امپاگلیفلوزین علائم دیابت و اختلال عملکرد لوله های کلیوی را در مدل موش دیابتی با کلیه بزرگ شده (DEK) بهبود می بخشد

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

آیاکا دومون¹، Kentaro KatayamaID¹، توکو ساتو²، یوکی توچیگی¹هیرویوکی تازاکی²Hiroetsu SuzukiID^1*

خلاصه

زمینه و هدف: مهارکننده های کوترانسپورتر سدیم-گلوکز 2 (SGLT2) به طور گسترده ای برای کاهش هایپرگلیسمی استفاده می شوند. مطالعه حاضر به بررسی اثرات مهارکننده SGLT2، امپاگلیفلوزین، بر هیپرگلیسمی در مدل جدید موش صحرایی دیابت نوع 2 غیرچاق با بزرگ شده پرداخت.کلیه ها(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >mg/dl 300 به ترتیب غیر دیابتی و دیابتی طبقه بندی شد. گروه‌های موش‌های غیر دیابتی (شاهد) و دیابتی (DM-cont) به مدت 12 هفته با غذای استاندارد تغذیه شدند، در حالی که گروه دیگری از موش‌های دیابتی (DM-empa) به مدت 12 هفته با غذای استاندارد حاوی امپاگلیفلوزین (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز) تغذیه شدند. . گلوکز خون، وزن بدن، تحمل گلوکز، مصرف غذا و آب، حجم ادرار، پلاسما و پارامترهای بیوشیمیایی ادرار و تراکم مواد معدنی استخوان اندازه‌گیری شد.کلیه هاو پانکراس از نظر بافت شناسی مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: درمان با امپاگلیفلوزین باعث کاهش غلظت گلوکز خون و دریافت غذا در موش‌های دیابتی شد، اما از دست دادن آدپس مهار شد و منجر به افزایش وزن بدن شد. امپاگلیفلوزین پلی اوری و پلی دیپسی را تضعیف کرد اما غلظت کلسترول تام، سدیم و پروتئین کل پلاسما را به سطح طبیعی افزایش داد. امپاگلیفلوزین همچنین به طور قابل توجهی دفع پروتئین ها و الکترولیت ها از طریق ادرار را کاهش داد و تراکم استخوان و غلظت والین و ایزولوسین در پلاسما را به سطوح طبیعی بازگرداند. علاوه بر این، اتساع لوله های کلیوی وکلیهبزرگ شدن در گروه DM-empa ضعیف نشد. نتیجه‌گیری: پاسخ موش‌های DEK به امپاگلیفلوزین با سایر مدل‌های حیوانی دیابتی متفاوت است که نشان می‌دهد موش‌های DEK دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی برای مطالعه و ارزیابی اثرات بیولوژیکی متعدد مهارکننده‌های SGLT2 هستند. این یافته ها همچنین نشان داد که امپاگلیفلوزین می تواند متابولیسم سیستمیک را بهبود بخشد و بهبود بخشدکلیهعملکرد لوله دردیابتیشرایط

Cistanche tubulosa جلوگیری می کندکلیهبیماری، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

مقدمه

شیوع دیابت شیرین (DM) در سرتاسر جهان همچنان در حال افزایش است و تخمین زده می شود که تعداد بیماران تا سال 2045 به 700 میلیون نفر برسد [1]. حدود 90 تا 95 درصد از این بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 هستند که با کاهش تدریجی ترشح انسولین با یا بدون مقاومت به انسولین مشخص می شود [2] و یک عامل خطر اصلی برای بیماری های کلیوی و قلبی عروقی است [3]. دیابت نوع 2 یکی از علل اصلی نارسایی کلیه مرحله نهایی (ESRD) با نفروپاتی دیابتی است که دیابتی نیز نامیده می شود.کلیهبیماری ها، مسئول ESRD در 20 تا 40 درصد از این بیماران است [4]. بیماران مبتلا به ESRD برای حفظ وضعیت طبیعی نیاز به دیالیز یا پیوند کلیه دارندعملکرد کلیه. این روش ها بار اجتماعی و اقتصادی را بر جوامع و افراد تحمیل می کند و همچنین بر کیفیت زندگی بیمار تأثیر می گذارد [5]. بنابراین برای پیشگیری یا بهبود DM و نفروپاتی دیابتی به تلاش‌هایی نیاز است [6].

مهارکننده های کوترانسپورتر سدیم-گلوکز 2 (SGLT2) دسته جدیدی از داروهای ضد دیابت هستند که مستقل از انسولین درون زا عمل می کنند [7]. مهارکننده‌های SGLT2 با مهار بازجذب گلوکز در لوله‌های کلیوی پروگزیمال، غلظت گلوکز خون را کاهش می‌دهند [7]. مهارکننده های SGLT2 همچنین اثرات مفیدی بر عوارض کلیوی و قلبی عروقی DM [8-10] و همچنین بهبود متابولیسم [11] دارند که همه اینها تا حدی مستقل از اثرات کاهش دهنده گلوکز آنها هستند. علاوه بر این، مهارکننده های SGLT2 نتایج کلیوی را در بیماران غیر دیابتی مزمن بهبود می بخشدکلیهبیماری ها [12]. با این حال، اثرات مهارکننده های SGLT2، از جمله پیامدهای کلیوی، در بین بیماران متفاوت است [13]. این تغییرات احتمالاً منعکس کننده تفاوت در عوامل متعدد، از جمله استعداد ژنتیکی، وضعیت متابولیک، همودینامیک و سبک زندگی است.

ما اخیراً یک سویه جدید موش صحرایی غیرچاق نوع 2 DM با بزرگ شده ایجاد کردیمکلیه(DEK) از LEA. سویه مادرزادی PET-pet. در سویه DEK، حدود 50 درصد از مردان تا 30 هفتگی دیابت نشان می دهند. این موش‌های دیابتی کاهش تدریجی غلظت انسولین پلاسما را به دلیل از دست دادن سلول‌های لوزالمعده، افزایش پارانشیم کلیه و بزرگ شدن مشخص نشان دادند.کلیه هابا اتساع لوله های کلیوی [14]. موش‌های DEK همچنین کاهش غلظت پلاسمایی کلسترول تام (TCHO)، پروتئین تام و آلبومین را نشان دادند [14]. این ویژگی‌های بافت‌شناسی و متابولیک منحصر به موش‌های DEK است که این مدل را از سایر مدل‌های حیوانی دیابت متمایز می‌کند و نشان می‌دهد که موش‌های DEK می‌توانند برای مطالعه اثرات دارویی داروهای ضد دیابت بر روی مفید باشند.کلیه هاو متابولیسم بنابراین مطالعه حاضر، اثرات مهارکننده SGLT2، امپاگلیفلوزین را بر کلیه ها و متابولیسم سیستمیک موش DEK ارزیابی کرد.

Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >mg/dl 300 به ترتیب غیر دیابتی و دیابتی طبقه بندی شد [14]. همه موش‌ها تحت شرایط معمولی از جمله چرخه نور: تاریکی 14:10 ساعت، دمای اتاق 2±20 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 10±50 درصد نگهداری شدند. تمام مطالعات حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه دامپزشکی و علوم زیستی نیپون تأیید شد و مطابق با دستورالعمل‌های کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه دامپزشکی و علوم زیستی نیپون انجام شد.

Male rats with blood glucose concentrations >300 میلی گرم در دسی لیتر در سن 20-15 هفته در سویه DEK به طور تصادفی به یک گروه رژیم غذایی امپاگلیفلوزین (DM-empa) (n=5) و یک گروه رژیم غذایی استاندارد (DM-cont) (n {{6}) تقسیم شد. }) در عرض 2 تا 3 هفته پس از ابتلا به DM. موش‌های صحرایی نر با دیابت غیر دیابتی (سطح گلوکز خون در 30 هفتگی هنوز کمتر از 300 میلی‌گرم در دسی لیتر بود) در سویه DEK به‌عنوان شاهد (n=12) تعریف شدند. گروه کنترل و DM-cont به طور آزاد به آب و رژیم غذایی استاندارد (CR-LPF، Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo. Japan) به مدت 12 هفته دسترسی داشتند، در حالی که موش های گروه DM-empa به طور آزاد به آب دسترسی داشتند. و یک رژیم غذایی استاندارد به همراه امپاگلیفلوزین (300 میلی گرم بر کیلوگرم؛ الی لیلی ژاپن؛ کوبه، ژاپن). دوز امپاگلیفلوزین با استناد به گزارش های قبلی طراحی شد [15، 16]. غلظت گلوکز خون غیر ناشتا، وزن بدن و مصرف غذا به صورت هفتگی اندازه گیری شد. همه موش‌ها پس از 12 هفته قربانی شدندکلیه، پانکراس و نمونه خون جمع آوری شد. ما برای هر حیوانی که 25 درصد از وزن بدن خود را کاهش داد یا علائم مرتبط با بیماری شدید را نشان داد، نقاط پایانی انسانی تعیین کردیم. با این حال، هیچ موش صحرایی که چنین کاهش شدید وزن بدن و وضعیت بیماری را نشان دهد در این مطالعه وجود نداشت.

تست تحمل گلوکز خوراکی (OGTT)

آزمایشات تحمل گلوکز خوراکی (OGTT) یک روز پس از دوره درمان 12 هفته ای، همانطور که توضیح داده شد، انجام شد. به طور خلاصه، موش‌ها به مدت 16 ساعت ناشتا بودند و 2 گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن (BW) گلوکز خوراکی تجویز کردند. خون از ورید دم گرفته شد و غلظت گلوکز در 0، 3{12}}، 60، 120، 180 و 240 دقیقه پس از بارگذاری گلوکز اندازه‌گیری شد. نمونه‌های خون نیز از ورید ژوگولار تحت بی‌هوشی ایزوفلوران با کنترل یک بی‌هوش‌کننده حیوانات کوچک (TK{11}}، Biomachinery، Chiba، Japan) در 0، 30 و 60 دقیقه پس از بارگیری گلوکز، مخلوط با هپارین و سانتریفیوژ جمع‌آوری شد. به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد برای بدست آوردن پلاسما. غلظت انسولین پلاسما با استفاده از کیت الایزا انسولین LBIS Rat (RTU) (Shibayagi، Gunma، ژاپن) اندازه گیری شد.

اندازه گیری پارامترهای کلیوی

در طول هفته 12، موش ها به مدت 24 ساعت به صورت جداگانه در قفس های متابولیک قرار گرفتند و حجم ادرار و حجم آب آشامیدنی اندازه گیری شد [14]. غلظت کراتینین (Cre)، نیتروژن اوره (UN)، کلسیم (Ca)، Na-K-Cl و گلوکز (Glu) با Dri Chem 3500V (FUJIFILM، توکیو، ژاپن) اندازه‌گیری شد. غلظت پروتئین ادرار با استفاده از کیت تست سریع پروتئین Wako II (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation، توکیو، ژاپن) اندازه گیری شد. خون از ورید اجوف دمی تحت بیهوشی ایزوفلوران جمع‌آوری شد و غلظت پلاسمایی UN، آلبومین (Alb)، پروتئین تام (TP)، کلسترول تام (Tcho)، کلسیم و Na K-Cl با استفاده از Dri-Chem 3500V اندازه‌گیری شد. غلظت پلاسمایی Cre با استفاده از FUJIFILM VET Systems Co., Ltd. (توکیو، ژاپن) اندازه گیری شد. ترخیص کالا از گمرک کراتینین (Ccre)، گلوکز (Cglu)، کلسیم (Cca)، سدیم (Can)، پتاسیم (Ck) و کلر (Ccl) با استفاده از فرمول محاسبه شد:

ترخیص کالا از گمرک (Cx) (ml/min/kg)=[غلظت ادرار (mg/dl یا mEq/l) × حجم ادرار (ml/min)] / غلظت پلاسما (mg/dl یا mEq/l)/ وزن بدن (کیلوگرم).

دفع کسری گلوکز (FEglu)، کلسیم (FEca)، سدیم (FEna)، پتاسیم (FEk) و کلر (FEcl) با استفاده از فرمول محاسبه شد:

دفع کسر (FEx) ( درصد )=Cx (ml/min/kg) / Ccre (ml/min/kg) × 100.

غلظت ادرار اتصال به اسید چرب کبد (L-FABP) با استفاده از کیت FABP1/L-FABP موش/موش (R&D Systems, Inc., MN, USA) اندازه‌گیری شد.

بافت شناسی، ایمونوفلورسانس، و محاسبه ناحیه انسولین مثبت

حیوانات با مصرف بیش از حد پنتوباربیتال سدیم پس از 12 هفته درمان معدوم شدند. راکلیه هاو لوزالمعده از هر موش كشته شده خارج و وزن شد. نمونه‌های بافت با 4 درصد پارافورمالدئید در سالین بافر فسفات (PBS) تثبیت شدند، به دنبال روش‌های استاندارد در پارافین جاسازی شدند و در ضخامت 1 میکرومتر یا 4 میکرومتر برای رنگ‌آمیزی اسید پریودیک شیف (PAS) و ایمونوفلورسانس برش داده شدند. اتساع لوله های کلیوی همانطور که قبلاً توضیح داده شد نمره گذاری شد [17]. 10 میدان بزرگ‌نمایی تصادفی بدون همپوشانی 40 x از قشر کلیه و ناحیه مجاورت مدولاری نمره‌گذاری شدند. اتساع لوله‌ای در مقیاس {{10}}-3، با 0، 1، 2 و 3 نشان‌دهنده 0، نمره‌گذاری شد.<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >10 برش جزایر در هر موش با استفاده از نرم افزار Image J، و درصد سطح انسولین مثبت در هر منطقه جزایر محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل تراکم سنجی استخوان فمور

استخوان ران از چهار موش کنترل غیر دیابتی، سه موش صحرایی DM-cont و سه موش DM-empa پس از 12 هفته درمان برداشته شد و با یک سیستم میکرو سی‌تی اسکن شد (Latheta LCT-100، Aloka، توکیو، ژاپن) . تراکم استخوان (BMD، mg/cm3) و محتوای معدنی استخوان (BMC، mg) با استفاده از نرم افزار Latheta محاسبه شد.

کروماتوگرافی گازی - طیف سنجی جرمی (GC-MS) تجزیه و تحلیل اسیدهای آمینه پلاسما

نمونه‌های پلاسما از 30-موش‌های کنترل هفته‌ای و از موش‌های 27-32 هفته‌ای DM Cont و DM-empa پس از دوره درمان 12- هفته‌ای به‌دست آمد. نمونه های پلاسما با Phenomenex EZ: کیت آنالیز سریع AA (Phenomenex، Torrance، CA)، با نوروالین به عنوان استانداردهای داخلی تیمار شدند [18]. GCMS-QP2010Plus و نرم افزار راه حل GCMS (Shimadzu، کیوتو، ژاپن) برای تجزیه و تحلیل GC-MS [19] استفاده شد.

تحلیل آماری

نتایج به‌عنوان میانگین ± خطای استاندارد (SE)، در دو گروه با استفاده از آزمون‌های t دو طرفه دانشجویان و در گروه‌های چندگانه با آزمون توکی کرامر مقایسه شد. مقدار p < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

شرایط عمومی مرتبط با دیابت

اندازه‌گیری‌های هفتگی دریافت غذا نشان داد که میانگین تخمینی دریافت غذای روزانه در گروه DM-cont کمی بیشتر از گروه DM-empa بود (5/1±9/36 گرم در مقابل 1±3/34 گرم.0 گرم). دوز تخمینی روزانه امپاگلیفلوزین در گروه DM-empa 7/23/7±0 میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن (BW) بود. امپاگلیفلوزین به طور چشمگیری غلظت گلوکز خون را یک روز پس از شروع درمان کاهش داد، از 4{29}}4.6±36.3 میلی گرم در دسی لیتر به 14.6±143.8 میلی گرم در دسی لیتر، با گلوکز خون در گروه DM-empa به طور قابل توجهی کمتر از DM بود. -گروه ادامه در طول دوره درمان هفته ای 12- (شکل 1A). این سطح در DM-empa شبیه کنترل طبیعی با یک رژیم غذایی معمولی است (147.{{4{53}}}}±1.2 mg/dl) [14]. وزن بدن به تدریج با افزایش سن در گروه DM-empa افزایش یافت، اما نه در گروه DM-cont (شکل 1B). گروه ادامه در همان سن، وزن بدن کنترل تقریباً 9.8±533.4 گرم بود [14]. مطابق با افزایش وزن بدن، adeps reins (0.2±1.4 گرم) در گروه DM-empa باقی ماند اما در گروه DM-cont نه.

قبلا نشان داده شده بود که موش‌های DEK مبتلا، عدم تحمل شدید گلوکز، عدم ترشح انسولین در پاسخ به بارگذاری گلوکز و از دست دادن سلول‌ها را نشان می‌دهند [14]. ما بررسی کردیم که آیا امپاگلیفلوزین تحمل گلوکز و ترشح انسولین را بهبود می بخشد و از از دست رفتن سلول ها جلوگیری می کند. سطح گلوکز خون پس از 16 ساعت ناشتایی در گروه DM-empa به طور قابل توجهی کمتر از گروه DMcont بود، همانطور که سطح گلوکز خون 60 تا 240 دقیقه پس از بارگیری گلوکز بود (شکل 1C). تغییر وابسته به زمان گلوکز خون در OGTT DM-empa تقریباً شبیه موش‌های کنترل غیردیابتی سویه DEK است [14]. با این حال، ترشح انسولین ناشی از گلوکز در هیچ یک از گروه ها رخ نداد (شکل 1D). رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس انسولین در جزایر پانکراس، سیگنال‌های انسولین ضعیف یا ضعیفی را در گروه DM-cont و تقریباً 100 درصد سیگنال‌های مثبت را در موش‌های کنترل نشان داد، در حالی که سیگنال انسولین ضعیف، شامل 24.2±3.5 درصد در هر ناحیه جزایر در سه موش صحرایی مشاهده شد. گروه DM-empa (شکل 2).

پارامترهای متابولیک و کلیوی و تراکم سنجی استخوان

اندازه گیری پارامترهای متابولیک پس از دوره درمان 12 هفته نشان داد که مصرف غذا در DM-empa نسبت به گروه DM-cont در هر دو مقدار نسبی (شکل 3A) و مطلق (شکل S1) به طور قابل توجهی کمتر بود. علاوه بر این، مصرف آب (شکل 3B، شکل S1) و حجم ادرار (شکل 3C، شکل S1) در گروه DM-empa حدود 50 درصد کمتر از گروه DM-cont بود.

در پایان دوره درمان 12-هفته‌ای، غلظت پلاسمایی Tcho، Cre، Alb، TP و Na در DM-cont به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود، با اکثر این کاهش‌ها در DM-cont. گروهی که بهبود نسبی را در گروه DM-empa نشان می‌دهد. به طور خاص، غلظت Tcho، TP و Na پلاسما در DM-empa به طور قابل توجهی بالاتر از گروه DM-cont بود، اگرچه همه این غلظت ها در DM-empa کمتر از گروه کنترل بود. سطوح Alb و Cre پلاسما نیز در گروه DM-empa بالاتر از گروه DM-cont بود، اما این تفاوت ها از نظر آماری معنی دار نبودند (جدول 1). دفع ادراری گلوکز، UN، کلسیم، سدیم، K، کلر، و پروتئین در DM-cont به طور قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود، با اکثر این افزایش ها در گروه DM-empa کاهش یافت. به طور خاص، دفع ادراری Glu، UN، Na، K و Cl در DM-empa به طور قابل توجهی کمتر از گروه DM-cont بود، اگرچه همه این دفعات در DM-empa به طور قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود. . افزایش دفع ادراری کلسیم و پروتئین نیز در گروه DM-empa کاهش یافت، بدون اینکه تفاوت معنی داری بین گروه DM-empa و گروه کنترل وجود نداشت (جدول 2). به جز Ccre که در بین سه گروه تفاوت معنی داری نداشت، تمام کلیرانس ها و دفع کسرهای مورد بررسی در DM-cont به طور قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود (جدول 3). علاوه بر این، به جز Cglu و FEglu که در گروه DM-empa بیشتر باقی ماندند، بیشتر این افزایش ها در گروه DM-cont در گروه DM-empa کاهش یافت. به طور خاص، Cca، Cna و Ccl در DM-empa به طور قابل توجهی کمتر از گروه DM-cont بودند، اما در گروه DM-empa نسبت به گروه کنترل بالاتر باقی ماندند (جدول 3).

BMD استخوان ران در گروه DM-cont به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود، با اینکه امپاگلیفلوزین برای بازیابی تراکم استخوان استخوان ران در گروه DM-empa یافت شد (جدول 4). BMC در گروه DM-empa بیشتر از گروه DM-cont بود، اما این تفاوت از نظر آماری معنی دار نبود (جدول 4).

آسیب شناسی کلیه ها

موش‌های DEK مبتلا بزرگ شدن پیشرونده کلیه با لوله‌های گشاد شده را نشان دادند [14]. اگرچه درمان با امپاگلیفلوزین به طور چشمگیری سطح گلوکز خون را کاهش داد، اما کاهش نیافت

وزن کلیه، که در گروه DM-empa و DM-cont مشابه بود (0 ± 2.35. 0 8 گرم در مقابل 0.08 ± 2.24 گرم). بررسی بافت شناسی نشان داد که اتساع شدید در لوله های کلیوی نواحی juxtamedullary در هر دو موش DM-cont و DM-empa برجسته بود (شکل 4A). امپاگلیفلوزین اتساع لوله های کلیوی را کاهش نداد (شکل 4B و 4C). در همین راستا، دفع ادراری L-FABP، نشانگر زیستی آسیب توبولار کلیوی [20]، در DM-cont و DM-empa در مقایسه با گروه کنترل بیشتر بود و تفاوتی بین DM-cont و DM-empa وجود نداشت. شکل 4D و 4E). همانطور که قبلاً گزارش شد [14]، هیچ ضایعه گلومرولی معمولی مانند هیپرتروفی در کنترل، DM-cont و DM-empa وجود نداشت (شکل 4F).

تجزیه و تحلیل GC-MS اسیدهای آمینه پلاسما

Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.

سارکوزین پلاسما در گروه DM-cont بیشتر از گروه کنترل بود و امپاگلیفلوزین سارکوزین پلاسما را افزایش داد. در مقابل، تریپتوفان پلاسما در گروه DM-cont کمتر از گروه کنترل بود، با امپاگلیفلوزین که تریپتوفان پلاسما را بیشتر کاهش داد (جدول 5). سطوح گلیسین پلاسما در گروه DM-cont و کنترل مشابه بود اما در DM-empa به طور قابل توجهی بالاتر از دو گروه دیگر بود. غلظت گلوتامین و اورنیتین در DM-cont به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود و با درمان empagliflozin ترمیم نشد. در مقایسه با گروه کنترل، اسید آمینوبوتیریک پلاسما در گروه DM-cont به طور قابل توجهی کمتر بود و امپاگلیفلوزین غلظت آن را بیشتر کاهش داد. غلظت والین و ایزولوسین پلاسما در DM-cont به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل بود، با این غلظت ها با درمان امپاگلیفلوزین به سطح کنترل بازگشت.

بحث

مهارکننده‌های SGLT2 سطح گلوکز خون را به شیوه‌ای مستقل از انسولین کاهش می‌دهند و در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2، و همچنین در چندین مدل حیوانی، اثرات محافظتی از خود نشان می‌دهند [8، 12، 21-23]. اکثر مطالعات حیوانی با مهارکننده های SGLT2 در حیوانات چاق مبتلا به دیابت نوع 2 انجام شده است [22، 24-28]. با این حال، بسیاری از بیماران دیابت نوع 2، به ویژه در آسیا، غیرچاق هستند [29]. اثرات مهارکننده‌های SGLT2 بر بیماران مبتلا به ضایعات کلیوی یا دیابت غیرچاق نامشخص است [29، 30]. مطالعه حاضر اثرات امپاگلیفلوزین را بر متابولیسم، عملکرد کلیوی و هیستوپاتولوژی در موش‌های صحرایی DEK، یک مدل جدید موش دیابتی غیرچاق با مستعد کلیه‌های بزرگ شده، بررسی کرد [14]. در مقایسه با مدل‌های حیوانی دیابتی با چاق، فنوتیپ موش‌های DEK دیابتی با کاهش تدریجی غلظت انسولین پلاسما به دلیل از دست دادن سلول‌های پانکراس به جای مقاومت به انسولین مشخص شد، به طوری که موش‌های DEK دیابتی کاهش وزن و چربی را با کاهش وزن نشان دادند. پیشرفت DM علاوه بر این، موش‌های DEK دیابتی افزایش پارانشیم کلیوی و بزرگ شدن مشخص کلیه‌ها با اتساع لوله‌های کلیوی را نشان دادند [14].

مهارکننده های SGLT2 استفاده از چربی، ماهیچه و اسیدهای آمینه را به عنوان منابع انرژی ترویج می کنند [31-33]، توده چربی و BW را در انسان ها و حیوانات چاق کاهش می دهند [28، 34، 35]. از دست دادن توده چربی و کاهش افزایش وزن نیز در جوندگان دیابتی غیر چاق تحت درمان با مهارکننده های SGLT2 مشاهده شده است [31]. علاوه بر این، هم انسان و هم جوندگان تحت درمان با مهارکننده‌های SGLT2، هیپرفاژی جبرانی برای حفظ تعادل انرژی و مواد مغذی خود نشان دادند [27، 32، 36]. در این مطالعه، درمان با امپاگلیفلوزین سطوح گلوکز خون موش‌های DEK را در عرض 24 ساعت کاهش داد، با این غلظت‌های پایین‌تر در طول دوره درمان هفته‌ای، مشابه سایر مطالعات مربوط به مهارکننده‌های SGLT2 [15، 24]. برخلاف یافته‌های قبلی [27، 28،36]، ما دریافتیم که درمان با امپاگلیفلوزین مصرف غذا را کاهش می‌دهد و از دست دادن مهارهای آدپس و مهار افزایش وزن بدن را کاهش می‌دهد. این نتیجه غیرمنتظره احتمالاً با بهبود تعادل انرژی همراه بود. در ابتدا، دفع گلوکز ادرار در DM-empa به طور قابل توجهی کمتر از موش های DM-cont بود، اگرچه Cglu به طور قابل توجهی بالاتر در گروه DM empa ناشی از مهار کامل بازجذب گلوکز بود، با FEglu تقریبا 100 درصد. این یافته بیشتر با کاهش قابل توجه دفع UN از طریق ادرار، یکی از پارامترهای کاتابولیسم پروتئین، علیرغم سطح نرمال BUN، در گروه DM-empa حمایت شد [37]. علاوه بر این، افزایش TP پلاسما و کاهش پروتئین ادراری در گروه DM-empa نشان داد که امپاگلیفلوزین احتباس پروتئین را بهبود می بخشد. حفظ و استفاده از گلوکز و بازگشت از حالت کاتابولیک به حالت جذب شده در موش‌های تحت درمان با امپاگلیفلوزین ممکن است به دلیل کنترل موفقیت‌آمیز آن بر سطوح گلوکز خون باشد.

نشان داده شده است که مهارکننده‌های SGLT2 حجم ادرار را افزایش می‌دهند، با افزایش بازجذب لوله‌ای که باعث از بین رفتن مایعات و الکترولیت‌های بدن می‌شود [21، 25، 38]. بنابراین، حجم ادرار بلافاصله پس از شروع درمان با مهارکننده SGLT2 افزایش می یابد، اما درمان طولانی مدت ممکن است حجم ادرار و مصرف آب را کاهش دهد [38، 39]. اگرچه سطح Cre پلاسما در DM-cont و DM-empa به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود، CCR در بین گروه های کنترل، DM-cont و DM-empa تفاوت معنی داری نداشت. بنابراین، از آنجایی که هیچ شواهد آشکاری از هیپرتروفی گلومرولی در موش‌های DEK-DM وجود نداشت [14]، ممکن است هیپرفیلتراسیون گلومرولی در DM-cont به سختی رخ دهد یا خفیف باشد. علاوه بر این، یک کلیه بزرگ شده با افزایش پارانشیم ممکن است تعداد نفرون را افزایش دهد، که نشان می‌دهد بزرگ شدن کلیه در هر دو نوع DM-cont و DM-empa ممکن است با کاهش سطح Cre پلاسما مرتبط باشد. بنابراین، کاهش حجم ادرار در گروه DM-empa ممکن است ناشی از بهبود در بازجذب آب در لوله‌های کلیوی باشد، نه از کاهش نرخ فیلتراسیون گلومرولی. به طور کلی، افزایش دفع ادراری الکترولیت‌ها در گروه DM-cont در گروه DM empa کاهش یافت، که نشان می‌دهد کاهش غلظت پلاسمایی الکترولیت‌ها در گروه DM-cont با درمان با امپاگلیفلوزین از طریق بهبود عملکرد لوله‌های کلیوی کاهش می‌یابد. این فرضیه با کاهش مداوم ترخیص کالا از گمرک آنها با کاهش دفع کسر در گروه DM-empa پشتیبانی شد.

گزارش شده است که مهارکننده های SGLT2 اثرات مضری بر استخوان دارند [31، 40]. از آنجایی که پوکی استخوان یک عارضه شایع دیابت است، ما BMD و BMC را در سه گروه موش مقایسه کردیم. BMD و BMC در گروه DM-cont به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود، اما این کاهش ها در گروه DM-empa کاهش یافت. علاوه بر این، این افزایش در BMD و BMC در گروه DM-empa با کاهش دفع کلسیم در ادرار همراه بود. از آنجایی که سطوح کلسیم پلاسما به شدت تنظیم می شود، تفاوت معنی داری در سطوح کلسیم پلاسما در بین گروه های کنترل، DM-cont و DM-empa وجود نداشت. این یافته‌ها نشان می‌دهند که تعادل منفی کلسیم در گروه DM-cont ممکن است با حرکت یک استخوان از استخوان به گردش خون جبران شود، با این وضعیت تا حدی با بهبود عملکرد لوله‌ای کلیوی کلسیم در گروه DM-empa کاهش می‌یابد.

کاهش هیپوپروتئینمی در گروه DM-empa ممکن است ناشی از بهبود پروتئینوری باشد. اگرچه هایپرفیلتراسیون و هایپرتروفی گلومرولی به وضوح در گروه DM-cont نشان داده نشد، کاهش سطح گلوکز خون ممکن است فیلتراسیون گلومرولی Alb را کاهش دهد. علاوه بر این، بهبود در بازجذب لوله ای پروتئین ها و اسیدهای آمینه ممکن است به سنتز پروتئین های پلاسما در کبد کمک کرده باشد. موش DEK مبتلا با غلظت کم Tcho پلاسما مشخص می شود [14]. از آنجایی که افزایش تولید Alb با افزایش تولید Tcho در کبد [41] همراه است، سطوح بالاتر Tcho پلاسما در گروه DM-empa ممکن است با افزایش تولید کبدی Alb همراه باشد. دومی ممکن است ناشی از افزایش اسید آمینه و منابع انرژی مربوط به بهبود حفظ پروتئین و تعادل انرژی باشد.

هموستاز آمینو اسیدهای شاخه دار (BCAA) تا حد زیادی توسط فعالیت کاتابولیک BCAA در بافت ها تعیین می شود [42]، با نقص در هموستاز BCAA به عنوان شاخص مقاومت به انسولین یا شرایط دیابتی [43-45]. تجزیه و تحلیل GC-MS ما از اسیدهای آمینه نشان داد که غلظت والین و ایزولوسین پلاسما در موش‌های DM-empa برابر با موش‌های کنترل غیردیابتی بود، که نشان می‌دهد درمان با امپاگلیفلوزین کاتابولیسم پروتئین و شرایط دیابتی را بهبود می‌بخشد. علاوه بر این، مشاهده کردیم که افزایش اختصاصی امپاگلیفلوزین در سطح گلیسین پلاسما با بهبود دیابت مرتبط است. جالب توجه است که سطح پایین گلیسین پلاسما در دیابت انسانی مشاهده شده است [46]، و مشخص شد که تجویز گلیسین باعث ایجاد اثرات آنتی اکسیدانی و محافظت مجدد در موش های مبتلا به دیابت ناشی از استرپتوزوتوسین می شود [47]. بنابراین سطوح بالاتر گلیسین پلاسما ممکن است با کاهش استرس اکسیداتیو و نفروپاتی دیابتی در بیماران دیابتی و حیوانات آزمایشگاهی تحت درمان با امپاگلیفلوزین همراه باشد. سطوح پلاسمایی اسیدهای آمینه تحت تأثیر استفاده از آنها توسط بافت ها و اندام های سراسر بدن است و به شرایط آنابولیک و کاتابولیک بستگی دارد. برای تعیین اینکه چگونه تغییرات در سطح این اسیدهای آمینه و سایر اسیدهای آمینه با شرایط متابولیک مرتبط است، مطالعات بیشتری مورد نیاز است.

مهارکننده‌های SGLT2 با سرکوب چندین فرآیند مرتبط با بیماری‌های کلیوی، مانند آلبومینوری و افزایش وزن کلیه، اثرات محافظتی مجدد را اعمال می‌کنند [15، 24، 48، 49]. اتساع توبول کلیه و پروتئینوری نشانگر آسیب کلیه مرتبط با دیابت هستند [50]. با این حال، امپاگلیفلوزین قادر به سرکوب اتساع لوله کلیوی و افزایش دفع ادراری L-FABP در مدل موش صحرایی ما نبود، اما عملکرد لوله‌ای را به طور قابل توجهی بهبود بخشید. این اختلاف نشان داد که بهبود مرتبط با امپاگلیفلوزین در عملکرد لوله‌ای ناشی از اثرات جزئی یا ثانویه است که با تغییرات ارگانیک در لوله‌های کلیوی همراه نیست. متناوبا، از آنجایی که اتساع لوله‌ای همراه با آسیب و افزایش وزن کلیه در شرایط نرموگلیسمی در موش‌های مبتلا به DEK حفظ شد، این تغییرات ممکن است صفات ژنتیکی مرتبط با دیابت در موش‌های DEK باشد تا ثانویه به هیپرگلیسمی.

اگرچه مهارکننده‌های SGLT2 توبول‌های کلیوی را هدف قرار می‌دهند، اطلاعات کمی در مورد اثرات این عوامل بر تغییرات کلی در عملکرد لوله‌های کلیوی وجود دارد، به جز اینکه هیپرتروفی گلومرولی شامل انتقال لوله‌ای سدیم با گلوکز می‌شود [13، 22، 24]. مطالعات اثرات مهارکننده‌های SGLT2 بر عملکرد لوله‌ای نشان داد که بازجذب آب نه تنها با دیورز اسمزی سرکوب می‌شود، بلکه با تنظیم مثبت آکواپورین و انتقال‌دهنده اوره توسط یک مکانیسم هنوز نامشخص افزایش می‌یابد [21، 25]. سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیوی بیماران دیابتی نه تنها تحت تأثیر فشار اسمزی گلوکز موجود در مایع لوله‌ای هستند، بلکه تحت تأثیر گلوکز و سدیم اضافی که از طریق SGLT2 به سلول‌ها جذب می‌شوند، می‌شوند. اخیراً، استرس اکسیداتیو در لوله‌های کلیوی برای پیشرفت نفروپاتی دیابتی (DN) مهم در نظر گرفته شده است و ایپراگلیفلوزین از طریق جلوگیری از تولید بیش از حد ROS در لوله‌های کلیوی، اثرات محافظتی از خود نشان داد [51]. اگرچه هیچ پیشرفت جدی DN در موش‌های DEK مبتلا مشاهده نشد، استرس اکسیداتیو ممکن است عملکرد لوله‌ای را مختل کند. در حال حاضر، هیچ توافق واحدی در مورد اثرات مهارکننده‌های SGLT2 بر عملکرد لوله‌ای وجود ندارد، که نشان‌دهنده نیاز به مطالعات بیشتر برای روشن کردن مکانیسمی است که توسط آن امپاگلیفلوزین عملکرد لوله‌ای را در موش‌های DEK بهبود می‌بخشد.

مهارکننده‌های SGLT2 برای حفظ توده سلولی در مدل‌های دیابت نوع 1 و چاق نوع 2 یافت شده است [52، 53]. ما سلول‌هایی با سیگنال‌های انسولین ضعیف در گروه DM-empa شناسایی کردیم، اما هیچ سلولی در گروه DM-cont وجود نداشت. با این حال، OGTT بهبود متوسطی را در تحمل گلوکز بدون ترشح انسولین در گروه DM-empa نشان داد. از آنجایی که امپاگلیفلوزین نیمه عمر کوتاهی در حدود 8 ساعت دارد، کاهش سطح گلوکز خون پس از 16 ساعت ناشتایی و بهبود تحمل گلوکز به دلیل اثرات باقیمانده امپاگلیفلوزین نبود. بنابراین، این یافته‌ها نشان می‌دهد که تجویز طولانی‌مدت امپاگلیفلوزین ممکن است متابولیسم گلوکز را بهبود بخشد و سطح گلوکز خون را پس از بارگیری یک بار گلوکز به روشی مستقل از انسولین به میزان متوسط ​​کاهش دهد.

در نتیجه، نتایج مطالعه حاضر نشان می‌دهد که امپاگلیفلوزین متابولیسم سیستمیک و عملکرد لوله‌ای کلیوی را در موش‌های DEK بهبود می‌بخشد، اگرچه مکانیسم‌های دقیق زیربنای پاسخ منحصر به فرد این حیوانات به امپاگلیفلوزین نامشخص است. این یافته‌ها همچنین نشان می‌دهد که موش‌های DEK مدل مفیدی برای مطالعه و ارزیابی اثرات بیولوژیکی متعدد مهارکننده‌های SGLT2 در دیابت هستند.

منابع

1. فدراسیون بین المللی دیابت. IDF اطلس دیابت ویرایش 9. بروکسل، بلژیک 2019.

2. انجمن دیابت آمریکا. طبقه بندی و تشخیص دیابت. بخش 2. استانداردهای مراقبت پزشکی در دیابت{2}}. مراقبت از دیابت 2019; 42 (ضمیمه 1): S13–S28.

3. ژنگ Y، لی SH، هو FB. اتیولوژی و اپیدمیولوژی جهانی دیابت نوع 2 و عوارض آن. Nat Rev Endocrinol. 2018; 14 (2): 88-98.

4. Lin CC، Li CI، Liu CS، Lin WY، Lin CH، Yang SY، و همکاران. توسعه و اعتبار یک مدل پیش‌بینی خطر برای بیماری کلیوی مرحله نهایی در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2. Sci Rep. 2017; 7 (1): 10177.

5. والدرابانو اف، جوفره آر، لوپز-گومز جی.ام. کیفیت زندگی در بیماران مرحله نهایی بیماری کلیوی جی کیدنی دیس هستم. 2001; 38 (3): 443-64.

6. بعد از ظهر تالار. پیشگیری از پیشرفت نفروپاتی دیابتی طیف دیابت 2006; 19 (1): 18-24.

7. Hsia DS، Grove O، Cefalu WT. به‌روزرسانی در مورد مهارکننده‌های ناقل سدیم-گلوکز-2 برای درمان دیابت. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2017; 24 (1): 73-79.

8. Perkovic V، Jardine MJ، Neal B، Bompoint S، Heerspink HJL، Charytan DM، و همکاران. کاناگلیفلوزین و پیامدهای کلیوی در دیابت نوع 2 و نفروپاتی N Engl J Med. 2019; 380 (24): 2295-2306.

9. Sarafidis PA، Tapas A. Empagliflozin، پیامدهای قلبی عروقی، و مرگ و میر در دیابت نوع 2. N Engl J Med. 2016; 374 (11): 1092.

10. Wiviott SD، Raz I، Bonaca MP، Mosenzon O، Kato ET، Cahn A، و همکاران. داپاگلیفلوزین و پیامدهای قلبی عروقی در دیابت نوع 2 N Engl J Med. 2019; 380 (4): 347-357.

11. Brown E، Rajeev SP، Cuthbertson DJ، Wilding JPH. مروری بر مکانیسم اثر، پروفیل متابولیک و اثرات همودینامیک مهارکننده‌های ناقل هم‌نقل سدیم-گلوکز{4}}. دیابت چاقی متاب. 2019; 21 ضمائم 2:9-18.

12. Heerspink HJL، Stefansson BV، Chertow GM، Correa-Rotter R، Greene T، Hou FF، و همکاران. منطق و پروتکل داپاگلیفلوزین و پیشگیری از پیامدهای نامطلوب در بیماری مزمن کلیه (DAPA-CKD) کارآزمایی تصادفی شده و کنترل شده. پیوند نفرول دیال. 2020; 35 (2): 274-282.

13. Bae JH، Park EG، Kim S، Kim SG، Hahn S، Kim NH. اثرات مهارکننده‌های هم‌ترانسپورتر سدیم-گلوکز 2 بر پیامدهای کلیوی در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2: یک مرور سیستماتیک و متاآنالیز کارآزمایی‌های تصادفی‌سازی و کنترل‌شده. Sci Rep. 2019; 9 (1): 13009.

14. Domon A، Katayama K، Tochigi Y، سوزوکی H. خصوصیات مدل موش دیابت نوع 2 غیر چاق جدید با کلیه های بزرگ شده. J Diabetes Res. 2019; 2019:8153140. PMID: 31467929

15. Vallon V، Gerasimova M، Rose MA، Masuda T، Satriano J، Mayoux E، و همکاران. امپاگلیفلوزین مهارکننده SGLT2 رشد کلیوی و آلبومینوری را متناسب با هیپرگلیسمی کاهش می دهد و از هیپرفیلتراسیون گلومرولی در موش آکیتا دیابتی جلوگیری می کند. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306 (2): F194–204.

16. Vickers SP، Cheetham SC، Headland KR، Dickinson K، Grempler R، Mayoux E، و همکاران. ترکیبی از امپاگلیفلوزین بازدارنده حامل سدیم-گلوکز-2 با اورلیستات یا سیبوترامین کاهش وزن بدن و هموستاز گلوکز را در موش‌های چاق که از رژیم غذایی کافه تریا تغذیه می‌کنند، بهبود می‌بخشد. دیابت متابس سندرم چاقی. 2014; 7:265-75.

17. گلستراس اس جی، چن اچ، آر، مک گراث RT، چن جی، پولاک کالیفرنیا، و همکاران. مدل موش دیابت، چاقی و بیماری کلیوی مرتبط PLoS One. 2016; 11 (8): e0162131.

18. Badawy AA، Morgan CJ، Turner JA. استفاده از کیت آنالیز اسید آمینه Phenomenex EZ:faast™ برای تعیین سریع کروماتوگرافی گازی غلظت تریپتوفان پلاسما و رقبای جذب مغز آن. آمینو اسید. 2008; 34 (4): 587-96.

19. Michishita M، Saito N، Nozawa S، Furumoto R، Nakagawa T، Sato T، و همکاران. پروفایل متابولیت در سلول های تشکیل دهنده کره از رده های سلولی آدنوکارسینوم پستان سگ با استفاده از کروماتوگرافی گازی - طیف سنجی جرمی. J Vet Med Sci. 2019; 81 (9): 1238-1248.

20. Kamijo-Ikemori A، Sugaya T، Kimura K. پروتئین اتصال دهنده به اسید چرب ادرار در بیماری کلیوی. کلین چیم اکتا. 2006; 374 (1-2): 1-7.