اکیناکوزید پیری سلولی سلول های فیبروبلاستیک انسانی MRC را به تاخیر می اندازد-5

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

ماده موثره سیستانچ: اکیناکوزید چگونه پیری می کند؟

Hong Xie 1، Hui Zhu1،2، Cong Cheng1، Yu Liang1، Zhao Wang1

در این مطالعه، اثرات اکیناکوزید، یکی از فنیل اتانوئیدهای جدا شده از ساقه سیستانچس سالسا، یک داروی گیاهی سنتی چینی، بر سلول‌های فیبروبلاستیک MRC{0}} ریه جنین انسان، مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت تکثیر سلولی با Alamar Blue مورد ارزیابی قرار گرفت و نشان داد که درمان با اکیناکوزید می‌تواند پیری را به تاخیر بیندازد. نتایج فلوسایتومتری نشان می دهد که اکیناکوزید می تواند سلول های فاز G1 را برای ورود به فاز S و فاز G2 تحریک کند و می تواند تخریب ROS را بهبود بخشد. نتایج حاصل از سنجش دنباله دار نشان می دهد که اکیناکوزید می تواند از سلول ها در برابر آسیب DNA محافظت کند و تا حدودی مکانیسم اثرات آن را روشن کند. همه نتایج فوق نشان می دهد که اکیناکوزید دارای فعالیت ضد پیری بالقوه است.

Cistanche deserticola اثرات زیادی دارد، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

سلول‌های طبیعی کشت‌شده در شرایط آزمایشگاهی برای تعداد محدودی از دو برابر شدن جمعیت (محدودیت Hayflflick) تکثیر می‌شوند و وارد مرحله پیری همانندسازی می‌شوند. سلول های پیر دچار توقف رشد سلولی در فاز G1 و تغییر در مورفولوژی و متابولیسم، از جمله بزرگ شدن سلولی، افزایش بیوژنز لیزوزوم و بیان فعالیت بالاتر -گالاکتوزیداز در pH 6 (گالاکتوزیداز مرتبط با پیری، SA{5}}Gal) می شوند. ) (Hayflflick and Moorhead 1961; Dimri 1995). انباشته شدن سلول‌های پیر، کاهش مرتبط با سن را پیش‌بینی می‌کندبافت/عضوکارکرد. برای دسترسی به راه تاخیر یا معکوس کردن پیری، تلاش برای کشف مواد ضد پیری فعال هرگز متوقف نشده است.اکیناکوزیدیکی از فنیل اتانوئیدهای جدا شده از ساقه استسیستانچ سالسایک داروی گیاهی سنتی چینی که دارای فعالیت های بیولوژیکی بالقوه است، هم به عنوان آنتی سرم و همضد خستگیعامل (دنگ و همکاران 2004؛ Xiong و همکاران 1996). همچنین گزارش شده است که در شرایط آزمایشگاهی به عنوان یک قوی رفتار می کندرایگانافراطیلاشخور(Facino et al. 1995) و نمایشگاهمحافظ عصبیفعالیت هاin vitro و in vivo (کو و همکاران 2005؛ گنگ و همکاران 2007). اکیناکوزید ممکن است کاندیدای یک ماده ضد پیری باشد و فعالیت ضد پیری ممکن است یکی از خواص بیولوژیکی آن باشد. بنابراین، ما یک رده سلولی فیبروبلاستیک ریه جنین انسان پیر شده MRC{4}} را با اکیناکوزید درمان کردیم، انتظار داشتیم که پیری را به تعویق بیاندازد یا معکوس کند.

2. بررسی ها و نتایج

ابتدا اکیناکوزید را به محیط کشت اضافه کردیم تا تأثیر آن بر رشد و چرخه سلولی را بررسی کنیم. مشاهده شد که زنده ماندن سلول‌ها با قرار گرفتن در معرض اکیناکوزید 48 ساعت نسبت به شاهد افزایش پیدا کرد، زیرا غلظت آن افزایش یافت (شکل 1A)، که نشان می‌دهد اکیناکوزید به تکثیر سلول‌های پیر کمک می‌کند. نتایج رنگ‌آمیزی SA-Gal نشان داد که سطح SA-Gal پس از تیمار با اکیناکوزید به وضوح کاهش می‌یابد (داده‌ها نشان داده نشده است) که نشان می‌دهد بخشی از سلول‌های پیر از پیری معکوس شده‌اند. برای تأیید اینکه آیا سلول‌های پیر واقعاً توسط اکیناکوزید تکثیر می‌شوند، سیتومتری دیگر برای بررسی تغییر فاز چرخه سلولی سلول‌های MRC{5}} پیر پس از درمان با اکیناکوزید معرفی شد. در مطالعه ما مشاهده کردیم که با افزایش غلظت اکیناکوزید، نسبت سلول ها در دوره G1 به تدریج کاهش یافت. در مقابل، سلول های بیشتری برای ورود به فاز S و فاز G2 هدایت شدند (شکل 1B). تجمع کانون های هتروکروماتین مرتبط با پیری (SAHF) یکی دیگر از نشانگرهای زیستی خاص سلول های پیر است (شای و رایت 2001). سلول‌های پیر، کانون‌های DNA نقطه‌گذاری شده را نشان می‌دهند که با رنگ‌آمیزی هوخست قابل مشاهده بودند (شکل 1C). در مقابل، سلول‌های MRC{12}} تیمار شده با اکیناکوزید به نظر می‌رسد که SAHF کمتری دارند.

سطح گونه های فعال اکسیژن (ROS) با نزدیک شدن سلول ها به حد Hayflflick افزایش می یابد (Hutter et al. 2002). درمان مداوم سلول ها با سطوح زیر کشنده ROS نه تنها سطح محصولات آسیب اکسیداتیو مانند لیپوفوسسین را افزایش می دهد (Sitte et al. 2001) بلکه باعث توقف دائمی رشد همراه با فعال شدن P{3}}مهار کننده رشد می شود. مسیر (Toussaint et al. 2000). بنابراین، در سطح سلولی، ROS نقش کلیدی در القای پیری دارد. رنگ فلورسنت FL DCFH-DA برای اندازه گیری محتوای ROS با سیتومتری همکار استفاده شد. نشان داده شد که در مقایسه با شاهد، محتویات ROS به وضوح در سلول های انکوبه شده با اکیناکوزید کاهش یافته است (شکل 2A). این نتایج نشان می دهد کهاکیناکوزیدممکن است به عنوان یک آنتی اکسیدان عمل کند، تولید ROS را کاهش دهد یا حذف ROS را تسریع کند.

گونه های اکسیژن فعال انباشته شده (ROS) باعث اختلال قابل توجه ماکرومولکول ها در سلول ها، از جمله پروتئین ها، DNA، و تلومرها می شود (Kovtun et al. 2007). آسیب های اکسیداتیو DNA باعث توقف رشد وابسته به p53-به دنبال بیان p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (چن و همکاران 1998) و پیری سلولی در فیبروبلاست های طبیعی انسان می شود. ما از یک روش دنباله دار برای اندازه گیری آسیب DNA و ترمیم آن استفاده کردیم. اندازه قطعات DNA و تعداد شکست ها، مهاجرت و الگوی دنباله دار دیده شده را تعیین می کند. محتوای DNA دم (محصول طول دم و محتوای DNA دم) با آسیب افزایش می یابد. نتایج ما نشان می‌دهد که پیش تیمار با اکیناکوزید می‌تواند تا حدی باعث ترمیم آسیب DNA شود، حداقل از سلول‌ها در برابر ضایعات DNA ناشی از H2O2 محافظت کند (شکل 2B). بر اساس این واقعیت ها، نتیجه می گیریم که اکیناکوزید حداقل در سلول های MRC{12}} دارای فعالیت ضد پیری است. نتایج مطالعه ما نشان می‌دهد که اکیناکوزید می‌تواند تجمع ROS را کاهش دهد، از سلول‌ها در برابر آسیب DNA محافظت کند، سلول‌های MRC{13}} را از فاز G1 به فازهای S و G2 ارتقا دهد و در نتیجه تکثیر سلول‌ها را بهبود بخشد. به طور کلی، اثرات اکیناکوزید بر سلول‌های MRC{16}} را می‌توان به دو جنبه تقسیم کرد: ترویج تکثیر سلولی و کاهش تجمع ROS. اگرچه مکانیسم دقیق پیری سلولی هنوز ناشناخته است و شبکه تنظیم چرخه سلولی بحث‌برانگیز است، ما نشان داده‌ایم که اکیناکوزید می‌تواند سلول‌ها را از آسیب اکسیداتیو محافظت کند. بنابراین، ما حدس می زنیم کهاکیناکوزیدممکن است کاندیدای خوبی برای تنظیم پیری باشد، حتی اگر مکانیسم زیربنایی دقیق یک سوال باز باقی بماند و مطالعات بیشتر در حال انجام است.

3. تجربی

3.1. کشت و درمان سلولی

رده سلولی فیبروبلاست ریه جنین انسان MRC{{0}} (موسسه بیوشیمی و زیست‌شناسی سلولی، SIBS، CAS) در محیط حداقل ضروری اصلاح‌شده (Gibco/BRL) نگهداری شد و با 10 درصد سرم جنین گاوی تکمیل شد. سلول‌های MRC{2}} پس از عبور سلولی متعدد دچار پیری همانندسازی می‌شوند که با کاهش متابولیسم و ​​توقف تقسیم در عرض 7 روز ارزیابی می‌شود. همه کشت‌ها در تراکم سلولی 104/cm2 کاشته شدند، مگر اینکه غیر از این ذکر شود و اجازه داده شد تا به مدت 7 روز، بدون مزاحمت، تکثیر شوند. غلظت‌های مختلف اکیناکوزید 48 ساعت قبل از آزمایش با حلال به‌عنوان شاهد اضافه شد، مگر اینکه خلاف آن ذکر شود. غلظت DMSO در کشت ها کمتر از 0.3 درصد (v/v) بود. برای تیمار H2O2، سلول ها با 250 مولار H2O2 به مدت 12 ساعت القا شدند.

3.2. سنجش میزان بقا

سلول ها کشت داده شدند و با اکیناکوزید روی صفحات 96 چاهی تیمار شدند. قبل از تشخیص، 10 درصد Alamar BlueTM به محیط اضافه شد و به مدت 4 ساعت انکوبه شد. جذب با اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد.

3.3. آنالیز فلوسیتومتری

فلوسیتومتری برای اندازه گیری محتوای DNA و سطوح ROS داخل سلولی به ترتیب با استفاده از پروپیدیوم یدید و DCFH-DA معرفی شد. سلول‌ها با تراکم 105 سلول در 10 میلی‌لیتر محلول سلولی در ظروف به قطر 100 میلی‌متر کاشته شدند و پس از کاشت سلول به مدت 48 ساعت با اکیناکوزید تکمیل شدند. پس از 48 ساعت تیمار، سلول ها برداشت و پس از سانتریفیوژ در PBS شسته شدند، سپس در محلول PBS با 1/0 درصد RNase و 50 گرم در میلی لیتر یدید پروپیدیوم یا محیط کشت حاوی 10 مولار DCFH-DA به مدت 30 دقیقه مجدداً معلق شدند. سپس محتویات DNA یا ROS با مرتب‌سازی سلولی فعال شده با فلورسانس FL بر روی سیستم فلوسیتومتری بکمن کولتر تعیین شد. داده ها با نرم افزار MultiCycle تجزیه و تحلیل شد.

3.4. رنگ آمیزی هوخست

سلول ها کشت داده شدند و با اکیناکوزید به مدت 48 ساعت در یک صفحه 96 چاهی تیمار شدند. محیط حذف شد، سلول ها با PBS شسته شدند، سپس با فرمالدئید 4 درصد به مدت 20 دقیقه در PBS تثبیت شدند، سپس یک بار شستشو با PBS انجام شد و به مدت 10 دقیقه با رنگ هوخست رنگ آمیزی شدند. تصاویر گرفته شد.

3.5. الکتروفورز ژل تک سلولی (آزمایش دنباله دار)

سنجش دنباله دار طبق گزارش انجام شد (Olive and Banath 2006). تصاویر تک تک دنباله دار با نرم افزار CometScore تجزیه و تحلیل شدند. قدردانی: این کار توسط برنامه ملی تحقیقات پایه (پروژه 973) چین (شماره 2007CB507406)، بنیاد ملی علوم طبیعی چین (شماره 30572341) و صندوق علوم پزشکی Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008) حمایت مالی شد. ).