اکیناکوزید بازسازی میوکارد را معکوس می کند و عملکرد قلب را بهبود می بخشد

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

Yajuan Ni1|جی دنگ1|شین لیو1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|جینگ ون ژانگ2

خلاصه

بازسازی میوکارد یک پایه پاتولوژیک مهم HF است، استرس اکسیداتیو میتوکندری یک محرک هیپرتروفی میوکارد، فیبروز و آپوپتوز است. ECH جزء فعال اصلی یک داروی سنتی چینی Cistanches Herba است، مطالعات زیادی نشان می دهد که دارای ظرفیت آنتی اکسیدانی قوی در سلول های عصبی و تومورها است، استرس اکسیداتیو میتوکندری را مهار می کند، از عملکرد میتوکندری محافظت می کند، اما مکانیسم خاص آن نامشخص است. SIRT1/FOXO3a/MnSOD یک محور آنتی اکسیدانی مهم است، مطالعه نشان می دهد که ECH به صورت کووالانسی به SIRT1 به عنوان یک لیگاند متصل می شود و بیان SIRT1 را در سلول های مغز تنظیم می کند. ما فرض می‌کنیم که ECH ممکن است بازسازی میوکارد را معکوس کند و عملکرد قلب HF را از طریق تنظیم محور سیگنال‌دهی SIRT1/FOXO3a/MnSOD و مهار استرس اکسیداتیو میتوکندری در کاردیومیوسیت‌ها بهبود بخشد. در اینجا، ابتدا یک مدل سلولی استرس اکسیداتیو توسط ISO با سلول‌های AC القا می‌کنیم و با ECH، سطح ROS میتوکندری، آسیب اکسیداتیو mtDNA، MMP، پروتئین کربونیله، پراکسیداسیون لیپیدی، ROS داخل سلولی و آپوپتوز تشخیص داده می شود، اثر ECH در استرس اکسیداتیو میتوکندری و عملکرد در شرایط آزمایشگاهی تایید می شود. سپس، یک مدل موش HF القا شده توسط ISO و پیش درمان با ECH ایجاد می‌کنیم. شاخص های عملکرد قلب، بازسازی میوکارد، استرس اکسیداتیو میتوکندری و عملکرد، بیان محور سیگنالینگ SIRT1/FOXO3a/MnSOD اندازه گیری می شود، داده ها نشان می دهد که ECH عملکرد قلب را بهبود می بخشد، هیپرتروفی میوکارد را مهار می کند، فیبروز و آپوپتوز بیان SIRT1/FOXO3a1/FOX را افزایش می دهد. محور سیگنالینگ MnSOD، آسیب های اکسیداتیو میتوکندری را کاهش می دهد، از عملکرد میتوکندری محافظت می کند. نتیجه می‌گیریم که ECH بازسازی میوکارد را معکوس می‌کند و عملکرد قلب را از طریق تنظیم کردن محور SIRT1/FOXO3a/MnSOD و مهار استرس اکسیداتیو میتوکندری در موش‌های HF بهبود می‌بخشد.

کلمات کلیدی سکیناکوزید، نارسایی قلبی، استرس اکسیداتیو میتوکندری، بازسازی میوکارد

سیستانچ سبزی تازهبهاسترس اکسیداتیو میتوکندری

1|مقدمه

نارسایی قلبی (HF) پیامد نهایی بیشتر بیماری‌های قلبی عروقی با شیوع بالا و پیش‌آگهی ضعیف است و با روند تشدیدکننده پیری جمعیت، بستری شدن در بیمارستان و مرگ و میر ناشی از نارسایی مزمن قلبی (CHF) به شدت در سراسر جهان افزایش یافته است. در طول 20 سال گذشته، درمان های دارویی برای HF پیشرفت زیادی داشته است، اما اثر آن بسیار محدود است، بنابراین داروهای جدید به فوریت مورد نیاز است. بازسازی میوکارد پایه پاتولوژیک مهم HF است و با هیپرتروفی میوکارد، آپوپتوز، فیبروز بینابینی مشخص می شود، سلول های میوکارد به هم ریخته و منجر به کاهش کسر جهشی (LVEF)، افزایش ابعاد انتهای دیاستولی و سیستولیک بطن چپ می شود. (LVIDd و LVIDs)، و کاهش کوتاه شدن کسری بطن چپ (LVFS). در سال‌های اخیر، مطالعات متعددی تایید کرده‌اند که استرس اکسیداتیو عامل مهمی در بازسازی میوکارد است.{4}}

استرس اکسیداتیو شرایطی است که در آن گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) یا رادیکال‌های آزاد بیش از حد تولید می‌شوند و منجر به آسیب اکسیداتیو اجزای سلولی می‌شوند و این به نوبه خود باعث اختلال عملکرد سلولی می‌شود. نشت از زنجیره انتقال الکترون تنفسی و میتوکندری ها حساس ترین موقعیت به اثرات ROS هستند. 9 مطالعات در HF افزایش تولید ROS را از کمپلکس I زنجیره تنفسی شناسایی کردند. به صورت کربونیلاسیون پروتئین ها، پراکسیداسیون لیپیدها و آسیب DNA، 10و اختلال در عملکرد میتوکندری، که در نتیجه منجر به تشکیل بیش از حد ROS می شود، یک دایره باطل را تشکیل می دهد. نشان داده شده است که استرس اکسیداتیو پایدار می تواند باعث هیپرتروفی میوکارد و فیبروز میوکارد شود و از طریق فعال شدن آپوپتوز وابسته به میتوکندری در نتیجه کربونیلاسیون پروتئین های غشای میتوکندری و از دست دادن پتانسیل غشای میوکارد، باعث آپوپتوز سلول های میوکارد شود. در نظر گرفته شده است که مهار استرس اکسیداتیو میتوکندری ممکن است یک استراتژی جدید برای جلوگیری از بازسازی میوکارد و حتی HF باشد.{8}}

اکیناکوزید (ECH)، یک گلیکوزید فنیل اتانوئید طبیعی، جزء فعال اصلی گیاه سیستانچس هربا است که طب سنتی چینی است. در سال های اخیر، ECH به طور گسترده در سیستم عصبی و تومورها مورد مطالعه قرار گرفته است، و گزارش شده است که دارای اثرات دارویی مختلفی مانند خواص آنتی اکسیدانی، ضد التهابی، ضد آپوپتوز و ضد تومور است. سلول های عصبی، ECH به طور قابل توجهی ظرفیت آنتی اکسیدانی را افزایش می دهد، تولید ROS را کاهش می دهد، پتانسیل غشای میتوکندری (MMP) را بهبود می بخشد، و حیات سلولی را افزایش می دهد، 20 اثرات محافظتی بر عملکرد میتوکندری نشان می دهد و استرس اکسیداتیو میتوکندری را مهار می کند، در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت می کند و حافظه را بهبود می بخشد، در نهایت از جلوگیری می کند. نورودژنراسیون. 21،22 ECH همچنین فعالیت SOD را افزایش می دهد و نقش محافظتی در بافت مغز و بافت شبکیه ایفا می کند، 19،23، اما مکانیسم خاصی برای اثر آنتی اکسیدانی آن نامشخص است.

SIRT1 ارتباط نزدیکی با استرس اکسیداتیو دارد و محور سیگنالینگ SIRT1/FOXO3a/MnSOD مهمترین محور آنتی اکسیدانی است و مسئول سرکوب استرس اکسیداتیو میتوکندری است، MnSOD به طور گسترده در میتوکندری ها توزیع می شود و در درجه اول مسئول پاکسازی میتوکوندریال است. مهار استرس اکسیداتیو، ترکیباتی که این محور آنتی اکسیدانی را فعال می کنند، می توانند استرس اکسیداتیو را مهار کنند. مطالعات اخیر نشان داده است که ECH اثرات دارویی خود را از طریق تنظیم مسیرهای سیگنالینگ متعدد، مانند p-AKT، mTOR/STAT3، TGF-beta 1/Smads اعمال می کند. و مسیر سیگنالینگ SIRT1.{10}} یک مطالعه جدید نشان می‌دهد که ECH به‌صورت کووالانسی به SIRT1 به‌عنوان لیگاند متصل می‌شود و بیان SIRT1 را در سلول‌های مغز تنظیم می‌کند.26این نشان می‌دهد که ECH ممکن است استرس اکسیداتیو میتوکندری را در قلب و عروق مهار کند و میوکارد معکوس کند. بازسازی با این حال، تحقیقات در مورد اثرات ECH بر روی سیستم عصبی یا تومور متمرکز شده است، اثرات و مکانیسم های ECH بر استرس اکسیداتیو میتوکندری در قلب و بازسازی میوکارد ناشناخته باقی مانده است. در اینجا، ابتدا مدل سلولی استرس اکسیداتیو را با ISO القا می کنیم و اثر ECH را بر استرس اکسیداتیو میتوکندری و عملکرد در شرایط آزمایشگاهی تایید می کنیم. سپس، ما یک مدل موش HF القا شده توسط ISO ایجاد می‌کنیم و نشان می‌دهیم که ECH بازسازی میوکارد را معکوس می‌کند و عملکرد قلب را از طریق تنظیم کردن محور سیگنالینگ SIRT1/FOXO3a/MnSOD و مهار استرس اکسیداتیو میتوکندری در موش‌های HF بهبود می‌بخشد. نتایج به منظور ارائه شواهد تجربی برای توسعه داروهای جدید برای جلوگیری از نارسایی قلبی است.

2|مواد و روش ها

2.1|کشت و درمان سلولی

سلول های AC16 از مجموعه کشت بنا خریداری می شوند. سلول‌ها در مکمل Eagle اصلاح‌شده Dulbecco با گلوکز بالا (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) با 10 درصد سرم جنین گاوی (10 درصد FBS؛ Gibco) در فلاسک‌های T{3}} (Corning Glassworks, Corning, نیویورک، ایالات متحده آمریکا). شرایط در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب حاوی 5 درصد CO2 حفظ می شود. هنگامی که سلول ها به 70 درصد -80 درصد تلاقی رسیدند، سلول های گروه ISO (سیگما، ایالات متحده آمریکا) با محیطی حاوی 10 میکرومولار ISO (سیگما، ایالات متحده آمریکا) به مدت 24 ساعت انکوبه می شوند، سلول های گروه ECH با 50 میکرومولار ECH (MCE) پیش تیمار می شوند. ، ایالات متحده) برای 30 دقیقه قبل از قرار گرفتن در معرض ISO. سلول های کنترل (Ctrl) هیچ درمان نمی شود.

سیستانچ برای فروشاستخراج کردن

2.2|تشخیص سطح ROS میتوکندری با استفاده از نورتابی شیمیایی لومینول

طبق دستورالعمل سازنده، میتوکندری ها با استفاده از کیت جداسازی میتوکندری (سیگما، ایالات متحده آمریکا) از سلول های AC-16 جدا و خالص می شوند. غلظت پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین BCA (Biotech) تعیین می شود. سطح ROS میتوکندری توسط لومینال (3-آمینوفتالیک هیدرازید 5-آمینو-2،3-دی هیدرو-1،4-فتالازین دیون) با استفاده از کیت الایزا شناسایی می‌شود. (GERMED SCIENTIFIC INC، USA)، با ROS واکنش می دهد و باعث گسیل فوتون ها می شود، که یک طیف باندی است که اوج آن در حدود 460 نانومتر است و واحد نور نسبی (RLU) توسط ابزار اندازه گیری نورتابی شیمیایی تشخیص داده می شود و به RLU/ug تبدیل می شود. پروتئین میتوکندری

2.3|8-OHdG برای ارزیابی آسیب اکسیداتیو DNA میتوکندری استفاده می‌شود

آسیب اکسیداتیو DNA میتوکندری با شناسایی محتوای 8-هیدروکسی-2-دئوکسی گوانوزین (8-OHG) ارزیابی می‌شود. میتوکندری های خالص شده در سلول ها با استفاده از کیت جداسازی میتوکندری مانند بالا (سیگما) جدا می شوند. غلظت پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین BCA (Biotech) تعیین می شود. سپس برای تعیین سطح 8-OHdG با استفاده از کیت Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC، USA) طبق دستورالعمل سازنده جدا می شوند. جذب تغییر رنگ در یک اسپکتروفتومتر در طول موج 450 نانومتر اندازه گیری می شود. سپس غلظت 8-OHdG در نمونه ها با مقایسه OD نمونه ها با منحنی استاندارد تعیین و به ng/ml تبدیل می شود.

2.4|اندازه گیری MMP توسط JC-1

میتوکندری ها جدا شده و از AC{0} خالص می شوند و غلظت پروتئین همانطور که در بالا ذکر شد تعیین می شود. سپس میتوکندری‌ها با غلظت 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر معلق می‌شوند، MMP با استفاده از کیت سنجش JC{2}} طبق دستورالعمل سازنده اندازه‌گیری می‌شود. شدت فلورسانس در طول موج تحریک: 490 نانومتر، شکاف 5 نانومتر، طول موج انتشار: 590 نانومتر، شکاف 5 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود، 30 نتایج به صورت FLU/ugP نشان داده می‌شوند.

2.5|تشخیص سلول های آپوپتوز با فلوسیتومتری در سلول های AC{2}}

فلوسیتومتری برای ارزیابی آپوپتوز سلولی استفاده می شود. کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC/PI (CWBIO، چین) برای تشخیص سلول های آپوپتوز و نکروز طبق دستورالعمل های تامین کننده استفاده می شود. آپوپتوز در مراحل اولیه، آپوپتوز یا نکروز در مراحل پایانی، بقایای سلولی و سلول های زنده به عنوان انکسین V (+)/PI (-)، انکسین V (بعلاوه)/PI (به علاوه)، انکسین V (-)/PI شناسایی می شوند. (+) و انکسین V (-)/PI (-) به ترتیب. شدت فلورسانس با استفاده از فلوسایتومتر (BD FACSVerse™ Flow Cytometer، BD Biosciences، San Jose، CA، USA) تجزیه و تحلیل می شود. هر آزمایش 3 بار تکرار می شود.

2.6|ROS داخل سلولی توسط فلوسایتومتر ارزیابی شد

پس از درمان، سلول ها تریپسین می شوند، دو بار با PBS شسته می شوند. سپس سلول ها در PBS مجدداً معلق می شوند، با DCFH-DA (Beyotime، چین) در غلظت نهایی 1 میکرومولار رنگ آمیزی می شوند و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه در انکوباتور با CO2 انکوبه می شوند و سپس در فلوسیتومتر با تحریک 488 نانومتر آزمایش می شوند. . شدت فلورسانس نشان دهنده سطح ROS داخل سلولی است.

2.7|محتوای پروتئین کربونیل را در میتوکندری سلول های AC-16 آزمایش کنید

پس از درمان، میتوکندری های خالص جدا شده و بر روی یخ فراصوت می شوند و با 1 درصد سولفات استرپتومایسین تیمار می شوند تا اسیدهای نوکلئیک میتوکندری رسوب کنند، غلظت پروتئین تعیین می شود. محتوای پروتئین کربونیل با استفاده از کیت Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC، USA) بر اساس مشتق سازی گروه کربونیل با دینیتروفنیل هیدرازین (DNPH) آزمایش می شود، طبق دستورالعمل کیت، OD توسط دستگاه میکروپلیت خوان اندازه گیری شده و به nmol/ تبدیل می شود. میلی گرم پروتئین با مقایسه با منحنی استاندارد.

2.8|تعیین سطح پراکسیداسیون لیپیدی در میتوکندری سلولهای AC

پس از درمان، سلول‌ها جمع‌آوری و لیز می‌شوند، میتوکندری‌ها جدا و خالص می‌شوند و با سونوگرافی ترک می‌شوند، غلظت پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین BCA (Biotech)، پراکسیداسیون لیپیدی با سطح مالون دی‌آلدئید (MDA) از طریق سنجش TBARS تعیین می‌شود. ، با استفاده از کیت (Nan jing Jian cheng، چین) و سطح MDA طبق پروتکل سازنده اندازه گیری می شود. OD در طول موج 586 نانومتر توسط یک میکروپلیت خوان تشخیص داده می شود و با مقایسه با منحنی استاندارد به میکرومول در گرم پروتئین تبدیل می شود.

2.9|حیوانات و درمان

موش‌های نر جوان Sprague-Dawley با وزن 120-140 گرم از مرکز حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه شیان جیائو تونگ (شانشی، چین) خریداری شده‌اند. این تحقیق مطابق با راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی است که توسط مؤسسه ملی بهداشت ایالات متحده منتشر شده است (نشریه NIH شماره85-23، بازبینی شده در سال 1996)، و پروتکل های آزمایشی توسط مقامات محلی تأیید شده است. کمیته اخلاق زیست پزشکی گروه پزشکی دانشگاه ژیئو تانگ). مدل موش HF همانطور که قبلا توسط ما توضیح داده شد ایجاد شده است. به طور خلاصه، ایزوپروترنول (1{10}} mg/kg) یک بار در روز با تزریق داخل صفاقی به مدت 2 هفته (تعریف شده به عنوان گروه HF)، ECH با 20 تجویز می‌شود. ug/g یک بار در روز با تزریق داخل صفاقی در 30 دقیقه قبل از درمان ISO (تعریف شده به عنوان گروه ECH)، و تجویز به مدت 2 هفته طول می کشد. حیوانات کنترل با 0.9 درصد NaCl (تعریف شده به عنوان گروه Ctrl) تجویز می شوند. اندازه گیری اکوکاردیوگرافی برای ارزیابی عملکرد قلب انجام می شود.

2.10|اندازه گیری اکوکاردیوگرافی

حیوانات با تزریق داخل صفاقی 300 میلی گرم بر کیلوگرم کلرال هیدرات بیهوش می شوند. سیستم اولتراسوند SONOS{1}} با مبدل اولتراسوند 7.5 مگاهرتز (HP، ایالات متحده آمریکا) برای انجام معاینات اکوکاردیوگرافی استفاده می شود. کسر جهشی بطن چپ (LVEF)، کوتاه شدن کسری بطن چپ (LVFS)، ابعاد انتهای دیاستولی بطن چپ (LVIDd)، ابعاد انتهای سیستولیک بطن چپ (LVIDs)، ضربان قلب (HR)، ضخامت سپتوم بین بطنی در دیاستول (IVSTd) ضخامت دیواره خلفی بطن چپ در دیاستول (LVPWTd) همانطور که قبلا توسط ما توضیح داده شد اندازه گیری می شود.

شکل 1 50μmol ECH به طور موثری استرس اکسیداتیو میتوکندریایی سلول‌های AC-16 القا شده توسط ISO 10μmol/L را مهار می‌کند و از عملکرد میتوکندری محافظت می‌کند و آپوپتوز را کاهش می‌دهد.

2.11|نسبت وزن قلب به وزن بدن (HW/BW) اندازه گیری می شود

موش قبل از بیهوشی وزن می‌شود، قلب تازه جدا می‌شود و خون را با 0.1mol/L PBS می‌شوید، عروق و سایر بافت‌های اضافی را جدا می‌کند و قلب وزن می‌شود، سپس HW/BW (mg/100g) محاسبه شد.

2.12|رنگ آمیزی بافت شناسی

قلب موش ها جدا شده و در 4 درصد پارافورمالدئید ثابت شده، در پارافین جاسازی شده و به برش هایی به ضخامت 5 میکرومتر تقسیم می شود. برای مشاهده تغییرات پاتولوژیک از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (HE) و برای ارزیابی فیبرهای کلاژن بافت میوکارد موش از تری کروم ماسون استفاده می شود. کسر حجمی کلاژن قلبی (CVF) و سطح مقطع کاردیومیوسیت ها با Image-Pro Plus 6 اندازه گیری می شود.{7}} (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2.13|رنگ آمیزی TUNEL

بافت میوکارد از بطن چپ جمع آوری می شود و آزمایش TUNEL همانطور که قبلا توسط ما توضیح داده شد انجام می شود.

2.14|میکروسکوپ الکترونی عبوری

بافت قلب تازه در گلوتارآلدئید 2.5 درصد در دمای 4 درجه تثبیت می شود، سپس بافت به حجم 1 میلی متر مکعب برش داده می شود و دوباره در 2.5 درصد گلوتارآلدئید در دمای 4 درجه به مدت 2 ساعت ثابت می شود، سپس با 0}}}.1mol/L PBS شسته می شود، ثابت می شود. در اسید اسمیک 1 درصد، آبگیری با استون، جاسازی شده با رزین اپوکسی، برش های فوق نازک با نازکی حدود 8 نانومتر ساخته می شود، با اورانیل استات و سیترات سرب رنگ آمیزی می شود و سپس در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده می شود (H{ {13}}، هیتاچی محدود، ژاپن). برای تعیین کمیت اثر محافظتی ECH در مورفولوژی میتوکندری، میانگین محیط میتوکندری، میانگین سطح مقطع میتوکندری، درصد انحطاط و درصد واکوئل شدن در میتوکندری به صورت آماری با Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics، ایالات متحده آمریکا) تجزیه و تحلیل شدند.

2.15|PCR کمی

RNA کل از بافت بطن چپ با معرف تریزول (Invitrogen، Carlsbad، ایالات متحده آمریکا) تهیه می شود. cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته 1st TUREscript (تاکارا، ژاپن) سنتز می شود. توالی پرایمر خاصی از کلاژن که من برای PCR بلادرنگ استفاده کردم به شرح زیر است: فوروارد: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′، معکوس: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH فوروارد 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3'، معکوس 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. PCR کمی در زمان واقعی (qPCR) با SYBRPremix Ex انجام می شود Taq (زمان واقعی کامل) (Takara، ژاپن). سطح نسبی mRNA طبق روش 2-ΔΔCT با نرمال کردن به GAPDH محاسبه می‌شود.

2.16|تجزیه و تحلیل وسترن بلات بیان پروتئین SIRT1، FOXO3a، MnSOD

کل پروتئین بافت بطن چپ با استفاده از بافر سرد RIPA (BioRad، ایالات متحده آمریکا) با کوکتل مهارکننده پروتئاز (Sigma-Aldrich) روی یخ استخراج می‌شود. غلظت با روش BCA تعیین می شود. مراحل وسترن بلات قبلاً شرح داده شده است. به طور خلاصه، نمونه پروتئین بر روی ژل های 15 درصد سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید تکه تکه می شود، به غشاهای PVDF (BioRad، ایالات متحده آمریکا) منتقل می شود، توسط 5 درصد شیر بدون چربی مسدود می شود، و با آنتی بادی MYH از موش انکوبه می شود. (رقیق شده 1:200، سانتا کروز، ایالات متحده). سپس، با آنتی بادی موش بز کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی (رقیق 1:2،{10}}، سانتا کروز، ایالات متحده آمریکا) انکوبه شد. سطح نسبی پروتئین با نرمال کردن مقدار متوسط ​​پرتو به -اکتین محاسبه می شود. نوارهای پروتئینی توسط یک سیستم نورتابی شیمیایی (ChemiDoc XRS، BioRad) شناسایی می شوند.

2.17|اندازه گیری استرس اکسیداتیو میتوکندری در میوکارد موش صحرایی

میتوکندری های خالص شده از میوکارد موش صحرایی با استفاده از کیت جداسازی میتوکندری (سیگما، ایالات متحده آمریکا) طبق دستورالعمل سازنده جدا می شوند، ROS میتوکندری، MMP، آسیب اکسیداتیو mtDNA، محتوای پروتئین کربونیله و سطح پراکسیداسیون لیپید در میتوکندری همگی با استفاده از روش های مشابه شناسایی می شوند. آزمایشات سلولی که در بالا توضیح داده شد. نکته قابل توجه، ROS در بافت میوکارد با پروب های فلورسنت DCFH-DA تشخیص داده می شود، شدت فلورسانس با ابزار اندازه گیری برچسب آنزیم تشخیص داده می شود، نتایج به عنوان پروتئین میتوکندری RLU/ug نشان داده می شود.

2.18|تحلیل آماری

همه داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. از آنالیز واریانس یک طرفه برای مقایسه تفاوت‌ها در بین گروه‌های مختلف استفاده می‌شود و پس از آن از آزمون تعقیبی Tukey برای معنی‌داری استفاده می‌شود. همه آمارها با استفاده از نرم افزار SPSS15 تعیین می شوند.{2}} (SPSS Inc, IL, USA). مقدار احتمال P <.05 معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" می="">

3|نتایج

3.1|50 میکرومولار ECH به طور موثر آسیب اکسیداتیو میتوکندری و آپوپتوز را در سلول‌های AC مهار می‌کند.

سلول های درمان نشده به عنوان یک گروه Ctrl تنظیم می شوند. در مرحله اول، همانطور که شکل 1A نشان می دهد، ECH ROS میتوکندری ناشی از ISO را مهار می کند. سلول های تحت تیمار ISO افزایش قابل توجهی در ROS میتوکندری در مقایسه با Ctrl نشان می دهند و این افزایش به طور قابل توجهی با پیش تیمار با 50 میکرومولار ECH کاهش می یابد. در مرحله دوم، ECH می تواند آسیب اکسیداتیو mtDNA ناشی از ISO را مهار کند. 8- اعتقاد بر این است که OHdG یکی از فراوان‌ترین ضایعات DNA ناشی از استرس اکسیداتیو است و نشانگر زیستی آسیب و ترمیم DNA اکسیداتیو است. همانطور که شکل 1B نشان می دهد، محتوای 8-OHdG در میتوکندری های خالص شده از سلول های AC-16 شناسایی شده است، نتایج نشان می دهد که سطح 8-OHdG در میتوکندری از سلول های تحت تیمار ISO به طور چشمگیری افزایش یافته است. اما تغییر توسط 50 میکرومولار ECH معکوس شد. ثالثاً، ECH برای محافظت از MMP، که توسط ISO مختل می شود، موثر است. شدت فلورسانس در سلول های تیمار شده با ISO در مقایسه با سلول های Ctrl به طور قابل توجهی کاهش می یابد، در حالی که پیش تیمار با 50 میکرومولار ECH به طور قابل ملاحظه ای کاهش MMP را کاهش می دهد، همانطور که شکل 1C نشان می دهد. چهارم، ECH از آسیب اکسیداتیو پروتئین میتوکندری در سلول‌های AC محافظت می‌کند. همانطور که شکل 1D نشان می دهد، محتوای پروتئین کربونیل در میتوکندری سلول های تصفیه ISO به طور قابل توجهی افزایش یافته و ECH اثر را کاهش می دهد. پنجم، ECH همچنین پراکسیداسیون لیپیدی میتوکندری را در سلول‌های AC{14}} القا شده توسط ISO مهار می‌کند. همانطور که شکل 1E نشان می دهد، سطح پراکسیدهای لیپیدی در میتوکندری سلول های ISO به وضوح بالاتر از سلول های Ctrl است، در حالی که این افزایش به طور قابل توجهی با 50 میکرومولار ECH پیش تیمار کاهش می یابد. در نهایت، ECH از تجمع ROS داخل سلولی جلوگیری می کند. همانطور که شکل 1F نشان می دهد، سطح ROS داخل سلولی در سلول های ISO به طور قابل توجهی افزایش یافته و در سلول های پیش تیمار شده با ECH به طور قابل توجهی کاهش می یابد. شکل 1G نشان می‌دهد که میزان آپوپتوز سلول‌های AC در مقایسه با سلول‌های Ctrl، پس از انکوباسیون 24 ساعته با ISO 10 به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است، در حالی که سلول‌های قبل از درمان با 50 میکرومولار ECH به طور قابل‌توجهی آپوپتوز ناشی از ISO را کاهش می‌دهند.

شکل 2 هیپرتروفی قلبی موش های HF ناشی از ISO تسکین یافته و عملکرد قلب به طور قابل توجهی با درمان ECH بهبود می یابد.

3.2|ECH بازسازی میوکارد را معکوس می کند و عملکرد قلبی موش های HF القا شده با ISO را بهبود می بخشد.

همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است، قلب در موش های HF هیپرتروفی آشکار است و با درمان با ECH معکوس می شود. همانطور که شکل های 2B-D و L نشان می دهند، ECH HW/BW را کاهش می دهد. نتایج اکوکاردیوگرافی نشان می دهد که LVEF و LVFS در گروه HF به طور قابل توجهی کاهش می یابد، LVIDd، LVIDs و IVSTd به طور قابل توجهی در گروه HF افزایش می یابد. با این حال، ECH به طور قابل توجهی LVIDd، LVIDs، IVSTd را کاهش می دهد و LVEF و LVFS را بهبود می بخشد، تفاوت معنی داری در HR در بین سه گروه وجود ندارد، LVPWTd در HF افزایش می یابد، اما تفاوتی بین ECH و Ctrl یا بین ECH و HF وجود ندارد، همه به عنوان شکل 2E-K نشان می دهد. نتایج رنگ آمیزی HE نشان می دهد که هیپرتروفی میوکارد، اختلال مرتب یا نکروز دژنراسیون، انفیلتراسیون سلول های التهابی و پرخونی و ادم بینابینی در موش های صحرایی HF، و ECH به طور قابل توجهی این آسیب ها را کاهش می دهد، هیپرتروفی میوکارد و اختلال ترتیب داده شده را تسکین می دهد. همانطور که در شکل 3A نشان داده شده است، نکروز دژنراسیون و ارتشاح التهابی کاهش می یابد. همانطور که شکل 3E نشان می دهد، سطح مقطع کاردیومیوسیت اندازه گیری می شود، پس از ISO به طور قابل توجهی افزایش می یابد و در گروه تحت درمان با ECH کاهش می یابد. ارزیابی رسوب کلاژن توسط رنگ‌آمیزی ماسون نشان می‌دهد که محتوای کلاژن بطن چپ در موش‌های HF به وضوح افزایش یافته و ظاهراً پس از درمان با ECH کاهش می‌یابد، که به وضوح CVF را کاهش می‌دهد. آنالیز بلادرنگ PCR نشان می‌دهد که رونوشت‌های نوع پروکلاژن Ⅰ در موش‌های ISO تنظیم شده و در موش‌های ECH کاهش می‌یابد، این نتایج با یکدیگر سازگار هستند، همانطور که شکل‌های 3B و FG نشان می‌دهند، داده‌ها نشان می‌دهند که ECH رسوب کلاژن را به طور موثر کاهش می‌دهد. . تعداد سلول های TUNEL مثبت در کاردیومیوسیت ها در موش های HF در مقایسه با Ctrl به طور قابل توجهی افزایش یافته است، ECH به طور قابل توجهی آپوپتوز سلول های میوکارد را کاهش می دهد، و شکل 3C-D تصویر نماینده سلول های TUNEL مثبت را به ترتیب در میدان های کم و زیاد نشان می دهد، و شکل 3H میزان آپوپتوز سلول های میوکارد را نشان می دهد. این نتایج نشان می دهد که ECH به طور موثر هیپرتروفی میوکارد، فیبروز بینابینی میوکارد و آپوپتوز را معکوس می کند و عملکرد قلب را در موش های HF ناشی از ISO بهبود می بخشد.

شکل 3 نتایج رنگ آمیزی بافت شناسی نشان می دهد که ECH بازسازی بطن چپ موش های HF القا شده توسط ISO را معکوس می کند.

3.3|ECH از فراساختار میوکارد در موش های HF محافظت می کند

نتایج میکروگراف های الکترونی عبوری نشان می دهد که آسیب به فراساختار میوکارد می تواند توسط ECH کاهش یابد، همانطور که شکل 4A-B نشان می دهد. میوفیبریل ها دارای آرایش عمودی هستند، ساختار سارکومر مشخص است، میوفیلامان ها به طور مرتب چیده شده اند و خط Z مشخص است. میتوکندری ها مرتب چیده شده اند و ساختار آن در موش های Ctrl واضح است. با این حال، میوفیبریل‌ها به هم ریخته، پاره شده و حل می‌شوند، ساختار سارکومر مبهم است، خط Z وجود ندارد، ناحیه انقباض میوکارد قابل مشاهده است، تعداد و حجم میتوکندری‌ها افزایش می‌یابد، میتوکندری‌ها اشکال و اندازه‌های متفاوتی دارند و به‌صورت بی‌نظم مرتب شده‌اند. ساختار نامشخص است، تورم و تکه تکه شدن کریستا، فروپاشی یا جمع شدن و حل شدن به واکوئل در موش‌های HF. ECH بدیهی است که این تغییرات را کاهش می دهد، اکثر رشته های عضلانی قلب به طور منظم چیده شده اند و رشته های میوکارد واضح هستند، خط Z وجود دارد، اگرچه مقداری انحلال رشته ها آشکار است، ساختار سارکومر واضح است، تراکم میتوکندری کاهش یافته است، شکل ها و اندازه‌ها کاهش می‌یابند، منظم‌تر چیده می‌شوند، تورم میتوکندری و تکه تکه شدن کریستا، فروپاشی یا کلوخه شدن، و واکوئل شدن آشکارا توسط ECH در مقایسه با HF کاهش می‌یابد. تورم میتوکندری و تکه تکه شدن کریستا، فروپاشی یا جمع شدن و واکوئل شدن جزئی به عنوان دژنراسیون میتوکندری شناخته می شود. نتایج نشان می دهد که ECH به طور موثر از فراساختار میوکارد محافظت می کند، و به ویژه از مورفولوژی میتوکندری در موش های HF محافظت می کند، همانطور که شکل 4C-F نشان می دهد.

شکل 4 ECH از فراساختار کاردیومیوسیت ها و مورفولوژی میتوکندری موش های HF القا شده توسط ISO محافظت می کند.

3.4|ECH بیان پروتئین SIRT1، FOXO3a و MnSOD را افزایش می دهد

تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان می دهد که سطح بیان پروتئین SIRT1، FOXO3a و MnSOD به طور قابل توجهی در موش های HF کاهش می یابد، با این حال، ECH به وضوح بیان پروتئین کاهش یافته را تنظیم می کند. نوارهای پروتئینی نماینده ایمونوبلات و نتایج آنالیز آماری در شکل 5 نشان داده شده است. بخشی از داده ها نشان می دهد که ECH بیان پروتئین SIRT1، FOXO3a و MnSOD را افزایش می دهد.

3.5|ECH استرس اکسیداتیو میتوکندری را در بافت میوکارد بطن چپ مهار می کند

در این بخش، ROS، MMP میتوکندری، آسیب اکسیداتیو DNA میتوکندری، محتوای پروتئین کربونیل و سطح پراکسیداسیون لیپیدی در میتوکندری در بافت میوکارد بطن چپ موش صحرایی اندازه‌گیری می‌شود و نتایج با آزمایش‌های سلولی مطابقت دارد. همانطور که شکل 6 نشان می دهد ECH ROS میتوکندری را کاهش می دهد، از MMP محافظت می کند، درجه آسیب mtDNA را کاهش می دهد، محتوای پروتئین کربونیل و پراکسیداسیون لیپیدی را در میتوکندری کاهش می دهد.

شکل 5 ECH سطح بیان پروتئین SIRT1، FOXO3a و MnSOD را تنظیم می کند که در موش های HF کاهش می یابد.

4|بحث

این مطالعه نشان می دهد که ECH نقش موثری در پیشگیری از بازسازی میوکارد و بهبود عملکرد قلب از طریق تنظیم کردن محور سیگنالینگ SIRT1/FOXO3a/MnSOD و مهار استرس اکسیداتیو میتوکندری ایفا می کند.

میتوکندری ها محل اصلی تولید ROS به عنوان محصول جانبی فسفوریلاسیون اکسیداتیو هستند، به دلیل نزدیکی به ROS، پروتئین های میتوکندری، لیپیدها و mtDNA هدف اولیه آسیب اکسیداتیو پس از انتشار بیش از حد ROS میتوکندریایی هستند،34،35 این آسیب تولید بیشتر ROS را تحریک می کند، دایره باطل ادامه می یابد، ROS و استرس اکسیداتیو می تواند منجر به هیپرتروفی میوکارد، آپوپتوز، فیبروز بینابینی و HF از طریق فعال سازی مسیرهای سیگنالینگ متعدد شود. استرس برای جلوگیری از بازسازی میوکارد موثر است. ECH یک گلیکوزید فنیل اتانوئید طبیعی است که جزء گیاه سنتی چینی Cistanche tubulosa است. به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته و در سال های اخیر ثابت شده است که دارای انواع فعالیت های دارویی مانند ضد تومور، ضد آپوپتوز، ضد پیری، عملکرد محافظت کننده عصبی و غیره است. مطالعات ثابت کرده اند که اثرات دارویی ECH عمدتاً به خاصیت آنتی اکسیدانی و فعالیت ضد التهابی آن بستگی دارد، 18،21 و ECH ROS میتوکندری را کاهش می دهد و از عملکرد میتوکندری در برابر آسیب اکسیداتیو در سلول های عصبی محافظت می کند. 20،22 در اینجا، ابتدا نشان دادیم که ECH ROS میتوکندری کاردیومیوسیت ها را کاهش می دهد، از این رو، MMP را بهبود می بخشد، آسیب اکسیداتیو mtDNA، پروتئین و لیپیدها را کاهش می دهد، به طور موثری آسیب اکسیداتیو میتوکندری را مهار می کند و آپوپتوز را در شرایط in vitro و in vivo کاهش می دهد، بنابراین، بازسازی میوکارد را معکوس می کند و عملکرد قلب را بهبود می بخشد. این بدان معنی است که ECH یک داروی جدید بالقوه برای پیشگیری از بازسازی میوکارد و HF است.

در شرایط عادی، ROS میتوکندری عمدتاً توسط MnSOD پاک می شود که در میتوکندری پخش می شود و از آسیب اکسیداتیو میتوکندری محافظت می کند. Ang II به طور قابل توجهی بیان MnSOD قلب را کاهش می دهد و باعث هیپرتروفی میوکارد می شود، با این حال، رسوراترول می تواند بیان MnSOD را افزایش دهد و هیپرتروفی میوکارد ناشی از Ang II را مهار کند.36 در HF، فعالیت MnSOD به طور قابل توجهی کاهش می یابد و تولید ROS میتوکندری می شود 0.37،38 در موش‌های ناک اوت ژن MnSOD اختصاصی قلب، ROS میتوکندری نمی‌تواند پاک شود و ROS در قلب افزایش می‌یابد، که منجر به اختلال عملکرد میتوکندری و بزرگ شدن پیشرونده قلب می‌شود که در نهایت منجر به نارسایی قلبی می‌شود. که بیان MnSOD به طور قابل توجهی کاهش می یابد، که با درمان ECH کاهش می یابد، و بنابراین، ROS میتوکندری کاهش می یابد و استرس اکسیداتیو میتوکندری مهار می شود. این بدان معنی است که ECH از طریق تنظیم افزایش بیان MnSOD از قلب در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت می کند، ما مکانیسم های مولکولی زیربنایی این اثرات را بیشتر بررسی می کنیم.

بیان MnSOD توسط FOXO3a تنظیم می شود که یک فاکتور رونویسی است و در ناحیه پروموتر ژن MnSOD متصل می شود و منجر به ترویج رونویسی ژن می شود. محور سیگنالینگ SIRT1/FOXO3a/MnSOD نقش اساسی در محافظت در برابر استرس اکسیداتیو در انواع سلول ایفا می کند، فعال شدن محور سیگنالینگ توسط استرادیول استرس اکسیداتیو را مهار می کند و محافظت قلبی را اعمال می کند. فعال‌سازی محور سیگنال‌دهی توسط رسوراترول، مرگ سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو را مهار می‌کند. در غیر این صورت، آنژیوتانسین II مسیر SIRT1/FoxO3a/MnSOD را مهار می‌کند و استرس اکسیداتیو میتوکندری، آسیب mtDNA در استئوبلاست‌ها را القا می‌کند، آدنیلیل سیکلاز نوع 5 با مهار بیان MnSOD از طریق Sirt1/Fox، استرس اکسیداتیو را افزایش می‌دهد. بیان SIRT1، FoxO3a و MnSOD همگی به طور قابل توجهی در موش‌های HF کاهش می‌یابند و ROS میتوکندری بالا می‌رود و استرس اکسیداتیو افزایش می‌یابد، با این حال، تغییرات توسط ECH معکوس می‌شوند. تحقیقات جدید نشان می دهد که ECH به طور مستقیم به SIRT1 به عنوان یک لیگاند متصل می شود و یک کمپلکس با 9 پیوند کووالانسی تشکیل می دهد و بیان SIRT1 را در سلول های عصبی تنظیم می کند. SIRT1 در کاردیومیوسیت ها، سپس بیان ژن MnSOD را از طریق FoxO3a تنظیم می کند و ROS میتوکندری و استرس اکسیداتیو را مهار می کند.

ایسکمی مزمن طولانی مدت می تواند باعث خواب زمستانی میوکارد شود، این سلول های میوکارد در خواب زمستانی معمولاً رشته های انقباضی را از دست می دهند، گرانول های گلیکوژن اضافی در سیتوزول وجود دارد، شبکه سارکوپلاسمی و لوله های عرضی از بین می روند، همچنین ناهنجاری هایی در اندازه و شکل میتوکندری وجود دارد. ، هیپرتروفی واکنشی میوکارد و فیبروز بینابینی، که ثانویه به از دست دادن میوسیت است. ما همچنین تغییرات فوق را در موش های HF در مطالعه خود مشاهده کردیم، در حالی که ECH به طور قابل توجهی این تغییرات را تسکین می دهد، زیرا آخرین مطالعه بهبود عملکرد قلب را پس از استرس ایسکمیک گزارش کرده است. ویژگی خواب زمستانی میوکارد، 45 سطح گلیکوژن میوکارد نیز اندازه گیری می شود، نتایج نشان می دهد که تفاوت معنی داری بین سه گروه وجود ندارد، همانطور که در شکل 7J نشان داده شده است.

مطالعه قبلی همچنین خواب زمستانی میوکارد را در یک مدل خوک نارسایی قلبی غیر ایسکمیک با قدم زدن دیواره آزاد LV با فرکانس بالا تشخیص داد، زیرا انسداد میکروواسکولار نقش مهمی در خواب زمستانی میوکارد و اختلال انقباضی ناشی از آن ایفا می کند و زمانی که به طور قابل توجهی بهبود می یابد. انسداد میکروواسکولار توسط یک دارو معکوس می شود.47 در حال حاضر، برخی از مطالعات به این نتیجه رسیده اند که درمان عروقی مجدد در خواب زمستانی میوکارد موثر است. توسط ECH، همانطور که در شکل 7A-H نشان داده شده است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که سایر ترکیبات طبیعی مانند بتا گلوکان جو با افزایش بیان MnSOD، 48،49، اثرات محافظتی قلبی دارند و افزایش MnSOD با افزایش تراکم مویرگ‌های میوکارد و بیان VEGF مرتبط است. ما RT-PCR را برای تشخیص بیان VEGF انجام دادیم، داده‌ها با یافته‌های رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی مطابقت دارند، به این معنی که ECH ممکن است باعث افزایش رگ‌زایی و افزایش تراکم مویرگ‌های میوکارد از طریق تنظیم بیان VEGF شود، همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است. مطالعه حاضر نشان می‌دهد که ECH می‌تواند از طریق تنظیم کننده مسیر SIRTI/FOXO3a/MnSOD و بیان VEGF از مویرگی و شریان‌های میوکارد محافظت و افزایش دهد، در نتیجه میوکارد خواب زمستانی را سرکوب کرده و به بهبود عملکرد قلب کمک می‌کند.

سیستانچ کمک می کندبهبهبود عملکرد قلب.

برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید.

توجه داشته باشید، آپوپتوز کاردیومیوسیت به خوبی شناخته شده است که یک تغییر پاتولوژیک مهم در نارسایی قلبی است، و مطالعه حاضر در واقع تایید می کند که مقدار زیادی از سلول های آپوپتوز در موش های صحرایی HF و ECH به طور قابل توجهی آپوپتوز را از طریق تنظیم مسیر SIRTI/FOXO3a/MnSOD و مهار آن کاهش می دهد. استرس اکسیداتیو میتوکندری، همانطور که در بالا ذکر شد.

مهمتر از همه، ECH بازسازی میوکارد را معکوس می‌کند و عملکرد قلب را از طریق تنظیم کردن محور سیگنالینگ SIRT1/FoxO3a/MnSOD بهبود می‌بخشد، بنابراین استرس اکسیداتیو میتوکندری را مهار می‌کند و میوکارد خواب زمستانی را کاهش می‌دهد. بنابراین، پیشنهاد می شود که ECH یک داروی بالقوه برای پیشگیری یا درمان بازسازی میوکارد و HF است.