اسیدوز خارج سلولی متابولیسم تک کربنی را محدود می کند و ساقه سلول T را حفظ می کند.

تجمع مواد زائد متابولیک اسیدی در ریزمحیط تومور، عملکردهای مؤثر لنفوسیت‌های متورم کننده تومور (TILs) را مهار می‌کند. با این حال، مشخص نیست که چگونه یک محیط اسیدی بر متابولیسم و ​​تمایز سلول های T تأثیر می گذارد. در اینجا نشان می‌دهیم که قرار گرفتن طولانی‌مدت در معرض اسید، متابولیسم داخل سلولی سلول T و تناسب میتوکندری را برنامه‌ریزی مجدد می‌کند و ساقه سلول T را حفظ می‌کند. از نظر مکانیکی، اسیدوز خارج سلولی بالا جذب متیونین و متابولیسم را از طریق تنظیم پایین SLC7A5 مختل می کند، بنابراین رسوب H3K27me3 در پروموترهای ژن های بنیادی سلول T کلیدی را تغییر می دهد. این تغییرات باعث حفظ حالت "حافظه ساقه مانند" می شود و ماندگاری طولانی مدت in vivo و اثر ضد تومور را در موش ها بهبود می بخشد. یافته‌های ما نه تنها ظرفیت غیرمنتظره اسیدوز خارج سلولی را برای حفظ خواص بنیادی سلول‌های T نشان می‌دهد، بلکه درک ما را از اینکه چگونه متابولیسم متیونین بر ساقه سلول‌های T تأثیر می‌گذارد، افزایش می‌دهد.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

انتقال اقتباسی سلول های T اختصاصی آنتی ژن تومور نشان دهنده یک پیشرفت بزرگ در زمینه درمان سرطان است، زیرا منجر به پسرفت کامل برخی از بدخیمی ها شده است. اثربخشی درمانی آن به شدت به وضعیت ماندگاری و تمایز سلول‌های T منتقل شده بستگی دارد. سلول‌های T حافظه با تمایز کمتر، به دلیل ویژگی‌های سلول‌های بنیادی خود تجدید و چندتوانی، جمعیت ارجح برای انتقال سلول T پذیرنده (ACT) هستند. در واقع، نشان داده شده است که استفاده از سلول های T حافظه مانند بنیادی برای ACT به پاسخ های ضد توموری برتری دست می یابد. در مقایسه با سلول‌های T موثر تمایز یافته، سلول‌های T مانند بنیادی علائم مشخصی دارند6. سلول های T بنیادی مانند انسان و موش با بیان مولکول های تجربه شده با آنتی ژن و مولکول های مرتبط با خانه مشخص می شوند، از جمله سطوح بالای CD62L و CCR7 (مراجعه 7). درک ما از پروفایل‌های رونویسی، تغییرات اپی ژنتیکی و مسیرهای متابولیکی که سلول‌های T بنیادی را تنظیم می‌کنند، در سال‌های اخیر به طرز چشمگیری پیشرفت کرده است. چندین فاکتور رونویسی، مانند TCF1، KLF2 و LEF1، گزارش شده است که نقش اساسی در هدایت یا حفظ بنیادی سلول T دارند. قابل ذکر است که TCF1 فاکتور رونویسی کلیدی است که باعث تولید سلول های T حافظه طولانی مدت می شود. در طول عفونت‌های مزمن، بخش کوچکی از سلول‌های T بنیادی مانند TCF{30}} پاسخ سلول‌های T را در برابر عفونت ثانویه حفظ می‌کنند1،12. تغییرات اپی ژنتیکی وسیله ای برای سلول های T فراهم می کند تا هم تغییرات رونویسی را که زمینه ساز کسب ویژگی های سلول حافظه است آغاز کنند و هم این الگوهای بیان رونویسی را حفظ کنند. مطالعات متعدد نشان داده‌اند که تری متیلاسیون هیستون H3 در K4 (H3K4me3)، یک اصلاح مرتبط با فعال‌سازی، در مکان‌های ژن مرتبط با حافظه، از جمله TCF7، KLF2، LEF1، CCR7 و SELL، در طی تمایز CD ساده به دست می‌آید. }} سلول‌های T به سلول‌های T حافظه تبدیل می‌شوند، در حالی که تری متیلاسیون H3 در K27 (H3K27me3)، یک تغییر سرکوب‌کننده، در این مکان‌های 13-15 از بین می‌رود. برعکس، ژن‌های مرتبط با اثر (GZMB، PRF1، IFNG، و TBX21) کاهش تغییرات سرکوب‌کننده و افزایش اپی ژنتیک فعال‌کننده را در این مکان‌ها در سلول‌های T مؤثر نشان می‌دهند. در نهایت، انباشته‌ای از شواهد نشان می‌دهد که مدارهای متابولیک تصمیمات سرنوشت سلول T را دیکته می‌کنند و حالت‌های اپی ژنتیک و عملکردی آن‌ها را شکل می‌دهند. سلول‌های T مؤثر با عمر کوتاه بسیار گلیکولیتیک هستند و به متابولیسم یک کربن وابسته هستند، در حالی که سلول‌های T حافظه‌مانند مانند پروفایل‌های متابولیکی متمایزی را نشان می‌دهند که با افزایش اکسیداسیون اسید چرب (FAO) و ظرفیت تنفسی اضافی میتوکندری (SRC)، کاردینال مشخص می‌شود. ویژگی های دخیل در تداوم طولانی مدت 20-22. بنابراین، برنامه ریزی مجدد متابولیک برای کسب کارآمد ساقه و بقای طولانی مدت سلول های T مهم است.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

ریزمحیط تومور سرکوب کننده سیستم ایمنی (TME) که با pH پایین، هیپوکسی، محرومیت از گلوکز و غنی سازی اسید لاکتیک مشخص می شود، مانع کلیدی مانع گسترش، تمایز و عملکرد مناسب سلول های T است. در واقع، استرس متابولیک تحمیل‌شده توسط TME ظرفیت و تناسب میتوکندری را مختل می‌کند و باعث نارسایی متابولیک سلول‌های T داخل توموری و اختلال در عملکرد می‌شود. جالب است که بیشتر لنفوسیت های نفوذ کننده تومور (TILs) ناکارآمد هستند، اما بخش کوچکی از آن حافظه ساقه مانند یا ویژگی های پیش ساز دارد. این زیرمجموعه TIL ساقه مانند، پتانسیل و تداوم تکثیر را حفظ می کند و با پاسخ مطلوب به محاصره ایست بازرسی ایمنی (ICB) و TIL-ACT در افراد مبتلا به سرطان همراه است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که اسیدوز خارج سلولی بالا (↑[H+]) فعالیت سیتولیتیک سلول‌های T را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن 31-33 سرکوب می‌کند. علاوه بر این، TME اسیدی تأثیر قابل‌توجهی بر فعالیت و تمایز سلول‌های میلوئیدی نفوذگر تومور، مانند سلول‌های دندریتیک (DCs) و ماکروفاژهای مرتبط با تومور (TAMs)34-36 دارد. با این حال، تاثیر ↑[H+] بر بنیادی سلول های T و تناسب متابولیک تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده است. در اینجا، ما گزارش می‌کنیم که قرار گرفتن در معرض طولانی‌مدت در شرایط آزمایشگاهی ↑[H+] تمایز سلول‌های CD8+ بنیادی مانند انسان و موش را به بهای سلول‌های CD8+ تأثیرگذار انتهایی تسهیل می‌کند. ما دریافتیم که درمان طولانی مدت ↑[H+] متابولیسم سلول های T را بازسازی می کند و ظرفیت تنفسی میتوکندری را حفظ می کند. علاوه بر این، قرار گرفتن در معرض مداوم ↑[H+] جذب متیونین و متابولیسم را مختل می کند، که متعاقباً منجر به کاهش رسوب H3K27me3 ژن های مرتبط با حافظه می شود و در نتیجه حفظ وضعیت "حافظه ساقه مانند" را تسهیل می کند. در نهایت، انتقال پذیرفته‌شده سلول‌های T کشت‌شده در شرایط ↑[H+] فعالیت ضد توموری قوی در داخل بدن، مطابق با فنوتیپ کمتر خسته‌شان نشان می‌دهد. بنابراین، مطالعه ما نقش غیرمنتظره اسیدوز خارج سلولی را در حفظ ساقه سلول T از طریق بازسازی متابولیسم سلولی و الگوهای اپی ژنتیکی نشان می‌دهد.

نتایج

↑ قرار گرفتن در معرض [H+ ] باعث تقویت بنیادی سلول های CD{1}} می شود

برای تعیین اینکه آیا ↑[H+] خارج سلولی بر تمایز سلول‌های T بنیادی تأثیر می‌گذارد، آنالیز فلوسایتومتری فنوتیپ‌های کلیدی شبه بنیادی را بر روی سلول‌های T انسانی که به مدت 12 روز در هر یک از محیط‌های کنترل کشت داده شده بودند، انجام دادیم، محیط ↑[H+] حاوی 10 میلی مولار اسید لاکتیک. (تقلید از غلظت لاکتات در موقعیت های پاتوفیزیولوژیک 23،35) یا محیط اسیدی (~ 6.6 pH، توسط اسید هیدروکلریک) (شکل 1a). نسبت بالاتری از سلول‌های CD{12}} بنیادی مانند، از جمله حافظه اولیه (CD45RO− CD27+ ) و حافظه مرکزی (CD45RO+ CD27+)، در سلول‌های T شرطی‌شده در ↑ مشاهده شد. [H+] در مقابل محیط کنترل (داده های توسعه یافته شکل 1a). علاوه بر این، ما دریافتیم که سلول‌های T کشت‌شده در محیط ↑[H+] درصد بیشتری از سلول‌های شبه بنیادی (CCR7+ CD62L+) دارند (شکل 1b). قابل توجه، ما متوجه افزایش قابل توجه بیان TCF1، عامل کلیدی تمایز حافظه مرکزی و ساقه‌مانند، در سطح پروتئین در سلول‌های CD انسان و موش در معرض ↑[H+] شدیم (شکل 1c و داده های توسعه یافته شکل 1b). علاوه بر این، یک اثر وابسته به غلظت [H+] بر بیان CCR7 و TCF1 وجود داشت (داده های توسعه یافته شکل 1c). مطابق با فنوتیپ شبه بنیادی سلول های T شرطی شده ↑[H+]، تولید اینترفرون درون سلولی (IFN-) و فاکتور نکروز تومور (TNF-) به طور قابل توجهی در این سلول ها کاهش یافت (شکل 1d).

برای بررسی بهتر وضعیت تمایز سلول های T، آنالیز توالی یابی RNA (RNA-seq) را انجام دادیم و دریافتیم که قرار گرفتن در معرض طولانی مدت در شرایط in vitro ↑[H+] منجر به نمایه رونویسی متمایز می شود (داده های توسعه یافته شکل 1d). قرار گرفتن در معرض ↑[H+] منجر به کاهش قابل ملاحظه بیان ژن‌های کدکننده مولکول‌های مؤثر، مانند PRF1، GZMB و IFNG، و گیرنده مهارکننده BTLA شد (شکل 1e,f و داده‌های گسترده شکل 1e). در مقابل، سلول های T کشت شده با ↑[H+] بیان بالاتری از BACH2، CCR7، LEF1 و TCF7 را نشان دادند که با بنیادی سلول T مرتبط است (شکل 1e,f و داده های توسعه یافته شکل 1e). تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن (GSEA) نشان داد که الگوی رونویسی ناشی از قرار گرفتن در معرض ↑[H+] مشابه سلول های T حافظه بود (شکل 1g و داده های توسعه یافته شکل 1f). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل کمی واکنش زنجیره ای پلیمراز (qPCR) افزایش بیان mRNA BACH2، KLF2، LEF1 و TCF7 را پس از درمان ↑[H+] تایید کرد (شکل 1h). در مجموع، این مشاهدات از این واقعیت حمایت می‌کنند که درمان ↑[H+] تا حد زیادی نمایه‌های رونویسی سلول‌های T را برای ایجاد بنیادی شکل می‌دهد. نکته قابل توجه، ما دریافتیم که درمان ↑[H+] از تکثیر سلول های T جلوگیری می کند و توزیع چرخه سلولی را به سمت فاز G1 و دور از فاز S منحرف می کند (شکل تکمیلی 1a-c). ما بعداً فعال‌سازی سلول‌های T را پس از درمان ↑[H+] در طی تحریک TCR بررسی کردیم و دریافتیم که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] هیچ تأثیر قابل‌توجهی بر بیان نشانگرهای فعال‌سازی سلول T یا اندازه سلول ندارد (شکل تکمیلی 2a,b). علاوه بر این، ما بیشتر تأیید کردیم که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] پس از فعال‌سازی سلول‌های T همچنان می‌تواند حالتی بنیادی مانند سلول‌های T ایجاد کند (شکل تکمیلی 2c-f). این یافته‌ها این احتمال را رد می‌کند که سلول‌های T در معرض ↑[H+] به سادگی در برابر تحریک مقاوم هستند، برخلاف اتخاذ یک حالت ساقه مانند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

گزارش های قبلی نشان داده اند که محیط اسیدی به طور حاد فعالیت سیتولیتیک سلول های T را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن مهار می کند. ما همچنین دریافتیم که قرار گرفتن در معرض کوتاه مدت ↑[H+] تولید سیتوکین ها را مختل می کند اما تأثیر کمی بر فنوتیپ ساقه مانند در سلول های T دارد (داده های توسعه یافته شکل 1g-i و شکل تکمیلی 3a-c). علاوه بر این، اثرات بازدارندگی تولید سیتوکین با قرار گرفتن در معرض ↑[H+] گذرا و برگشت پذیر است زیرا حذف ↑[H+] به سرعت تولید سیتوکین توسط سلول های T را بازیابی می کند (داده های توسعه یافته شکل 1h). بنابراین، مهار عملکرد موثر سلول T توسط محیط اسیدی بسیار سریع است، در حالی که برنامه ریزی مجدد بنیادی سلول T نیاز به قرار گرفتن در معرض طولانی مدت ↑[H+] دارد. از آنجایی که لاکتات در محلول به شکل جدانشدنی (اسید لاکتیک) یا به صورت نمک یونی (لاکتات سدیم) در محلول وجود دارد، ما در مرحله بعدی به دنبال این بودیم که مشخص کنیم آیا لاکتات سدیم اثرات مشابهی بر روی ساقه سلول های T دارد یا خیر و دریافتیم که لاکتات سدیم همچنین باعث افزایش علائم ساقه می شود. اگرچه کارایی آن بسیار کمتر از تیمار با اسید لاکتیک (10 میلی مولار) بود (داده های توسعه یافته شکل 1j,k و شکل تکمیلی 4a-f). این یافته‌ها هم اهمیت ↑[H+ ] و هم تفاوت آن با درمان یون‌های لاکتات را در القای فنوتیپ شبه بنیادی سلول‌های CD{16}} نشان می‌دهد.

شکل 1|↑ قرار گرفتن در معرض [H+] تمایز سلول های CD{3}} T شبه بنیادی را تسهیل می کند. شماتیک فعال سازی سلول های T انسانی در شرایط نشان داده شده: pH 7.4 (–↑[H+، کنترل)، pH 6.6 (+↑[H+]، اسید کلریدریک)، یا 10 میلی مولار اسید لاکتیک (+↑[H+]). PBMC ها، سلول های تک هسته ای خون محیطی. ب، نمایه‌های بیان CCR7 و CD62L در سلول‌های T CD{16}} انسان تحت شرایط مختلف در روز ۱۲. n=3 نمونه مستقل. ج، هیستوگرام های نماینده و تعیین کمیت بیان TCF1 در سلول های CD{20}} T انسان تحت شرایط مختلف در روز 12. n=3 نمونه مستقل. MFI، میانگین شدت فلورسانس. d، سلول‌های T انسانی به مدت 12 روز منبسط شدند و با فوربول 12-میریستات 13-استات (PMA) حاوی برفلدین A (BFA) به مدت 4.5 ساعت تحریک شدند. نمایه بیان درون سلولی IFN- و TNF- برای سلول های T در شرایط pH 7.4 (سمت چپ)، 10 میلی مولار اسید لاکتیک (وسط)، یا pH 6.6 (راست) نشان داده شده است. n=3 نمونه مستقل. تجزیه و تحلیل e,f, RNA-seq سلول های T انسانی که در کنترل (pH 7.4) یا اسید لاکتیک (10 میلی مولار) گسترش یافته بودند. نقشه حرارتی ژن‌های منتخب (e) و نمودار آتشفشانی همه ژن‌هایی که در آن ژن‌های مرتبط با حافظه، عامل و سلول‌های T خسته نشان‌دار شدند (f). در نمودار آتشفشان، محور x مقادیر تغییر شکل log (FC) برای سلول‌های تیمار شده با اسید لاکتیک نسبت به گروه شاهد در روز 12 را نشان می‌دهد و محور y مقادیر P تنظیم‌شده را نشان می‌دهد. n=4 نمونه مستقل. g، نمودار GSEA مقایسه کنترل با سلول های T شرطی شده با اسید لاکتیک برای اثربخش در مقابل غنی سازی حافظه. NES، امتیاز غنی سازی نرمال شده. h، بیان کمی mRNA فاکتورهای رونویسی مرتبط با بنیادی سلول T (BACH2، KLF2، LEF1، TCF7) در سلول های T تحت شرایط نشان داده شده. n=3 نمونه مستقل. داده ها به صورت میانگین ± نیم ارائه می شوند. مقادیر P اسمی و نرخ های کشف کاذب (FDRs) با روش پیش فرض نرم افزار GSEA (g) محاسبه شد.

افزایش [H+] باعث برنامه ریزی مجدد متابولیک می شود

فراتر از برنامه‌های رونویسی متمایز، سلول‌های T مانند بنیادی نیز ترجیحاً ویژگی‌های متابولیکی منحصربه‌فردی را کسب می‌کنند، از جمله افزایش FAO و متابولیسم گلیکولیتیک محدود17،20،37. برای بررسی ویژگی‌های متابولیکی سلول‌های T در معرض ↑[H+] طولانی‌مدت، آنالیز غنی‌سازی ژن هستی‌شناسی (GO) را انجام دادیم و تفاوت‌های قابل‌توجهی را در بیان ژن‌های مرتبط با مسیرهای متابولیک، مانند متابولیسم مولکول‌های کوچک و گلیکولیز (شکل 2a). در واقع، سلول‌های T شرطی‌شده طولانی‌مدت، گلیکولیز و متابولیسم اسید آمینه کاهش یافته را در مقابل افزایش متابولیسم اسیدهای چرب زنجیره بلند نشان دادند (داده‌های توسعه یافته شکل 2a,b). برخلاف مواجهه طولانی مدت ↑[H+]، درمان کوتاه مدت ↑[H+] فقط گلیکولیز را مهار کرد، اما هیچ اثر قابل توجهی بر FAO نداشت (شکل تکمیلی 5a). تجزیه و تحلیل کمی PCR بیشتر تأیید کرد که ژن‌های گلیکولیز SLC2A1، SLC2A3 و LDHA به طور قابل توجهی در سلول‌های T در معرض ↑[H+] کاهش یافتند (داده‌های توسعه یافته شکل 2c). برعکس، تهویه ↑[H+] بیان کارنیتین پالمیتوئیل ترانسفراز 1 (کدگذاری شده توسط CPT1A)، یک آنزیم محدود کننده سرعت درگیر در FAO را ارتقا داد (داده های توسعه یافته شکل 2c). برای توضیح بیشتر تغییرات متابولیکی ناشی از ↑[H+]، ما یک آنالیز متابولومیک بی طرفانه انجام دادیم و 285 واسطه متمایز را در سلول‌های T کشت شده با ↑[H+] در مقابل شاهد یافتیم (داده‌های توسعه یافته شکل 2d). به طور خاص، قرار گرفتن در معرض ↑[H+] به‌جای افزایش گونه‌های کارنیتین متعدد، شکل فعال اسیدهای چرب که برای اکسیداسیون به میتوکندری منتقل می‌شود، به طور قابل‌توجهی واسطه‌های گلیکولیتیک و اسیدهای آمینه ضروری خاص را کاهش داد. تجزیه و تحلیل شار متابولیک با استفاده از [13C6] گلوکز یا [13C16] پالمیتات نشان داد که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] به شدت مانع از ادغام [13C6] گلوکز به واسطه‌های TCA و اسید لاکتیک می‌شود و در عین حال ترکیب [13C16] پالمیتات را در استیل‌کوه و استیل‌تیون حمایت می‌کند. که اسیدوز خارج سلولی گلیکولیز را سرکوب می کند و FAO را در سلول های T افزایش می دهد (شکل 2b-e). این سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] محدودیت‌هایی را در رابطه با جذب مواد مغذی نشان دادند، همانطور که با کاهش مصرف [13C6] گلوکز و جذب آنالوگ‌های لیپیدی (BODIPY FL C16) مشهود است، یافته‌ای که ممکن است به دلیل افزایش گرادیان الکتروشیمیایی باشد. (داده های توسعه یافته شکل 2h, i).

جذب محدود مواد مغذی و سوئیچ متابولیسم سلولی می تواند منجر به تغییر شبکه های سیگنالینگ در سلول های T شود. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی GO سلول‌های T تیمار شده با اسید لاکتیک نشان داد که بیشتر ژن‌های آسیب‌دیده عمدتاً با سیگنال‌دهی PI3K-AKT، mTOR و TCR درگیر هستند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a). سیگنال دهی mTOR نقش اصلی را در یکپارچه سازی سیگنال های ایمنی و نشانه های متابولیک برای فعال سازی مناسب سلول های T ایفا می کند و مهار سیگنال دهی mTOR سلول ها را به سمت تشکیل سلول های CD حافظه T به جای تمایز اثرگذار 38-40 منحرف می کند. تجزیه و تحلیل GSEA ما نشان داد که فعالیت سیگنال دهی AKT-mTOR و NF-kB در سلول های T شرطی شده ↑[H+] در مقایسه با سلول های T کنترل کاهش یافته است (شکل 2f و داده های توسعه یافته شکل 3b). این بیشتر با کاهش فسفوریلاسیون S6 (در Ser235 و Ser236)، 4EBP1 (در Thr37 و Thr46)، AKT (در Ser473) و NF-kB (در Ser536) در سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] تأیید شد (شکل. 2g,h و داده های توسعه یافته شکل 3c). mTOR به عنوان یک تنظیم کننده حیاتی در فرآیندهای بیولوژیکی متنوع، از جمله اندازه سلول، تولید انرژی و سنتز پروتئین شناخته شده است. در واقع، ما دریافتیم که اندازه سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] در مقایسه با سلول‌های T کنترل کاهش یافته است (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3d). ما سپس سنتز پروتئین وابسته به بیوانرژی را در سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] با استفاده از SCENITH، یک روش جدید توسعه‌یافته که از ترکیب پورومایسین به عنوان بازخوانی سطوح سنتز پروتئین استفاده می‌کند، ارزیابی کردیم. همانطور که انتظار می رفت، قرار گرفتن در معرض ↑[H+] سنتز پروتئین انرژی بر را سرکوب کرد (شکل 2i)، که نشان می دهد متابولیسم انرژی در سلول های CD{37}} تغییر کرده است. این نتایج با یافته های قبلی که مهار فعالیت mTOR توسط راپامایسین بیان عوامل رونویسی مرتبط با ساقه را افزایش می دهد مطابقت دارد (داده های توسعه یافته شکل 3e,f). با در نظر گرفتن نتایج با هم، نتیجه می گیریم که قرار گرفتن در معرض طولانی مدت ↑[H+] یک سوئیچ متابولیک را تنظیم می کند و فعالیت mTOR را سرکوب می کند، در نتیجه کسب و حفظ بنیادی سلول T را تسهیل می کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

↑ محدودیت متابولیسم متیونین با واسطه [H+] باعث حفظ ساقه اپی ژنتیک می شود

مدارک انباشته نشان می دهد که متابولیسم تک کربنی تصمیمات سرنوشت سلول های T را دیکته می کند و حالت های عملکردی آنها را شکل می دهد43،44. تجزیه و تحلیل RNA-seq ما غنی‌سازی ضعیفی را برای فرآیند متابولیک یک کربنه و امضای چرخه متیونین در سلول‌های T نشان داد که در معرض درمان طولانی‌مدت و نه کوتاه‌مدت ↑[H+] هستند (شکل 3a، داده‌های توسعه یافته شکل 4a، و شکل تکمیلی 5b). بر این اساس، قرار گرفتن در معرض ↑[H+] بیان ژن‌های کدکننده آنزیم‌های مربوط به چرخه متیونین (MTR، AHCY و BHMT) و همچنین متابولیسم فولات (SHMT1 و SHMT2) را مهار کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4b). تجزیه و تحلیل متابولومیک بیشتر نشان داد که سلول های T کشت شده در اسید لاکتیک کاهش قابل توجهی از متابولیت های داخل سلولی درگیر در چرخه متیونین، از جمله متیونین، S-آدنوزیل متیونین (SAM) و S-آدنوزیل هموسیستئین (SAH) را نشان دادند، اما سطوح سرین و هموسیستئین را افزایش دادند (Extended) داده ها شکل 4c). [13C5] ردیابی متیونین بیشتر تأیید کرد که جذب و فراوانی درون سلولی متیونین، SAM داخل سلولی با برچسب 13C (m+5)، SAH (m+4) و 5'-متیل تیوآدنوزین (MTA, m +1) به طور قابل توجهی در سلول‌های T در معرض ↑[H+] کاهش یافت (شکل 3b–d و داده‌های گسترده شکل 4d). نکته قابل توجه، مکمل متیونین اگزوژن جذب و فراوانی درون سلولی [13C5] متیونین و همچنین واسطه های مربوطه را در سلول های T در معرض ↑[H+] ترمیم کرد (شکل 3c,d و داده های توسعه یافته شکل 4d)، که نشان می دهد متیونین اگزوژن مکمل می تواند جذب متیونین و متابولیسم سلول های T در معرض ↑[H+] را بازیابی کند. ما بعداً بررسی کردیم که آیا محدودیت متیونین می‌تواند باعث ایجاد بنیادی سلول T شود. ما دریافتیم که محرومیت از متیونین در واقع القای جمعیت سلول های T TCF1+ CD8+ را افزایش داد، اما تأثیری بر بیان CD62L و CD44 نداشت (داده های توسعه یافته شکل 4e,f). برای مطالعه بیشتر نقش متابولیسم متیونین در بنیادی سلول های T ناشی از ↑[H+]، سلول های T را با محیط ↑[H+] همراه با متیونین، SAM یا SAH کشت دادیم. فنوتیپ ساقه سلول T ناشی از اسیدوز خارج سلولی در واقع تا حدی با مکمل سازی با متیونین یا SAM ممنوع شد، اما نه SAH (شکل 3e و داده های توسعه یافته شکل 4g-i). متیونین داخل سلولی به SAM تبدیل می‌شود، که یک اهداکننده مهم گروه متیل برای واکنش‌های متیلاسیون DNA و هیستون است (داده‌های توسعه یافته شکل 5a). بنابراین، ما الگوهای متیلاسیون هیستون را مشخص کردیم و دریافتیم که افزایش [H+] به میزان زیادی سطح کل H3K27me3 را در سلول های T کاهش داد، اما تأثیر قابل توجهی بر بیان دیگر نشانگرهای متیلاسیون هیستون نداشت (شکل 3f و داده های توسعه یافته شکل 5b). همانطور که انتظار می رفت، مکمل متیونین به سلول های T تحت قرار گرفتن در معرض ↑[H+] سطح کل بیان H3K27me3 را بازیابی کرد (شکل 3f). کاهش خاص سطح H3K27me3 مشاهده شده در سلول‌های T که تحت درمان طولانی مدت ↑[H+] قرار گرفتند، ما را بر آن داشت تا این فرضیه را مطرح کنیم که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] به طور انتخابی متیل ترانسفراز خاص برای رسوب H3K27me3 را تنظیم می‌کند. در واقع، ما کاهش قابل توجهی بیان EZH2، یک متیل ترانسفراز کلیدی برای H3K27me3، هم در سطح mRNA و هم در سطح پروتئین در سلول‌های T در معرض ↑[H+] مشاهده کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 5c,d). علاوه بر این، مهار فعالیت EZH2 توسط یک مهارکننده بسیار خاص، GSK126، بیان TCF1 و همچنین درصد سلول‌های T CCR7+ CD62L+ CD{8+ را افزایش داد (داده‌های توسعه یافته شکل 5e,f) که مطابق با گزارش قبلی بود که EZH2 می‌تواند پتانسیل سلول T حافظه را از طریق تغییرات اپی ژنتیکی انتخابی تنظیم کند. برای شناسایی تغییرات گسترده ژنومی در الگوهای اپی ژنتیک بنیادی سلول T ناشی از ↑[H+]، ما سنجش CUT&Tag-seq را انجام دادیم و حداقل تغییرات را در تناسب رسوب H3K4me3 و H3K27me3 در میان گروه‌های مختلف درمان شده در طول پروموتر، بدن ژن و مناطق بین ژنی (داده های توسعه یافته شکل 5g). به طور خاص، پروفایل اپی ژنومیک کاهش سطح نشانگر هیستون سرکوبگر H3K27me3 را در مکان‌های ژن مرتبط با حافظه (به عنوان مثال TCF7، CCR7، ID3، LEF1 و KLF2) در سلول‌های T درازمدت درمان شده با ↑[H+] نشان داد (شکل 3g) . نکته مهم، افزودن متیونین تحت قرار گرفتن در معرض ↑[H+] تا حدی سطح H3K27me3 را در جایگاه‌های فوق و همچنین بیان ژن آن‌ها را بازیابی کرد، که نشان‌دهنده نقش مهم متیونین در مدولاسیون اپی ژنتیکی این ژن‌های مرتبط با حافظه است (شکل 3g و داده های توسعه یافته شکل 5h). مطابق با مطالعه قبلی14، ژن‌های عاملی مانند PRF1، GZMB، IFNG، TBX21 و NR4A2 به طور مطلوب یک الگوی متیلاسیون هیستون فعال کننده (H3K4me3hi و H3K27me3lo) به دست آوردند (شکل 3g). شایان ذکر است، اشغال H3K4me3 در نواحی پروموتر این ژن‌های مؤثر در سلول‌های T کشت‌شده تحت قرار گرفتن در معرض ↑[H+] مختل شد و با مکمل‌سازی متیونین بازسازی شد (شکل 3g). به طور کلی، این یافته‌ها نشان می‌دهد که اختلال با واسطه ↑[H+] در چرخه متیونین، حفظ اپی ژنتیک بنیادی سلول T را ترویج می‌کند.

چندین ناقل متیونین (SLCs)، از جمله SLC7A5، SLC38A1، SLC38A2، و SLC43A2، می توانند واسطه انتقال متیونین باشند46. برای بررسی اینکه چگونه قرار گرفتن در معرض ↑[H+] جذب متیونین و متابولیسم را در سلول های T کاهش می دهد، الگوهای بیان SLC های متمایز را تجزیه و تحلیل کردیم و دریافتیم که ↑[H+] به طور چشمگیری بیان SLC7A5 و SLC38A2 را کاهش داد، اما تأثیر کمی بر بیان SLC38A1 انتهایی داشت (Ext) داده ها شکل 6a,b). علاوه بر این، قرار گرفتن در معرض ↑[H+] بیان و فعالیت MYC را کاهش داد (داده های توسعه یافته شکل 6c,d)، که گزارش شده است که بیان ناقل متیونین مانند SLC7A5 را تنظیم می کند (مرجع 47). ما همچنین اشغال بالای MYC را در پروموتر SLC7A5 و به میزان کمتری در پروموتر SLC38A2 نشان دادیم (داده های توسعه یافته شکل 6e). نکته مهم، کاهش قابل توجه اتصال MYC به این مکان‌ها در سلول‌های T طولانی‌مدت تیمار شده با ↑[H+] مشاهده شد (داده‌های توسعه یافته شکل 6e). مطابق با این مشاهدات، بیان بیش از حد MYC به طور قابل ملاحظه ای بیان SLC7A5 و SLC38A2 را در سلول های T در معرض ↑[H+] بازیابی کرد (داده های توسعه یافته شکل 6f). این نتایج از نقش مهم MYC در کاهش بیان ناقل‌های متیونین پس از قرار گرفتن در معرض ↑[H+] پشتیبانی می‌کند. جالب توجه است، ما دریافتیم که مکمل متیونین همچنین می‌تواند بیان MYC و SLC7A5 را در سلول‌های T در معرض ↑[H+] بازگرداند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 6g)، که نشان می‌دهد مکمل متیونین ممکن است توانایی جذب متیونین سلول‌های T را بازیابی کند. تنظیم بیان ناقل متیونین SLC7A5 به روشی وابسته به MYC. مطالعه قبلی نشان داده است که SLC7A5 فراوان ترین ناقل متیونین در سلول های T فعال است. این، همراه با یافته های قبلی ما، نشان می دهد که SLC7A5 ممکن است نقش مهمی در محدودیت متیونین ناشی از ↑[H+] و حفظ حالت ساقه مانند ایفا کند. در واقع، ما دریافتیم که بیان بیش از حد SLC7A5 تا حدی فنوتیپ ساقه‌مانند ناشی از ↑[H+] را مختل می‌کند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 6h, i)، که بیشتر از دخالت ناقل متیونین SLC7A5 در T ناشی از حافظه ↑[H+] حمایت می‌کند. فنوتیپ مانند با تجزیه و تحلیل زیرجمعیت‌های سلول‌های T مختلف نفوذکننده تومور، بیان کمتری از MYC و SLC7A5 در CDهای حافظه‌مانند8+ TIL (داده‌های توسعه‌یافته شکل 7a,b) کاهش یافته است. با یافته های آزمایشگاهی ما بنابراین، این یافته‌ها نشان می‌دهند که محور MYC-SLC7A5-متیونین می‌تواند به طور بالقوه در حفظ وضعیت حافظه مانند TILها کمک کند.

شکل 2|↑ قرار گرفتن در معرض [H+] برنامه ریزی مجدد متابولیک را آغاز می کند و سیگنال دهی mTOR را سرکوب می کند. الف، تجزیه و تحلیل GO با استفاده از داده‌های RNA-seq، نشان‌دهنده ژن‌های متابولیکی متفاوت بیان‌شده در سلول‌های T انسانی کنترل‌شده و دارای اسید لاکتیک (مقدار P تنظیم‌شده <4.23 × 10-2). ب، شماتیک الگوهای برچسب گذاری [13C6] گلوکز یا [13C16] پالمیتات. ج، درصد m+3 لاکتات مشخص شده از لاکتات کل یا m+3 پیرووات از کل پیروات در سلول‌های T. n=3 نمونه مستقل. د، درصد ایزوتوپومر برای واسطه‌های TCA، مانند سیترات (m+2)، مالات (m+2)، و سوکسینات (m+2)، مشتق شده از [13C6]گلوکز. n=3 نمونه مستقل. e، درصد m+2 استیل-CoA مشخص شده از کل استیل-CoA یا m+2 ایزوتوپ سیترات از کل سیترات در سلول های T از پالمیتات [13C16]. n=4 نمونه مستقل. f، GSEA با تجزیه و تحلیل آماری مجموعه ژنی مرتبط با سیگنال‌دهی mTORC1 در کنترل در مقابل سلول‌های T انسانی شرطی‌شده با اسید لاکتیک (سمت چپ) یا pH 6.{33}}شرطی‌شده (راست) g،h، تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری و تعیین کمیت برای S6 فسفریله شده در Ser235 و Ser236 (g) و 4EBP1 فسفریله شده در Thr37 و Thr46 (h) در سلول‌های CD{41}} T انسان تحت شرایط نشان داده شده. n=3 نمونه مستقل. I، تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری و کمی سازی سنتز پروتئین انرژی بر در گروه شاهد یا سلول های T انسانی با اسید لاکتیک یا pH 6.{47}}. n=3 نمونه مستقل. داده‌ها به صورت میانگین ± نیم ارائه می‌شوند. تجزیه و تحلیل‌های آماری با آزمون دقیق فیشر یک‌طرفه با آزمون مقایسه‌های چندگانه بنجامینی-هخبرگ (a) یا آزمون t-test دانشجوی دو دنباله بدون جفت (c-e,g-i) تعیین شد. مقادیر اسمی P و FDR با روش پیش فرض در نرم افزار GSEA (f) محاسبه شد.

شکل 3|افزایش [H+] متابولیسم متیونین سلول T را برای حفظ ساقه اپی ژنتیک تغییر می دهد. نمودار GSEA از مجموعه ژن مرتبط با متابولیسم یک کربن و متابولیسم سیستئین و متیونین در کنترل در مقابل سلول های T انسانی شرطی شده با اسید لاکتیک. ب، شماتیک [13C5] الگوهای برچسب زدن متیونین. ج، درصد SAM داخل سلولی (m+5)، SAH (m+4)، و MTA (m+1) ​​مشتق شده از [13C5]متیونین، از مجموع کل مخازن مربوطه خود، در سلول های T در شرایط کنترل یا با 10 میلی مولار اسید لاکتیک یا 10 میلی مولار اسید لاکتیک تکمیل شده با متیونین (10 میلی مولار + Met) کشت داده شدند. n=3 نمونه مستقل. د، فراوانی نسبی [12C5] متیونین و [13C5] متیونین در سلول های T. e، هیستوگرام نماینده و تعیین کمیت TCF1 در سلول‌های CD{21}} T انسان کشت‌شده در شرایط مختلف. n=3 نمونه مستقل. f، اثرات مکمل متیونین بر متیلاسیون هیستون در سلول های T انسانی. H3K4me3، هیستون H3 تری متیله در K4. H3K79me2، H3 دی متیله در K79. H3K27me3، H3 تری متیله در K27. H3K9me2، H3 دی متیله در K9. n=3 نمونه مستقل. g، نمای مسیر ژنوم جایگاه‌های ژن نماینده که قله‌های H3K27me3 (قرمز، بالای خط) یا H3K4me3 (آبی، زیر خط) را نشان می‌دهد. داده‌های CUT&Tag-seq از دو نمونه مستقل هستند. داده ها به صورت میانگین ± sem مقادیر P اسمی ارائه شده و FDR ها با روش پیش فرض نرم افزار GSEA (a) محاسبه شدند. تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه (ANOVA) با آزمون مقایسه چندگانه توکی (c-f) انجام شد.

قرار گرفتن در معرض ↑[H+] تناسب میتوکندری را حفظ می کند 

با توجه به کاهش سنتز پروتئین فشرده انرژی در سلول های T شرطی شده ↑[H+]، ما فرض کردیم که قرار گرفتن در معرض طولانی مدت با ↑[H+] ممکن است منجر به تغییرات قابل توجهی در متابولیسم انرژی سلولی شود. هم سلول های T شرطی شده ↑[H+] با استفاده از SCENITH42 به منظور محاسبه وابستگی به گلوکز، وابستگی میتوکندری، ظرفیت گلیکولیتیک، و ظرفیت اکسیداسیون FAO و اسید آمینه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند (شکل 4a و داده های توسعه یافته شکل 8a). مطابق با نتایج متابولومیک و ردیابی ایزوتوپی ما، افزایش متابولیسم میتوکندری را در سلول‌های T در معرض ↑[H+] مشاهده کردیم، در حالی که نرخ گلیکولیز کاهش یافت (شکل 4b،c و داده‌های توسعه یافته شکل 8b)، که نشان‌دهنده برنامه‌ریزی مجدد درون سلولی است. متابولیسم پرانرژی در سلول های T شرطی شده ↑[H+]. تجزیه و تحلیل اسب دریایی بیشتر نشان داد که سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] نرخ مصرف اکسیژن بالاتر (OCR) و همچنین SRC را نشان می‌دهند که یکی از ویژگی‌های اصلی سلول‌های T حافظه طولانی مدت CD{20}} و نرخ اسیدی شدن خارج سلولی پایین‌تر است. ECAR) (شکل 4d-h و داده های توسعه یافته شکل 8c-f). از آنجایی که افزایش توده / همجوشی میتوکندری و کاهش پتانسیل غشای میتوکندری (Δψm) برای حفظ ساقه سلول T مهم است48-50، ما کمیت و کیفیت میتوکندری سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] را بررسی کردیم و دریافتیم که ↑[H+ ] درمان توده میتوکندریایی را در سلول‌های T انسان و موش افزایش داد (شکل 4i,j و داده‌های توسعه یافته شکل 8g,h) که همچنین Δψm پایین‌تری را حفظ می‌کنند (شکل 4k و داده‌های توسعه‌یافته شکل 8i). تجزیه و تحلیل فراساختار توسط میکروسکوپ الکترونی (EM) نشان داد که سلول‌های T در معرض ↑[H+] دارای میتوکندری‌های بزرگ و متراکم هستند که در سیتوپلاسم پراکنده شده‌اند و در مقایسه با سلول‌های T کنترل دارای کریستاهای تنگ و باریک زیادی هستند که با نتایج منتشر شده مرتبط است. به مورفولوژی میتوکندری در سلول های T حافظه (شکل 4l,m). مطابق با این یافته، ما همچنین افزایش بیان ژن چندین تنظیم کننده حیاتی همجوشی میتوکندری را در سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] مشاهده کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 8j)، که پیشنهاد شده است نقش ضروری برای تولید سلول‌های T حافظه ایفا کند. در مجموع، این یافته‌ها نشان می‌دهند که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] توده/همجوشی و تناسب میتوکندری را برای ترویج تشکیل سلول‌های T بنیادی افزایش می‌دهد.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

↑ قرار گرفتن در معرض [H+ ] فعالیت ضد تومور سلول CD{1}} را افزایش می دهد 

سلول های T بنیادی مانند پیوند، گسترش و اثربخشی ضد تومور را در ایمونوتراپی پذیرفته شده ترجیح می دهند. برای بررسی اینکه آیا سلول‌های T سی‌دی ↑[H+]-حفظ طولانی‌مدت در هنگام انتقال، انبساط یا تداوم بیشتری را نشان می‌دهند، CD45.{8}} سلول‌های T OT-I که در کنترل گسترش یافته‌اند یا ↑[ محیط تهویه شده H+ به طور پذیرفته شده به CD45 منتقل شد.{13}}موش های C57BL/6N بدون تومور کاشته شده (شکل 5a). اگرچه تعداد سلول‌های آپوپتوز کمی افزایش یافته است با شرطی‌سازی ↑[H+] (داده‌های توسعه‌یافته شکل 9a)، درصد بیشتری از سلول‌های T در خون محیطی موش‌هایی که با سلول‌های T گسترش یافته در شرایط ↑[H+] منتقل شده‌اند، مشاهده شد. در مقایسه با موارد منبسط شده در محیط کنترل (سلول های T شاهد) (شکل 5b). به طور مشابه، فرکانس‌های بسیار بالاتری از سلول‌های T در طحال و غدد لنفاوی (LNs) شناسایی شد (داده‌های توسعه یافته شکل 9b,c). علاوه بر این، ما افزایش قابل توجهی افزایش تجمع سلول‌های T در تومورها، طحال و غدد لنفاوی تخلیه‌کننده را در موش‌های حامل تومور B{22}}OVA پیدا کردیم که در آن‌ها سلول‌های گسترش یافته ↑[H+] در مقایسه با موش‌هایی سلول‌های کنترلی دریافت کردند، که نشان می‌دهد سلول‌های CD{26}} که در ↑[H+] نگهداری می‌شوند، ماندگاری بهتری دارند (شکل 5c–e و داده‌های گسترده شکل 9d). مطابق با این یافته‌ها، درصد سلول‌های T حافظه به طور قابل‌توجهی در طحال و LN موش‌هایی که سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] را دریافت کردند، افزایش یافت (شکل 5f و داده‌های توسعه‌یافته شکل 9e). قابل توجه، سلول های T OT-I با ↑[H+]-گسترش یافته رشد تومور را به طور قابل توجهی در مقایسه با سلول های T کنترل به تاخیر انداختند (شکل 5g). ما بعداً اثر درمانی سلول‌های T اصلاح‌شده با گیرنده کایمریک-آنتی ژن CD19 (CAR) ↑[H+]-گسترش یافته را با یک مدل تومور درون تنی بررسی کردیم که در آن سلول‌های تومور CD{44}}K562 به‌صورت زیر جلدی به پهلوها تزریق شدند. موش NCG (شکل 5h). ما دریافتیم که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] همچنین باعث تقویت بنیادی سلول های CAR-T می شود اما هیچ تأثیری بر آپوپتوز نداشت (داده های توسعه یافته شکل 9f)، همانطور که با افزایش قابل توجه درصد CCR7+ CD62L+ ساقه مانند CAR-T مشهود است. سلول ها و همچنین بیان افزایشی TCF1 (داده های توسعه یافته شکل 9g,h). علاوه بر این، پس از تزریق با سلول‌های T شرطی‌شده ↑[H+] در محل‌های تومور و طحال موش‌های NCG، میزان بیشتری از تجمع سلول‌های CAR-T وجود داشت (شکل 5i). همانطور که انتظار می‌رفت، موش‌های NCG که با سلول‌های CAR-T که در ↑[H+ ] منبسط شده بودند منتقل شدند، در مقایسه با موش‌هایی که سلول‌های CAR-T گسترش یافته بودند، پاکسازی بیشتری از تومور CD{63} کاشته شده نشان دادند. در محیط کنترل (شکل 5j). روی هم رفته، این داده‌ها نشان دادند که درمان ↑[H+] ماندگاری و فعالیت ضد توموری سلول‌های T را در داخل بدن افزایش می‌دهد.

قرار گرفتن در معرض ↑[H+] خستگی سلول های T را محدود می کند

برای بررسی بیشتر اثرات قرار گرفتن در معرض ↑[H+] مداوم بر فرسودگی سلول های T در شرایط آزمایشگاهی، بیان LAG-3 و TIM-3 را در سلول های T انسانی ↑[H+]-primed که تحت چندین دور آزمایش قرار گرفتند اندازه گیری کردیم. تحریک بیشتر با آنتی بادی های ضد CD3 و در محیط کنترل شرطی شدند (شکل 6a). ما دریافتیم که بیان LAG-3 و TIM-3 در سلول‌های T در معرض ↑[H+]-در معرض کاهش یافتند (شکل 6b و داده‌های گسترده شکل 10a)، که نشان می‌دهد درمان ↑[H+] منجر به کاهش می‌شود. فرسودگی سلول T علاوه بر این، ما دریافتیم که غلظت بالای متیونین منجر به افزایش بیان نشانگرهای بازدارنده مانند PD{15}}، LAG{16}}، و TIM{17}} می‌شود، در حالی که درمان با مقدار کم غلظت متیونین بیان این نشانگرها را اندکی کاهش داد (شکل تکمیلی 6a-c). به طور قابل‌توجه، در مواجهه طولانی‌مدت با ↑[H+]، فراوانی نفوذ TIM{21}} LAG{22}} به سلول‌های T OT-I و سلول‌های CD19-CAR T در داخل تومورها تا حد زیادی بود. پس از انتقال پذیرفته شده کاهش می یابد (شکل 6c-e و داده های توسعه یافته شکل 10b)، که با خستگی کمتر آنها در شرایط آزمایشگاهی و بهبود ظرفیت کنترل تومور در داخل بدن سازگار است. علاوه بر این، ما نشان دادیم که سلول‌های T شرطی‌شده طولانی‌مدت ↑[H+] بیان TOX را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن کاهش قابل‌توجهی نشان دادند (شکل 6f,g و داده‌های توسعه‌یافته شکل 10c,d). همانطور که قبلاً توضیح داده شد، سلول‌های T خسته را می‌توان به طور کلی به یک زیرمجموعه فرسوده از پیش‌ساز یا پایان‌یافته تقسیم کرد، همانطور که توسط TCF1 و بیان 52،53 TIM تعیین می‌شود. به این ترتیب، الگوی بیان TCF1 و TIM{38}} را در CD45 اندازه‌گیری کردیم.{40}} TILها و متوجه شدیم که فرکانس سلول‌های T انتهایی TCF1−TIM{42}} تا حد زیادی کاهش می‌یابد، با یک به طور قابل توجهی افزایش درصد TCF1+ TIM-3 - سلول های T پیش ساز تحت شرطی سازی ↑[H+] (شکل 6h). علاوه بر این، ما افزایش یافته LY{47}} TIM-3– جمعیت سلول های T پیش ساز (داده های توسعه یافته شکل 10e) و همچنین افزایش فرکانس IFN- + TNF- + T را نشان دادیم. سلول‌ها (داده‌های توسعه‌یافته شکل 10f)، بیشتر از این واقعیت حمایت می‌کنند که سلول‌های T انتقال یافته با گسترش طولانی‌مدت in vitro ↑[H+]، خستگی را محدود می‌کنند و ساقه را حفظ می‌کنند.

بحث

ACT خاص تومور یک رویکرد امیدوارکننده برای درمان افراد مبتلا به تومورهای مقاوم به درمان است، اما اثرات درمانی تا حد زیادی توسط اختلال عملکرد سلول T در TME محدود شده است. اخیراً توجه قابل‌توجهی به آماده‌سازی سلول‌های T با گرسنگی گذرا از گلوکز، محدودیت گلوتامین، یا افزایش پتاسیم خارج سلولی (↑[K+]) در طی کشت آزمایشگاهی برای حفظ ساقه سلول‌های T و بهبود نتایج درمانی شده است54-56. در این مطالعه، ما نشان دادیم که کشت سلول‌های CD{5}} تحت سطوح بالای [H+] در طول پرایمینگ، به‌طور شگفت‌انگیزی باعث کسب ساقه سلول‌های T و افزایش مقاومت در برابر فرسودگی سلول‌های T شد و اثرات ضد توموری را تا حد زیادی بهبود بخشید. سلول های T منتقل شده به صورت پذیرفته شده

تجمع بیش از حد اسید لاکتیک در TME به مدت طولانی به عنوان یک عامل کلیدی در فرار ایمنی تومور در نظر گرفته شده است. برای مثال، نشان داده شده است که اسید لاکتیک و TME اسیدی فعالیت سیتولیتیک سلول‌های T CD{{{0}} و تولید سیتوکین را سرکوب می‌کنند. مطابق با این یافته‌ها، ما همچنین دریافتیم که قرار گرفتن در معرض کوتاه‌مدت ↑[H+] در شرایط آزمایشگاهی برای مهار عمیق تولید سیتوکین‌های مؤثر کافی بود، اما هیچ تأثیری بر بیان TCF1 یا ویژگی‌های متابولیک مرتبط با ساقه نداشت. با این حال، درمان طولانی مدت ↑[H+] به طور غیرمنتظره ای بیان TCF1 را ارتقا داد و فنوتیپ سلول های T بنیادی را از طریق برنامه ریزی مجدد متابولیک و بازسازی اپی ژنتیک حفظ کرد. قرار گرفتن سلول‌های T در معرض ↑[H+] پس از فعال‌سازی کامل آن‌ها نیز می‌تواند باعث ایجاد یک فنوتیپ ساقه مانند شود، بنابراین این احتمال را که سلول‌های T در معرض pH پایین قرار گرفته‌اند، به‌جای اینکه حالت ساقه‌مانندی داشته باشند، به سادگی در برابر تحریک مقاوم شده‌اند را حذف می‌کند. غلظت فیزیولوژیکی اسید لاکتیک در خون افراد سالم حدود 1.5 تا 3.0 میلی‌مولار است، اما در TME35،58 می‌تواند به 10 تا 40 میلی‌مولار برسد. با استفاده از یک مدل تحریک مداوم ضد CD3/CD28، Feng و همکاران. اخیراً گزارش شده است که غلظت بالای لاکتات سدیم باعث افزایش سطح H3K27ac در جایگاه فوق تقویت‌کننده TCF7 از طریق مهار فعالیت هیستون داستیلاز می‌شود که منجر به افزایش بیان TCF1 و ارتقای ساقه سلول‌های CD{31}} می‌شود. در مقابل، ما دریافتیم که قرار گرفتن طولانی‌مدت در معرض غلظت نسبتاً کم اسید لاکتیک (10 میلی‌مولار)، اما نه لاکتات سدیم، می‌تواند به آسانی از طریق محدود کردن متابولیسم متیونین و تنظیم H3K27me3، یک امضای ساقه مانند سلول‌های T ایجاد کند. رسوب در مکان های ژنی مرتبط با ساقه، که به وضوح از تنظیم اپی ژنتیکی متمایز توسط لاکتات سدیم و اسید لاکتیک پشتیبانی می کند. با این حال، درمان با اسیدیته پایین (pH 6.9) تأثیر قابل‌توجهی بر بیان TCF1 تحت تحریک مداوم ضد CD3/CD28 ندارد، و نشان می‌دهد که امضاهای بنیادی سلول‌های T CD{48}} توسط ↑[H+] القا می‌شوند. قرار گرفتن در معرض ممکن است با تحریک TCR نادیده گرفته شود. فعال سازی TCR می تواند جذب متیونین را افزایش داده و متابولیسم متیونین را مجددا برنامه ریزی کند تا به فعال سازی سلول های T کمک کند19،60. ما حدس زدیم که تحریک TCR ممکن است جذب متیونین را در سلول‌های T تیمار شده با ↑[H+]، که متابولیسم متیونین را محدود کرده بودند، تقویت کند، بنابراین بنیادی اپی ژنتیک ناشی از ↑[H+] را مختل می‌کند. علاوه بر این، سلول های T می توانند از یون های لاکتات به عنوان منبع کربن خارج سلولی برای تسهیل کسب ساقه در حضور یا عدم وجود تحریک مداوم TCR استفاده کنند. فعالیت متابولیک ارتباط نزدیکی با تمایز سلول‌های T دارد و برخی مداخلات متابولیکی ممکن است تا حد زیادی تشکیل سلول‌های T حافظه طولانی‌مدت را افزایش دهند. بر این اساس، تجزیه و تحلیل‌های متابولومیک و ایزوتوپ ردیابی ما از این ایده پشتیبانی می‌کنند که قرار گرفتن در معرض طولانی‌مدت ↑[H+] منجر به برنامه‌ریزی مجدد متابولیک قابل توجهی می‌شود، مانند کاهش جذب گلوکز و کاهش گلیکولیز و متابولیسم چرخه TCA. چندین مطالعه نشان داده‌اند که سلول‌های حافظه T CD{65}} از FAO برای برآوردن نیازهای انرژی خود استفاده می‌کنند، اگرچه این احتمالاً سازگاری با تمایز دودمان حافظه است و بیان بیش از حد Cpt1 باعث افزایش طول عمر سلول‌های T می‌شود21،22،63،64. با این حال، Raud و همکاران در مدل حذف ژنتیکی اختصاصی سلول T Cpt1a. اخیراً نشان داده شده است که LC-FAO تا حد زیادی برای فعال‌سازی سلول‌های T و تشکیل سلول‌های حافظه T CD{74}} ضروری است. توضیح چنین تناقضی همچنان چالش برانگیز است. در زمینه مطالعه ما، ما حدس می‌زنیم که برنامه‌ریزی مجدد متابولیسم اسیدهای چرب ناشی از اسیدوز خارج سلولی احتمالاً با تولید سلول‌های T حافظه مرتبط است، اگرچه مکانیسم دقیق زیربنای این فرضیه نیاز به بررسی بیشتر دارد. علاوه بر این، ما دریافتیم که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] فعالیت mTOR را مهار می کند، که ممکن است توسط مهار گلیکولیتیک ایجاد شود. قابل ذکر است، سرکوب سیگنال دهی mTOR همچنین ممکن است به تغییر متابولیک از گلیکولیز به تنفس میتوکندری کمک کند. در واقع، این سلول‌های T گسترش یافته ↑[H+] تناسب میتوکندری بهبود یافته را نشان دادند، همانطور که با افزایش قابل توجه SRC و توده میتوکندری و کاهش Δψm مشهود است. این امضاهای میتوکندری، که در سلول‌های T بنیادی غنی شده‌اند و به طول عمر و فعالیت ضد توموری برتر در داخل بدن مربوط می‌شوند، با همجوشی میتوکندریایی و دینامیک شکافت بسیار تعدیل می‌شوند. پروتئین فیوژن غشای داخلی میتوکندری OPA1 نقش مهمی در تولید سلول های T حافظه ایفا می کند. بر این اساس، ما دریافتیم که اسیدوز خارج سلولی همچنین بیان OPA1 را در سلول‌های T ترویج می‌کند و در نهایت منجر به تعادل مورفولوژی به سمت همجوشی در سلول‌های T می‌شود. بسیاری از متابولیت های سلولی به طور مستقیم در تغییرات اپی ژنتیکی نقش دارند. به عنوان مثال، متابولیسم یک کربن می تواند متیل دهنده جهانی SAM را برای متیلاسیون هیستون ایجاد کند.

شکل 4|تناسب میتوکندری در سلول های T در معرض ↑[H+] حفظ می شود. آنالیز SCENITH از سلول‌های T انسانی در سلول‌های کنترل یا T شرطی‌شده با اسید لاکتیک. یک سطح ترجمه نماینده (ضد پورو) نشان داده شده است (n=3 نمونه مستقل). خط چین نشان دهنده سطح پس زمینه به دست آمده پس از درمان 2-دئوکسی-د-گلوکز + اولیگومایسین (2-DG+O) است. b,c, تجزیه و تحلیل کمی ظرفیت گلیکولیتیک (b) و وابستگی میتوکندریایی (c) در a. n=3 نمونه مستقل. d-f، OCR (d) سلول‌های T شرطی شده با اسید لاکتیک در زمان واقعی در شرایط پایه در پاسخ به مهارکننده‌های نشان‌داده‌شده اندازه‌گیری شد. FCCP، کربونیل سیانید-p-trifluoromethoxy فنیل هیدرازون. ROT/AA، روتنون و آنتی‌مایسین A. تجزیه و تحلیل آماری بازال OCR (e)، حداکثر تنفس (e) و SRC (f). n=9 تست; 3 نمونه مستقل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و هر نمونه 3 بار اندازه گیری شد. g،h، ECAR (g) سلول‌های T کنترل یا شرطی‌شده با اسید لاکتیک که در پاسخ به مهارکننده‌های نشان‌داده‌شده اندازه‌گیری شد. تجزیه و تحلیل آماری نماینده ECAR پایه و ECAR تاکید شده (h). n=9 تست; 3 نمونه مستقل شناسایی شد و هر نمونه 3 بار اندازه گیری شد. i، تجزیه و تحلیل ایمونوبلات COXIV و TIM23 در سلول های T انسانی تحت شرایط نشان داده شده است. اکتین به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد. j,k, Representative histograms or contour plots and statistics analysis of mitochondrial mass (MTG) (j) and mitochondrial membrane potansial (TMRM) (k), in the control or lactic-acid- or pH 6.{30} }سلول های T انسانی شرطی شده. n=3 نمونه مستقل. l، m، مورفولوژی میتوکندریایی سلول‌های T که در شرایط کنترل، اسید لاکتیک یا شرایط pH 6.6 به مدت 12 روز کشت شده‌اند، با EM (نوار مقیاس، 1 میکرومولار) آنالیز شدند (l). مساحت میتوکندری های منفرد در سلول های T (m)، n=45 سلول. داده ها به صورت میانگین ± نیم ارائه می شود.

شکل 5|↑ سلول‌های T گسترش‌یافته [H+] فعالیت ضد توموری را افزایش می‌دهند. سلولهای T a، b، کنترل یا منبسط شده با اسید لاکتیک پس از انتقال پذیرفته شده (تعداد=6 موش) برای ماندگاری آنالیز شدند. سلول‌های T OT-I با IL موش و آنتی‌بادی‌های CD3 و CD28 ضد موش متصل به پلیت به مدت 2 روز فعال شدند و سپس در محیط کشت نگهداری شدند. IL ماوس{18}} تا انتقال پذیرفته شده (CD3&CD{20}}IL-2). شماتیک آزمایش حیوانی (a) و همچنین نمودارهای نماینده FACS و تجزیه و تحلیل آماری CD45.1+ و CD45.{25}} سلول های T در خون در (b) نشان داده شده است. c-g، CD45.{27}} سلول‌های T OT-I به مدت 7 روز در محیط کنترل یا اسید لاکتیک منبسط شدند و به موش‌های حامل تومور B{30}OVA منتقل شدند و میزان نفوذ نسبت ارزیابی شد. (n=5 موش). شماتیک آزمایش حیوانی با استفاده از موش‌های حامل تومور B{34} OVA (c)، و همچنین نمودارهای نماینده FACS (سمت چپ) و آماری برای تعداد (راست) CD45 منتقل‌شده.{37}} OT- سلول های I T در تومور (d). sc، تزریق زیر جلدی. آمار برای درصد CD45.{40}} سلول‌های T (e) و داده‌های نماینده (سمت چپ) و آمار برای درصد (راست) CD62L+ CD44+ CD45.{45}} سلول‌های T (f) ) در طحال نشان داده شده اند. منحنی رشد تومور (g) (n=5 موش، روز 14). سلول‌های h-j، CD{48}}CAR T به مدت 12 روز در محیط کنترل یا اسید لاکتیک منبسط شدند و به موش‌های CD{50}با بیان بیش از حد تومور K562 NCG منتقل شدند و نسبت نفوذ در تومور و طحال ارزیابی شد (n=6 موش). شماتیکی از آزمایش حیوانی (h)، درصدی از سلول‌های T انتقال یافته در تومور و طحال (i)، و منحنی‌های رشد تومور (j) نشان داده شده‌اند (n=6 موش، روز 10). داده ها به صورت میانگین ± نیم ارائه می شود.

شکل 6|↑ قرار گرفتن در معرض [H+] فرسودگی سلول های T را محدود می کند. شماتیک تحریک مزمن سلول های T انسانی در شرایط آزمایشگاهی b، نمودارهای نماینده FACS برای LAG-3 و TIM-3 در سلول های T انسانی تحریک شده مزمن که در شرایط کنترل یا اسید لاکتیک کشت شده اند. n=3 نمونه مستقل. ج، بیان LAG-3 و TIM-3 در CD45.1+ TILها از B16-موش‌های C57BL/6N حامل تومور B16- (n=5 موش) ). د، کمی سازی بیان LAG-3، TIM{15}} و PD-1 در CD45.{18}} TIL ها از B16-C57BL دارای تومور OVA/ 6N موش (n=5 موش). e، بیان LAG-3 و TIM-3 در سلول‌های CD19-CAR T نفوذکننده تومور از موش‌های CD{29}}K562 حامل تومور NCG، همانطور که توسط فلوسیتومتری تعیین شد (n=6 موش). f، بیان TOX در CD45.1+ TILها از B{35}}موش C57BL/6N حامل تومور B{35} (n=5 موش). g، هیستوگرام ها و تجزیه و تحلیل آماری TOX در سلول های CD{41}}CAR T نفوذ کننده تومور از موش های CD{42}}K562 حامل تومور NCG (n=6 موش). h، نمودارهای فلوسیتومتری نماینده سمت چپ برای TIM-3 و TCF1 در CD45.{49}} TILها از B{50}}موش C57BL/6N حامل تومور B{{50} (n=5 موش) . درست است، درصد جمعیت TCF1+ TIM-3– یا TCF1– TIM-3+. داده ها به صورت میانگین ± نیم ارائه می شود.

متابولیت هایی مانند S{0}هیدروکسی گلوتارات و -هیدروکسی بوتیرات گزارش شده است که به عنوان تنظیم کننده های اپی ژنتیکی تمایز سلول های حافظه-T عمل می کنند67،68. نتایج ما نشان داد که درمان مداوم ↑[H+] جذب متیونین و متابولیسم متیونین را با کاهش متیونین داخل سلولی، SAM و SAH از طریق مهار بیان ناقل‌های متیونین محدود می‌کند. این نتایج ممکن است تا حدی توضیح دهد که چرا سلول های T قادر به رقابت با سلول های تومور برای جذب متیونین در TME69 نیستند. از نظر مکانیکی، ما نشان دادیم که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] به طور چشمگیری بیان MYC و اتصال آن به پروموتر SLC7A5 را کاهش می دهد، در نتیجه منجر به کاهش بیان SLC7A5 و اختلال در متابولیسم متیونین در سلول های T می شود. به طور جالبی، مکمل متیونین می تواند بیان MYC و SLC7A5 و همچنین شار چرخه متیونین را در سلول های T در معرض ↑[H+] بازگرداند، که نشان می دهد که بازسازی توانایی جذب متیونین احتمالاً به دلیل تنظیم مثبت ناقل متیونین است. SLC7A5 به روشی وابسته به MYC. فعالیت mTOR برای تنظیم ترجمه MYC70 گزارش شده است. بر این اساس، ما حدس زدیم که کاهش ↑[H+] ناشی از MYC به احتمال زیاد به دلیل سرکوب ترجمه ای از طریق مهار تدریجی mTOR و جذب مختل متیونین است. چنین سرکوبی ممکن است با مکمل متیونین اگزوژن معکوس شود، اگرچه مکانیسم دقیق نیاز به مطالعه بیشتر دارد. SAM مشتق شده از چرخه متیونین به عنوان واسطه متیلاسیون هیستون و بازسازی اپی ژنتیکی در طول تمایز سلول های T موثر در نظر گرفته شده است 8،71. مطابق با کاهش SAM درون سلولی در سلول‌های T گسترش یافته ↑[H+]، ما دریافتیم که فراوانی کل H3K27me3 و اشغال آن در پروموتر جایگاه‌های سلول T-stemness هر دو تا حد زیادی کاهش یافته است. H3K27me3 و H3K4me3 به طور انتخابی به گونه‌ای اصلاح می‌شوند که با بیان ژن‌های مرکزی در برنامه مؤثر یا بنیادی سلول‌های T همبستگی دارد. در واقع، غنی‌سازی کمتری از H3K4me3 در پروموترهای ژن مؤثر در سلول‌های T گسترش یافته ↑[H+] وجود داشت. بنابراین، کاهش سطوح SAM اهداکننده متیل ناشی از اختلال در جذب متیونین و متابولیسم تحت شرایط ↑[H+] منجر به تغییرات اپی ژنتیکی می‌شود که در نهایت تمایز سلول‌های T را به وضعیت حافظه مطلوب می‌کند. جالب توجه است، افزودن متیونین تحت قرار گرفتن در معرض ↑[H+] نه تنها بیان MYC و SLC7A5 را در سلول‌های T در معرض ↑[H+] نجات می‌دهد، بلکه سطح کلی بیان H3K27me3 را نیز بازیابی می‌کند و از نقش مهمی برای MYC-SLC7A5 پشتیبانی می‌کند. -محور متابولیسم متیونین در تنظیم ساقه اپی ژنتیک ناشی از ↑[H+]. در واقع، ما دریافتیم که بیان بیش از حد SLC7A5 تا حدی فنوتیپ شبه ساقه‌ای ناشی از ↑[H+] را مختل می‌کند، و بیشتر از نقش حیاتی ناقل متیونین SLC7A5 در کسب فنوتیپ حافظه‌مانند سلول T تحت ↑[H+] حمایت می‌کند.

در طول تاریخ تصور می شد که اکثر TIL ها به دلیل مواجهه مداوم با TCR در داخل تومورها از بین رفته اند، اما به طور متناقض، زیر مجموعه کوچکی از کلونوتیپ های سلول T در TIL هایی که فاکتور رونویسی TCF1 را بیان می کنند، خواص مشابه سلول های بنیادی را حفظ می کنند. یافته‌های ما نشان داد که قرار گرفتن در معرض ↑[H+] عملکرد مؤثر سلول‌های T را خنثی می‌کند و از طریق محور متابولیسم MYC-SLC7A5-متیونین، ساقه سلول‌های T را حفظ می‌کند، که توضیحی ممکن برای پارادوکس فعلی ارائه می‌دهد که چرا بخش کوچکی از TILs هنوز ساقه را در خود جای داده است. مانند حافظه یا ویژگی های پیش ساز. در واقع، یافته‌های مشابهی گزارش شده است که به موجب آن یون‌های پتاسیم در TME نقش دوگانه‌ای دارند و بر عملکرد مؤثر سلول T و ساقه تأثیر می‌گذارند. گلوکز) بر عملکرد و تمایز سلول های T. علاوه بر این، نواحی اسیدی درون تومورها بسیار پویا هستند و هم از نظر مکانی و هم از نظر زمانی تنظیم می‌شوند، و تناسب سلول‌های T سازگار با اسیدوز خارج سلولی احتمالاً زمانی تحت الشعاع قرار می‌گیرد که آنها با سایر عوامل خشن TME مواجه می‌شوند که می‌توانند بر عملکرد و تمایز موثر سلول‌های T داخل توموری تأثیر بگذارند. علاوه بر این، ما بیان بالاتری از MYC را در سلول‌های T پایان‌یافته (LY108− TIM{11}}) نسبت به سلول‌های T خسته‌شده از اجداد (LY108+ TIM-3–) مشاهده کردیم. مطابق با گزارش های قبلی که سلول های T MYClo ترجیحاً سرنوشت حافظه را به دست می آورند. مطابق با کاهش بیان SLC7A5 و جذب متیونین در سلول‌های T در معرض ↑[H+]، بیان SLC7A5 نیز به طور قابل‌توجهی در LY108+ TIM{23}}-جمعیت سلول‌های T خسته‌شده از پیش ساز در تومورها کاهش یافت. نشان می دهد که محور تنظیمی MYC-SLC7A5-متیونین ممکن است در داخل بدن نیز عمل کند. اکنون آشکار است که سلول های T حافظه مانند بنیادی کمتر تمایز یافته به دلیل تداوم طولانی مدت و مقاومت در برابر ایجاد اختلال، اثرات درمانی ضد توموری برتری دارند. ما در اینجا شواهد قانع‌کننده‌ای ارائه کرده‌ایم که نشان می‌دهد سلول‌های T طولانی مدت ↑[H+] شرطی‌شده CD{35}} پایداری و توانایی برتر ضد توموری را در داخل بدن، با کاهش جمعیت سلول‌های T پایان‌یافته (TCF1-TIM{35}) نشان دادند. {39}}) و افزایش زیرمجموعه اجدادی ساقه مانند (TCF{41}} TIM-3–) در تومورها. در نتیجه، مطالعه حاضر ما بینش هایی را در مورد اثرات چند بعدی قرار گرفتن در معرض ↑[H+] در سرکوب عملکرد موثر سلول T و تأثیر همزمان آن بر بنیادی سلول T ارائه می دهد.

مواد و روش ها

موش ها و خطوط سلولی

همه آزمایش‌های حیوانی با تأیید کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی (IACUC) مؤسسه پزشکی سیستم‌های سوژو (ISM-IACUC-0151-R) انجام شد و حیوانات در مراکز موش بدون پاتوژن خاص قرار گرفتند. موش‌ها در شرایط استاندارد، با چرخه‌های نور/تاریکی 12-h/12- ساعت و دمای کنترل‌شده 22 تا 24 درجه و رطوبت 60 درصد، با غذا و آب نامحدود نگهداری شدند. در دسترس بود و روزانه مورد بررسی قرار گرفت. همه بارهای تومور از مجوزی که توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی موسسه پزشکی سیستم های سوژو تایید شده بود تجاوز نمی کند. CD45.{9}} موش تراریخته ماده OT-I TCR روی پس‌زمینه C57BL/6N در کنار هم قرار گرفتند. CD45.{14}} موش ماده C57BL/6N با سن 6 تا 8 هفته از رودخانه Vital به عنوان گیرنده خریداری شدند. موش های ماده NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) 6 تا 8 هفته ای از GemPharmatech خریداری شدند. برای یک آزمایش مستقل در داخل بدن، موش‌های CD45.{28}} و CD45.{30} (6 تا 12 هفته) از نظر جنسیت همسان شدند. سلول‌های HEK{34} از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC) در محیط DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد پنی‌سیلین-استرپتومایسین نگهداری شدند. رده سلولی ملانوم موش B16، از ATCC، به بیان OVA تبدیل شد و در محیط DMEM حاوی 10٪ FBS و 1٪ پنی سیلین-استرپتومایسین نگهداری شد. سلول‌های K562 از ATCC برای بیان CD19 انسانی انتقال داده شدند و در محیط RPMI 1640 حاوی 10٪ FBS، 1٪ پنی سیلین-استرپتومایسین، 1٪ GlutaMAX، 0.1 M HEPES، 1٪ اسیدهای آمینه غیر ضروری، 1 میلی مولار سدیم پیرووا کشت شدند. میکرومولار - مرکاپتواتانول. تمامی معرف های فوق از گیبکو خریداری شده است.

جداسازی سلول های T اولیه، فعال سازی و انتقال رتروویروسی

لنفوسیت‌های CD{0}} موش با استفاده از کیت جداسازی سلول‌های T ساده CD8 (BioLegend) از طحال 6 تا 12 هفته موش‌های نر یا ماده OT-I جدا و در RPMI کشت شدند{{5} } محیط حاوی 10% FBS، 1% پنی سیلین-استرپتومایسین، 1% اسیدهای آمینه غیرضروری، 1% گلوتامکس، 1 میلی مولار سدیم پیروات، 0.1 مولار HEPES و 50 میکرومولار - مرکاپتواتانول در حضور IL موش -2 (20U/ml، Peprotech). برای یک آزمایش مستقل در شرایط آزمایشگاهی، موش‌های نر و ماده (6 تا 12 هفته) مورد استفاده از نظر جنسیت همسان بودند. سلول های خالص شده توسط آنتی بادی های CD3 ضد موش (2 ug/ml، BioLegend) و ضد موش CD28 (1 ug/ml، BioLegend) به مدت 48 ساعت فعال شدند. سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی انسان (PBMCs) از اهداکنندگان سالم از Sailybio خریداری شده و در محیط کشت RMPI{28}} حاوی 5% سرم انسانی AB (جمینی)، 1% پنی‌سیلین-استرپتومایسین، 1% اسیدهای آمینه غیرضروری، کشت داده شدند. 1% گلوتاماکس، 1 میلی مولار پیروات سدیم، 0.1 مولار HEPES و 50 میکرومولار - مرکاپتواتانول در حضور IL انسانی (100 U/ml، Peprotech). آنتی بادی های مونوکلونال ضد CD3 (1 میکروگرم در میلی لیتر، BioLegend) و ضد CD28 (1 میکروگرم در میلی لیتر، BioLegend) برای فعال کردن PBMC ها به مدت 3 روز استفاده شد. سلول های T خالص موش و انسان در شرایط کشت مشخص شده فعال و منبسط شدند: pH 7.4، pH 6.6، اسید لاکتیک (Sangon)، یا لاکتات سدیم (Sangon). متابولیت‌های زیر برای تکمیل محیط pH 6.6 یا اسید لاکتیک (10 میلی‌مولار) استفاده شد: متیونین 800 میکرومولار (MCE)، SAM 100 میکرومولار (MCE)، یا SAH 100 میکرومولار (سیگما). برای انتقال ویروسی، 1 × 106 PBMC در هر چاه در 24- صفحات چاه فعال شد. پس از 48 ساعت فعال‌سازی، اکثر محیط با مایع رویی رتروویروسی غلیظ نشده با 10 ug/ml پلی‌برن (سانتا کروز) جایگزین شد. پس از سانتریفیوژ در 600 گرم به مدت 90 دقیقه در دمای 30 درجه، سلول ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور با محیط تازه کشت داده شدند. ترانسداکشن 24 ساعت بعد تکرار شد و سپس برای کشت به محیط تازه برگردانده شد. گیرنده فاکتور رشد عصبی کم میل ترکیبی (LNGFR) برای تعیین کمیت کارایی عفونت استفاده شد.

فلوسیتومتری

سلول ها با آنتی بادی های فلورسنت رنگ آمیزی شدند و سپس توسط فلوسایتومتری آنالیز شدند. برای رنگ‌آمیزی نشانگر سطحی، سلول‌ها با آنتی‌بادی‌های کونژوگه فلورسنت و کیت رنگ‌آمیزی سلول‌های مرده زنده/مرده (Invitrogen) در بافر FACS (سالین بافر فسفات (PBS) با 2٪ FBS رنگ‌آمیزی شدند، سپس با 2٪ پارافورمالدئید (Casmart) ثابت شدند. به مدت 2{15}} دقیقه در دمای اتاق. برای رنگ‌آمیزی داخل سلولی پروتئین‌های فسفو، سلول‌های از پیش رنگ‌آمیزی شده با یک بافر تثبیت (BioLegend) ثابت شدند و سپس با آنتی‌بادی‌های اختصاصی فسفو در بافر نفوذپذیر (Invitrogen) رنگ‌آمیزی شدند. برای تشخیص سیتوکین های داخل سلولی، سلول ها با فوربول میریستات استات (PMA) در حضور برفلدین A (BFA) (BioLegend) به مدت 4.5 ساعت تحریک شدند. سپس سلول های از پیش رنگ آمیزی شده ثابت شده و با آنتی بادی های سیتوکین در یک بافر نفوذپذیر رنگ آمیزی شدند. برای رنگ‌آمیزی فاکتور رونویسی درون سلولی، سلول‌ها با کیت رنگ‌آمیزی سلول‌های مرده ثابت و زنده/مرده و آنتی‌بادی‌های کونژوگه فلورسنت در بافر FACS برای شناسایی نشانگرهای سطحی از قبل رنگ‌آمیزی شدند. سپس سلول ها به مدت 30 دقیقه روی یخ با استفاده از بافر FOXP3/Transcription Factor Fixation (Invitrogen) ثابت شدند و با آنتی بادی های فاکتور رونویسی در بافر نفوذپذیر رنگ آمیزی شدند. پس از رنگ‌آمیزی، سلول‌ها در بافر FACS برای فلوسایتومتری معلق شدند. داده های فلوسایتومتری توسط BD LSR Fortessa و BD FACSDiva (v8.0.2) جمع آوری و با نرم افزار FlowJo (v10.4) تجزیه و تحلیل شد. راهبردهای گیتینگ نماینده در شکل 10b داده توسعه یافته ارائه شده است.

توالی یابی RNA

تجزیه و تحلیل RNA-seq با استفاده از سلول‌های T منبسط شده در روز کشت داده شده در شرایط نشان‌داده شده در شکل 1a انجام شد. به طور خلاصه، 12 روز پس از گسترش سلول T، RNA کل با همگن سازی در TRIzol (Takara) و انجماد در لوله های بدون RNase با نیتروژن مایع استخراج شد. یکپارچگی RNA با استفاده از Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) ارزیابی شد. کتابخانه ها با استفاده از کیت آماده سازی نمونه RNA TruSeq (FC{7}}، Illumina) ساخته شدند. سپس کتابخانه ها با استفاده از پلتفرم Illumina NovaSeq 6000 (PE150) توالی یابی شدند و تقریباً 40 میلیون خواندن با پایان جفتی (Novogene) ایجاد شد. تعداد خواندن خام استخراج شد و سپس توسط فاکتورهای اندازه کتابخانه آنها با استفاده از DESeq2 (v1.28.1) نرمال شد. تبدیل لگاریتم منظم (r-log) برای تثبیت واریانس در بین نمونه ها استفاده شد. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر GO و KEGG ژن‌های بیان شده متفاوت با پروفایل خوشه‌ای (v3.16.0) انجام شد. نقشه های حرارتی بیان با بسته R 'pheatmap' (v1.0.12) تولید شد. GSEA v.4.0 برای تجزیه و تحلیل GSEA استفاده شد.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq همانطور که قبلاً توضیح داده شد، با استفاده از کیت سنجش CUT&Tag Hyperactive Universal برای Illumina (TD903، Vazyme) انجام شد. به طور خلاصه، سلول های T انسانی به مدت 12 روز تحت شرایط کنترل، اسید لاکتیک یا اسید لاکتیک با 800 میکرومولار متیونین گسترش یافتند. سپس سلول های T 105×1 برای استخراج مواد نوکلئیک لیز شدند و با دانه های ConA در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند. سلول‌ها در بافر آنتی‌بادی 50 میکرولیتری که با آنتی‌بادی اولیه (anti-H3K27me3 یا anti-H3K4me3) از قبل مخلوط شده بود، مجدداً تعلیق شدند و یک شب در 4 درجه انکوبه شدند. نمونه ها با آنتی بادی ثانویه در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و سپس با پروتئین A/G-Tn5 transposase به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند تا قطعه قطعه شدن DNA مختل شود. DNA خالص برای تهیه کتابخانه استفاده شد و با استفاده از PE150 توسط توالی سنجی Illumina Nova6000 توالی یابی شد.

تجزیه و تحلیل CUT&Tag-seq

FastQC (v{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) برای بررسی کیفیت خواندن توالی استفاده شد. کیفیت خوانده‌ها با استفاده از trimmomatic (v0.39) به حداقل امتیاز Phred 20 کاهش یافت (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . تمام خوانده‌های تولید شده توسط CUT&Tag-seq از H3K27me3 و H3K4me3 با ژنوم انسان hg38 با استفاده از Bowtie2 (v2.2.8) (https:// bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) با گزینه‌های: –local– تراز شدند. very-sensitive-local-no-unal-no-mixed-no-discordant-phred33 -I 10 -X 700. نمونه های بدون DNA spike-in با استفاده از روش ChIPseqSpikeInFree نرمال سازی شدند، که یک روش نرمال سازی جدید برای تعیین موثر فاکتورهای پوسته پوسته شدن نمونه ها در شرایط و تیمارهای مختلف. برای H3K27me3، پیک‌ها با استفاده از MACS2 (نسخه 2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/{40}} پیک{41}}تماس{42}}مک .html) با گزینه های '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. برای H3K4me3، حداکثر فراخوانی از MACS2 با پارامترهای '-g hs -q 0 استفاده می‌شود.01 -f BAMPE–keep-dup all'. پیک ها با ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/) حاشیه نویسی شدند و تجسم ها با استفاده از deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en) ایجاد شدند /develop/) و pyGenomeTracks (نسخه 3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT–PCR

RNA کل با TRIzol (Takara) جدا شد و طبق دستورالعمل سازنده با HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme) به cDNA رونویسی معکوس شد. برای Real-time PCR کمی، سیستم PCR Real-time ABI Prism 7500 (Thermo Fisher) و 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. ACTB به عنوان یک استاندارد داخلی استفاده شد. بیان نسبی mRNA با استفاده از روش 2-ΔΔCT محاسبه شد. توالی پرایمر مورد استفاده برای qPCR را می توان در جدول تکمیلی 1 یافت.

وسترن بلاتینگ

برای آنالیز بیان پروتئین، سلول‌ها جمع‌آوری و با PBS سرد شسته شدند و پروتئین کل با استفاده از 1% SDS (Sangon) روی یخ استخراج شد. غلظت پروتئین توسط کیت سنجش پروتئین BCA (Merck) اندازه گیری شد. نمونه های پروتئینی توسط ژل های SDS-PAGE جدا شده و سپس به غشاهای PVDF (Millipore) منتقل شدند. غشاها با شیر بدون چربی 5 درصد در PBS حاوی Tween2 مسدود شدند. پس از مسدود شدن، غشاها با آنتی‌بادی‌های اولیه یک شبه در دمای 4 درجه و آنتی‌بادی‌های ثانویه همراه با HRP به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. سیگنال HRP توسط electrochemiluminescence (ChemeMINI610) توسعه یافت و توسط Sage Capture (v2.19.12) جمع آوری شد. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار ImageJ (v1.8.0) انجام شد.

تجزیه و تحلیل مورفولوژی میتوکندری

در هر چاهک از صفحات چاهک، PBMC ها توسط آنتی بادی های ضد CD3 و anti-CD28 انسانی به مدت 3 روز فعال شدند و به مدت 12 روز در محیط RPMI-1640 در شرایط مختلف کشت شدند. سپس، 1 × 106 PBMC جمع آوری و در یک بافر تثبیت از قبل سرد شده (2.5٪ گلوتارآلدئید، 0.1 مولار بافر فسفات (PB)، pH 7.4) یک شبه در دمای 4 درجه ثابت شد. پس از سه بار شستن با PBS، سلول ها به مدت 2 ساعت در تتروکسید اسمیم 1% در PBS تثبیت شدند، آبگیری شدند و طبق روش استاندارد در رزین Spurr جاسازی شدند. مقاطع بسیار نازک با اورانیل استات و سیترات سرب رنگ آمیزی شدند. مورفولوژی میتوکندری با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری هیتاچی HT{21} (TEM) (v01.20) و دوربین AMT-XR81DIR تصویربرداری شد.

آنتی بادی ها و معرف ها

آنتی بادی های مورد استفاده برای آنالیز فلوسایتومتری به شرح زیر بودند. APC ضد انسان NGFR (شماره گربه 345108، 1:1،000 برای FACS)، FITC ضد انسان CD4 (شماره گربه 357406، 1:200 برای FACS)، پاسیفیک آبی ضد انسان CD8 (شماره گربه 300928، 1:200 برای FACS)، APC-Cy7 ضد انسان/موس CD44 (شماره گربه 103028، 1:200 برای FACS)، PE ضد انسان CCR7 (گربه شماره 353204، 1 :200 برای FACS)، PE ضد انسان TNF- (شماره گربه 502909، 1:200 برای FACS)، PE-Cy7 ضد انسان CD45RO (شماره گربه 304230، 1:200 برای FACS)، APC anti- انسان IFN- (cat. no. 502512, 1:200 for FACS), PE-Cy7 anti-human LAG{47}} (cat. no. 369310, 1:200 for FACS), PE antihuman TIM{{ 52}} (cat. no. 345006, 1:200 for FACS), BV711 anti-human PD{58}} (cat. no. 329928, 1:200 for FACS), Percp-Cy5.5 antihuman CD62L (شماره گربه 304824، 1:200 برای FACS)، APC ضد انسان CD27 (شماره گربه 302810، 1:200 برای FACS)، BV711 ضد موش CD8 (شماره cat. 100748، 1:200 برای FACS ) PE-Cy7 ضد موش CD62L (شماره گربه 104418، 1:200 برای FACS)، APC-Cy7 ضد ماوس CD45.2 (شماره cat. 830789، 1:200 برای FACS)، Pacific Blue anti- ماوس CD45.1 (شماره گربه 110722، 1:200 برای FACS)، APC Anti-Mouse Ly108 (cat. نه 134610, 1:200 for FACS), PE anti-mouse LAG{108}} (cat. no. 125207, 1:200 for FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC Antibody (cat. no. 626811, 1 :200 برای FACS)، PE ضد موش TNF- (شماره گربه 506306، 1:200 برای FACS)، و APC ضد موش IFN- (شماره cat. 505810، 1:200 برای FACS) از BioLegend خریداری شدند. . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 anti-mouse PD-1 (cat. no. 46-9981-82, 1:200 for FACS), PE phosphor-S6 (Ser235/236) (cat. . no. 12-9007-42، 1:200 برای FACS)، PE anti-human/mouse TOX (cat. no. 12-6502-82, 1:200 for FACS) and PE-Cy7 anti-mouse TIM{ {149}} (cat. no. 25-5870-82, 1:200 for FACS) از Thermo Fisher خریداری شد. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (cat. No. 6709, 1:200 for FACS) و فسفر{159}}E-BP1 (Thr37/46) (cat. No. 2846, 1:200 for FACS) از فناوری سیگنالینگ سلولی Alexa Fluor 647 anti-puromycin (cat. no. MABE{169}}AF647, 1:800 for FACS) از Merck خریداری شد. آنتی بادی های مورد استفاده برای وسترن بلات به شرح زیر بود. Rabbit anti-phospho-Akt (Ser473) (cat. no. 4060, 1:1,{179}} for IB), anti-phospho-NF-kB p65 (Ser536) (cat. no. 3033, 1:1 ,000 for IB), anti-c-MYC (cat. no. 18583, 1:1,000 for IB), anti-EZH2 (cat. no. 5246, 1:1,{ {200}} برای IB)، anti-tri-methyl-histone H3 (Lys27) (cat. no. 9733, 1:1,{209}} for IB), anti-tri-methyl-histone H3 (Lys4) (cat. no. 9751, 1:1,000 for IB), anti-di-methyl-histone H3 (Lys9) (cat. no. 4658, 1:1,000 for IB) , anti-di-methyl-histone H3 (Lys79) (cat. no. 5427, 1:1,000 for IB), anti-histone H3 (cat. no. 9715, 1:1,{{242) }} for IB), anti-COXIV (cat. no. 850, 1:1,000 for IB), anti-rabbit IgG (HRP-linked) (cat. no. 7074, 1:2,{ {253}} برای IB)، و ضد IgG موش (HRP-linked) (cat. no. 7076, 1:2,000 for IB) از Cell Signaling Technology خریداری شد. Mouse anti-Tim23 (cat. no. 611223, 1:1,000 for IB) از BD Biosciences بود. ماوس anti- -actin (cat. no. 66009-1-Ig, 1:5,000 for IB), anti-SLC7A5 (cat. no. 67951-1-Ig, 1: 1,000 برای IB)، و rabbit anti-SLC38A1 (cat. no. 12039-1-AP, 1:1,000 for IB) از Proteintech بودند. Rabbit anti-SLC38A2 (cat. no. BMP081, 1:1,000 for IB) از Medical & Biological Laboratories خریداری شد.

سنجش متابولیک سلول T

برای بررسی جذب BODIPY FL C16 در سلول‌های T تیمار شده با ↑[H+]، سلول‌های T با 1 میکرومولار BODIPY FL C16 (Invitrogen) تازه محلول به مدت 1 ساعت کشت داده شدند، سپس دو بار با PBS قبل از رنگ‌آمیزی سطحی شسته شدند. برای بررسی بیشتر وابستگی متابولیک در گروه‌های درمانی مختلف، آزمایش‌هایی با استفاده از روش SCENITH (متابولیسم انرژی تک سلولی با پروفیل‌سازی بازداری ترجمه) انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌های T در صفحات چاهک با غلظت 1 × 106 سلول در میلی‌لیتر کشت شدند. سپس سلول‌ها با کنترل (Ctrl)، 2-دئوکسی-د-گلوکز (غلظت نهایی 100 میلی‌مولار)، الیگومایسین (غلظت نهایی 5 میکرومولار)، یا ترکیبی از مهارکننده‌ها در غلظت‌های نهایی به مدت 40 دقیقه در دمای 37 تیمار شدند. درجه . پورومایسین (غلظت نهایی 10 ug/ml) در 30 دقیقه آخر اضافه شد. پس از تیمار پورومایسین، سلول ها با PBS سرد شسته شدند و با کیت رنگ آمیزی سلول های مرده قابل تثبیت زنده/مرده و آنتی بادی ها علیه نشانگرهای سطحی از قبل رنگ آمیزی شدند. رنگ آمیزی پورومایسین داخل سلولی توسط فرآیند رنگ آمیزی برای فاکتورهای رونویسی داخل سلولی دنبال شد.

تجزیه و تحلیل متابولومیک با LC-MS/MS

تجزیه و تحلیل متابولومیک و جمع آوری نمونه مانند گزارش های قبلی انجام شد77. به طور خلاصه، PBMC ها به مدت 3 روز به صورت جداگانه در 24-صفحه چاهک توسط انسان anti-CD3/CD28 فعال شدند و در محیط RPMI 1640 با شاهد یا اسید لاکتیک تا روز 12 کشت داده شدند. سپس، 8×8 106 سلول در هر نمونه (n=4 نمونه مستقل در هر گروه) جمع آوری شد و به یک لوله 1.{12}} میلی لیتری برای سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه و سپس منتقل شد. با PBS سرد شسته شده است. پس از سانتریفیوژ در 300 گرم به مدت 5 دقیقه دوباره، متانول سرد 80 درصد اضافه شد و به شدت گرداب شد تا گلوله سلولی به طور کامل مختل شود و سپس سلول ها به فریزر در دمای 80- درجه منتقل شدند. نمونه ها در 12،{21}} گرم به مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جمع آوری شد. در نهایت، عصاره ها لیوفیلیز شدند و توسط UHPLC-MS/MS در Novogene آنالیز شدند. فایل های داده خام تولید شده توسط UHPLC-MS/MS با استفاده از Compound Discoverer (v3.1، Thermo Fisher) برای انجام تراز پیک، برداشت پیک و کمیت برای هر متابولیت پردازش شدند. نرم افزار Metaboanalyst (v5.0) برای تجزیه و تحلیل بیشتر داده ها استفاده شد و سپس مسیرهای غنی شده با استفاده از P <0.05 انتخاب شدند.

آزمایش‌های برچسب‌گذاری ایزوتوپ پایدار

شار متابولیک 13C بر روی سلول‌های T با استفاده از روش‌هایی که قبلاً توضیح داده شد انجام شد 6{19}}،78،79. به طور خلاصه، PBMCs در هر چاهک در صفحات چاهک با ضد CD3/CD28 انسانی به مدت 3 روز، همانطور که در بالا توضیح داده شد، فعال شدند. برای ردیابی گلوکز [13C6]، محیط پس از 11 روز به RPMI بدون گلوکز (Gibco) همراه با 10٪ FBS دیالیز شده (Thermo Fisher Scientific)، 1٪ پنی سیلین-استرپتومایسین، 1٪ اسیدهای آمینه غیر ضروری، 50 میکرومولار تغییر یافت. - مرکاپتواتانول و 0.1 مولار HEPES، حاوی 11 میلی‌مولار [13C6] گلوکز (آزمایشگاه‌های ایزوتوپ کمبریج) با کنترل یا 10 میلی‌مولار اسید لاکتیک، به مدت 24 ساعت. برای ردیابی پالمیتات [13C16]، 2 × 107 سلول T فعال شده و در محیط کامل با کنترل یا شرایط اسید لاکتیک 10 میلی مولار همانطور که در بالا در روز 12 توضیح داده شد، حاوی 200 میکرومولار [13C16] پالمیتات (آزمایشگاه‌های ایزوتوپ کمبریج)، برای 8 قرار داده شدند. ساعت برای [13C5] ردیابی متیونین، سلول های T تحت کنترل، اسید لاکتیک یا اسید لاکتیک با شرایط متیونین 800 میکرومولار به مدت 12 روز گسترش یافتند. سپس، 4 × 107 سلول T به محیط RPMI کامل بدون متیونین (Gibco) تغییر یافته و تحت شرایط کنترل، اسید لاکتیک یا اسید لاکتیک مکمل با متیونین (حاوی 100 میکرومولار، 100 میکرومولار، یا 800 میکرومولار [13C5] متیونین) کشت داده شدند. (آزمایشگاه های ایزوتوپ کمبریج)، به مدت 8 ساعت. سوپرناتانت مربوطه جمع آوری و سپس در دمای 80- درجه نگهداری شد. سلول ها با سانتریفیوژ (300 گرم، 4 درجه، 5 دقیقه)، دو بار با سالین شسته شدند و بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد شدند و در دمای 80- درجه نگهداری شدند. متابولیت‌ها با استفاده از متانول 80% با درجه HPLC سرد استخراج شدند و به طور خلاصه گرداب شدند، سپس 200 میلی‌لیتر آب با درجه HPLC و سپس 500 میلی‌لیتر کلروفرم درجه HPLC (نسبت متانول: آب: کلروفرم، 5:2:5) اضافه شد. ). مخلوط گرداب شد و سانتریفیوژ شد تا جداسازی فاز حاصل شود. سوپرناتانت ها با اسپین خلاء برای مشتق سازی بعدی خشک شدند و سپس با 2% (wt/vol) متوکسیامین هیدروکلراید (226904, Sigma-Aldrich) در پیریدین به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شدند و توسط N-methyl-N-( tert-butyldimethylsilyl) trifluoroacetamide با 1% tert-butyldimethylchlorosilane (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) به مدت 30 دقیقه در دمای 45 درجه. مشتقات گلوکز [13C6] توسط GC-HRMS، کروماتوگرافی گازی Trace 1310 (Thermo Fisher) با ستون DB-35MS (Agilent Technologies) و سیستم Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS (Thermo Fisher) آنالیز شدند. سنجش متابولومیک GC-MS/MS توسط Metabo-Profile انجام شد. متابولیت ها توسط Xcalibur (v4.1) و TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher)، از جمله زمان ماند، نسبت بار به جرم قطعات یون، و شدت پیک شناسایی و تعیین شدند. مشتقات [13C16] پالمیتات و [13C5] متیونین توسط کروماتوگرافی مایع با فشار فوق‌العاده- طیف‌سنج جرمی چهارقطبی سه‌گانه (UPLC-TQMS) آنالیز شدند. داده‌های خام UPLC-TQMS با استفاده از نرم‌افزار Waters MassLynx (v4.1، Waters) برای استخراج، ادغام، شناسایی و کمیت متابولیت‌ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. زبان R (v4.1.1) برای تجزیه و تحلیل آماری بعدی استفاده شد.

مدل تومور B16 و ایمونوتراپی انتقال سلول پذیرفته شده

برای بررسی فعالیت ضد توموری سلول‌های T در داخل بدن، سلول‌های ملانوما 2×106 B{1}} OVA به صورت زیر جلدی به موش‌های ماده C57BL/6N تزریق شد. 9 روز پس از کاشت تومور، موش ها با 5 × 106 سلول T از موش های ماده OT-I به مدت 7 روز در شرایط مختلف به صورت داخل وریدی تزریق شدند. موش های حامل تومور قبل از ACT 5 گری تابش کشنده دریافت کردند. ناحیه تومور هر 2 روز یکبار اندازه گیری شد و به صورت طول (mm) × عرض (mm) محاسبه شد. موش هایی با ناحیه تومور نزدیک به 300 میلی متر مربع کشته شدند. برای بررسی تداوم سلول‌های T منبسط شده در شرایط مختلف، 4 × 106 CD45.{19}} سلول‌های T از موش‌های ماده OT-I به‌طور تطبیقی ​​به موش‌های ماده C57BL/6N منتقل شدند. یک هفته بعد، موش‌ها کشته شدند و سلول‌های خون، طحال و غدد لنفاوی جدا شده شمارش شدند. نسبت سلول‌های T انتقال‌یافته با گیتینگ روی سلول‌های T بیان‌کننده CD45.{24}} و CD45 از طریق فلوسیتومتری تعیین شد.

مدل موش NCG و درمان CD{0}CAR-T

موش های ماده NCG به صورت زیر جلدی با 1 × 106 سلول CD19-K562 کاشته شدند. وقتی حجم تومور به 75 میلی‌متر مکعب رسید، موش‌ها 5 × 106 سلول T و سلول‌های CD{9}CAR T را دریافت کردند که در محیط کنترل یا 10 میلی‌مولار حاوی اسید لاکتیک کشت داده شدند. رشد تومور هر 2 روز با کولیس های الکترونیکی اندازه گیری شد و با طول (mm) × عرض (mm) محاسبه شد. موش هایی با مساحت تومور بزرگتر از 300 میلی متر مربع کشته شدند. تومورها جمع آوری، هضم و با Percoll (سیگما) پردازش شدند و سپس عملکرد و فنوتیپ سلول T با فلوسیتومتری تعیین شد.

میزان مصرف اکسیژن پایه و تجزیه و تحلیل نرخ اسیدی شدن خارج سلولی

برای تجزیه و تحلیل ویژگی های متابولیک، OCR و ECAR توسط آنالایزر XF24 اسب دریایی (Agilent) ارزیابی شد. به طور خلاصه، سلول‌های T انسانی که در شرایط مختلف به مدت 12 روز کشت شده بودند، با محیط XF غیر بافری (RPMI 1640 غیر بافری حاوی 10 میلی‌مولار گلوکز، 1 میلی‌مولار سدیم پیروات و 2 میلی‌مولار گلوتامین) پیش تیمار شدند. . سپس سلول‌های T انسانی در 106×5/5 سلول در هر چاهک در میکروپلیت کشت سلولی XF24 کاشته شدند و در انکوباتور بدون CO2 به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. برای افزایش چسبندگی سلولی، صفحات در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه در 100 گرم با ترمز صفر چرخانده شدند. مصرف اکسیژن و اسیدی شدن خارج سلولی تحت شرایط پایه و در پاسخ به 1.25 میکرومولار اولیگومایسین، 50 میلی‌مولار 2-دئوکسی-d-گلوکز، 1.5 میکرومولار FCCP، 0.5 میکرومولار روتنون و 0.5 میکرومولار آنتی‌مایسین A. SRC با تفریق محاسبه شد. OCR پایه از حداکثر OCR.

ChIP-qPCR

ایمونوپسیت کروماتین (ChIP) طبق دستورالعمل سازنده ارائه شده با کیت برشی آنزیمی اکسپرس Chip-IT (Active Motif) انجام شد. به طور خلاصه، 15 میلیون سلول T انسانی کشت شده در شرایط کنترل یا 10 میلی مولار اسید لاکتیک با فرمالدئید به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند و واکنش تثبیت با افزودن 1× گلیسین متوقف شد. سلول های ثابت با PMSF و کوکتل مهار پروتئین پلت شدند و در دمای 80- درجه قبل از لیز سلولی ذخیره شدند. سپس، گلوله ذوب شده در 1 میلی لیتر بافر لیز سرد یخی با کوکتل PMSF و مهار پروتئین روی یخ به مدت 30 دقیقه برای به دست آوردن مواد هسته ای مجدداً معلق شد. سپس گلوله هسته ای مجدداً معلق شد و با یک کوکتل آنزیمی برای برش کروماتین به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه هضم شد. کروماتین برش خورده با دانه های مغناطیسی پروتئین G با anti-c-MYC (CST، cat. No. 18583، 1:100 برای ChiP) و anti-IgG (CST، cat. No. 2729، 1:100 برای ChiP) در انکوبه شد. 4 درجه یک شب سپس دانه های مغناطیسی چهار بار با بافرهای تراشه شسته و با بافر شستشوی 50 ul شسته شدند. DNA شسته شده به مدت 2.5 ساعت در دمای 65 درجه به طور معکوس متصل شد و سپس با استخراج فنل-کلروفرم خالص شد. DNA خالص شده برای انجام ChIP-qPCR برای شناسایی غنی‌سازی MYC در پروموترهای ژن‌های هدف مورد استفاده قرار گرفت. پرایمرهای مورد استفاده برای ChIP-qPCR را می توان در جدول تکمیلی 2 یافت.

تجزیه و تحلیل پتانسیل توده میتوکندری و غشاء

توده و پتانسیل غشای میتوکندری با استفاده از MitoTracker Green و متیل استر تترا متیرودامین (TMRM) آنالیز شد. قبل از رنگ‌آمیزی سطح سلول، سلول‌ها با 250 نانومولار MitoTracker Green (Thermo Fisher) یا 50nM TMRM (Thermo Fisher) در انکوباتور در دمای 37 درجه (5٪ CO2) به مدت 1 ساعت رنگ‌آمیزی شدند. سلول ها با بافر FACS سه بار شسته شدند و سپس نشانگرهای سطحی رنگ آمیزی شدند تا تجزیه و تحلیل FACS بیشتر انجام شود.

تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از GraphPad Prism نسخه 8 انجام شد.{1}}. نتايج به صورت ميانگين ± sem نشان داده مي شود. براي مقايسه تيمارها با گروه كنترل از آزمون t Student's Two-tailed استفاده شد. آنالیز واریانس دوطرفه با آزمون مقایسه چندگانه Sidak's Tukey یا Dunnett برای مقایسه های چندگانه استفاده شد. P < 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

منابع

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T حافظه سلول های بنیادی در سلامت و بیماری. نات. پزشکی 23، 18-27 (2017).

2. گائو، اس و همکاران. سلول های T حافظه مانند سلول های بنیادی: چشم اندازی از سمت تاریک سلول ایمونول. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP انتقال سلولی به عنوان ایمونوتراپی شخصی برای سرطان انسان. Science 348, 62-68 (2015).

4. Ribas، A. & Wolchok، JD ایمونوتراپی سرطان با استفاده از محاصره ایست بازرسی. Science 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli، E.، Galletti، G.، Boi، SK & Youngblood، BA ساقه، عامل، و حالت های ترکیبی سلول های CD حافظه8+. Trends Immunol. 41، 17-28 (2020).

6. گالتی، جی و همکاران. دو زیرمجموعه از اجداد سلول های T حافظه سی دی{2} بنیادی با تعهدات سرنوشت مشخص در انسان. نات. ایمونول. 21، 1552–1562 (2020).

7. گتینونی، ال و همکاران. یک زیر مجموعه سلول T حافظه انسانی با ویژگی های مشابه سلول های بنیادی. نات. پزشکی 17، 1290-1297 (2011).

8. فرانکو، اف.، جاکارد، آ.، رومرو، پی، یو، ی آر و هو، پی سی تنظیم متابولیک و اپی ژنتیک فرسودگی سلول T. نات. متاب. 2، 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. کنترل رونویسی تمایز سلول‌های T تأثیرگذار و حافظه8+. نات. کشیش ایمونول. 12, 749-761 (2012).

10. Huang, Q. et al. تمایز اولیه سلول‌های CD{2}} حافظه اختصاصی تومور به عنوان پاسخ‌دهنده صادقانه به انسداد PD-1/PD-L1 در تخلیه گره‌های لنفاوی. سلول 185، 4049-4066 (2022).

11. صدیقی، آی و همکاران. سلول‌های Tcf1+ PD{2}} CD8+ داخل توموری با ویژگی‌های بنیادی مانند، کنترل تومور را در پاسخ به واکسیناسیون و ایمونوتراپی مسدودکننده نقطه بازرسی ترویج می‌کنند. مصونیت 50، 195-211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. نقش اساسی اثرگذار مسیر Wnt Tcf-1 برای ایجاد حافظه سلول T عملکردی CD8. Proc. Natl Acad. علمی USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning، AN، Roychoudhuri، R. & Restifo، NP کنترل اپی ژنتیک تمایز سلول های T CD{1}}. نات. کشیش ایمونول. 18, 340–356 (2018).

14. کرومپتون، جی جی و همکاران. رابطه دودمانی زیرمجموعه‌های سلول‌های CD{1}} با تغییرات پیشرونده در چشم‌انداز اپی ژنتیک آشکار می‌شود. سلول مول. ایمونول. 13, 502–513 (2016).

15. یو، بی و همکاران. مناظر اپی ژنتیکی فاکتورهای رونویسی را نشان می دهد که تمایز سلول های CD{1}} را تنظیم می کند. نات. ایمونول. 18، 573-582 (2017).

16. اراکی، ی و همکاران. تجزیه و تحلیل گسترده ژنوم متیلاسیون هیستون، تنظیم مبتنی بر حالت کروماتین رونویسی ژن و عملکرد سلول های T حافظه CD{3}} را نشان می دهد. مصونیت 30، 912-925 (2009).

17. برنامه های Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC متابولیک ایمنی سلول های T را در عفونت های ویروسی، سرطان و پیری تنظیم می کنند. سلول متاب. 34، 378-395 (2022).

18. Phan, AT et al. متابولیسم گلیکولیتیک سازنده از تمایز حافظه مولد سلول CD{1}} در طول عفونت ویروسی پشتیبانی می کند. مصونیت 45، 1024-1037 (2016).

19. سینکلر، LV و همکاران. کنترل گیرنده آنتی ژن متابولیسم متیونین در سلول های T eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan، D. et al. سلول‌های T حافظه CD{1}} از لیپولیز ذاتی سلولی برای پشتیبانی از برنامه‌ریزی متابولیک لازم برای توسعه استفاده می‌کنند. مصونیت 41، 75-88 (2014).

21. پیرس، EL و همکاران. تقویت حافظه سلول T CD8 با تعدیل متابولیسم اسیدهای چرب. Nature 460, 103-107 (2009).

22. Van der Windt، GJ و همکاران. ظرفیت تنفسی میتوکندری یک تنظیم کننده حیاتی در رشد حافظه سلول های CD{1}} T است. مصونیت 36، 68-78 (2012). 23. Boedtkjer، E. & Pedersen، SF ریزمحیط تومور اسیدی به عنوان یک محرک سرطان. آنو. کشیش فیزیول. 82، 103-126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T cell disfunction در سرطان. سلول سرطانی 33، 547-562 (2018).

25. Scharping، NE و همکاران. ریزمحیط تومور، بیوژنز میتوکندری سلول t را سرکوب می کند تا نارسایی و اختلال در عملکرد متابولیک سلول های T داخل توموری ایجاد کند. مصونیت 45، 374-388 (2016).

26. یو، YR و همکاران. دینامیک میتوکندری مختل در CD{1}} TILها خستگی سلول های T را تقویت می کند. نات. ایمونول. 21، 1540–1551 (2020).

27. چانگ، CH و همکاران. رقابت متابولیک در ریزمحیط تومور محرک پیشرفت سرطان است. سلول 162، 1229-1241 (2015).

28. Scharping، NE et al. استرس میتوکندری ناشی از تحریک مداوم تحت هیپوکسی به سرعت باعث خستگی سلول های T می شود. نات. ایمونول. 22، 205-215 (2021).

29. Jansen, CS et al. یک طاقچه درون توموری سلول های CD8 T مانند بنیادی را حفظ و تمایز می دهد. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ et al. تعریف سلول‌های CD{1}} که پس از درمان PD{2}} باعث انفجار تکثیر شوند. Nature 537, 417-421 (2016).

31. هاس، آر و همکاران. لاکتات مدارهای متابولیک و پیش التهابی را در کنترل مهاجرت سلول های T و عملکردهای موثر تنظیم می کند. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. وو، اچ و همکاران. سلول های T برای سرکوب عملکردهای موثر خود، شیارهای اسیدی در غدد لنفاوی تولید می کنند. نات. اشتراک. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto، A. et al. تعدیل اسیدیته ریزمحیط، آنرژی را در لنفوسیت‌های T نفوذگر تومور انسان و موش معکوس می‌کند. سرطان Res. 72، 2746-2756 (2012). 34. گوتفرید، ای و همکاران. اسید لاکتیک مشتق شده از تومور، فعال سازی سلول های دندریتیک و بیان آنتی ژن را تعدیل می کند. Blood 107، 2013–2021 (2006).

35. Colegio، OR و همکاران. پلاریزاسیون عملکردی ماکروفاژهای مرتبط با تومور توسط اسید لاکتیک مشتق شده از تومور Nature 513, 559-563 (2014).

36. ارا دیاز، اف و همکاران. اسیدوز خارج سلولی و مهار mTOR باعث تمایز سلول های دندریتیک مشتق از مونوسیت انسان می شود. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. سوکومار، ام و همکاران. مهار متابولیسم گلیکولیتیک حافظه سلول های CD{1}} و عملکرد ضد تومور را افزایش می دهد. جی. کلین. سرمایه گذاری. 123, 4479-4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. مدولاسیون سیگنال دهی mTOR باعث تشکیل سلول های T حافظه مانند سلول های بنیادی می شود. EBioMedicine 4، 50-61 (2016).

39. Pollizzi، KN و همکاران. mTORC1 و mTORC2 به طور انتخابی تمایز سلول های CD{3}} T را تنظیم می کنند. جی. کلین. سرمایه گذاری. 125، 2090–2108 (2015).

40. Zhang، L. و همکاران. هدف پستانداران کمپلکس 2 راپامایسین، تمایز حافظه سلول T CD8 را به روشی وابسته به Foxo کنترل می‌کند. Cell Rep. 14, 1206-1217 (2016).

41. Zhou، H. و Huang، S. نقش سیگنال دهی mTOR در تحرک، تهاجم و متاستاز سلول های تومور. Curr. پروتئین پپت. علمی 12، 30-42 (2011).

42. Arguello, RJ و همکاران. SCENITH: یک روش مبتنی بر فلوسیتومتری برای پروفایل عملکردی متابولیسم انرژی با وضوح تک سلولی. سلول متاب. 32، 1063–1075 (2020).

43. رون هارل، ان و همکاران. بیوژنز میتوکندری و بازسازی پروتئوم متابولیسم تک کربنی را برای فعال سازی سلول های T ترویج می کند. سلول متاب. 24، 104-117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. سوخت رسانی ایمنی ضد توموری سلول T: متابولیسم اسید آمینه مورد بازبینی مجدد قرار گرفت. سرطان ایمونول. Res. 9، 1373–1382 (2021).

45. کاکارادوف، بی و همکاران. تنظیم اولیه رونویسی و اپی ژنتیکی تمایز سلول های CD{1}} با توالی یابی RNA تک سلولی آشکار شد. نات. ایمونول. 18, 422-432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. اسیدهای آمینه و ناقلان آنها در ایمنی سلول های T و درمان سرطان. مول. سلول 80، 384-395 (2020).

47. Marchingo، JM، Sinclair، LV، Howden، AJ & Cantrell، DA تجزیه و تحلیل کمی از چگونگی کنترل Myc پروتئوم های سلول T و مسیرهای متابولیک در طول فعال سازی سلول T. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. et al. پتانسیل غشای میتوکندری سلول هایی را با ساقه افزایش یافته برای درمان سلولی شناسایی می کند. سلول متاب. 23، 63-76 (2016).

49. علیزاده، د و همکاران. IL15 با کاهش فعالیت mTORC1 و حفظ فنوتیپ حافظه سلول های بنیادی، فعالیت ضد توموری سلول های CAR-T را افزایش می دهد. سرطان ایمونول. Res. 7, 759–772 (2019).

50. باک، MD و همکاران. دینامیک میتوکندری سرنوشت سلول T را از طریق برنامه ریزی متابولیک کنترل می کند. سلول 166، 63-76 (2016).

51. کریشنا، اس و همکاران. سلول‌های CD8 T شبه بنیادی، واکنش ایمونوتراپی سلولی را در برابر سرطان انسان واسطه می‌کنند. Science 370, 1328–1334 (2020).

52. برگر، ام ال و همکاران. سلسله مراتب غلبه آنتی ژن، فنوتیپ های سلول T CD8 پیش ساز TCF1+ را در تومورها شکل می دهد. سلول 184، 4996-5014 (2021).

53. Guo, Y. و همکاران. برنامه‌ریزی مجدد متابولیک سلول‌های سی‌دی8+ T پایان یافته توسط IL-10 ایمنی ضد تومور را افزایش می‌دهد. نات. ایمونول. 22، 746-756 (2021).

54. کلاین گلتینک، RI و همکاران. تهویه متابولیک سلول های T عامل CD{1} برای سلول درمانی پذیرفته شده. نات. متاب. 2, 703–716 (2020).

55. سوزوکی، جی.، نابه، اس.، یاسوکاوا، ام و یاماشیتا، ام. گلوتامین فعالیت ضد توموری سلول های CD8 T را تنظیم می کند. گان تو کاگاکو ریوهو 47، 11–15 (2020).

56. Vodnala، SK و همکاران. بنیادی و اختلال عملکرد سلول T در تومورها توسط یک مکانیسم مشترک ایجاد می شود. Science 363, eaau0135 (2019).

57. بوستیکاردو، ام و همکاران. فعال‌سازی مغرضانه لنفوسیت‌های T انسانی به دلیل pH پایین خارج سلولی با تحریک‌سازی B7/CD28 مخالفت می‌کند. یورو J. Immunol. 31, 2829-2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. تجمع لاکتات در محل التهاب مزمن با القای سیم کشی مجدد متابولیک سلول های CD{1}} باعث افزایش بیماری می شود. سلول متاب. 30، 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. لاکتات بنیه سلول های CD{1}} T را افزایش می دهد تا ایمنی ضد تومور را تقویت کند. نات. اشتراک. 13, 4981 (2022).

60. روی، DG و همکاران. متابولیسم متیونین از طریق تنظیم برنامه ریزی مجدد اپی ژنتیک، پاسخ های سلول های کمکی T را شکل می دهد. سلول متاب. 31، 250–266 (2020).

61. Zhang، L. و Romero، P. کنترل متابولیک تصمیمات سرنوشت سلول های CD{1}} و ایمنی ضد تومور. روند مول. پزشکی 24، 30-48 (2018).

62. Cham، CM، Driessens، G.، O'Keefe، JP & Gajewski، TF محرومیت از گلوکز، چندین رویداد بیان ژن و عملکردهای مؤثر را در سلول های CD{1}} مهار می کند. یورو J. Immunol.38, 2438-2450 (2008).

63. O'Sullivan، D. et al. سلول‌های T حافظه CD{1}} از لیپولیز ذاتی سلولی برای پشتیبانی از برنامه‌ریزی متابولیک لازم برای توسعه استفاده می‌کنند. مصونیت 49، 375-376 (2018).

64. Lin, R. et al. اکسیداسیون اسیدهای چرب بقای سلول های T حافظه ساکن CD{1}} را در آدنوکارسینوم معده کنترل می کند. سرطان ایمونول. Res 8, 479-492 (2020).

65. Raud, B. et al. اقدامات Etomoxir بر روی سلول های T تنظیمی و حافظه مستقل از اکسیداسیون اسید چرب Cpt1a است. سلول متاب. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ ورودی های متابولیک به اپی ژنوم. سلول متاب. 25, 544-558 (2017).

67. تیراکیس، PA و همکاران. S-2-هیدروکسی گلوتارات سرنوشت لنفوسیت T CD8+ را تنظیم می کند. Nature 540, 236-241 (2016).

68. ژانگ، اچ و همکاران. بتا هیدروکسی بوتیرات تولید شده توسط کتوژنز یک تنظیم کننده اپی ژنتیکی توسعه حافظه سلول های T CD{3}} است. نات. سلول بیول. 22، 18-25 (2020).

69. Bian, Y. et al. سرطان SLC43A2 متابولیسم متیونین سلول T و متیلاسیون هیستون را تغییر می دهد. Nature 585, 277-282 (2020).

70. Wall, M. et al. کنترل ترجمه ای c-MYC توسط راپامایسین باعث افزایش تمایز میلوئید انتهایی می شود. Blood 112, 2305-2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. کنترل متابولیک اپی ژنتیک و نقش آن در تمایز و عملکرد سلول های CD{1}}. جلو. ایمونول. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. سرکوب سیستم ایمنی یونی در ریزمحیط تومور، عملکرد موثر سلول T را محدود می کند. Nature 537, 539-543 (2016).

73. Guo, A. et al. اجزای کمپلکس cBAF و MYC در اوایل سرنوشت سلول های T CD{1}} همکاری می کنند. Nature 607, 135-141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. کنترل متابولیک تولید سلول های T حافظه و ساقه. کولد اسپرینگ هارب. چشم انداز Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur، HS et al. CUT&Tag برای پروفایل اپی ژنومیک کارآمد نمونه های کوچک و تک سلولی. نات. اشتراک. 10، 1930 (2019).

76. جین، اچ و همکاران. ChIPseqSpikeInFree: یک رویکرد عادی سازی تراشه-seq برای آشکار کردن تغییرات کلی در تغییرات هیستون بدون spike-in. بیوانفورماتیک 36، 1270-1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ متابولیت استخراج از سلولهای پستانداران پرورش داده شده با سوسپانسیون برای پروفایل متابولیت جهانی. نات. پروتکل 6، 1241-1249 (2011).

78. لی، سی و همکاران. کاتابولیسم اسید آمینه پروتئوستاز سلول های بنیادی خونساز را از طریق یک محور GCN2-eIF2 تنظیم می کند. سلول بنیادی سلولی 29، 1119-1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. حامل پیروات میتوکندری تمایز سلول های T حافظه و عملکرد ضد تومور را تنظیم می کند. سلول متاب. 34، 731-746 (2022).