اثر Tanshinone IIA بر پاسخ التهابی ناشی از LPS به روش وابسته به التهاب ROS-NLRP3 در سلول های RAW264.7

برای اطلاعات بیشتر:emily.li@wecistanche.com

نکات برجسته

Tan IIA می تواند پاسخ التهابی و بیان NLRP3 تحریک شده توسط LPS یا LPS به اضافه ATP را مهار کند. استیل سیستئین (N-acetyl-l-cysteine، NAC)، یک مهارکننده ROS، می تواند LPS به علاوه افزایش ATP ناشی از سطح NLRP3 را مهار کند. مکانیسم زیربنایی اثرات Tan IIA ممکن است شامل تنظیم مسیر ROS-NF-kB/P{8}}NLRP3 باشد. این مطالعه بیشتر مکانیسم مولکولی Tan IIA را مشخص کرد و افکار جدیدی را برای درمان بالینی آن ارائه کرد.

خلاصه

شواهد در حال ظهور نشان داده اند که Tanshinone IIA (Tan IIA) از آسیب قلب، فیبروبلاست های قلبی و تصلب شرایین جلوگیری می کند. با این حال، مکانیسم مولکولی زیربنای اثرات Tan lA هنوز نامشخص است. بررسی نقش Tan ll A در پاسخ التهابی به روش وابسته به التهاب ROS-NLRP3. سلول های RAW264.7 تحریک شده با LPS برای تولید مدل سلولی پاسخ التهابی انتخاب شدند. نتایج ما نشان داد که تولید NO به طور قابل توجهی پس از تحریک توسط LPS افزایش یافت. و Tan IIA تیمار شده به طور قابل توجهی سطح NO را کاهش داد. بیان mRNA NLRP3. IL{6}}B و TNF-a به طور قابل توجهی توسط Tan LLA در مقایسه با سلول های تیمار شده با LPS مهار شدند. بیان پروتئین NLRP3. IKBa، pp65/p65، و pp38/p38 در مقایسه با گروه‌های تحریک‌شده با LPS یا LPS به‌علاوه ATP، به‌طور مؤثر توسط Tan IIA کاهش یافتند. در همین حال. قهوهای مایل به زرد IA به طور قابل توجهی سطح ROS ناشی از LPS به علاوه ATP را مهار کرد. و NAC، یک مهار کننده ROS، همچنین می تواند بیان پروتئین NLRP3 را مهار کند. بر اساس این یافته ها می توان حدس زد که مکانیسم زیربنایی اثر Tan IIA ممکن است شامل تنظیم مسیر ROS-NF-kB/P{16}}NLRP3 باشد. این مطالعه بیشتر مکانیسم مولکولی Tan IA را مشخص کرد و افکار جدیدی را برای درمان بالینی آن ارائه کرد.

کلمات کلیدی: Tanshinone IIA،التهاب، NLRP3 التهابی، ROS

مزایای محصولات سیستانچ

زمینه

ماکروفاژها نقش مهمی در حفظ هموستاز قلبی و تنظیم ترمیم بافت و همچنین بازسازی دارند. که درقلبشکستدر بیماران، افزایش سیتوکین های پیش التهابی سرم فرض می شود که نشانگرهای زیستی پیش بینی کننده پیامدهای بالینی بدتر هستند، والتهابممکن است به پیشرفت نارسایی قلبی کمک کند [1]. اگر چهالتهاببه عنوان یک هدف درمانی برای درمان بیماری‌های قلبی عروقی ظاهر شده است، با این حال، به نظر می‌رسد که سرکوب گسترده سیستم ایمنی در بهبود نتایج بالینی چه پس از انفارکتوس میوکارد (MI) و چه در نارسایی قلبی شکست خورده است [2،3].

چندین مطالعه بالینی نشان داده اند که مهار یکالتهابیمسیر، مانندالتهابیسیتوکین، IL{0}}، می‌تواند به طور موثری حوادث قلبی عروقی مکرر را کاهش دهد [4، 5]. می توان حدس زد که تعدیل ایمنی پاسخ التهابی اهمیت تشخیصی و درمانی مهمی در روند بیماری های قلبی عروقی دارد.

NLRP3 inflammasome گسترده ترین مورد مطالعه در بین انواع التهاب است. مستند شده است که التهاب NLRP3 نقش مهمی در بسیاری از بیماری ها از جمله MS، بیماری آلزایمر، تصلب شرایین، چاقی و دیابت نوع 2 دارد [6] و شواهد بیشتر و بیشتر نشان می دهد که NLRP3 التهاب همچنین در آسیب ایسکمی میوکارد/آسیب خونرسانی مجدد (MI/RI) نقش دارد [7،8]. مکانیسم‌های فعال‌سازی NLRP3 ممکن است شامل تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، جریان پتاسیم و آزادسازی کاتپسین‌ها به داخل سیتوزول پس از بی‌ثباتی لیزوزومی باشد. وقتی سلول‌ها توسط پاتوژن‌ها یا سیگنال‌های خطر تحریک می‌شدند، NLRP3 فعال می‌شد و پروکاسپاز{10}} را از طریق پروتئین آداپتور ASC به‌کار می‌برد. NLRP3. ASC و پروکاسپاز{13}} مجموعه مجتمع التهابی NLRP3 را ساخته اند. تحت عمل NLRP3 التهابی، پروکاسپاز{17}} فعال شد تا کاسپاز شود-1 که در نهایت منجر به ترشح IL-1 و IL-18 شد و باعث ایجاد مجموعه ای از واکنش های التهابی [9،10].

Tan IIA یک ترکیب محلول در لیپوماتیک Danshen (Sahia miltiorrhiza Bge) است که دارای خواص بیولوژیکی مختلفی است و در یک سری واکنش های بیوشیمیایی شرکت می کند. قهوهای مایل به زرد IA داردضد-التهابی, آنتی اکسیدانو اثر رگ زایی را ترویج می کند، و همچنین به طور گسترده برای درمان بیماری سیستم قلبی عروقی استفاده شده است [1، 12]. شواهد در حال ظهور نشان داده اند که Tan IIA از آسیب قلب، فیبروبلاست های قلبی، تصلب شرایین والتهاب عصبی[13-16]. با این حال، مکانیسم مولکولی زیربنای اثرات Tan IIA هنوز نامشخص است.

در طول آسیب ایسکمی / خونرسانی مجدد، مونوسیت / ماکروفاژ، نوتروفیل ها و سلول های اندوتلیال شروع به کار می کنند.التهابیپاسخ، القای انتشار انواعالتهابیسیتوکین ها و در نتیجه افزایش نفوذپذیری عروقی، ادم بافتی و آسیب. ماکروفاژ یک نوع سلول تنظیم کننده التهابی مهم در میان همه استالتهابیگونه های سلولی و نقش مهمی در روند انفارکتوس میوکارد دارد [17]. مونوسیت/ماکروفاژ به کار گرفته شده در میوکارد آسیب دیده می تواند ROS، واسطه های التهابی و پروتئازهایی را آزاد کند که آسیب میوکارد را تشدید می کند [18].

به این دلیل که ماکروفاژها نقش مهمی در حفظ هموستاز قلبی و تنظیم ترمیم بافت دارند، ما سلول‌های RAW264.7 تحریک شده با LPS را برای تولید یک مدل سلولی از پاسخ التهابی به کار گرفتیم. مطالعه حاضر بررسی کرد که آیا Tan IIA بر ماکروفاژهای تحریک‌شده با LPS و مکانیسم‌های زیربنایی اثرات Tan ⅡA بر ماکروفاژها به روشی وابسته به التهاب ROS-NLRP3 تأثیر دارد یا خیر.

مواد و روش ها

کشت و درمان سلولی

سلول RAW264.7 از مرکز کشت سلولی آکادمی علوم پزشکی چین (پکن، چین) خریداری شد. سلول ها در محیط DMEM (گلوکز بالا)، 1{11}} درصد سرم جنین گاو (FBS)، 1{14}}0 U/ml پنی سیلین و 100 ug/mL استرپتومایسین اضافه شدند. سلول ها در دمای 37 درجه در اتمسفر کاملاً مرطوب با 5 درصد CO2 کشت داده شدند. برای همه آزمایش‌ها، سلول‌ها در 80-90 درصد تلاقی سلولی تیمار شدند. سلول ها با غلظت های مختلف Tan IIA (در 10،1 و 0.1 میکرومولار) برای زمان های مختلف، با یا بدون 1 ug/mL LPS تیمار شدند. در همین حال، سلول های گروه کنترل با حجم مساوی 0.1 درصد DMSO تیمار شدند.

اندازه گیری تولید NO

NO Assay Kit (Beyotime، چین) برای اندازه گیری تولید NO طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، استانداردها با DMEM به اضافه 10 درصد FBS رقیق شدند و 50 میکرولیتر استاندارد رویی کشت سلولی به هر چاهک صفحه چاهک اضافه شد. سپس 50 uL از معرف Griess I و II به هر چاه صفحه پیپت شد و چگالی نوری (OD) توسط میکروپلیت خوان چند حالته Varioskan LUX در 540 نانومتر شناسایی شد.

استخراج RNA

سلول‌های RAW264.7 با تراکم 1×1{14}}6 سلول در چاهک با 10 درصد FBS DMEM در صفحات شش چاهی کاشته شدند. 24 ساعت بعد، محیط خارج شد و به جای آن با محیط DMEM عاری از سرم و آنتی بیوتیک اضافه شد. سلول‌های RAW264.7 با DMSO (شاهد)، LPS (1 ug/mL) و LPS به علاوه Tan IIA (10،1، و 0.1uM به مدت 6 ساعت تیمار شدند. سپس RNA کل استخراج شد تا سطح mRNA NLRP3، IL{ {18}} و TNF-. RNA کل با استفاده از معرف TRIZol (Ambion) استخراج شد. RNA با غلظت Va یک اسپکتروفتومتر اولترامیکروفلورسانس (DeNovix) اندازه‌گیری شد. کیت سنتز cDNA HiFiScript (cwbiotech) برای رونویسی معکوس استفاده شد. دستورالعمل سازنده 1 میکروگرم نمونه RNA رونویسی معکوس شد و مراحل واکنش به شرح زیر بود: 42 درجه سانتیگراد برای 50 دقیقه، 85 درجه سانتیگراد برای 5 دقیقه، و سپس در دمای 4 درجه نگهداری شد.

RT-PCR

سنجش Ouantitative PCR (OPCR) با ابزار O-PCR (Lightcycler 96, Roche)، با استفاده از مخلوط UltraSYBR (cwbiotech) انجام شد. پروتکل PCR 95 درجه برای 10 دقیقه بود، به دنبال آن 40 سیکل 95 درجه برای 10 ثانیه، 56 برای 30 ثانیه و 72 برای 32 ثانیه بود. پرایمرهای مورد استفاده برای qRT-PCR به شرح زیر نشان داده شده اند: GADPH-Forward: 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3';GADPH-Reverse:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3',NLRP{20}به جلو: 5'-ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3'NLRP3-معکوس:5'-AACCAATGCGAGATCCTGAC{27}}';IL-1 -به جلو:5'-GCCCATCCTCTGTGACTCAT-3';IL{ {32}}معکوس:5'-AGGCCACAGGTATTTTGTCG-3':TNF- -به جلو:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3'TNF-a-Reverse:5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC{4} ! سطح بیان ژن با استفاده از روش 2-AACt محاسبه شد.

وسترن بلاتینگ

وسترن بلات با موارد زیر انجام شدآنتی بادی ها: آنتی بادی ضد NLRP3 (CST)، آنتی بادی ضد pp38 (CST)، آنتی بادی ضد p38 (CST)، آنتی بادی ضد pp65 (CST)، آنتی بادی ضد GADPH (تکنولوژی پروتئین)، آنتی بادی ضد توبولین (تکنولوژی پروتئین)، آنتی بادی ضد HMGB1 (تکنولوژی پروتئین)، آنتی بادی ضد p65 (تکنولوژی پروتئین)، آنتی بادی ضد IKB (تکنولوژی پروتئین). فراکسیون های پروتئینی از لیزات سلول های کشت شده استخراج شد و از کیت سنجش پروتئین BCA پیشرفته (بیوتیم، چین) برای اندازه گیری غلظت پروتئین استفاده شد. پروتئین ها دناتوره شده و بر روی SDS-PAGE حل و فصل شدند، سپس به یک غشاء PVDF منتقل شدند. پس از مسدود شدن با بافر QuickBlockTMBlocking (Beyotime، چین) به مدت 1 ساعت، غشاهای PVDF با آنتی بادی های اولیه در طول شب در درجه 4 انکوبه شدند. سپس غشاها با وسترن واش بافر (بیوتیم، چین) سه بار شسته شدند و با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه HRP به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. یک کیت BeyoECL Plus (Beyotime، چین) برای شناسایی پروتئین ها مطابق دستورالعمل سازنده استفاده شد. یک C-DiGit 3600 (Li-Cor، ایالات متحده آمریکا) برای تصویربرداری استفاده شد و باندها توسط نرم افزار Image J کمی سازی شدند.

اندازه گیری تجمع ROS

کیت سنجش گونه‌های اکسیژن واکنش‌دهنده پروب DCFH-DA (Beyotime، چین) برای اندازه‌گیری سطوح ROS درون سلولی در سلول‌های RAW264.7 طبق دستورالعمل‌های سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، DCFH-DA با محیط DMEM بدون سرم رقیق شد و غلظت نهایی به 10μM/L تنظیم شد. پس از انکوباسیون با 10 میکرومولار رنگ DCFH-DA به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد، سلول های RAW264.7 سه بار با محیط DMEM بدون سرم شسته شدند تا DCFH-DA اضافی حذف شود. برای کنترل مثبت، lμL Rosup به سلول ها اضافه شد. فلورسانس با استفاده از میکروسکوپ معکوس نیکون IX73 اندازه‌گیری شد. تصاویر سلول ها با استفاده از نرم افزار Image J اندازه گیری شد.

تحلیل آماری

تمام آزمایشات حداقل سه بار تکرار شد. برای تمامی تحلیل ها از نرم افزار SPSS و برای ترسیم گرافیکی GraphPad Prism 5 استفاده شد. تمام نتایج به عنوان مقدار میانگین ± انحراف معیار داده شد. برای تجزیه و تحلیل داده ها در بین گروه ها از آنالیز واریانس یک طرفه و مقایسه زوجی با استفاده از آزمون SNK-q استفاده شد. یک مقدار P< 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

شکل 1. Tan IIA دارای اثر تنظیمی بر تولید NO، NLRP3، IL-1، TNF-mRNA است.

اصطلاح

A. سلول های RAW264.7 بدون تولید گروه های مختلف. سلول ها با Tan IIA 10μM، 1μM و پیش تیمار شدند

{{0}}.1μM برای 30 دقیقه و با LPS (1 ug/mL) به مدت 24 ساعت تحریک شد. * P <0.05 در="" مقابل="" ctrl،="" #="" p=""><0.05 در="" مقابل="" lps.="" bd.="" تان="">

دارای اثر تنظیمی بر بیان mRNA TNF-، NLRP3 و IL{2}}. سلول ها با Tan IIA پیش تیمار شدند

نتایج

اثر بر تولید سلول های RAW264.7 NO از درمان قهوهای مایل به زرد

NO، یک مولکول پیام رسان دوم، عملکردهای مختلفی را در فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک سلول انجام می دهد. NO ترشح شده توسط ماکروفاژها نقش مهمی در واکنش های التهابی، ایمنی و ضد ویروسی دارد [19، 20]. با توجه به این موارد، NO می تواند برای تخمین اثرات LPS بر پاسخ های ایمنی و التهابی استفاده شود. سلول ها با غلظت های مختلف Tan IIA (در 10، 1 و 0.1 میکرومولار) با یا بدون 1 ug/mL LPS به مدت 24 ساعت تیمار شدند و سلول های گروه کنترل با حجم مساوی تیمار شدند. 0.1 درصد DMSO. همانطور که در شکل 1A نشان داده شده است، در مقایسه با گروه کنترل، در گروه مدل تحریک شده با LPS به مدت 24 ساعت، تولید NO بطور قابل توجهی افزایش یافت (P<0.05); and="" various="" concentrations="" of="" taniia="" treatment="" (at="" 10,="" 1,="" and="" 0.1="" μm)="" significantly="" decreased="" the="" no="" production=""><0.05) of="" the="" cells="" stimulated="" with="">

تاثیر بر بیان NLRP3، IL-1 و TNF-mRNA درمان Tan IIA

سلول‌های RAW264.7 تحریک‌شده با LPS می‌توانند باعث فعال‌سازی پاسخ التهابی شوند و می‌توان آن را با Tan IIA، از جمله بیان mRNA NLRP3، IL{3}} و TNF- بهبود بخشید. همانطور که در شکل 1B-D نشان داده شده است، در مقایسه با گروه کنترل، در گروه مدل تحریک شده با LPS، بیان mRNA NLRP3، IL{8}} و TNF- بطور قابل توجهی افزایش یافته است (P < {{{{14}="" }}}.05);="" و="" غلظت‌های="" مختلف="" تیمار="" tan="" iia="" (در="" 10،="" 1="" و="" 0.1="" میکرومولار)="" به="" طور="" قابل‌توجهی="" بیان="" mrna="" nlrp3،="" il{17}}="" و="" tnf-="" (0.05="">< p)="" را="" در="" سلول‌های="" تحریک‌شده="" با="" lps="" کاهش="">

اثر بر بیان پروتئین NLRP3 درمان Tan IIA

ATP، یک مولکول سیگنال دوم، یک فعال کننده مورد نیاز برای فعال سازی التهاب NLRP3 است. بنابراین، ATP برای القای فعال شدن NLRP3 استفاده شد [21، 22]. نتایج ما نشان داد که LPS به علاوه ATP باعث فعال‌سازی بیان پروتئین NLRP3 می‌شود و می‌توان آن را با Tan IIA بهبود بخشید. همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، در مقایسه با گروه کنترل، در گروه مدل القا شده توسط LPS به اضافه ATP، سطح بیان پروتئین NLRP3 به طور قابل توجهی افزایش یافته بود (P < 0.05).="" و="" درمان="" taniia="" (در="" 10μm)="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" بیان="" پروتئین="" nlrp3="" (p=""><0.05) را="" در="" سلول="" های="" تحریک="" شده="" با="" lps="" به="" علاوه="" atp="" کاهش="">

فعال سازی NF-kB و مسیر p38 ناشی از LPS را می توان با Tan IIA مهار کرد.

همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، در مقایسه با گروه کنترل، در سلول های تحریک شده با LPS یا LPS به اضافه ATP، بیان پروتئین IKB، pp65/p65 به طور قابل توجهی افزایش یافته است (P < 0.05).="" و="" درمان="" قهوهای="" مایل="" به="" زرد="" iia="" (در="" 10μm)="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" دخیل.="" سطح="" پروتئین="" pp38/p38="" در="" سلول‌های="" تحریک="" شده="" با="" lps="" به="" اضافه="" atp="" افزایش="" یافت،="" و="" تنظیم="" بالا="" توسط="" tan="" iia="" (10μm)="" مهار="" شد="" (شکل="" 2).="" با="" این="" حال،="" سطح="" پروتئین="" pp38/p38="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" در="" سلول="" های="" تحریک="" شده="" با="" lps="" تغییر="" نکرد.="" علاوه="" بر="" این،="" بیان="" پروتئین="" hmgb1="" نیز="" در="" سلول="" های="" القا="" شده="" با="" lps="" یا="" lps="" به="" علاوه="" atp="" افزایش="" یافت="" اما="" تفاوت="" آماری="" نشان="" نداد.="" این="" نتایج="" نشان="" می="" دهد="" که="" lps="" یا="" lps="" به="" علاوه="" atp="" فعال="" سازی="" nf-kb="" و="" مسیر="" p38="" را="" می="" توان="" توسط="" tan="" iia="" مهار="">

Tan IIA دارای یک اثر نظارتی بر ROS بود

برای تأیید اینکه آیا Tan IIA می‌تواند ROS درون سلولی را از بین ببرد، تولید ROS درون سلولی با میکروسکوپ فلورسانس با استفاده از کیت سنجش گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر ارزیابی شد. سلول‌های RAW264.7 به مدت 6 ساعت در معرض LPS قرار گرفتند و 1 میلی‌مولار ATP 30 دقیقه قبل از برداشت سلول‌ها اضافه شد. سلول های ROS مثبت به صورت لکه های سبز روشن مشاهده شدند و تیمار LPS به اضافه ATP سطح ROS داخل سلولی را به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد (شکل 3). در همین حال، درمان با Tan IIA به طور قابل توجهی از افزایش LPS به علاوه ATP در ROS داخل سلولی جلوگیری کرد (شکل 3). این نتایج نشان داد که Tan IIA دارای ظرفیت آنتی اکسیدانی است.

شکل 3. Tan IIA دارای اثر تنظیمی بر بیان ROS (نوار مقیاس 50μm) است.

سلول ها با Tan IIA 10μM به مدت 30 دقیقه پیش تیمار شدند و با LPS (1 ug/mL) به مدت 5.5 ساعت تحریک شدند. ATP 30 دقیقه قبل از برداشت سلول ها اضافه شد. الف. تصاویر فلورسانس نشان دهنده بیان سلولی ROS. ب. داده های کمی میانگین در سه آزمایش جداگانه. * P <0.05 در="" مقابل="" ctrl،="" #="" p=""><0.05 در="" مقابل="" lps/lps="" به="" اضافه="">

شکل 4. NAC دارای یک اثر تنظیمی بر بیان پروتئین NLRP3 است.

سلول ها با Tan IIA 10μM به مدت 3{11}} دقیقه پیش تیمار شدند و با LPS (1 میکروگرم در میلی لیتر) / LPS (1 میکروگرم در میلی لیتر) به اضافه NAC (1 میلی مولار) به مدت 5.5 ساعت تحریک شدند. ATP 30 دقیقه قبل از برداشت سلول ها اضافه شد. الف. وسترن بلات نماینده NLRP3. ب. داده های کمی میانگین در سه آزمایش جداگانه. * P <0.05 در="" مقابل="" ctrl،="" #="" p=""><0.05 در="" مقابل="" lps="" به="" علاوه="">

NAC دارای یک اثر نظارتی بر NLRP3 است

استیل سیستئین (N-acetyl-l-cysteine،NAC)، یک پاک کننده ROS، می تواند بیان پروتئین NLRP3 را مهار کند. همانطور که قبلا ذکر شد، بیان پروتئین NLRP3 پس از تحریک با LPS به علاوه ATP به مدت 6 ساعت به طور قابل توجهی افزایش یافت و درمان با Tan IIA افزایش LPS به علاوه ATP در سطح پروتئین NLRP3 را مهار کرد. علاوه بر این، درمان با NAC می‌تواند به طور قابل توجهی از افزایش LPS به علاوه ATP در سطح پروتئین NLRP3 جلوگیری کند (شکل 4). این نتایج نشان داد که اثر تنظیمی Tan IIA بر NLRP3 ممکن است به مسیر ROS-NLRP3 بستگی داشته باشد.

بحث

ماکروفاژها در فرآیند پاسخ التهابی شرکت می کنند و نقش مهمی در روند انفارکتوس میوکارد دارند. مونوسیت/ماکروفاژ به کار گرفته شده در میوکارد آسیب دیده می تواند ROS، واسطه های التهابی و پروتئاز را آزاد کند که آسیب میوکارد را تشدید می کند [23]. سلول‌های RAW264.7 به‌عنوان یک مدل تجربی غالب در نظر گرفته شده‌اند و نقش مهمی در تحقیق مسیرهای سیگنالینگ التهابی مربوط به ماکروفاژ دارند [24]. ماکروفاژها نقش حیاتی در حفظ هموستاز قلبی و هماهنگی ترمیم بافت و همچنین بازسازی دارند. سلول های RAW264.7 تحریک شده با LPS به طور گسترده برای مطالعه داروهای دارای خواص ضد التهابی و مکانیسم های زمینه ای استفاده شده اند [25،26].

التهاب NLRP3 یک واسطه حیاتی برای پاسخ های التهابی است و شواهد فزاینده ای وجود دارد که نشان می دهد التهاب NLRP3 نقش مهمی در بیماری های قلبی ایفا می کند. در عروق شریانی انسان، بیان بالای NLRP3 با عوامل خطر بیماری‌های آترواسکلروتیک و شدت بیماری عروق کرونر [27] و سطح ژن‌های مرتبط با التهاب NLRP3 با پلاک آترواسکلروتیک مرتبط بود [28]. فعال شدن التهاب NLRP3 نیز با بازسازی نامطلوب قلب همراه است. NLRP3 در کاردیومیوسیت‌ها در مدل بازسازی نامطلوب قلب موش‌های ناشی از انقباض آئورت عرضی (TAC) فعال شد و فعال‌سازی التهاب NLRP3 باعث تبدیل پروکاسپاز{11}} به شکل فعال آن شد [29]. MCC950.a یک مهارکننده التهاب NLRP3 می‌تواند اثر آترواسکلروتیک را مهار کند، احتمالاً به روشی برای مهار چسبندگی مونوسیت‌ها و کاهش تجمع ماکروفاژهای داخل پلاک [30].

Tan IIA یک مونومر اصلی استخراج شده از Danshen است که دارای خواص بیولوژیکی مختلفی است. قهوهای مایل به زرد ⅡA داردضد-التهابی, آنتی اکسیدانو اثر رگزایی را ترویج می کند و به طور گسترده برای درمان بیماری های سیستم قلبی عروقی استفاده می شود [11]. شواهد نوظهور نشان داده است که قهوهای مایل به زرد از آسیب قلب، فیبروبلاست‌های قلبی، تصلب شرایین، والتهاب عصبی[13-16]. مطالعات قبلی ما نشان داده است که Tan IIA با مهار مسیر سیگنالینگ TLR4-MyD88-NF-KB و تنظیم بیان miRNA مرتبط در سلول‌های RAW264.7 تحریک‌شده با LPS، اثر ضد التهابی دارد [31] . علاوه بر این، Tan IIA می تواند پلاریزاسیون ماکروفاژها را از یک فنوتیپ M1 پیش التهابی به سمت یک فنوتیپ M2 ضد التهابی ارتقا دهد [32]. با این حال، مکانیسم مولکولی زیربنایی اثرات Tan IIA هنوز نامشخص بود.

نتایج ما نشان داد که تولید NO به طور قابل‌توجهی در سلول‌های RAW264.7 تحریک‌شده با LPS افزایش یافت و تیمار Tan IIA (در 10، 1 و 0.1 میکرومولار) به طور قابل‌توجهی تولید NO سلول‌ها را کاهش داد. سلول‌های RAW264.7 تحریک‌شده با LPS می‌توانند باعث فعال‌سازی پاسخ التهابی شوند و می‌توان آن را با Tan IIA، از جمله بیان mRNA NLRP3، IL{9}} و TNF-.ATP یک مولکول سیگنال دوم بهبود بخشید. فعال سازی التهابی NLRP3 در این مطالعه، ATP برای القای فعال شدن NLRP3 استفاده شد. نتایج نشان داد که LPS به علاوه ATP باعث فعال‌سازی بیان پروتئین NLRP3 می‌شود و می‌توان آن را با Tan IIA بهبود بخشید. در سلول های تحریک شده با LPS یا LPS به علاوه ATP، بیان پروتئین IKBa، pp65/p65 به طور قابل توجهی افزایش یافت. و درمان IA قهوهای مایل به زرد (در 10μM) به طور قابل توجهی کاهش دخیل. سطح پروتئین pp38/p38 در سلول‌های تحریک‌شده با LPS به علاوه ATP تنظیم مثبت شد، و تنظیم مثبت توسط Tan IA (10uM) مهار شد. علاوه بر این، بیان پروتئین HMGB1 نیز در سلول های القا شده با LPS یا LPS به علاوه ATP افزایش یافت اما تفاوت آماری نشان نداد. این نتایج نشان می دهد که LPS یا LPS به علاوه ATP فعال سازی NF-kB و مسیر p38 را می توان با Tan IIA مهار کرد.

درمان LPS به علاوه ATP سطح ROS داخل سلولی را به طور قابل توجهی افزایش داد، و Tan IIA افزایش LPS به علاوه ATP ناشی از ROS داخل سلولی را به طور قابل توجهی مهار کرد. استیل سیستئین (N-acetyl-I-cysteine، NAC) یک پاک کننده ROS است. NAC می تواند به طور قابل توجهی از افزایش سطح پروتئین NLRP3 ناشی از IPS به علاوه ATP جلوگیری کند. این نتایج نشان داد که Tan IIA دارای ظرفیت آنتی اکسیدانی است و اثر تنظیمی Tan IIA بر NLRP3 ممکن است به مسیر ROS-NLRP3 بستگی داشته باشد.

برای جمع بندی. Tan IIA می تواند پاسخ التهابی و بیان NLRP3 تحریک شده توسط LPS یا LPS به اضافه ATP را مهار کند و NAC می تواند از افزایش LPS به علاوه ATP در سطح NLRP3 جلوگیری کند. بدین ترتیب، می توان حدس زد که مکانیسم زیربنایی اثرات Tan IIA ممکن است شامل تنظیم مسیر ROS-NF-kB/P38-NLRP3 باشد. این مطالعه بیشتر مکانیسم مولکولی Tan IA را مشخص کرد و افکار جدیدی را برای درمان بالینی آن ارائه کرد.

منابع

1 M.DeBerge.SJ. شاه، L. Weilbacher، و همکاران ماکروفاژها در نارسایی قلبی با کسر جهشی کاهش یافته در مقابل حفظ شده. روند مول. Med 2019, 25: 328-340.

2. GH. Gislason، S. Jacobsen، JN Rasmussen، و همکاران خطر مرگ یا انفارکتوس مجدد مرتبط با استفاده از مهارکننده‌های انتخابی سیکلواکسیژناز{1}} و داروهای ضدالتهابی غیر استروئیدی غیرانتخابی پس از انفارکتوس حاد میوکارد. تیراژ 2006، 113: 2906-2913

3. DM McNamara، R. Holubkov، RCStarling، و همکاران. کارآزمایی کنترل شده ایمونوگلوبولین داخل وریدی در کاردیومیوپاتی متسع با شروع اخیر. تیراژ 2001، 103:2254-2259.

4. PM Ridker، BMEverett، T.Thuren، و همکاران. درمان ضد التهابی با کاناکینوماب برای بیماری آترواسکلروتیک. N Engl J Med 2017,377:1119-1131. PMRidker، JG MacFadyen، T. Thuren، و همکاران.

5. اثر مهار اینترلوکین-1بتا با کاناکینوماب بر سرطان ریه اتفاقی در بیماران مبتلا به آترواسکلروز: نتایج اکتشافی از یک کارآزمایی تصادفی‌شده، دوسوکور و کنترل‌شده با دارونما. Lancet 2017,390:1833-1842. H. Guo، JB Callaway، JP Ting.

6. مکانیسم اثر، نقش در بیماری، و درمان. Nat Med 2015,21:677-687.

7. L.Minutoli.D.Puzzolo,M.Rinaldi, et al. فعال سازی التهابی NLRP3 با واسطه ROS در مغز. قلب. کلیه، و بیضه ایسکمی/آسیب خونرسانی مجدد. Oxid Med Cell Longley 2016.2016:2183026.

8. M.KawaguchiM.TakahashiTHata، و همکاران. فعال شدن التهابی فیبروبلاست های قلبی برای آسیب ایسکمی/آسیب خونرسانی مجدد میوکارد ضروری است. تیراژ 2011، 123:594-604. G. Trendelenburg. تنظیم مولکولی سرنوشت سلول

9. در ایسکمی مغزی: نقش مسیرهای التهابی و متصل. J Cereb Blood Flow Metab 2014,34:1857-1867.

10.C. جین، رافلول. مکانیسم مولکولی فعال سازی التهاب NLRP3. J Clin Immunol 2010،30:628-631.

11.Y. کای. W، Zhang، Z.Chen، و همکاران. بینش‌های اخیر در مورد فعالیت‌های بیولوژیکی و سیستم‌های دارورسانی تانشینون‌ها. Int J Nanomedicine 2016,11:121-130.

12. م.اکابری، م.ایرانشاهی، س.مهری. مسیرهای سیگنال دهی مولکولی در پشت اثرات بیولوژیکی دیترپن گونه های مریم گلی در نوروفارماکولوژی و قلب. Phytother Res2016.30:878-893.

13. D. Wang, Y.Liu, G.Zhong, et al. سازگاری tanshinone IIA و astragaloside IV در کاهش آسیب قلبی ناشی از هیپوکسی Ethnopharmacol 2017,204:67-76.

14. W. Chen, X.Li, S.Guo, et al.Tanshinone IIA تداخل اتوفاژی و پلاریزاسیون در ماکروفاژها را از طریق مسیر miR-375/KLF4 برای تضعیف آترواسکلروز هماهنگ می‌کند. Int Immunopharmacol 2019,70:486-497.

15. YT Tsai، SHLoh، CY Lee، و همکاران. Tanshinone A سنتز کلاژن ناشی از گلوکز بالا را از طریق فاکتور هسته ای اریتروئید 2-مربوط به فاکتور 2 در فیبروبلاست های قلبی مهار می کند. Cell Physiol Biochem 2018,51:2250 2261.

16.N. Huang، Y.Li، Y. Zhou، و همکاران. اثر محافظتی عصبی سلول های مزانشیمی انکوبه شده با تانشینون IA ساقه های Abeta25-35-القای 5C بر التهاب عصبی.Behav Brain Res 2019,365:48-55.

17.T. هیدت G Courtesies, P Dutta, et al. سهم متفاوت مونوسیت ها در ماکروفاژهای قلب در حالت پایدار و بعد از انفارکتوس میوکارد. Circ Res 2014,115:284-295.

18. S. Steffens، F. مونتکوکو، اف. ماخ پاسخ التهابی هدفی برای کاهش ایسکمی میوکارد و آسیب خونرسانی مجدد است. Thromb Haemost 2019,102:240-247.

19.جی. MacMicking، OW Xie. C. Nathan Nitric oxide and macrophage function Annu Rev Immunol 1997,15: 323-350.

20. SHHH. W, WU NO at Work.Cell 1994.78: 919-925.

21. L. Franchi, T. Eigenbrod, R. Munoz-Planllo, et al The Inflammasome: سکوی فعال سازی کاسپاز که پاسخ های ایمنی و پاتوژنز بیماری را تنظیم می کند. Nat Immunol 2009،10:241-247.

22. X. Dong Z. Zheng، P. Lin، و همکاران ACPA تولید بتا IL را در آرتریت روماتوئید با فعال کردن التهاب NLRP3 ترویج می‌کنند. Cell Mol Immunol 2019.

23. پی جی. موری، تی وین. عملکردهای محافظتی و بیماریزای زیر مجموعه های ماکروفاژها Nat Rev Immunol 2011,11:723-737.

24. G Pascual, AL Fong, S.Ogawa, et al.A مسیر وابسته به SUMOylation سرکوب ژنهای پاسخ التهابی توسط PPAR-گاما را واسطه می کند. Nature 2005,437:759-763.

25.X. Zhang G.Wang، ECGurley، و همکاران. فلاونوئید آپیژنین پاسخ التهابی ناشی از لیپو پلی ساکارید را از طریق مکانیسم های متعدد در ماکروفاژها مهار می کند. PLoS One 2014,9:e107072.

26. Z. Yuan, MA Syed, D. Panchal, et al. مدولاسیون اپی ژنتیکی با واسطه کورکومین، بیان TREM{1}} را در پاسخ به لیپوپلی ساکارید مهار می کند. Int J Biochem Cell Biol 2012,44:2032-2043.

27.F.Zheng.S، Xing. Zhong و همکاران NLRP3 التهابی بیان بالایی را در آئورت بیماران مبتلا به آترواسکلروز نشان می دهند. Heart Lung Circ 2013, 22:746-750.

28. G Paramel Varghese, L. Folkersen, RJ Strawbridge, et al. بیان و فعال سازی التهابی NLRP3 در آترواسکلروز انسانی J Am Heart Assoc 2015,5.

29.T. Suetomi، A. Willeford، CSBrand، er al Inflammation و NLRP3 فعال‌سازی التهابی که در پاسخ به اضافه بار فشار توسط سیگنال‌دهی دلتای پروتئین کیناز II وابسته به کالمودولین Ca(2) در قلب‌ها برای بازسازی نامطلوب قلب ضروری است. تیراژ 2018، 138:2530-2544.

30. T. van der Heijden, E. Kritikou, W. Venema, et al. مهار التهاب NLRP3 توسط MCC950 باعث کاهش رشد ضایعات آترواسکلروتیک در موش‌های دارای کمبود آپولیپوپروتئین E می‌شود. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017,37:1457-1461.

31. G Fan.X. جیانگ. X. Wu، e1 al. فعالیت ضد التهابی تانشینون IIA در ماکروفاژهای RAW264.7 تحریک شده با LPS از طریق miRNA ها و مسیر TLR{6}}NF-kappaB. Inflammation 2016,39: 375-384.

32. S. Gao، Y. Wang، D. Li، و همکاران. Tanshinone IIA پاسخ التهابی را کاهش می دهد و قطبش ماکروفاژها را در سلول های RAW264.7 تحریک شده با لیپوپلی ساکارید هدایت می کند. Inflammation 2019, 42: 264-275.