DNA خارج از ویروسی در آماده‌سازی‌های ناقل ویروسی مرتبط با آدنو، پاسخ‌های ایمنی ذاتی وابسته به TLR9 را در سلول‌های دندریتیک پلاسماسیتوئید انسان ایجاد می‌کند.

سوسپانسیون‌های ناقل ویروسی مرتبط با آدنو (AAV) تولید شده در سلول‌های HEK مشتق از انسان یا در سلول‌های حشره Spodoptera frugiperda (Sf9) از نظر اجزای سلول میزبان باقی‌مانده و همچنین تغییرات پس از ترجمه ویژه گونه‌ای که روی پروتئین‌های کپسید AAV نشان داده می‌شوند، متفاوت هستند. . در اینجا ما تأثیر این تفاوت ها را بر روی خواص ایمنی زایی ناقل مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم. ما سلول‌های دندریتیک پلاسماسیتوئید انسانی را با تعداد زیادی از وکتورهای AAVCMV-eGFP تولید شده توسط سلول HEK و سلول Sf9 که از تولیدکنندگان مختلف مشتق شده‌اند، تحریک کردیم. ما متوجه شدیم که وکتورهای AAV8-CMV-eGFP و همچنین AAV{11}}CMV-eGFP پاسخ‌های سیتوکین التهابی مختص پلتفرم یا تولیدکننده را القا می‌کنند. اینها را می‌توان با مسدود کردن سیگنال‌دهی گیرنده شماره 9 یا با کاهش آنزیمی DNA در قسمت‌های وکتور با استفاده از DNase کاهش یا لغو کرد. انتقال موفقیت آمیز سلول HEK توسط تعداد زیادی AAV تیمار شده با DNase و تجزیه و تحلیل DNA نشان داد که DNase بر یکپارچگی ناقل تأثیر نمی گذارد اما DNA خارج ویروسی را تخریب می کند. نتیجه می‌گیریم که هر دو آماده‌سازی AAV مشتق از سلول HEK و Sf{21} می‌توانند حاوی اجزای DNA خارج ویروسی ایمونوژن باشند که می‌توانند پاسخ‌های ایمنی التهابی خاص را تحریک کنند. این نشان می‌دهد که استراتژی‌های بهبود یافته برای حذف ناخالصی‌های DNA خارج از ویروس ممکن است در کاهش خواص ایمنی زایی آماده‌سازی‌های وکتور AAV مفید باشد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

دهه گذشته شاهد علاقه زیادی به توسعه استراتژی‌های جدید مبتنی بر ویروس آدنو مرتبط با نوترکیب (AAV) برای تحقیقات پایه و کاربردهای بالینی بوده است. دلیل اصلی در این واقعیت نهفته است که وکتورهای AAV با توجه به توانایی آنها در رساندن موثر و ایمن ژن های درمانی به بافت های هدف، ابزار بسیار متنوعی در زمینه ژن درمانی بوده اند. با این حال، تعداد فزاینده‌ای از محققین به طور مستقل یافته‌هایی را گزارش می‌کنند که نشان‌دهنده پاسخ‌های ایمنی موضعی و سیستمیک پس از تحویل AAV در مطالعات پیش‌بالینی و بالینی است.

نشان داده شده است که وکتورهای AAV گیرنده های تشخیص الگوی ایمنی ذاتی مانند گیرنده شبه تلفات (TLR)2 و TLR9 را فعال می کنند که منجر به آزادسازی سایتوکاین های التهابی و اینترفرون های نوع I (IFN)9،10 می شود. اجزای ایمونوژنیک AAV که ممکن است این پاسخ ها را تحریک کنند عبارتند از پروتئین های کپسید و ژنوم ناقل 9،10. پاسخ‌های ایمنی پس از کاربرد AAV نیز ممکن است توسط ناخالصی‌های موجود در سوسپانسیون ناقل ایجاد شود5،11. این ناخالصی ها به عنوان هر جزء موجود در سوسپانسیون بردار AAV خالص به غیر از محصول مورد نظر و ناشی از فرآیند تولید وکتور تعریف شده است. دو روش عمده تولید ناقل‌های AAV نوترکیب بالینی شامل انتقال DNA پلاسمید به سلول‌های HEK و عفونت سلول‌های حشره Spodoptera frugiperda (Sf9) با باکولوویروس 13 است. بر این اساس، ناخالصی‌های بالقوه ایمونوژنیک موجود در سوسپانسیون‌های ناقل AAV می‌تواند شامل اندوتوکسین‌ها، اجزای محیط کشت سلولی، معرف‌هایی که برای خالص‌سازی AAV استفاده می‌شوند، پروتئین‌ها و DNA مشتق‌شده از سلول‌های میزبان، و DNA باکولوویروس باقی‌مانده یا پلاسمید DNA5 باشد. عوامل دیگری که می تواند بر ایمنی زایی سوسپانسیون های بردار AAV تأثیر بگذارد، تغییرات پس از ترجمه (PTMs) است که توسط پلتفرم های مختلف تولید بردار روی کپسید حک شده است. نکته مهم این است که وکتورهای AAV مشتق از سلول HEK و Sf9 از نظر PTM، ناخالصی‌های باقی‌مانده پروتئین سلول میزبان، و احتمالاً در ناخالصی‌های DNA (DNA سلول HEK در مقابل DNA سلول Sf9 و همچنین DNA پلاسمید باقی‌مانده با هم تفاوت دارند. در مقابل DNA باکولوویروسی)14. سلول‌های دندریتیک پلاسماسیتوئید (pCDs) یک نوع سلول ایمنی ذاتی تخصصی هستند که مقادیر زیادی IFN نوع I و سیتوکین‌های پیش التهابی را بر روی عفونت‌های ویروسی ترشح می‌کنند و نقش عمده‌ای در سنجش ناقل‌های AAV دارند. بر این اساس، برای تجزیه و تحلیل اینکه آیا تفاوت بین بردارهای AAV تولید شده توسط سلول HEK و Sf{26}} منجر به تفاوت در خواص ایمنی زایی آنها می شود، ما pDCهای انسانی را با تعداد زیادی از وکتورهای AAV یکسان به دست آمده از دو سیستم تولید تحریک کردیم. و تولید کنندگان مختلف ما دریافتیم که نیمی از لات های وکتوری که مورد بررسی قرار گرفتند، پاسخ های ایمنی پیش التهابی خاص بسیاری را برانگیختند که نه به سیستم تولید ناقل و نه به سازنده مربوط بودند. این پاسخ‌ها با سیگنال‌دهی TLR9 و حساس به درمان تعداد زیادی ناقل با DNase بودند. انتقال موفقیت آمیز سلول HEK توسط تعداد زیادی وکتور AAV تیمار نشده و تیمار شده با DNase و تجزیه و تحلیل DNA آماده سازی AAV نشان داد که DNase بر یکپارچگی ذرات AAV تأثیر نمی گذارد بلکه DNA خارج ویروسی غیر کپسوله شده را هدف قرار می دهد. در مجموع، این نشان می‌دهد که آماده‌سازی‌های وکتور AAV می‌توانند حاوی DNA خارج ویروسی غیر کپسوله‌شده باشند که می‌تواند بر خواص ایمنی زایی آماده‌سازی‌های وکتور AAV در pDC‌های انسانی تأثیر بگذارد.

فواید سیستانچ توبولوزا-تقویت سیستم ایمنی بدن

نتایج

AAV باعث ایجاد پاسخ های ایمنی ذاتی خاص در pDCهای انسانی می شود.

مطالعات نشان داده‌اند که بردارهای AAV مشتق از سلول HEK و Sf9 از نظر PTM و ناخالصی‌های موجود در سوسپانسیون‌های ویروسی متفاوت هستند. ما فرض کردیم که این عوامل می توانند منجر به تفاوت در خواص ایمنی بین تعداد زیادی ناقل مشتق شده از سلول HEK و Sf9 شوند. برای آزمایش این فرضیه، ما در مجموع هشت لات وکتور سروتیپ 8 AAV (AAV8) حاوی توالی DNA یکسان پروموتر سیتومگالوویروس (CMV) و تراریخته یکسان برای پروتئین فلورسانس سبز افزایش یافته (eGFP) (AAV{9}) را تجزیه و تحلیل کردیم. CMV-eGFP؛ پنج لات مشتق شده از سلول HEK- و سه Sf9) و چهار لات AAV{14}}CMV-eGFP (دو لات مشتق از سلول HEK- و دو لات Sf9) از سه سازنده مختلف [سازنده A; مرکز هسته برداری ویروسی دانشگاه آیووا (آیووا، ایالات متحده آمریکا)، سازنده B; Virovek (CA، ایالات متحده آمریکا) و سازنده C; Vigene Biosciences (MD، ایالات متحده آمریکا)]. برای به حداکثر رساندن شباهت ها بین لات ها، هفت لات AAV8 از سازنده A و سازنده B (جدول 1) با استفاده از همان پلاسمید اصلی تولید شدند. علاوه بر این، ثبت قطره‌ای PCR دیجیتال (ddPCR) ژنوم‌های وکتور (vg) لات‌های وکتور AAV در اندازه‌گیری کنار هم با استفاده از دو هدف مختلف انجام شد: یکی در توالی CMV و دیگری در توالی eGFP. بردارها نتایج به‌دست‌آمده از کمی‌سازی هدف CMV برای تیتراسیون لات‌های بردار AAV در آزمایش‌های زیر استفاده شد (جدول 1). pDCها حسگرهای ویروسی تخصصی هستند که به طور انبوه IFN های نوع I را بر اثر عفونت ویروسی تولید می کنند، از جمله بردارهای AAV9. برای بررسی اینکه آیا ناقل‌های AAV تولید شده توسط سلول HEK و Sf{28}}در ظرفیتشان برای برانگیختن پاسخ‌های ایمنی ذاتی در سلول‌های دارای قابلیت ایمنی متفاوت هستند، ما pDCهای انسانی را با تعداد زیادی بردار AAV در بالا تحریک کردیم. برای این منظور، pDCها از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMCs) اهداکنندگان انسان سالم با انتخاب منفی با استفاده از مرتب‌سازی سلول‌های فعال مغناطیسی (MACS) خالص شدند. آنالیز فلوسایتومتری خلوص pDCهای جدا شده را بیش از 90% تایید کرد (شکل S1). 10 pDC از یک فرد اهداکننده با تعداد زیادی بردار AAV8 و AAV2 در MOI 1:1 × 106 Vg/cell به مدت 18 ساعت بذر و تحریک شدند. MOI 1:106 vg/cell که در مجموع 12.500 سلول در 50 ul/well اعمال می شود، به تیتر 2.5×1011 vg/ml تبدیل می شود. ما از این تیتر استفاده کردیم زیرا در محدوده آن چیزی است که در مطالعات ژن درمانی شبکیه در انسان (به عنوان مثال 1×1012 vg/ml16 یا 4×1011-1.3×1012 vg/ml17) و پستانداران غیر انسانی (مثلاً 5×5) استفاده می شود. 1011-5 × 1012 vg/ml6). تحریک با وسیله نقلیه به عنوان کنترل عمل کرد. جوجه کشی با تعداد زیادی وکتور AAV8 و AAV2 منجر به بیان تراریخته قابل تشخیص در pDCها نشد. با این حال، چهار لات از هشت لات AAV8 (لات های A-HEK{-1، A-HEK-2، A-HEK-3، A-Sf9-1) و دو مورد از چهار لات AAV2 (لات B-Sf9-1، B-Sf9-2) تکثیر سلولی واکنشی را در pDCهای تحریک شده القا کردند (شکل 1a). این با انتشار سیتوکین های پیش التهابی (IP{80}}، MIP{81}} و TNF-) و IFN نوع I (IFN-) همراه بود. برعکس، نه تکثیر سلولی و نه آزادسازی سیتوکین توسط باقیمانده AAV8 القا نمی‌شود (تعدادی A-Sf9-1، B-HEK-1، B-Sf{90}}، C-HEK{{92} }) و لات های AAV2 (لات های C-HEK-1، C-HEK-2). این نتایج در سه تا چهار آزمایش مستقل که هر کدام با سلول‌های یک اهداکننده انجام شد تأیید شد (شکل 1a-c و جدول S1). تفاوت‌های خاص در غلظت‌های سیتوکین در این آزمایش‌های مستقل با استفاده از یک مدل اثر مختلط خطی و آزمون دونیت تعقیبی (Q{101}}.6) با مقایسه میانگین حداقل مربعات لات‌های مختلف بردار AAV با کنترل خودرو (جدول S2 و S3). این تفاوت‌های آماری معنی‌داری را در پاسخ‌های سیتوکین بین تعداد زیادی بردار AAV "ایمن‌زا" نشان داد (AAV8 lots A-HEK{108}}، A-HEK{110}}، A-HEK{112}}، A-Sf{ {114}}، یا AAV2 lots B-Sf9-1، B-Sf9-2 به ترتیب) و شاهد، اما تفاوت معنی‌داری بین تعداد زیادی بردار AAV "غیر ایمنی زا" وجود ندارد (AAV8 lots A-Sf{{{ 123}}، B-HEK-1، B-Sf{127}}، C-HEK{129}} یا AAV2 lots C-HEK-1، C-HEK{134}} به ترتیب) و کنترل (جدول S3). غلظت بقیه سیتوکین‌های اندازه‌گیری‌شده در سنجش مالتی پلکس یا کمتر از محدوده سنجش بود (یعنی IL{136}}، IL{137}}، IL{138}}، IL{139}} , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN- ) یا نه "ایمونوژن" و نه تعداد زیادی ناقل "غیر ایمنی زا" هر گونه افزایش قابل توجهی را در انتشار آنها ایجاد کردند (به عنوان مثال، IL{148}}، IL{149}}، G-CSF، MCP{151}}) (شکل S2)، نشان می دهد درجه ای از ویژگی در پاسخ سیتوکین با واسطه AAV. برای بررسی پاسخ‌های سیتوکین در زمان‌های قبلی، pDCs با لات بردار AAV8 «ایمونوژنیک» A-HEK{156}} تحریک شدند. ما افزایش قابل توجهی در غلظت TNF- در مایع رویی در 2 ساعت پس از تحریک pDC مشاهده کردیم. این الگوی پاسخ را می‌توان در سه آزمایش تأیید کرد، که هر آزمایش با سلول‌های یک اهداکننده انجام شد (شکل S3). برای بررسی اینکه آیا یک دوز بالاتر از یک مقدار ناقل AAV8 "غیر ایمنی زا" قادر به ایجاد یک پاسخ ایمنی است، ما pDCها را با حداکثر MOI قابل اجرا از نظر فنی (1:4.61×106 vg) تحریک کردیم. جالب توجه است، نه تکثیر سلولی واکنشی و نه پاسخ سیتوکین با تحریک با این تیتر افزایش یافته شناسایی نشد (شکل S4). برخلاف فرضیه ما، این نتایج نشان می‌دهد که پاسخ‌های ایمنی ذاتی به AAV در pDC‌ها به مقدار زیادی اختصاصی بوده و به یک سیستم تولید خاص یا روش سازنده/تصفیه مربوط نمی‌شود.

جدول 1. تعداد زیادی ناقل ویروسی AAV8 و AAV2 در این مطالعه استفاده شده است.

شکل 1. القای پاسخ های ایمنی مربوط به ناقل AAV در pDCهای انسانی. pDCهای انسانی با تعداد زیادی از AAV8-CMV-eGFP و AAV{4}}CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) به مدت 18 ساعت تحریک شدند (الف) تصاویر میدان روشن نماینده pDCs تحریک شده با کنترل وسیله نقلیه (تصویر بالا) یا یک لات بردار AAV ایمنی زا (تصویر پایین). نوار مقیاس 100 میکرومتر است. (ب) انتشار سیتوکین IP{11}}، MIP{12}}، TNF-، و IFN{14}} توسط PDCهای تحریک‌شده AAV{15}}. (C) انتشار سیتوکین توسط PDCهای تحریک شده با AAV{16}}. نمودارهای نماینده یکی از سه تا چهار آزمایش مستقل. از آنجایی که در اندازه‌گیری‌های IFN- 2 (b,c) و اندازه‌گیری TNF- (c) برخی از مقادیر زیر محدوده سنجش قرار گرفتند، ثابت 1 برای ارائه به همه مقادیر اندازه‌گیری شده IFN{- 2 و TNF- اضافه شد. در یک نمودار نیمه لگاریتمی میانه ها و محدوده های بین چارکی نشان داده شده است. در برچسب های لات های بردار مجزا، سه سازنده با حروف A، B و C نشان داده می شوند. بردارهای مشتق از سلول HEK و بردارهای مشتق از سلول Sf{24} با "HEK و "Sf9" نشان داده می شوند و تعداد مربوط به همان سازنده و همان سیستم تولیدی "1، 2، 3" شماره گذاری می شوند. دایره: برگرفته از HEK تعداد بردار؛ مثلث: Sf{30}}مشتق‌شده بردار؛ مشکی: مقدار بردار از سازنده A؛ نارنجی: تعداد بردار از سازنده B؛ سبز: تعداد بردار از سازنده C.

پاسخ ایمنی به تحریک AAV در pDCها تحت تأثیر تفاوت نسبت کپسید / VG نیست.

مطالعات پیش بالینی نشان داده‌اند که تفاوت در تعداد ذرات ناقل پر و خالی در سوسپانسیون‌های ناقل AAV می‌تواند بر پاسخ ایمنی تأثیر بگذارد. به منظور ارزیابی اینکه آیا تفاوت در خواص ایمونوژنیک بین لات های ناقل تجزیه و تحلیل شده به دلیل تفاوت در نسبت ذرات ناقل پر و خالی است، ما تیتر کپسیدهای بردار را در تمام لات های AAV توسط ELISA تیتراسیون AAV تعیین کردیم و کپسید/VG را محاسبه کردیم. نسبت جالب توجه است که تفاوت های زیادی در نسبت کپسید/vg بین تمام لات های AAV پیدا شد (شکل 2). تقریباً دو برابر کپسیدهای بیشتری نسبت به vg (2:1) در لات های AAV8-CMV-eGFP A-HEK-1، A-HEK-3، A-Sf{11} یافت شد. } و AAV{12}}CMV-eGFP B-Sf9-1؛ و چهار برابر بیشتر (4:1) در AAV8 lot A-Sf{20}}. نسبت 1:1 در بقیه لات ها مشاهده شد. با این حال، هیچ تفاوت معنی‌داری بین نسبت کپسید/vg لات‌های ناقل AAV "ایمن زا" و "غیر ایمنی زا" در AAV8 (P{25}}.27) و در AAV2 (P=0.37) یافت نشد. لات های برداری (شکل 2). این نشان می‌دهد که تفاوت‌ها در ویژگی‌های ایمنی‌زایی تعداد زیادی بردار AAV تجزیه‌وتحلیل‌شده نیز به تفاوت در نسبت ذرات بردار پر و خالی مربوط نمی‌شود.

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

شناسایی تعداد زیادی بردار AAV8 "ایمونوژنیک" توسط TLR9.

نشان داده شده است که تشخیص ایمنی ذاتی AAV توسط pDCهای موش و انسان با سنجش DNA TLR99 انجام می شود. بر این اساس، ما ارزیابی کردیم که آیا TLR9 در شناسایی تعداد زیادی بردار "ایمن‌زا" AAV8 ما نیز نقش داشته است یا خیر. برای این منظور، pDCها همانطور که توضیح داده شد، کاشته شدند و با آنتاگونیست TLR9 H154 (50 میکرومولار) و سپس با تحریک با لات های ناقل AAV8 "ایمونوژنیک" A-HEK{8}}، A-HEK{10}}، کشت داده شدند. -HEK{12}} و A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). پس از 18 ساعت، هیچ شواهدی از تکثیر سلولی مشاهده نشد (شکل 3a) و کاهش قابل توجهی در انتشار IP{20}}، MIP{21}}، TNF- و IFN- اندازه گیری شد (شکل. 3 ب). این نشان می‌دهد که پاسخ‌های ایمنی به تعداد زیادی وکتور AAV8 «ایمن‌زا» در pDC‌های انسانی با سیگنال‌دهی TLR9 انجام می‌شود.

شکل 2. مقایسه نسبت کپسید/vg بین لات های مختلف AAV8-CMV-eGFP و AAV2-CMV-eGFP. نسبت کپسید/vg از اندازه‌گیری جذب (ELISA) و نتایج ddPCR (الف) هشت لات بردار AAV8 و (ب) چهار لات بردار AAV2 حاصل می‌شود. خطوط بریده بردار AAV "ایمن زا" را از "غیر ایمنی زا" جدا می کند. میله ها میانگین و انحراف معیار تکرارها را نشان می دهند. معنی‌داری آماری با استفاده از آزمون t غیر زوجی تعیین شد.

شکل 3. شناسایی لات های ناقل AAV{1}"ایمونوژنیک" CMV-eGFP توسط pDCها وابسته به TLR9 است. pDCهای انسانی با آنتاگونیست TLR9 H154 (5{24}} میکرومولار) و به دنبال آن تحریک با تعداد زیادی بردار AAV8 "ایمونوژنیک" (MOI: 1:1×106 vg) به مدت 18 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. (الف) تصاویر میدان روشن نماینده pDCهای خالص شده که با لات های بردار AAV "ایمن زا" (تصویر بالایی) یا لات های بردار AAV "ایمن زا" و H154 (تصویر پایین) درمان شده اند. نوار مقیاس 100 میکرومتر است. (ب) انتشار سیتوکین IP{14}}، MIP{15}}، TNF-، و IFN- 2 توسط pDCهای تحریک شده. از آنجایی که در اندازه‌گیری‌های IFN{18}}، برخی از مقادیر زیر محدوده سنجش قرار گرفتند، ثابت 1 برای ارائه در نمودار نیمه لگاریتمی به همه مقادیر اندازه‌گیری‌شده IFN- 2 اضافه شد. میانگین و انحراف معیار نشان داده شده است. اهمیت آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و تحلیل تعقیبی هولم سیداک تعیین شد. مقادیر P: کمتر یا مساوی 0.05: *; کمتر یا مساوی 0.01: **; کمتر یا مساوی 0.001: ***.

درمان با DNase پاسخ های ایمنی تعداد زیادی ناقل AAV8 و AAV2 "ایمن زا" را کاهش می دهد.

در حالی که وکتورهای "ایمونوژنیک" AAV8 یک پاسخ ایمنی وابسته به TLR را در pDCها برانگیختند، چنین پاسخ هایی توسط لات های "غیر ایمنی زا" ایجاد نشد. TLR9 در پاسخ به DNA، به ویژه DNA حاوی نقوش CpG غیر متیله9 فعال می شود. نکته مهم، اندازه‌گیری‌های ddPCR ما تأیید کرد که همان اجزای DNA ویروسی در هر دو لات‌های ناقل «ایمونوژنیک» و «غیر ایمنی‌زا» وجود دارد. در مجموع، این نشان می‌دهد که DNA بسته‌بندی نشده/آزاد در سوسپانسیون ویروسی به جای DNA درون ویروسی می‌تواند عامل ایجاد کننده پاسخ‌های ایمنی مشاهده‌شده به تعداد زیادی ناقل AAV "ایمن‌زا" باشد. از این رو، اگر DNA آزاد باقیمانده در سوسپانسیون ویروسی لات های ناقل AAV8 "ایمن زا" وجود داشته باشد، پاسخ ایمنی ذاتی باید توسط DNase تضعیف شود. برای آزمایش این فرضیه، تعداد زیادی ناقل AAV8 و AAV2 "ایمن زا" با DNase I (100 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 30 دقیقه قبل از تحریک AAV پیش تیمار شدند. برای حذف اثرات غیر اختصاصی درمان DNase بر روی pDCها یا ذرات AAV، در تحریک‌های AAV فقط، وکتورها قبل از تحریک pDC تحت درمان DNasemock قرار گرفتند. در این تیمارهای ساختگی بدون DNase، ذرات AAV در دمای 37 درجه در یک محیط هضم DNase یکسان برای مدت زمان مشابه AAVهای تیمار شده با DNase انکوبه شدند. ده، pDC با تعداد زیادی بردار AAV "ایمونوژنیک" درمان شده با DNase از قبل تیمار شده یا با درمان ساختگی (MOI: 1:1 × 106 Vg) بذر و تحریک شدند. pDCهایی که فقط با DNase انکوبه شدند یا با وسیله نقلیه تحت درمان قرار گرفتند، به عنوان کنترل عمل کردند. جالب توجه است که تیمار DNase تعداد زیادی ناقل AAV8 و AAV2 "ایمن زا" تکثیر سلولی واکنشی را کاهش داد (شکل 4a) و یا به طور کامل لغو شد (AAV8 لات A-HEK-2 و A-Sf9-1؛ لات های AAV2 B-Sf9-1 و B-Sf9-2) یا کاهش قابل توجهی (AAV8 lots A-HEK-1 and A-HEK-3) انتشار IP{40} }، MIP{41}}، TNF- و IFN- پس از تحریک AAV (شکل 4b،c). برای تأیید اینکه اثر DNase مشاهده شده در واقع توسط هضم DNA خارج از ویروس ایجاد می شود و نه توسط تأثیر DNase بر یکپارچگی ناقل، بررسی کردیم که آیا درمان با DNase تعداد زیادی وکتور AAV بر ظرفیت انتقال AAV تأثیر می گذارد یا خیر. از آنجایی که کاربرد AAV منجر به هیچ انتقال pDC قابل تشخیصی نشد، از سلول‌های HEK برای این سنجش‌ها استفاده شد، زیرا سلول‌های HEK یک مدل سلولی شناخته شده برای تجزیه و تحلیل کارایی ترانسداکشن بر روی انتقال AAV هستند. ما سلول‌های HEK293T را با لات‌های وکتور AAV8 و AAV2 تیمار شده با DNase و شم (MOI: 1:8 × 104 vg) تحریک کردیم و کارایی انتقال را با میکروسکوپ فلورسانس 3 روز پس از کاربرد وکتور ارزیابی کردیم. همانطور که توضیح داده شد، وکتورهای AAV2 قدرت انتقال بالاتری را در مقایسه با وکتورهای AAV8 نشان دادند. علاوه بر این، مهمتر از همه، پیش تیمار با DNase نه بازده انتقال را در تعداد زیادی بردار AAV8 و AAV2 مشتق شده از HEK و نه در تعداد زیادی از سلول های Sf{61} کاهش داد (شکل S5a,b). این نتایج شواهد بیشتری را ارائه می‌دهند که اثر DNase بر ویژگی‌های ایمونوژنیک تعداد زیادی ناقل به دلیل تخریب DNA خارج از ویروس است. اگرچه آنتاگونیست TLR9 H154 اساساً آزادسازی سیتوکین های پیش التهابی را برای هر چهار لات AAV8 ایمونوژن (شکل 3) لغو کرد، اما پیش درمان با DNase می تواند پاسخ سیتوکین پیش التهابی را برای لات های AAV8 A-HEK نیز از بین ببرد{75} } و A-Sf9-1، در حالی که آن را برای لات های AAV8 A-HEK-1 و A-HEK-3 به طور کامل حذف نکرد (شکل 4). برای آزمایش اینکه آیا افزایش زمان درمان با DNase می‌تواند این پاسخ سیتوکین را لغو کند، آزمایش‌های شبیه‌سازی pDCs را به دنبال افزایش ده برابری زمان انکوباسیون DNase در لات‌های مربوطه (A-HEK{85}} و A-HEK{87}) تکرار کردیم. }). ما مشاهده کردیم که پس از درمان DNase از وکتورها به مدت 5 ساعت، میانگین غلظت سیتوکین در مایع رویی سلول های تحریک شده با AAV بیشتر کاهش یافت و دیگر تفاوت معنی داری با کنترل وسیله نقلیه نداشت. این الگوی پاسخ را می‌توان در سه آزمایش تأیید کرد، که هر آزمایش با سلول‌های یک اهداکننده انجام شد (شکل S6). این نشان می دهد که علت اصلی پاسخ ایمنی پیش التهابی وابسته به TLR در pDCها در واقع DNA خارج از ویروس است. به منظور آزمایش اینکه آیا انتشار DNA داخل ویروسی باعث افزایش فعالیت ایمنی بردارهای AAV می‌شود، ما عمداً کپسیدهای ویروسی AAV8 "ایمونوژنیک" A-HEK{97}} را با عملیات حرارتی در دمای 95 درجه به مدت 10 دقیقه باز کردیم. . سپس مقدار وکتور عملیات حرارتی شده برای تحریک pDCها مورد استفاده قرار گرفت. اگرچه هیچ تفاوتی در تکثیر سلولی واکنشی بر تحریک AAV8 A-HEK{103}} با و بدون عملیات حرارتی وجود نداشت، افزایش قابل‌توجهی در انتشار IP{104}}، MIP{105}} ، TNF- و IFN- در شرایط تیمار گرم شده، نشان می دهد که انتشار DNA ویروسی محصور شده در سوسپانسیون ناقل می تواند به القای پاسخ های ایمنی کمک کند (شکل 5). این داده‌ها با هم نشان می‌دهند که آماده‌سازی‌های وکتور AAV ممکن است حاوی آلاینده‌های DNA خارج از ویروس باشند که می‌توانند پاسخ‌های ایمنی خاص در pDCها را تحریک کنند. این پاسخ‌ها با سیگنال‌دهی TLR9 انجام می‌شوند و می‌توانند با درمان تعداد زیادی ناقل با DNase کاهش یا لغو شوند.

شکل 4. پیش تیمار با DNase پاسخ های ایمنی ناشی از تعداد زیادی ناقل AAV8-CMV-eGFP و AAV{4}}CMV-eGFP "ایمن زا" را کاهش می دهد. pDCهای انسانی با تعداد زیادی ناقل AAV8 "ایمن زا" تیمار شده با DNase به مدت 18 ساعت تحریک شدند (MOI: 1:1×106 vg). (الف) تصاویر فلد روشن نمایشی از pDCهای خالص شده تحریک شده با تعداد زیادی بردار AAV "ایمن زا" (تصویر بالایی) و تعداد زیادی بردار AAV "ایمن زا" پیش تیمار شده با 1{{3{32}}}}0 میکروگرم در میلی لیتر DNase من (تصویر پایین). نوار مقیاس 500 میکرومتر است. (ب) انتشار سیتوکین IP{15}}، MIP{16}}، TNF-، و IFN{18}} توسط PDCهای تحریک‌شده توسط AAV{19}}. (ج) آزادسازی سیتوکین توسط PDCهای تحریک شده با AAV{20}. از آنجایی که در اندازه‌گیری‌های IFN- 2 (b و c) و اندازه‌گیری TNF- (b)، برخی از مقادیر زیر محدوده سنجش قرار گرفتند، ثابت 1 به همه مقادیر اندازه‌گیری شده IFN{- 2 و TNF- برای ارائه در نمودار نیمه لگاریتمی میانگین و انحراف معیار نشان داده شده است. اهمیت آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و تحلیل تعقیبی هولم سیداک تعیین شد. مقادیر P: کمتر یا مساوی 0.05: *; کمتر یا مساوی 0.01: **; کمتر یا مساوی 0.001: ***.

تجزیه و تحلیل اکتشافی آلاینده‌های DNA خارج از ویروس در آماده‌سازی‌های وکتور AAV8.

برای انجام اولین توصیف اکتشافی اجزای DNA خارج از ویروس در لات های وکتور AAV، یک نماینده "ایمن زا" (A-HEK-1) و "غیر ایمنی زا" (B-HEK-1) است. تعداد زیادی بردار مشتق از سلول HEK مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. این لات ها یا در محیط pDC به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه تیمار شدند، یا با استفاده از دستگاه فیلتر برش 100 کیلو دالتون تحت درمان ساختگی و فوق فیلتر شدند، یا فقط به صورت ساختگی انجام شدند (شکل S7a- ز). جداسازی متوالی Bioanalyzer LabChip و ارزیابی DNA خالص شده، وجود مقادیر قابل مقایسه DNA ناقل (شکل S7b-g) را در نمونه‌های تیمار شده و آزمایش‌شده هر لات نشان داد که تأیید می‌کند که نه اولترافیلتراسیون و نه تیمار DNase بر محتوای DNA تأثیر نمی‌گذارد. داخل کپسید بعلاوه، نشان داد که فقط بخش ناقل "ایمن زا" (شکل S7a-d) اما نه "غیر ایمنی زا" (شکل S7a,e-g) حاوی مولکول های DNA اضافی در اندازه های 100 تا 450 جفت باز است (شکل S7c،d و h). نکته مهم این است که این مولکول‌های DNA اضافی را می‌توان در نمونه آزمایش‌شده و نمونه اولترا فیلتر شده شناسایی کرد، اما عملاً در نمونه تیمار شده با DNase وجود نداشت (شکل S7a-d). این نشان می‌دهد که این مولکول‌های DNA، آلاینده‌های DNA خارج از ویروس را نشان می‌دهند که می‌توانند توسط DNase تجزیه شوند، اما نمی‌توان آنها را با اولترافیلتراسیون از سوسپانسیون ناقل خارج کرد. سرمایه گذاری مبنی بر اینکه این آلاینده ها را فقط می توان در تعداد ناقل "ایمن زا" شناسایی کرد، اما نه در تعداد ناقل "غیر ایمن زا"، ثابت می کند که وقوع این مولکول های DNA خارج از ویروس بسیار خاص است و علاوه بر این ممکن است نشان دهد که این مولکول ها باعث القا یا مشارکت می شوند. به خواص ایمنی محرک ناقل. برای ارزیابی منبع بالقوه DNA آلوده کننده در تجزیه و تحلیل کمی (q)PCR HEK "ایمونوژنیک" (A-HEK{36}}) و "غیر ایمنی زا" (B-HEK-1) DNA سلولی، DNA پلاسمید و DNA ناقل AAV انجام شد. DNA الگو از نمونه‌های تیمار شده با DNase، آزمایش‌شده و اولترا فیلتر شده و فقط نمونه‌های آزمایش‌شده از هر لات برای تکثیر تکرار Alu، ژن NPIP چند نسخه‌ای ژنوم هسته‌ای و توالی‌های ژن 16S rRNA میتوکندری (mt16S) با منشأ سلول HEK استفاده شد. برای تکثیر یک آمپلیکون تکراری ترمینال معکوس AAV8 (ITR2؛ ناقل و منشا DNA پلاسمید ترانس ژن)، و برای تقویت یک آمپلیکون برای ژن blah (مقاومت به آمپی سیلین) (Amp؛ منشاء DNA پلاسمید) (جدول S4). مقایسه نسبت مقادیر ΔCt آمپلیکون اختصاصی DNA سلول HEK در مقابل آمپلیکون ITR2 (یعنی Alu در مقابل ITR2، NPIP در مقابل ITR2 و mt16S در مقابل ITR2) و آمپلیکون اختصاصی DNA پلاسمید در مقابل آمپلیکن ITR2 (Amp) در مقابل ITR2)، به ترتیب نشان می دهد که دو لات حاوی مقادیر ناچیزی از DNA هسته ای و میتوکندری سلول HEK هستند. در مقابل، تجزیه و تحلیل مقدار مناسبی از DNA پلاسمید را در هر دو گروه ناقل "ایمن زا" و "غیر ایمنی زا" نشان داد (به ترتیب حدود 1/32 و 1/50، از نظر تعداد کپی نسبت به DNA AAV)، نسبتی که به خوبی در محدوده مقادیر گزارش شده برای سایر بردارهای AAV12 قرار دارد (شکل S7). با این وجود، هیچ تفاوت آشکاری در نسبت نسبی DNA ناقل به پلاسمید و DNA سلول HEK بین نمونه‌های تیمار شده با DNase و تیمار ساختگی یا فوق فیلتر شده و نمونه‌های تیمار ساختگی هر دو لات وکتور وجود نداشت (شکل S8). این ممکن است نشان دهد که DNA آلاینده غیر بسته بندی شده از نظر ترکیب توالی هدف مشابه DNA بسته بندی شده است. با این حال، یک محدودیت در تجزیه و تحلیل qPCR اندازه DNA آلاینده (100-450 جفت باز) است که شامل بخش مناسبی از قطعات با توالی هدف ناقص است.

شکل 5. آزادسازی DNA داخل ویروسی با عملیات حرارتی ناقل ها، پاسخ های سیتوکین های پیش التهابی را در pDC ها افزایش می دهد. انتشار سیتوکین IP-10، MIP{4}}، TNF- و IFN- 2 توسط pDCها 18 ساعت پس از تحریک با AAV8 لات A-HEK{11}} (MOI: 1:1× 106 vg). خطوط افقی میانگین و انحراف معیار را نشان می دهد. تفاوت آماری معنی‌داری بین پاسخ‌های سیتوکین ناشی از وکتورهای تیمار نشده و تیمار نشده با استفاده از آزمون t-student تعیین شد. مقدار P: کمتر یا مساوی با 0.01: **; کمتر یا مساوی 0.001: ***.

بحث

وکتورهای AAV یکی از امیدوارکننده ترین ابزارها در ژن درمانی هستند. با این حال، انباشت شواهد این دیدگاه را به چالش می کشد که ایمنی زایی AAV ناچیز است. با توجه به این موضوع، درک بهتر مکانیسم هایی که توسط آن پاسخ های ایمنی به AAV رخ می دهد، اهمیت فزاینده ای پیدا کرده است. در این مطالعه نشان می‌دهیم که (1) AAV8 و AAV2 باعث ایجاد پاسخ‌های ایمنی ذاتی خاص در pDCهای انسانی می‌شوند که نه مختص نسبت کپسید/vg هستند و نه پلت فرم تولید و نه روش سازنده/تصفیه. (2) پاسخ های ایمنی ذاتی در pDC ها به سیگنال دهی TLR9 وابسته است و می توان با پیش تیمار با DNase کاهش داد. (3) درمان DNase بر یکپارچگی ذره ناقل تأثیر نمی گذارد زیرا نرخ انتقال تعداد زیادی بردار AAV8 و AAV2 را در سلول های HEK293T کاهش نمی دهد. و (4) لات های وکتور AAV می توانند شامل مولکول های DNA خارج از ویروس باشند که می توانند با درمان لات ناقل با DNase حذف شوند. این نشان می‌دهد که هر دو آماده‌سازی AAV مشتق از HEK و Sf{15}}می‌توانند حاوی ناخالصی‌های DNA خارج از ویروس باشند که پاسخ ایمنی ذاتی را تحریک می‌کنند. در یک مطالعه اخیر، تجزیه و تحلیل مقایسه ای با استفاده از وکتورهای AAV از گونه های مختلف سلول میزبان (سلول های HEK و سلول های Sf9)11 انجام شد. نویسندگان دریافتند که بردارهای مشتق شده از HEK و Sf{21}}از نظر PTM و ناخالصی‌های باقی‌مانده پروتئین سلول میزبان در همه سروتیپ‌های AAV و تولیدکنندگانی که آزمایش کردند، متفاوت هستند. علاوه بر این، آنها پاسخ سیتوکین فیبروبلاست‌های اولیه انسانی به انتقال AAV را تجزیه و تحلیل کردند و دریافتند که ناقل‌های مشتق از HEK و Sf{23}} ممکن است در خواص ایمنی‌زایی خود متفاوت باشند. در مطالعه خود، ما همچنین این دو سیستم تولید اصلی را با استفاده از تعداد زیادی از ساختار مشابه AAV از سازندگان مختلف و دو سروتیپ مختلف مقایسه کردیم. با این حال، پاسخ‌های ایمنی ناشی از ناقل که ما در مدل pDC انسانی خود مشاهده کردیم، به طور خاص به یک سیستم تولید، سازنده یا سروتیپ معین مربوط نبودند، در عوض، آن‌ها به مقدار زیادی اختصاص داشتند. مطالعات پیش‌بالینی و بالینی قبلی ژن‌درمانی شبکیه گزارش کرده‌اند که پاسخ‌های ایمنی به ناقل‌های AAV، مانند التهاب چشمی یا ارتشاح سلول‌های ایمنی، ممکن است تحت‌تاثیر تفاوت‌های نسبت کپسید/vg18 یا تفاوت‌های دوز قرار گیرند. تیمرز و همکاران 18 نشان دادند که حذف کپسیدهای خالی AAV از سوسپانسیون ویروسی باعث کاهش التهاب و بهبود انتقال ویروس در یک مطالعه پیش بالینی با پستانداران غیر انسانی شد. با این حال، نتایج ما نشان داد که نسبت کپسید/vg بالا در هر دو گروه ناقل AAV "ایمن زا" و "غیر ایمنی زا" وجود دارد، به این معنی که تعداد بیشتری از کپسیدها (کپسیدهای خالی) در سوسپانسیون ویروسی مسئول القای بیماری نیستند. پاسخ‌های ایمنی خاص بردار در مدل pDC انسانی ما. علاوه بر این، ما قبلا نشان داده‌ایم که AAV8 پاسخ‌های ایمنی را به شیوه‌ای وابسته به دوز در پستانداران غیرانسانی القا می‌کند. با این حال، افزایش دوز بردارهای AAV "غیر ایمنی زا" در این مطالعه برای تحریک پاسخ ایمنی در pDCهای انسانی کافی نبود. بنابراین، برای درک علت تفاوت در خواص ایمنی ناقل ها، مکانیسم دخیل در تشخیص تعداد زیادی AAV "ایمن زا" را بررسی کردیم. استفاده از مدل‌های سلولی دارای قابلیت ایمنی آزمایشگاهی به دانشمندان این امکان را داده است تا نقش مسیرهای TLR را در پاسخ‌های ایمنی ذاتی تولید شده توسط بردارهای AAV با دقت بیشتری مطالعه کنند. Zhu و همکاران 9frst توضیح دادند که pDCها، اما نه DCهای معمولی یا غیر pDC، مقادیر زیادی از IFN نوع I و سیتوکین های پیش التهابی را در پاسخ به تحریک AAV آزاد می کنند و دخالت مسیر TLR9 را در شناسایی AAV8 و AAV2 نشان دادند. با استفاده از pDC های ماوس نویسندگان همچنین مشاهده کردند که AAV2 پاسخ‌های ایمنی وابسته به TLR را در pDCهای انسانی القا می‌کند. در مطالعه ما، با استفاده از یکی از خاص ترین آنتاگونیست های TLR9، H1549،21-24، به طور غیرمستقیم نشان دادیم که نه تنها AAV2، بلکه بردارهای AAV8 نیز پاسخ های ایمنی ذاتی وابسته به TLR را در pDCs انسان القا می کنند. اما به شیوه ای بسیار خاص از آنجایی که TLR9 یک گیرنده DNA است، این نشان می دهد که پاسخ های ایمنی به تعداد زیادی وکتور AAV "ایمن زا" توسط اجزای DNA القا می شود. با این حال، اگرچه اندازه‌گیری‌های ddPCR ما تأیید کرده بود که همان اجزای DNA بسته‌بندی‌شده در هر دو لات‌های ناقل «ایمن‌زا» و «غیر ایمنی‌زا» وجود دارد، لات‌های «غیر ایمنی‌زا» پاسخ‌های ایمنی را در pDCs ایجاد نکردند. علاوه بر این، تیمار با DNase خواص ایمنی محرک تعداد زیادی وکتور AAV "ایمن زا" را کاهش یا لغو کرد، اما قدرت انتقال این وکتورها را در سلول‌های HEK کاهش نداد، که نشان می‌دهد که درمان DNase AAV DNA خارج ویروسی غیر کپسوله‌شده را هدف قرار می‌دهد. تعلیق بردار اما بر یکپارچگی ژنوم ناقل در کپسید دست نخورده تأثیری نداشت. این بیشتر با تجزیه و تحلیل DNA مقایسه ای تعداد زیادی ناقل "ایمونوژنیک" و "غیر ایمنی زا" تحت درمان با DNase و درمان ساختگی تایید شد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

در مجموع، همه این آزمایش‌ها نشان می‌دهند که پاسخ ایمنی به تعداد زیادی ناقل «ایمن‌زا» در pDC‌ها توسط DNA موجود در ذرات AAV (یعنی ژنوم ناقل یا ناخالصی‌های DNA بالقوه بسته‌بندی شده در کپسیدهای AAV) تنظیم نشده است، بلکه توسط DNA خارج از ویروسی قابل دسترسی تنظیم شده است. اجزای موجود در سوسپانسیون های ویروسی (یعنی DNA در خارج یا محافظت نشده توسط کپسید ویروسی). ما همچنین مشاهده کردیم که وقتی DNA موجود در کپسیدهای ویروسی یک مقدار ناقل "ایمن زا" با عملیات حرارتی ناقل در معرض سلول ها قرار گرفت، پاسخ ایمنی افزایش یافت. مشخص نیست که آیا افزایش فعالیت ایمنی پس از باز کردن کپسیدها به دلیل DNA تک رشته ای ناقل بوده یا به دلیل ناخالصی های بالقوه بسته بندی شده در کپسیدهای AAV مانند اسیدهای نوکلئیک سلول میزبان باقی مانده، توالی های DNA کمکی باقیمانده، توالی ستون فقرات. قطعات بسته بندی شده همراه با کاست یا پرایم معکوس از ITR ها که منجر به قطعات کوچک ستون فقرات بسته بندی شده در AAV12,25 می شود. مکانیسم دقیق جذب DNA خارج از ویروس توسط pDCها ناشناخته باقی مانده است. واکنش pDCها به الیگونوکلئوتیدهای CpG نشان می دهد که pDCها می توانند به DNA26 آزاد واکنش نشان دهند. این نشان می دهد که پاسخ ایمنی در pDC ها ممکن است با جذب DNA آلوده کننده رایگان موجود در سوسپانسیون ناقل ایجاد شود. بعلاوه، نشان داده شده است که pDCها می توانند وکتورهای AAV27 را بگیرند که به طور متناوب نشان می دهد که DNA بالقوه متصل به کپسید می تواند در طول جذب ذرات AAV به داخل سلول منتقل شود. وجود آلودگی DNA خارج از ویروس در آماده‌سازی‌های ناقل AAV یا می‌تواند یکی از ویژگی‌های ذاتی تعداد ناقل مربوطه ناشی از فرآیند تولید و خالص‌سازی وکتورها باشد، یا می‌تواند به دلیل انتشار DNA کپسوله‌شده به دلیل شرایط نامناسب نگهداری باشد. . همه لات های وکتوری که در این آزمایش ها مورد بررسی قرار گرفتند در یک دوره زمانی به دست آمدند (5 مورد از 8 لات بردار AAV8 مورد بررسی قرار گرفت، که دو مورد "ایمونوژنیک" بودند (A-HEK{13}}؛ A-HEK{15}}) و سه مورد "غیر ایمنی زا" بودند (A-Sf9-2؛ B-Sf9-1؛ B-Sf9-2) حتی به طور موازی به طور خاص برای این مطالعه تولید شدند). هر تولید کننده در جعبه های حمل و نقل یکسانی حمل شد و پس از دریافت، همه لات ها در کنار هم در یک کشوی یک فریزر 80- درجه محافظت شده با هشدار دما ذخیره شدند قبل از اینکه مقدار کمی از همه لات ها به طور همزمان ذوب شوند و روی pDC ها اعمال شوند. در آزمایش های جانبی این به شدت نشان می‌دهد که فرآیند تولید و خالص‌سازی AAV، به جای ذخیره‌سازی نامناسب، مسئول تفاوت در محتوای DNA خارج از ویروس و خواص ایمنی تحریک‌کننده این تعداد است. در گذشته، مقادیر بالینی ناقل AAV تولید شده برای ژن درمانی (alipogene tiparvovec، Glybera) به دلیل مقادیر بالای ناخالصی از جمله DNA28 سلول میزبان بالقوه ایمونوژنیک دیگر مجاز نبودند. حذف ناخالصی های DNA از سوسپانسیون های ویروسی معمولاً در طول فرآیند تولید انجام می شود. در اینجا درمان Benzonase29 یا DNase30 به طور معمول به منظور حذف DNA باقی مانده از سوسپانسیون ویروسی نهایی اعمال می شود. این درمان بسته به پروتکل بین 30 دقیقه تا 3 ساعت طول می کشد و سپس آنزیم توسط مواد شیمیایی مانند نمک های کلرید سزیم غیر فعال می شود. در آزمایش‌های ما، چهار عدد از پنج لات‌های AAV8 مشتق‌شده از مرکز هسته ناقل ویروسی دانشگاه آیووا، و هر دو لات‌های وکتور AAV2 از Virovek در pDCها ایمنی‌زا بودند. همانطور که در بخش "مواد و روش ها" توضیح داده شد، فرآیند خالص سازی لات های برداری از هر دوی این سازنده ها شامل چندین مرحله تصفیه است که برخی از آنها تفاوت های زیادی با یکدیگر دارند. بنابراین، فرآیند تصفیه در مرکز مرکزی در آیووا شامل تیمار توربونوکلئاز و به دنبال آن اولتراسانتریفیوژ با گرادیان یدیکسانول، کروماتوگرافی ستون تبادل آنیون، عقیم سازی فلاتر و تبادل بافر با استفاده از فیلترهای گریز از مرکز است. در مقابل، Virovek از تیمار بنزوناز، اولتراسانتریفیوژ در CsCl و سپس نمک زدایی و استریل کردن فیلتر استفاده می کند. از طرف دیگر، فرآیند خالص سازی Vigene شامل تیمار DNase نمی شود، اما همانطور که توسط Core Facility در آیووا استفاده می شود، شامل اولتراسانتریفیوژ با گرادیان یدیکسانول است. با این حال، با کمال تعجب، هیچ یک از سه لات ناقل مشتق شده از Vigene (AAV8: C-HEK{40}}؛ AAV2: C-HEK-1 و 2) پاسخ های ایمنی را در pDC ها القا نکردند، که نشان می دهد که "غیر ایمنی زا مقدارهای برداری همچنین می توانند با فرآیندهای تولیدی که شامل درمان DNase نیستند تولید شوند.

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

به طور کلی، مراحل خالص سازی تا حدی مشابه و تا حدی متفاوت که توسط سه سازنده استفاده می شود، پیوند دادن خواص ایمنی زایی ناقل های مشاهده شده در pDC را به یک مرحله واحد در فرآیند تولید دشوار می کند. کارآزمایی‌های بالینی از بردارهای درجه عملکرد تولید خوب (GMP) استفاده می‌کنند که تحت کنترل‌های کیفی سخت‌گیرانه قرار دارند. هیچ یک از وکتورهای سه تولیدکننده مورد استفاده در این مطالعه دارای درجه عمل آزمایشگاهی خوب (GLP) نیستند و بنابراین ممکن است خلوص کمتری نسبت به وکتورهای درجه بالینی داشته باشند. بنابراین، مهم است که تشخیص دهیم که ناقل‌های GMP مورد استفاده در کارآزمایی‌های بالینی روی انسان ممکن است تفاوت‌هایی را که در مطالعه حاضر مشاهده کردیم را نشان دهند یا نداشته باشند و اینکه ارتباط یافته‌های ما برای استفاده بالینی ژن‌درمانی‌ها مشخص نیست. با این حال، در تجربه خود ما، تفاوت‌های خاص قابل توجهی در غلظت اجزای آلوده‌کننده مانند پروتئین‌های سلول میزبان می‌تواند حتی با ناقل‌های درجه GMP رخ دهد، و حتی در ناقل‌های درجه GMP، هیچ مشخصات یکسانی در مورد سطوح مورد توافق وجود ندارد. قابل قبول 5. در مجموع، بهبود فرآیند تولید وکتورهای AAV برای جلوگیری از حضور ناخالصی‌های باقیمانده در سوسپانسیون‌های ویروسی به منظور به حداقل رساندن پتانسیل پاسخ‌های ایمنی ناخواسته، کلیدی است. در نتیجه، ما نشان دادیم که ناخالصی‌های DNA خارج از ویروس می‌توانند بر خواص ایمنی بردارهای AAV در pDCهای انسانی تأثیر بگذارند. مطالعات بیشتری برای بررسی پیامدهای این یافته ها برای ایمنی ژن درمانی با واسطه AAV در مدل های حیوانی یا بیماران انسانی مورد نیاز است.

منابع

1. Gaj، T.، Epstein، BE & Schafer، مهندسی ژنوم DV با استفاده از ویروس مرتبط با آدنو: کاربردهای تحقیقاتی اساسی و بالینی. مول. تر. 24، 458-464 (2016).

2. گاریتا هرناندز، ام. و همکاران. انتقال ژن با واسطه AAV به ارگانوئیدهای شبکیه سه بعدی مشتق شده از سلول های بنیادی پرتوان القایی انسان. بین المللی جی. مول. علمی 21, 994 (2020).

3. راسل، اس و همکاران. اثربخشی و ایمنی voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) در بیماران مبتلا به دیستروفی ارثی شبکیه با واسطه RPE: یک کارآزمایی تصادفی، کنترل‌شده، برچسب باز، فاز 3. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. تکامل درمان های AAV ارائه شده به سوی درمان های نهایی. جی. مول. پزشکی 99، 1-25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD پاسخ های ایمنی به ژن درمانی شبکیه با استفاده از ناقل های ویروسی مرتبط با آدنو - پیامدهایی برای موفقیت و ایمنی درمان. Prog. رتین. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. رایشل، FF و همکاران. AAV8 می تواند پاسخ های ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​را در چشم نخستی القا کند. مول. تر. 25, 2648–2660 (2017).

7. بوید، RF و همکاران. کاهش انتقال شبکیه و افزایش ایمنی زایی مبتنی بر ژن با تحویل داخل زجاجیه ای rAAV به دنبال ویترکتومی خلفی در سگ ها. ژن تر. 23, 548-556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. ارزیابی طولی کانون‌های واکنش‌دهنده بیش از حد در شبکیه به دنبال تحویل زیر شبکیه‌ای ویروس مرتبط با آدنو در پستانداران غیر انسانی. ترجمه Vis. علمی تکنولوژی 10، 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-مسیر MyD88 برای پاسخ‌های ایمنی تطبیقی ​​به ناقل‌های ژن درمانی ویروس مرتبط با آدنو در موش حیاتی است. جی. کلین. تحقیق کنید. 119، 2388-2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. گیرنده شبه تلفات 2-واکنش ایمنی ذاتی را در سلول‌های کبد غیرپارانشیمی انسان نسبت به ناقل‌های ویروسی مرتبط با آدنو انجام می‌دهد. کبدشناسی 55، 287-297 (2012).

11. روماچیک، NG و همکاران. روش‌ها اهمیت دارند: پلت‌فرم‌های تولید استاندارد برای AAV نوترکیب ناقل‌های شیمیایی و عملکردی متمایز تولید می‌کنند. مول. تر. روش ها کلین. توسعه دهنده 18، 98-118 (2020).

12. ناخالصی‌های مربوط به محصول رایت، JF در ناقل‌های AAV نوترکیب درجه بالینی: شناسایی و ارزیابی خطر. Biomedicines 2، 80-97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC ساخت وکتورهای ویروسی مرتبط با آدنو نوترکیب برای آزمایشات بالینی. مول. تر. روش ها کلین. توسعه دهنده 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. فارماکولوژی تولید ویروس آدنو مرتبط با نوترکیب. مول. تر. روش ها کلین. توسعه دهنده 8، 166-180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. بیولوژی سلولی دندریتیک پلاسماسیتوئید و نقش آن در بیماری های ناشی از ایمنی. کلین ترجمه ایمونول. 9, e1139 (2020).

16. فیشر، MD و همکاران. اثربخشی و ایمنی ژن درمانی شبکیه با استفاده از ناقل ویروس مرتبط با آدنو برای بیماران مبتلا به کوروئیدرمی: یک کارآزمایی بالینی تصادفی شده. JAMA Ophthalmol. 137، 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. نتایج 2 سال پس از ژن درمانی برای آموروز مادرزادی ناقص RPE و دیستروفی شدید شبکیه در اوایل دوران کودکی. Ophthalmology 123, 1606-1620 (2016).

18. تایمرز، AM و همکاران. پاسخ التهابی چشمی به تزریق داخل زجاجیه ناقل ویروس مرتبط با آدنو: سهم نسبی ژنوم و کپسید. هوم ژن تر. 31، 80–89 (2020).

19. ران، جی و همکاران. جهش‌زایی جهت‌دهی مکان، کارایی انتقال وکتورهای AAV نوترکیب مشتق از کتابخانه کپسید را بهبود می‌بخشد. مول. تر. روش ها کلین. توسعه دهنده 17، 545–555 (2020).

20. الیس، BL و همکاران. بررسی کارایی انتقال in vivo/in vitro سلول‌های اولیه و رده‌های سلولی پستانداران با نه ویروس مرتبط با آدنو طبیعی (AAV1-9) و یک سروتیپ ویروس مرتبط با آدنو مهندسی شده. ویرول. J. 10, 1-10 (2013).

21. یامادا، اچ و همکاران. اثر DNA سرکوب‌کننده بر فعال‌سازی ایمنی ناشی از CpG. J. Immunol. 169، 5590-5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. آنتاگونیست گیرنده 9 شبه تلفن، ایمنی هومورال را در میاستنی گراویس خودایمنی تجربی سرکوب می کند. مول. ایمونول. 94، 200-208 (2018).

23. چان، YK و همکاران. مهندسی ناقل‌های ویروسی مرتبط با آدنو برای فرار از پاسخ‌های ایمنی و التهابی ذاتی. علمی ترجمه پزشکی 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Structure, مکانیسم و ​​کاربرد درمانی الیگونوکلئوتیدهای سرکوب کننده ایمنی. داروسازی Res. 105، 216-225 (2016).

25. بریمبل، MA و همکاران. 547. آماده سازی AAV حاوی آلودگی از توالی های DNA در پلاسمیدهای تولیدی است که مستقیماً خارج از ITR ها هستند. مول. تر. 24, S218–S219 (2016).

26. لاتز، ای و همکاران. TLR9 پس از انتقال از ER به DNA CpG در لیزوزوم سیگنال می دهد. نات. ایمونول. 5، 190-198 (2004).

27. Veron, P. et al. زیرمجموعه‌های اصلی سلول‌های دندریتیک انسانی به‌طور مؤثری توسط ناقل‌های ویروسی مرتبط با آدنو-مکمل 1 و 2 منتقل می‌شوند. J. Virol. 81, 5385-5394 (2007).

28. گزارش ارزیابی: گلایبرا. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. بازدید در 03 مارس 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. پروتکل ارزان و مستقل از سروتیپ برای خالص سازی ویروس آدنو مرتبط با نوترکیب بومی و مهندسی زیستی. جی بیول. Methods 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ تولید و شناسایی ناقل های ویروسی مرتبط با آدنو. نات. پروتکل 1, 1412-1428 (2006).

31. کیمورا، تی و همکاران. تولید وکتورهای ویروسی مرتبط با آدنو برای کاربردهای in vitro و in vivo. علمی Rep. 9, 13601 (2019).

32. آیوسو، ای و همکاران. خلوص ناقل AAV بالا منجر به افزایش کارایی انتقال مستقل از سروتیپ و بافت می شود. ژن تر. 17, 503-510 (2010).