می توان پیشنهاد کرد که 4-BrC باعث فروپتوز می شود که تغییرات روزانه را نشان می دهد.

در این مطالعه، ما نشان دادیم که متابولیت‌های واسطه BB باعث ایجاد سمیت مزمن در بدن می‌شوندکلیه. در مقابل، نتیجه قبلی ما سمیت کلیوی ناشی از BB را نشان داد. با این حال، کرونوتوکسیسیتی کلیوی بین فاز روشن و فاز تاریک تغییر نکرده است. 8) اگرچه دلیل اصلی تفاوت بین تحقیقات قبلی و فعلی هنوز مشخص نیست، ما فکر می‌کنیم که این امر رخ داده است که سمیت مزمن کلیوی را با القای کبدی شدید پنهان کند. صدمه. در آزمایش آینده، ما باید مقادیر انباشته شده هر متابولیت BB-واسطه را اندازه گیری کنیم زیرا این مقادیر ممکن است توسط سطوح CYP و/یا آسیب تغییر کنند.

بسیاری از عوامل بیولوژیکی یک ریتم شبانه روزی را در سطوح بیان خود نشان می دهند. به عنوان مثال، Xu و همکاران. تغییرات روزانه در بیان ژن آنتی اکسیدان کبدی در موش ها را گزارش کرده اند. 12) گلوتاتیون (GSH) یک آنتی اکسیدان است که برای حفظ سلامت و محافظت در برابر ترکیبات سمی حیاتی است. گزارش شده است که هر دو 4-BrC و 3-BrP باعث کاهش سطح GSH کلیه می‌شوند. منجر به کاهش GSH و غیرفعال شدن GPX4 می شود. 14) نتایج ما نشان داد که GPX4 تنها در ZT14 توسط 4-BrC سرکوب شد. بنابراین، پروتئین‌ها یا ژن‌های مرتبط با GSH ممکن است با سمیت مزمن همراه باشند.

برای نتیجه‌گیری، مطالعه حاضر نشان می‌دهد که BB از طریق متابولیت‌های خود مانند 3-BrP، BrHQ و 4-BrC باعث آسیب کلیوی و همچنین آسیب کبدی می‌شود. دلیل اینکه تغییر روزانه کلیوی توسط BB در گزارش قبلی ما مشاهده نشد این است که آسیب کلیوی به دلیل آسیب شدید کبدی پوشانده شده است.

منابع

1) Lau SS، Monks TJ. سهم بروموبنزن در درک فعلی ما از سمیت های ناشی از مواد شیمیایی. Life Sci., 42, 1259-1269 (1988).

2) Zhao H، Cheng N، He L، Peng G، Liu Q، Ma T، Cao W. اثرات محافظتی کبدی عسل Apis cerana Fabricius بر آسیب کبدی ناشی از بروموبنزن در موش. J. Food Sci., 83, 509-516 (2018).

3) ودی م، سابینا ای پی. ارزیابی پتانسیل محافظت از کبد و نفروپروتکتیو با آفرین A در آسیب ناشی از بروموبنزن در موش‌های آلبینو سوئیسی: درگیری احتمالی اختلال عملکرد و التهاب میتوکندری. سلول بیول. Toxicol., 32, 373-390 (2016).

4) Dankovic DA، Billings RE. نقش 4-بروموفنل و 4-بروموکاتکل در اتصال کووالانسی برموبنزن و سمیت در سلول‌های کبدی جدا شده موش صحرایی. سموم Appl. Pharmacol.، 79، 323-331 (1985).

5) Lau SS، Monks TJ، Gillette JR. شناسایی 2-بروموهیدروکینون به عنوان متابولیت بروموبنزن و o-بروموفنول: پیامدهایی برای سمیت کلیوی ناشی از بروموبنزن. J. Pharmacol. انقضا Ther., 230, 360-366 (1984).

6) راش جی اف، نیوتن جی اف، مایتا کی، کو سی سی، هوک جی بی. سمیت کلیوی متابولیت های برموبنزن فنلی در موش سم شناسی، 30، 259-272 (1984).

7) Miura N، Yoshioka H، Nishimori A، Ohtani K، Hasegawa T، Hwang GW، Ikeda M، Nonogaki T. تجزیه و تحلیل چند جهتی سمیت مزمن کبدی ناشی از کادمیوم و در موش. J. Toxicol. Sci., 42, 597-604 (2017).

8) Yoshioka H، Nonogaki T، Fukuishi N، Shinohara Y، Hwang GW، Ohtani K، Miura N. سمیت مزمن آسیب کبدی ناشی از بروموبنزن در موش. J. Toxicol. Sci., 42, 251-258 (2017).

9) Yoshioka H، Tominaga S، Shinohara Y، Hwang GW، Maeda T، Miura N. سمیت مزمن آسیب کلیوی ناشی از استرپتومایسین در موش. Biol. فارم. Bull., 43, 53-58 (2020).

10) Yoshioka H، Ichimaru Y، Fukaya S، Nagatsu A، Nonogaki T. اثر تقویت کننده سمیت کبدی ناشی از استامینوفن و تتراکلرید کربن با فعال شدن پروتئین تعامل گیرنده در موش انجام می شود. سموم مکانیک. Methods, 28, 615-621 (2018).

11) Kim EH، Wong SW، Martinez J. نکروز و بیماری برنامه ریزی شده: ما برنامه ریزی منظم شما را قطع می کنیم تا التهاب نکرو را برای شما به ارمغان بیاوریم. تفاوت مرگ سلولی، 26، 25-40 (2019).

12) Xu YQ، Zhang D، Jin T، Cai DJ، Wu Q، Lu Y، Liu J، CD Klaassen. تغییرات روزانه بیان ژن آنتی اکسیدان کبدی در موش PLOS ONE, 7, e44237 (2012).

13) Monks TJ، Hinson JA، Gillette JR. سمیت بروموبنزن و p-بروموفنول و اتصال کووالانسی در داخل بدن. Life Sci., 30, 841-848 (1982).

14) Dixon SJ، Lemberg KM، Lamprecht MR، Skouta R، Zaitsev EM، Gleason CE، Patel DN، Bauer AJ، Cantley AM، Yang WS، Morrison B 3rd، Stockwell BR. فروپتوزیس: شکل وابسته به آهن مرگ سلولی غیرآپوپتوز. Cell, 149, 1060-1072 (2012).

هیروکی یوشیکا، a، b، # سارا تومیناگا، یک، # مای نیشیکاوا، یک یاسورو شینوهارا، یک ماکوتو ناکائو، یک ماسای یوشیکاوا، یک توهرو مائدا،*، یک و نوبوهیکو میورا*، سی

کالج داروسازی، دانشگاه کینجو گاکوین؛ 2-1723 اوموری، موریاما-کو، ناگویا 463-8521، ژاپن: b مرکز تحقیقات جمجمه و صورت، مرکز علوم بهداشتی دانشگاه تگزاس در هیوستون، دانشکده دندانپزشکی. 1941 East Road, Houston, TX 77054, USA: و cDepartment of Health Science, Yokohoma University of Pharmacy; 601 مومونو-چو، توتسوکا-کو، یوکوهاما 245–2006، ژاپن. دریافت شده در 30 آگوست 2020؛ پذیرفته شده در 25 اکتبر 2020

برای اطلاعات بیشتر: Ali.ma@wecistanche.com