ELOVL2 با مهار آپوپتوز سلولی در کارسینومای سلول کلیه، پیشرفت سرطان را تقویت می کند.

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه. کلیویکارسینوم سلولی (RCC) یک بدخیمی تهاجمی دستگاه تناسلی است که با پیش آگهی ضعیف به خصوص در بیماران مبتلا به متاستاز همراه است، زیرگروه های اصلی آن RCC سلول شفاف (ccRCC)، PCC پاپیلاری (pRCC) و کروموفوب RCC (chRCC) است. وجود قطرات چربی درون سلولی (LDs)به عنوان یک مشخصه ccRCC در نظر گرفته می شود. اهمیت تغییر متابولیسم لیپید در ccRCC به طور گسترده ای شناخته شده است. طویل شدن اسید چرب با زنجیره بسیار بلند (ELOVL) افزایش طول اسیدهای چرب (FAs) را کاتالیز می کند، ترکیب چربی را تعدیل می کند و برای عملکردهای طبیعی بدن مورد نیاز است. با این حال، دخالت elongases در RCC نامشخص است. در مطالعه حاضر، بیان ELOVL2 در ccRCC مورد بررسی قرار گرفت. به طور خاص، سطوح بالایی از هفت ELOVLisozymes در تومورهای اولیه مشاهده شد. قابل توجه، افزایش سطح بیان ELOVL2 در ccRCC و همچنین در pRCC و chRCC مشاهده شد. نابودی ELOVL2 با واسطه CRISPR/Cas{5} منجر به سرکوب طویل شدن اسیدهای چرب غیر اشباع با زنجیره بلند و افزایش تولید LD درکلیهسلول های سرطانی. علاوه بر این، فرسایش ELOVL2 منجر به سرکوب تکثیر سلولی از طریق القای آپوپتوز در شرایط آزمایشگاهی و کاهش رشد تومور در داخل بدن شد. به طور کلی، مطالعه حاضر بینش جدیدی را در مورد مکانیسم های تکثیر تومور شامل متابولیسم لیپید ارائه می دهد و نشان می دهد که ELOVL2 ممکن است یک هدف جدید جذاب برای درمان RCC باشد.

کلید واژه ها:کارسینوم سلول کلیه، قطرات چربی، تکثیر سلولی، کلیه، کلیه

مقدمه

کارسینوم سلول کلیوی (RCC) یک بدخیمی شایع و کشنده است که حدود 2 درصد از کل موارد سرطان و مرگ و میرهای مرتبط با آن را در سراسر جهان تشکیل می دهد (1) که زیرگروه های اصلی آن RCC سلول شفاف (ccRCC)، PCC پاپیلاری (pRCC) و کروموفوب است. RCC (RCC). از میان همه زیرگروه‌های RCC، ccRCC شایع‌ترین تظاهرات بافت‌شناسی است و پاتوژنز آن با فعال‌سازی عوامل القاکننده هیپوکسی (HIFs) به دلیل از دست دادن عملکرد در ژن سرکوب‌کننده تومور فون هیپل-لینداو (VHL) مشخص می‌شود. (1). درمان‌های هدفمند مختلفی علیه فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) یا هدف پستانداران سیگنال‌دهی راپامایسین (mTOR) و مهارکننده‌های ایمون بازرسی برای بیماری متاستاتیک ایجاد شده‌اند. با این حال، پیشرفت بیماری در اکثر بیماران اجتناب ناپذیر است (1،2).

سیستانچ دیالیز کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

مشخصه ccRCC فراوانی قطرات چربی درون سلولی (LDs) است که از یک هسته لیپیدی خنثی حاوی تری گلیسیرید (TGs) و کلسترول استرها (CEs) احاطه شده توسط یک تک لایه فسفولیپیدی (3) تشکیل شده است. و ذخیره سازی و برای حفظ هموستاز، تسهیل تولید انرژی و محافظت در برابر انواع مختلف استرس یا حفظ بیوژنز غشایی در طول رشد سریع سلول های تومور در چندین نوع سرطان استفاده می شوند (4). در واقع، مطالعات قبلی نشان داده اند که LD ها در ccRCC نقش دارند. پیشرفت (5،6).

اسیدهای چرب (FAs) که جزء اصلی لیپیدها را تشکیل می دهند، گزارش شده است که به عنوان بسترهایی برای ذخیره انرژی، سنتز غشاء و تولید مولکول های سیگنال دهی عمل می کنند. ازدیاد طول و اشباع نشدن مراحل اصلی سنتز FAهای زنجیره بلند (LC-FAs) هستند که طول و درجه اشباع نشدن از عوامل تعیین کننده عملکرد FA و سرنوشت متابولیک هستند (7). Stearoyl-CoA دساتوراز 1 (SCD1)، عضوی از خانواده آسیل دساتورازهای چرب، به طور گسترده در ccRCC (6.8.9) مورد مطالعه قرار گرفته است. نشان داده شده است که افزایش بیان SCD1 از زنده ماندن پشتیبانی می کند، در حالی که یک مهار کننده مولکول کوچک SCD1 (A939572) نشان داده شده است که تکثیر سلولی را در ccRCC (8.9) سرکوب می کند. علاوه بر این. یانگ و همکاران (10) نشان دادند که پروتئین 1 متصل به عنصر تنظیمی استرول (SREBP1) باعث کاهش اشباع چربی از طریق FA اسید دسات-اوراز 1 (FADSI) قبل از فعال شدن سیگنالینگ NF-xB برای ارتقای تکثیر سلولی در ccRCC می شود. با این حال، هر گونه نقش بالقوه از elongases در RCC همچنان نامشخص است.

گزارش شده است که در پستانداران، واکنش‌های تراکم FA اولیه و کنترل‌کننده سرعت توسط خانواده‌ای از آنزیم‌های الانگاز که به عنوان طویل شدن FAs با زنجیره بسیار بلند (ELOVL) شناخته می‌شوند، کاتالیز می‌شوند. تا به امروز، هفت عضو ELOVL شناسایی شده‌اند که می‌توان آن‌ها را به طور کلی به گروه‌های خاص برای اسیدهای چرب اشباع و تک غیراشباع (ELOVL1، ELOVL3، ELOVL6 و ELOVL7) یا برای اسیدهای چرب چند غیراشباع (PUFAs؛ ELOVL2، ELOVL4 و ELOVL5) تقسیم کرد. لوکارلی و همکاران (9) تجمع قابل توجهی از PUFA و افزایش بیان ELOVL2 و ELOVL5 را در ccRCC نشان دادند. شایان ذکر است، نشان داده شده است که اسید دوکوزاهگزانوئیک سیستمیک (DHA) به صورت درون زا تولید می شود و لیپوژنز جدید را کنترل می کند، در حالی که ذخیره چربی را به روشی مستقل از فاکتور رونویسی متصل به عنصر تنظیم کننده استرول (SREBPF1) تنظیم می کند، به دلیل فرسایش ELOVL2 در موش (11). علاوه بر این، نشان داده شده است که بیان بیش از حد ELOVL2 باعث افزایش تجمع LD با افزایش جذب FA در هر دو رده سلولی پیش چربی سلولی 3T3-LI و سلول‌های F442A می‌شود (12). مطالعات قبلی در شرایط آزمایشگاهی، با DHA، به صورت برون زا برای سلول های سرطانی تجویز می شد. نشان داده اند که DHA اثرات ضد توموری، ضد التهابی و پیش آپوپتوز روی سلول های سرطانی دارد ({27}}). با این حال، هر نقش بالقوه ELOVL2 در پیشرفت ccRCC از طریق مدولاسیون متابولیسم لیپید تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده است.

در مطالعه حاضر، نقش‌های ELOVL2 inccRCC با انجام پروفایل رونویسی ccRCC اولیه و نرمال بررسی شد.کلیهنمونه ها، نشان می دهد که ELOVL2 در ccRCC بیش از حد بیان می شود و در بین ایزوآنزیم های ELOVL بیش از حد نشان داده می شود. قابل توجه، ELOVL2 همچنین در ccRCC و همچنین در pRCC و RCC بیش از حد بیان شد، که به طور قابل توجهی با پیش آگهی ضعیف بیماران مبتلا به CCR CCR pRCC مرتبط است. علاوه بر این، نشان داده شد که مهار ELOVL2 بر متابولیسم لیپیدها تأثیر می گذارد و تکثیر سلولی را از طریق ارتقاء آپوپتوز سرکوب می کند، حداقل تا حدی از طریق اختلال در هموستاز شبکه آندوپلاسمی (ER)سرطان کلیهسلول ها. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که ELOVL2 ممکن است یک هدف درمانی جدید بالقوه برای درمان RCC باشد.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

مواد و روش ها

خطوط سلولی و کشت. خطوط سلولی 293T (RCB2202) و OS-RC-2 (RCB0735) از مرکز منابع زیستی RIKEN خریداری شدند در حالی که خطوط سلولی 786-O و ACHN از ATCC خریداری شدند. سلول های SK-RC-52 هدیه ای مهربان از DrJ.G.Old (مرکز سرطان Memorial Sloan Kettering) بود. رده سلولی RPTEC که از سلول های اپیتلیال انسان مشتق شده استکلیهلوله پروگزیمال، از Lonza Group, Ltd. (CC‑2553) خریداری شد. سلول های ACHN، 786‑O، SK‑RC‑52 و OS‑RC‑2 در محیط RPMI‑1640 حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS) در دمای 37 درجه سانتی گراد با اتمسفر CO2 مرطوب شده 5 درصد کشت داده شدند. سلول‌های 293T در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با اتمسفر CO2 مرطوب شده 5 درصد کشت داده شدند. سلول های RPTEC در داخل کشت داده شدندکلیهمحیط رشد اپیتلیال (REGM™) Bulletkit™ (CC‑3190؛ Lonza Bioscience) در دمای 37 درجه سانتیگراد با اتمسفر CO2 مرطوب شده 5 درصد.

بیماران و نمونه های ccRCC. بافت های RCC و نرمال مجاورکلیهبافت‌های 46 بیمار که نفرکتومی رادیکال یا جزئی دریافت کردند، بین سال‌های 2006 و 2015 طبق پروتکل‌های تأیید شده توسط کمیته اخلاق دانشگاه تسوکوبا (تصویب شماره H28-104) از بیمارستان دانشگاه تسوکوبا گرفته شد. همه بیماران قبل از انجام عمل جراحی رضایت آگاهانه کتبی ارائه کردند. مراحل تومور بر اساس مرحله بندی TNM اتحادیه بین المللی کنترل سرطان اختصاص داده شد (16). درجات پاتولوژیک بر اساس سیستم درجه بندی فورمن چهار طبقه طبقه بندی شدند (17). تمام مشخصات بیمار در استخراج SI RNA جدول و سنتز cDNA خلاصه شده است. RNA کل از بافت های منجمد استخراج شد وکلیهسلول های سرطانی با استفاده از معرف TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). پس از خالص سازی RNA، RNA با استفاده از کیت رونویسی معکوس cDNA با ظرفیت بالا (شماره گربه 4368814؛ Thermo Fisher Scientific, Inc.)، طبق دستورالعمل سازنده، به cDNA رونویسی معکوس شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی رونویسی معکوس (RT-qPCR). سطوح بیان ژن با استفاده از دستگاه PCR 7500 Fast Real-Time PCR با Fast SYBR-Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) اندازه گیری شد. شرایط چرخه به شرح زیر بود: نگهداری اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای 20 ثانیه، 40 چرخه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای 3 ثانیه و 60 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، و به دنبال آن یک منحنی ذوب از 95 درجه سانتیگراد برای 15 ثانیه تا 60 درجه سانتیگراد است. C به مدت 1 دقیقه Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. تمام توالی های آغازگر در جدول SII فهرست شده اند. به منظور ارزیابی ژن‌های مرتبط با آپوپتوز، سطح بیان نسبی ژن‌های پرواپوپتوز، پروتئین X مرتبط با Bcl-2 (BAX)، آنتاگونیست/قاتل همولوگ Bcl-2 (BAK)، فوربول-12-میریستات-13-13 پروتئین 1 القا شده با استات (PMAIP1/NOXA) و تعدیل کننده آپوپتوز p53 (BBC3/PUMA) و ژن ضد آپوپتوز BCL2 و ژن پروتئین تمایز سلولی لوسمی میلوئیدی القایی (MCL1) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سطوح بیان ژن نسبی با استفاده از روش 2-ΔΔCq اندازه گیری شد (18).

تجزیه و تحلیل وسترن بلات آنالیز وسترن بلات همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد (19). سلول‌ها در بافر لیز (20 میلی‌مولار Tris-HCl (pH 7.5)، 150 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار EDTA، 1 درصد SDS و بازدارنده پروتئاز لیز شدند و روی یخ تحت فراصوت قرار گرفتند. لیزات ها در دمای 1 و xg به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند و مایع رویی به عنوان نمونه جمع آوری شد. کمی‌سازی پروتئین نمونه‌ها با استفاده از روش Quick Start Bradford Protein (آزمایشگاه‌های Bio-Rad، Inc.) انجام شد. نمونه ها تحت 10 درصد SDS-PAGE قرار گرفتند و محصولات جدا شده متعاقباً به غشاهای PVDF منتقل شدند.

سیستانچ عفونت کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

غشاها با عامل مسدودکننده ECL Prime (گروه شماره RPN418V؛ Cytiva) به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق مسدود شدند. غشاها سپس یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی های زیر انکوبه شدند: آنتی سرین/ترئونین-پروتئین کیناز/اندوریبونوکلئاز آنزیم نیازمند اینوزیتول 1 (anti-IRE1؛ 1:200؛ #3294، فناوری سیگنال سلولی)، IRE1 ضد فسفریله (anti-p-IRE1؛ 1:200؛ NB100-2323، Novus Biologicals، LCC)، پروتئین همولوگ anti-C/EBP (anti-CHOP؛ 1:200؛ MA1-250 Fisher, The Scientificr. .). ضد خرگوش یا ایمونوگلوبولین ضد موش G HRP مرتبط با خر کامل Ab (شماره گربه. NA934V, NA931VS; GE Healthcare; Cytiva) در 1:10،{22}} به عنوان آنتی بادی ثانویه استفاده شد. وسترن بلات با ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) با استفاده از تصویرگر Fujifilm LAS-4000 و LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) تجسم شد. اکتین به عنوان کنترل داخلی استفاده شد (1:10000، شماره کاتالوگ A5316؛ سیگما-آلدریچ).

تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک بیان ژن. داده های بالینی و توالی یابی RNA (RNA-seq) تومورهای اولیه جمع آوری شده از بیماران مبتلا به RCC در پایگاه داده اطلس ژنوم سرطان (TCGA) از پورتال داده ژنومیک داده مشترک (GDC) دانلود شد (20). در مجموع 1005 نمونه (880 بیمار و 125 شاهد) مورد بررسی قرار گرفت که شامل 530 نمونه بیمار و 71 نمونه شاهد برایکلیه کلیهگروه کارسینوم سلول شفاف (KIRC؛ ccRCC)، 286 بیمار و 31 نمونه سالم برای دهانه رحمکلیه کلیهگروه کارسینوم سلول پاپیلاری (KIRP؛ pRCC)، و 64 نمونه بیمار و 23 نمونه سالم برای گروه کروموفوب کلیه (KICH؛ chRCC). بیان ژن ELOVL2 در نمونه‌های سرطان ادراری تناسلی با استفاده از پایگاه داده بیان ژن بافت‌های طبیعی و تومور (GENT2) آنالیز شد. داده های بیان ژن از مخزن عمومی بیان ژن omnibus (GEO) پلت فرم U133 Plus 2 (GPL570) (http://gent2.appex.kr/gent2/) دانلود شد (21).

پلاسمیدها و انتقال عدسی ویروسی. RNA های سنجاق سر کوچک (shRNAs) برای ELOVL2 که در مطالعات قبلی مشخص شده بودند (22،23) در ناقل لنتی ویروسی pLKO.1 (پلاسمید #8453؛ Addgene, Inc.) سابکلون شدند. توالی های الیگونوکلئوتیدی مورد استفاده در ساخت وکتور shRNA در جدول SIII فهرست شده اند. لنتی ویروس ها در سلول های 293T با ترانسفکت کردن چهار پلاسمید در ترانس، از جمله وکتور لنتی ویروسی (pLKO‑shControl یا pLKO‑shELOVL2)، pMDLg/pRRE (پلاسمید #12251؛ Addgene, Inc.)، pRSV3-Rev25 پلاسمید تولید شدند. ؛ Addgene, Inc.) و pMD2.G (پلاسمید #12259; Addgene, Inc.) با استفاده از معرف ترانسفکشن Lipofectamine 2000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). در 48 ساعت پس از ترانسفکشن، مایع رویی حاوی ویروس جمع آوری شد و از طریق فیلتر 0.45 میکرومتری برای عفونت فیلتر شد. برای انتقال ویروسی، لنتی ویروس‌های pLKO-shControl یا pLKO-shELOVL2 با سلول‌های 786-O، ACHN و SK-RC-52 یک شبه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور کشت سلولی مرطوب انکوبه شدند. سلول ها در حضور پورومایسین در 24 ساعت پس از عفونت انتخاب شدند. برای تثبیت ساب کلون ها، سلول ها در محیط کشت با پورومایسین به مدت 1 ماه در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور کشت سلولی مرطوب شده کشت داده شدند و از استخرهای باقیمانده برای آنالیز بیان و تکثیر استفاده شد.

برای آزمایش‌های بیان بیش از حد، سلول‌های OSRC-2 با وکتور خالی pCMV6 (پلاسمید #PS100001؛ Origene Technologies, Inc.) یا pCMV6-ELOVL2 (پلاسمید #RC209232؛ Origene Technologies, Inc.) در یک سلول 37mi˚C ترانسفکت شدند. انکوباتور، با استفاده از معرف ترانسفکشن Lipofectamine 3000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، طبق دستورالعمل سازنده. سلول ها برای سنجش های مشخص شده در 48 ساعت پس از ترانسفکشن مورد استفاده قرار گرفتند. طراحی و شبیه سازی CRISPR/Cas9. پلاسمید pX330‑U6‑Chi‑{12}}BB‑CBh‑hSpCas9 (pX330) هدیه ای از Feng Zhang (Addgene, Inc.؛ پلاسمید #42230) بود (24). توالی های تک راهنما (sg) CRISPR برای ELOVL2 به طور خاص به اگزون 2 (sgELOVL2 #1) و اگزون 3 (sgELOVL2 #2 و #3) ELOVL2 با استفاده از ابزار طراحی CRISPR (GE Healthcare Dharmacon, Inc.) هدف قرار گرفتند.‑discovery.com/gene-editing/crispr-cas9/crispr-design-tool/)، قبل از شبیه‌سازی در pX330. توالی راهنمای CRISPR برای کنترل تک راهنما (sgControl) قبلاً طراحی شده بود (25). توالی های الیگونوکلئوتیدی RNA های تک راهنما (sgRNA ها) در جدول SIII فهرست شده اند.

سلول‌های ACHN سپس در صفحات 6 چاهی (1.4x105 سلول در چاه) کاشته شدند و 2 ساعت بعد با 2 میکروگرم sgRNA بیان شده با pX330 و 0.2 میکروگرم pCI-neo وکتور (Promega Corporation; شماره گربه E1841) در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور کشت سلولی مرطوب شده، با استفاده از FuGENE HD (شرکت پرومگا؛ شماره گربه E2312). در 24 ساعت پس از ترانسفکشن، 400 میکروگرم در میلی لیتر G418 به مدت 7 تا 10 روز استفاده شد و سلول ها به مدت 2 یا 3 روز اجازه بهبود یافتند. هنگامی که سلول ها به همریزی نزدیک می شدند، آنها را به صورت پراکنده در ظروف 10 سانتی متری بذرپاشی کردند. پس از 2 یا 3 هفته، کلنی‌های قابل تشخیص با استفاده از دیسک‌های شبیه‌سازی جدا شدند (MilliporeSigma؛ شماره cat. Z374431-100EA). کلون های منفرد گسترش یافته و از نظر وضعیت حذفی توسط توالی یابی سنگر برای ناحیه مورد نظر ارزیابی شدند.

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

سنجش تکثیر سلولی تکثیر سلولی با استفاده از روش MTT با کیت شمارش سلولی-8 (CCK-8؛ Dojindo Molecular Technologies, Inc.) مطابق دستورالعمل سازنده ارزیابی شد. به طور خلاصه، سلول ها در صفحات 96 چاهی کاشته شدند و 1{18}} میکرولیتر WST-8 پس از 72 ساعت اضافه شد. OD460 پس از انکوباسیون 1 ساعته در دمای 37 درجه سانتی گراد اندازه گیری شد. پیوند زنوگرافت زیر جلدی. موش ماده BALB/c برهنه (nu/nu) (n=12؛ 6 تا 8 هفته سن) از Charles River Laboratories, Inc. خریداری شد. چرخه نور/تاریکی ساعت، با دسترسی آزادانه به غذا و آب. برای سنجش پیوند زنو زیر جلدی، 1x107 سلول معلق در 100 میکرولیتر PBS به صورت زیر جلدی به سمت راست با استفاده از سوزن 24G تزریق شد و حجم تومور یک بار در هفته اندازه‌گیری شد. حجم تومور با فرمول mm{17}} طول x عرض x ارتفاع x 0.52 محاسبه شد (26). پس از 90 روز، تمام حیوانات قربانی شدند و تومورهای زنوگرافت برداشته شدند. حیوانات قبل از کشته شدن با دررفتگی دهانه رحم با ایزوفلوران 2 درصد بیهوش شدند.

نمونه‌های تومورهای پیوند زنوگرافت با فرمالین ثابت و پارافین (FFPE) قبل از پارافین‌زدایی و هیدراتاسیون مجدد به بخش‌هایی به ضخامت 4 میکرومتر بریده شدند. برای بازیابی آنتی ژن، مقاطع توسط مایکروویو به مدت 21 دقیقه در بافر اسید سیتریک پیش تیمار شدند. پس از روش بازیابی آنتی ژن، فعالیت پراکسیداز درون زا با 3 درصد H2O2 به مدت 25 دقیقه مسدود شد و لام ها با آنتی بادی Ki-67 (1:200؛ Dako؛ Agilent Technologies, Inc.؛ M7240) یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. واکنش ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی بادی ثانویه Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences, Inc.; Cat. no. 424151) با استفاده از دی آمینوبنزیدین به عنوان کروموژن مشاهده شد. تمام مطالعات حیوانی توسط کمیته آزمایش حیوانات دانشگاه تسوکوبا تأیید شد و همه آزمایش‌ها مطابق با دستورالعمل‌های آیین‌نامه آزمایش‌های حیوانی دانشگاه تسوکوبا (تصویب شماره 20-370) انجام شد. سنجش آپوپتوز آپوپتوز با استفاده از سیستم سنجش Caspase-Glo® 3/7 (Promega Corporation؛ cat. No. G8090)، کیت رنگ آمیزی Annexin-V-FLUOS (Roche Diagnostics؛ cat. no. 11858777001) و JCcho-1 Mimbrantential ارزیابی شد. کیت سنجش (Cayman Chemical Company؛ cat. شماره 10009172)، طبق دستورالعمل سازنده.

رنگ آمیزی LD ها سلول‌ها روی ورقه‌های شیشه‌ای در ظروف 6{7}} میلی‌متری کاشته شدند و با محیط کشت حاوی اسید اولئیک (2{13}}0 میکرومولار) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت یک شب در انکوباتور CO2 5 درصد کشت داده شدند. سپس محیط آسپیره شد و سلول‌ها قبل از تثبیت با فرمالدئید 4 درصد (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) دو بار با PBS به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق شسته شدند. سلول‌ها سپس دو بار با PBS شسته شدند و با 0.5 میکرومولار لیپی-گرین (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) به مدت 30 دقیقه در تاریکی در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از آن، سلول‌ها دو بار با PBS شسته شدند و روکش‌ها با استفاده از VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium با DAPI (Vector Laboratories, Inc.؛ cat. no. H‑1200) روی لام‌های شیشه‌ای نصب شدند. تصاویر سلول های رنگ آمیزی شده با میکروسکوپ فلورسانس BZ-X710 (Keyence Corporation) به دست آمد. سلول های زنده با 0.5 میکرومولار Lipi-Green در محلول نمک متعادل هنکس (HBSS) به مدت 30 دقیقه قبل از شستشو دو بار در HBSS انکوبه شدند، در 1 میلی مولار EDTA/PBS (pH 8.0) با 0.5 درصد BSA معلق شدند و از یک صافی سلولی عبور داده شدند. . سلول ها بر روی یک فلوسایتومتر گالیوس (Beckman-Coulter, Inc.) تجزیه و تحلیل شدند و داده ها با استفاده از نرم افزار FlowJo v10 (FlowJo LLC) تجزیه و تحلیل شدند.

رنگ آمیزی ردیاب ER. سلول‌های ACHN (ACHN/sgControl، ACHN/sgELOVL2-1 و ACHN/sgELOVL2-2) بر روی روکش‌های شیشه‌ای در ظروف 6{{20}} میلی‌متری کاشته شدند و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. یک دستگاه جوجه کشی 5 درصد CO 2. سپس محیط آسپیره شد و سلولها قبل از تثبیت با فرمالدئید 4 درصد (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) دو بار با HBSS شسته شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. سلول‌ها سپس دو بار با HBSS شسته شدند و با 500 نانومولار ER Tracker Red (Thermo Fisher Scientific, Inc.; cat. No. E34250) به مدت 2 ساعت در تاریکی در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس سلول‌ها دو بار با PBS شسته شدند و روکش‌ها روی لام‌های شیشه‌ای نصب شدند. تصاویر سلول های رنگ آمیزی شده با میکروسکوپ فلورسانس BZ-X710 (Keyence Corporation) به دست آمد. سلول‌های زنده با 500 نانومولار ردیاب ER در HBSS به مدت 30 دقیقه قبل از شستشو دو بار در HBSS انکوبه شدند، در 1 میلی‌مولار EDTA/PBS (pH 8.0) با 0.5 درصد BSA معلق شدند و از یک صافی سلولی عبور داده شدند. سلول ها بر روی فلوسایتومتر گالیوس تجزیه و تحلیل شدند و داده ها با استفاده از نرم افزار FlowJo v10 تجزیه و تحلیل شدند.

کروماتوگرافی گازی - طیف سنجی جرمی (GC-MS). استخراج کل لیپیدها از گلوله های سلولی همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد (27). هیدرولیز و مشتق سازی عصاره ها به متیل استرهای FA (FAMEs) انجام شد. برای استانداردهای داخلی FAهای مزدوج، C20:4 (ω‑6)، C20:5 (ω‑3)، C22:5 (ω‑6)، C22:5 (ω‑3) و C22 :6 (ω-3) FAME از MilliporeSigma یا Cayman Chemical خریداری شد. تجزیه و تحلیل GC-MS با استفاده از یک GCMS-TQ8040 (شرکت شیمادزو) با یک ستون GC مویرگی Omegawax® (MilliporeSigma؛ cat. شماره 24136) انجام شد. گرادیان دما در ابتدا از 70 به 150 درجه سانتیگراد با سرعت 20 درجه سانتیگراد در دقیقه و از 150 به 280 درجه سانتیگراد با سرعت 8 درجه سانتیگراد در دقیقه افزایش یافت و سپس از 280 به 200 درجه سانتیگراد با سرعت 15 کاهش یافت. ˚C در دقیقه تزریق نمونه در حالت بدون شکاف با 0/1 میکرولیتر نمونه تزریق شده انجام شد. برای تجزیه و تحلیل MS، منبع یون و دمای سطح بین به ترتیب روی 200 درجه سانتیگراد و 270 درجه سانتیگراد تنظیم شد. داده ها در حالت اسکن کامل (30 تا 600 متر برز) تحت ولتاژ یونیزاسیون 70 ولت به دست آمد. FAME ها بر اساس زمان ماند و تطابق طیف یونیزاسیون الکترون-MS (EI-MS) با استانداردهای مرجع FAME شناسایی شدند. مقدار نسبی FAME با مقایسه میانگین سطح پیک در هر توده نمونه محاسبه شد. هر نمونه به طور مستقل سه بار اندازه گیری شد.

تحلیل آماری. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان می شوند. تمام تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار JMP 10 (SAS Institute, Inc.)، GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) یا بسته R (نسخه 4.0.2؛ RStudio, Inc.) انجام شد. معنی‌داری تفاوت‌های بین دو گروه با استفاده از آزمون t بدون جفت دانشجو یا آزمون من ویتنی ارزیابی شد. اهمیت تفاوت بین سه یا چند گروه با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه با مقایسه تعقیبی با استفاده از آزمون دانت یا آزمون کروسکال والیس و سپس آزمون تعقیبی دان با تصحیح بونفرونی ارزیابی شد. منحنی‌های بقا با استفاده از روش کاپلان مایر ساخته شدند و تفاوت بین منحنی‌ها با استفاده از آزمون log-rank ارزیابی شد. بیماران با استفاده از برش مقادیر بیانی متوسط ​​به دو گروه تقسیم شدند، یک گروه بیان کم یا گروه بیان بالا. پ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتایج

ELOVL2 در RCC به شدت بیان می شود. فراوانی هفت ایزوآنزیم ELOVL در بافت‌های طبیعی و تومور مربوطه برای اولین بار در گروه حاضر مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد که سطح بیان ELOVL1، ELOVL2، ELOVL5 و ELOVL7 در بافت‌های ccRCC افزایش یافته است (شکل 1A). برای تایید این نتایج، بیان ژن ایزوآنزیم ELOVL در بافت‌های طبیعی و تومور مربوطه با استفاده از پایگاه داده TCGA (کوهورت KIRC) مورد بررسی قرار گرفت. تأیید شد که بیان mRNA ژن ELOVL2 در بافت‌های ccRCC بسیار زیاد و قابل‌توجه است (شکل 1B؛ P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">

سطح بیان به طور قابل توجهی در رده های سلولی ACHN، 786-O و SK-RC-52 افزایش یافت، اگرچه سطوح بیان mRNA در رده سلولی OS-RC-2 در مقایسه با رده سلولی RPTEC کمتر بود (شکل 1D). . متعاقباً، تغییر مرتبط با سرطان بیان ژن ELOVL2 در انواع مختلف سرطان با استفاده از پایگاه داده GENT2 (شکل 1E) مورد بررسی قرار گرفت. در مقایسه با بافت های طبیعی، بیان ELOVL2 به طور قابل توجهی بالاتر بودکلیهسرطان پروستات، ریه و روده بزرگ، در حالی که بیان ELOVL2 در سرطان مثانه یا سینه مشابه بود. این نتایج نشان می دهد که نقش ایزوآنزیم های ELOVL بر اساس نوع سرطان متفاوت است و بیان بیش از حد ELOVL2 ممکن است با سرطان زایی یا پیشرفت بیماری RCC، به ویژه ccRCC مرتبط باشد.

بیان بیش از حد ELOVL2 با پیشرفت RCC مرتبط است. ارتباط بین بیان ژن ELOVL2 و مراحل متاستاز تومور-گره (TNM) در گروه KIRC مورد بررسی قرار گرفت تا اهمیت بالینی ELOVL2 در ccRCC روشن شود. بیان ELOVL2 در بیماری های پیشرفته و متاستاتیک موضعی بالاتر بود، اگرچه بیان آن با وضعیت متاستاز به غدد لنفاوی مرتبط نبود (شکل 2A-C). در مجموع، بیان ELOVL2 با توجه به مرحله بالینی افزایش یافت (شکل 2D). پس از آن، ارتباط بین بیان ELOVL2 و پیش آگهی بیماران مبتلا به RCC مورد ارزیابی قرار گرفت تا تأثیر بالینی ccRCC مشخص شود. با توجه به تجزیه و تحلیل کاپلان مایر، مشخص شد که بیان بالای ELOVL2 به طور قابل توجهی با پیش آگهی ضعیف در گروه حاضر مرتبط است (P{9}}.0015، شکل 2E). برای تایید این نتایج، ارتباط بین بیان ELOVL2 و پیش آگهی بیماران مبتلا به ccRCC در گروه KIRC بیشتر مورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد که به طور مشابه، بیان بالای ELOVL2 به طور قابل توجهی با پیش آگهی ضعیف مرتبط است (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">

ELOVL2 تکثیر سلول های سرطانی کلیه را ترویج می کند. برای ارزیابی عملکرد ELOVL2 در تکثیر سلول‌های RCC، حذف shRNA ELOVL2 در سلول‌های 786‑O، ACHN و SK‑RC‑52 انجام شد. اثرات هر shRNA با استفاده از RT-qPCR ارزیابی شد و کاهش قابل توجهی در بیان ELOVL2 تایید شد (شکل 3A). سپس سنجش MTT برای بررسی اثرات تخریب ELOVL2 بر تکثیر سلولی انجام شد. مشاهده شد که از بین رفتن ELOVL2 از تکثیر همه سلول ها در مقایسه با سلول های ترانسفکت شده با کنترل shRNA جلوگیری می کند (شکل 3B).

در مقابل، بیان بیش از حد ELOVL2 در سلول‌های OS-RC-2، یک رده سلولی با بیان پایه پایین‌تر ELOVL2، القا شد. کارایی ترانسفکشن با استفاده از RT-qPCR ارزیابی شد و افزایش قابل توجه بیان ELOVL2 تایید شد (شکل 3C). سنجش‌های MTT نشان داد که تکثیر سلول‌های دارای بیان بیش‌ازحد ELOVL2 در مقایسه با گروه کنترل (شکل 3D) به طور قابل‌توجهی ارتقا یافته است، که نشان می‌دهد ELOVL2 ممکن است یک پروموتور تکثیر باشد.کلیهسلول های سرطانی.

فرسایش ELOVL2 رشد تومور را در داخل بدن، سنتز PUFAs و تولید LD ها را سرکوب می کند.کلیهسلول های سرطانی. برای روشن شدن بیشتر نقش ELOVL2 در پیشرفت RCC، یک رده سلولی ACHN حذفی ELOVL2 با استفاده از سیستم CRISPR/Cas9 (sgELOVL2-1 و sgELOVL2-2) ایجاد شد (شکل S1). در شرایط آزمایشگاهی، تکثیر سلولی به طور قابل توجهی با فرسایش ELVOVL2 در سلول های ACHN کاهش یافت (شکل S1). مهمتر از آن، فرسایش ELOVL2 با واسطه CRISPR/Cas9 رشد تومور را هنگامی که سلول ها به صورت زیر جلدی در موش کاشته شدند سرکوب کرد (شکل 4A). حداکثر حجم تومورهای پیوند زنوگرافت زیر جلدی در ACHN/کنترل و ACHN/sgELOVL2-2 در روز قربانی به ترتیب 241 و 109 میلی‌متر مکعب بود. نکته قابل توجه، تمام تومورهای پیوند زنوگرافت در گروه ACHN/sgELOVL2-1 به طور خود به خود در 14 روز پس از پیوند پسرفت کردند و در زمان تخلیه شناسایی نشدند. شاخص Ki-67 همچنین در تومورهای پیوند زنوگرافت ترانسفکت شده با کنترل یا sgELOVL2 مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که سلول های ACHN/sgELOVL2-2 شاخص Ki-67 به طور قابل توجهی کمتر از سلول های ACHN/کنترل نشان دادند (شکل 4B و C). . این نتایج بیشتر از این احتمال پشتیبانی می کند که ELOVL2 رشد تومور را در داخل بدن افزایش می دهد. از آنجایی که ELOVL2 روی کروموزوم 6p24.2 قرار دارد و یک پروتئین گذرنده شبکه آندوپلاسمی را کد می کند که طول PUFA های C20-C24 را کنترل می کند (7)، سپس سطح کل FA در سلول های ACHN/sgControl و ACHN/sgELOVL2 با استفاده از آنالیز GC‑ ارزیابی شد. (شکل S2). تغییر سطوح LC-PUFA در شکل 4D نشان داده شده است. ELOVL2 یک آنزیم ضروری در تولید درون زا اسید دوکوزاهگزانوئیک (DHA, C22:6 n‑3) است (28,29) و همانطور که انتظار می رفت، سطوح DHA به طور قابل توجهی با فرسایش ELOVL2 در بدن کاهش یافت.کلیهسلول های سرطانی. علاوه بر این،

مقدار سایر گونه های LC-PUFAs، از جمله اسید آراشیدونیک (AA، C20:4 n-6)، ایکوزاپنتانوئیک اسید (EPA) و دوکوزاپنتانوئیک اسید (DPA) نیز به طور قابل توجهی کاهش یافت. از سوی دیگر، تولید DPA به طور مداوم در سلول‌های ACHN/sgELOVL2 تغییر نکرد. مقدار DPA در سلول های ACHN بسیار کم بود و در چندین نمونه شناسایی نشد (شکل S2). از آنجایی که مطالعات قبلی نشان داده اند که ELOVL2 تجمع LDs را از طریق تولید DHA ترویج می کند (11،12)، ذخیره LDs بیشتر با استفاده از رنگ آمیزی لیپید خنثی ارزیابی شد. توجه داشته باشید، فراوانی LDs در سلول‌های ACHN/sgELOVL2 در مقایسه با سلول‌های ACHN/sgControl (شکل 4E-4G) به طور قابل‌توجهی کاهش یافت، که نشان می‌دهد تغییر متابولیسم لیپید توسط بیان بیش از حد ELOVL2 ممکن است بر تکثیر سلول‌های RCC تأثیر بگذارد.

فرسایش ELOVL2 باعث آپوپتوز می شودکلیهسلول های سرطانی. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که تولید LDs درون سلولی آپوپتوز را در محیط‌های ریز تومور استرس‌زا ارتقا می‌دهد (4). بنابراین، در مطالعه حاضر، آپوپتوز در سلول‌های ACHN/sgControl یا ACHN/sgELOVL2 ارزیابی شد و فعالیت کاسپاز 3/7 به طور قابل‌توجهی در سلول‌های ACHN/sgELOVL2 شناسایی شد (شکل 5A). به طور مشابه، تعداد بیشتری از سلول های آپوپتوز ACHN/sgELOVL2 در مقایسه با سلول های ACHN/sgControl شناسایی شد، همانطور که با رنگ آمیزی Annexin V/PI مشهود است (شکل 5B). بسته به استرس سلولی، آپوپتوز ذاتی (30) منجر به از دست دادن پتانسیل غشای میتوکندری می شود. بنابراین، مطالعه حاضر پتانسیل الکتریکی گذرنده میتوکندری سلول‌های ACHN/sgControl یا ACHN/sgELOVL2 را با استفاده از فلورسنت JC-1 ارزیابی کرد. نسبت کل به مونومر به طور قابل توجهی در سلول های ACHN/sgELOVL2 کاهش یافت (شکل 5C)، که نشان دهنده ارتقاء پلاریزاسیون گذرنده میتوکندری و فعال شدن مسیر آپوپتوز ذاتی با فرسایش ELOVL2 است. به طور دقیق تر، سطح بیان ژن پرواپوپتوز (BAX، BAK، PUMA و NOXA) به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که سطوح بیان ژن ضد آپوپتوز (BCL2 و MCL1) به دلیل فرسایش ELOVL2 به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 5D). این نتایج نشان داد که ELOVL2 از طریق مهار آپوپتوز سلول های سرطانی کلیه به بقای سلولی کمک می کند.

تخریب ظرفیت ذخیره‌سازی لیپید به شکل LD می‌تواند منجر به فروپاشی هموستاز ER شود، و باعث ایجاد پاسخ پروتئین بازشده (UPR) و آپوپتوز سلولی شود (4،5). بنابراین، به منظور حمایت از فرضیه دخالت بیان ELOVL2 در هموستاز ER، رنگ‌آمیزی ردیاب ER در سلول‌های ACHN/sgControl یا ACHN/sgELOVL2 انجام شد. تصویربرداری ER بعدی (شکل 5E) و کمی سازی با استفاده از فلوسیتومتری (شکل 5F و G) نشان دهنده گسترش ER در سلول های ACHN/sgELOVL2 به دلیل استرس ER بود. علاوه بر این، فرسایش ELOVL2 باعث افزایش فسفوریلاسیون IRE1، فعال کننده حسگرهای UPR شد (شکل 5H)، در حالی که بیانCHOP، که نقش اصلی را در آپوپتوز ناشی از استرس ER ایفا می کند، با فرسایش ELOVL2 تنظیم مثبت شد (شکل 5H). در مجموع، این نتایج نشان داد که متابولیسم لیپیدی با واسطه ELOVL2 آپوپتوز سلولی را سرکوب می کند.کلیهسلول های سرطانی و پیشنهاد کردند که اختلال در هموستاز ER ممکن است یک مکانیسم بالقوه القا باشد.

بحث

مطالعه حاضر نشان داد که ELVOL2 ممکن است متابولیسم لیپید را تغییر دهد و رشد تومور را از طریق مهار آپوپتوز سلول‌های سرطانی کلیه افزایش دهد. علاوه بر این، مشاهده شد که بیان ELOVL2 در بافت های RCC افزایش یافته است و این

بیان بالاتر ELOVL2 به طور قابل توجهی با پیش آگهی ضعیف بیماران مبتلا به RCC همراه بود. مطالعات محدودی در مورد نقش ELOVL2 در پیشرفت سرطان وجود دارد (22،31،32) و نتایج آنها بحث برانگیز است. Simple و همکاران (22) نشان دادند که ELOVL2 سنتز LC-PUFA را ترویج می‌کند، از سیگنال‌دهی کارآمد EGFR و تکثیر سلول‌های بنیادی گلیوبلاستوما حمایت می‌کند. در مقابل، Kang و همکاران (31) گزارش کردند که فرسایش ELOVL2 ممکن است مهاجرت سلولی و تشکیل کلونی سلول‌های سرطان سینه را افزایش دهد و نشان داد که کاهش بیان ELOVL2 با پیش‌آگهی ضعیف‌تر بیماران مبتلا به سرطان پستان مرتبط است. علاوه بر این، دینگ و همکاران (32) گزارش کردند که ELOVL2 تکثیر سلول های نوروبلاستوما را سرکوب می کند و با نرخ بقای مطلوب همراه است. با توجه به یافته های متناقض گزارش شده در مطالعات قبلی، یک عملکرد چند نقشی برای ELOVL2 در پیشرفت سرطان نشان داده شده است، که به وضوح بسته به نوع سرطان متفاوت است.

متابولیسم لیپید تغییر یافته تا حد زیادی بر پیشرفت سرطان تأثیر می‌گذارد، اثری که در نتایج مطالعه حاضر مشاهده شد، که در راستای تحقیقاتی است که نقش ELOVL2 را به‌عنوان کنترل‌کننده اولیه روند افزایش طول LC-PUFA و یک آنزیم حیاتی در بیوسنتز DHA نشان می‌دهد. 7). در مطالعه حاضر، نشان داده شد که LC-PUFAهای درون زا،

از جمله AA و DHA به دلیل فرسایش ELOVL2 در سلول های سرطانی کلیه کاهش یافت. در رابطه با این موضوع، قبلاً گزارش شده است که مهار مسیر AA توسط مهارکننده‌های لیپوکسیژناز (LOX) باعث القای آپوپتوز و کاهش زنده‌مانی می‌شود.کلیهسلول های سرطانی در شرایط آزمایشگاهی (33،34). اگرچه نتایج بیان بیش از حد ELOVL2 در مطالعه حاضر با این یافته‌های مکانیکی مطابقت دارد، اما قبلاً گزارش شده است که تجویز DHA ممکن است از تکثیر و تهاجم سلول‌های سرطانی کلیه در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کند (35،36). با این حال، LC-PUFAها دارای اثرات متمایز و متضاد بر پیشرفت سرطان هستند. بنابراین، تغییر تعادل ظریف بین انواع LC-PUFAها، به دلیل مهار ELOVL2 ممکن است با فنوتیپ های مختلف مشاهده شده در انواع مختلف سرطان مرتبط باشد. مطالعات قبلی نشان داده اند که LD ها از طریق تولید درون زا DHA توسط ELOVL2 در موش افزایش می یابد (11،12). به طور مشابه، مشخص شد که فرسایش ELOVL2 ممکن است تولید DHA و LDs را در سلول های سرطانی کلیه سرکوب کند، که نشان می دهد بیان بیش از حد ELOVL2 ممکن است تولید LD را از طریق تولید DHA درون زا در RCC افزایش دهد. سلول‌های سرطانی اغلب در شرایط محیطی سخت‌تر (کلان و میکرو) از جمله هیپوکسی و محرومیت از مواد مغذی یافت می‌شوند، اما هنوز تحت چنین عوامل استرس‌زای شدیدی به سرعت رشد می‌کنند. عملکردهای LD ها تحت شرایط استرس سلولی، مانند حفظ انرژی و هموستاز ردوکس، تنظیم اتوفاژی، حفظ هموستاز ER و محافظت در برابر سمیت چربی، نشان داده شده است (4).

آکرمن و همکاران (6) نشان دادند که LD ها از تجمع چربی های سمی و اشباع شده در طول هیپوکسی با بافر کردن اشباع لیپید سلولی از طریق تبادل FAهای غیراشباع ساکن TG در ccRCC جلوگیری می کنند. لیپوتوکسیک سلولی ناشی از اسیدهای چرب اشباع شده (SFA)، از جمله پالمیتات (C16:{2}})، ممکن است باعث آپوپتوز شود که منجر به مرگ سلول های سرطانی شود (37،38). اخیراً، ELOVL2 به عنوان یک آنزیم حیاتی برای بقا معرفی شده است که به پیشگیری از آپوپتوز سلولی ناشی از سمیت گلوکولیپوتوکسیسیتی کمک می کند (39). قابل توجه است که تقسیم‌بندی لیپیدی اصلاح‌شده با محور ELOVL2/DHA منجر به استفاده غیرسمی از پالمیتات SFA با انتقال آن به میتوکندری برای اکسیداسیون FA (FAO) از طریق مکانیسم وابسته به CPT1 می‌شود. علاوه بر این، بالابان و همکاران نشان دادند که سلول های سرطانی پروستات C4-2B و سلول های سرطان سینه MCF-7 از آپوپتوز ناشی از پالمیتات توسط FAO میتوکندری محافظت می شوند (37،38). در طول لیپوتوکسیک ناشی از پالمیتات، سطوح سلولی پروتئین‌های ضد آپوپتوز، از جمله BCL-2 یا MCL-1، کاهش یافته است (40،41) در حالی که سطوح پروتئین‌های پرواپوپتوتیک، از جمله PUMA یا NOXA، گزارش شده است. افزایش یابد (42،43). در مطالعه حاضر مشخص شد که فرسایش ELOVL2 ممکن است باعث پیشرفت شودکلیهآپوپتوز سلول سرطانی از طریق تغییر ژن های پرو و ​​ضد آپوپتوز به روشی مشابه. این یافته‌ها نشان می‌دهد که ELOVL2 ممکن است از سلول‌ها در برابر آپوپتوز ناشی از سمیت چربی محافظت کند تا رشد تومور در RCC را تقویت کند.

علاوه بر این، نشان داده شد که فرسایش ELOVL2 در RCC ممکن است استرس ER و تنظیم CHOP را افزایش دهد، BCL-2 و MCL-1 را کاهش دهد، در حالی که BAK و BAX را از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری تنظیم کند (44). در واقع، نتایج مطالعه حاضر نشان داد که ژن‌های طرفدار و ضد آپوپتوز به طور مشابه با فرسایش ELOVL2 تغییر یافتند. مطابق با یافته های مطالعه Qui و همکاران (5)، که گزارش کردند LD های وابسته به HIF2 / PLIN2 باعث مقاومت در برابر استرس ER و بقای سلولی در ccRCC می شوند، این یافته های جمعی در حمایت از استرس ER که آپوپتوز سلولی را تقویت می کند توسط ELOVL2 است. فرسایش درکلیهسلول های سرطانی، کاهش LD ها و حذف بافر سلولی در برابر لیپیدهای سمی.

در نتیجه، مطالعه حاضر برای اولین بار با بهترین دانش ما نشان داد که ELOVL2 با مهار آپوپتوز از طریق طویل شدن PUFA، رشد تومور را افزایش می دهد، حداقل تا حدی با حفظ هموستاز ER درکلیهسلول های سرطانی. در مجموع، پیشنهاد شد که LD های ناشی از ELOVL2 ممکن است به پیشرفت سرطان به دلیل اثرات محافظتی متعدد در برابر استرس سلولی در RCC کمک کنند. علاوه بر این، پیشنهاد شد که ELOVL2 ممکن است یک هدف درمانی بالقوه جذاب برای بیماران مبتلا به RCC باشد.