مهارکننده فارنسیل ترانسفراز LNK-754 دیستروفی آکسون را کاهش می‌دهد و آسیب‌شناسی آمیلوئید را در موش‌ها کاهش می‌دهد قسمت 1

خلاصه

زمینه:

رسوب پلاک آمیلوئید و دژنراسیون آکسون رویدادهای اولیه در پاتوژنز AD هستند. A میکروتوبول‌ها را در نوریت‌های دیستروفیک پیش‌سیناپسی مختل می‌کند و در نتیجه باعث تجمع اندامک‌های اندولیزوزومی و اتوفاژیک آسیب‌دیده در انتقال آنزیم شکاف پروتئین پیش‌ساز آمیلوئیدی (BACE1) می‌شود. در نتیجه، نوریت های دیستروفیک A 42 تولید می کنند و به طور قابل توجهی به رسوب پلاک کمک می کنند.

دژنراسیون آکسون یک اختلال عصبی است که باعث آسیب به آکسون های نورون ها می شود و در نتیجه بر هدایت عصبی تأثیر می گذارد. ایمنی یک خط دفاعی مهم برای بدن انسان برای مقاومت در برابر تهاجم میکروب ها و ویروس های خارجی است. بنابراین، آیا بین دژنراسیون آکسون و ایمنی رابطه وجود دارد؟

اولاً، دژنراسیون آکسون بیماری ناشی از سیستم ایمنی نیست، بنابراین نیازی به نگرانی در مورد تأثیر منفی سیستم ایمنی وجود ندارد. اگرچه علت خاص دژنراسیون آکسون ناشناخته است، برخی از مطالعات نشان می دهد که دژنراسیون آکسون ممکن است با پاسخ های التهابی در سیستم ایمنی مرتبط باشد. پاسخ التهابی یک مکانیسم محافظتی سیستم ایمنی در برابر تهاجم پاتوژن های خارجی است. با این حال، اگر بیش از حد فعال شود، باعث آسیب التهابی به نورون ها می شود و باعث دژنراسیون آکسون می شود.

ثانیاً، یک سیستم ایمنی قوی می تواند مقاومت بدن را بهبود بخشد و خطر ابتلا به عفونت و بیماری را کاهش دهد، که به ویژه برای بیماران مبتلا به دژنراسیون آکسون اهمیت دارد. از آنجایی که سیستم عصبی بیماران مبتلا به دژنراسیون آکسون آسیب دیده است، توانایی خود ترمیم بدن نسبتا ضعیف است. اگر آنها از بیماری های دیگر رنج ببرند، وضعیت بدتر می شود و کیفیت زندگی آنها را بیشتر تحت تاثیر قرار می دهد. بنابراین، حفظ یک رژیم غذایی سالم و عادات زندگی و تقویت سیستم ایمنی می تواند به کاهش خطر ابتلا به بیماری های دیگر کمک کند. در عین حال، می تواند پاسخ ایمنی بدن را بهبود بخشد و باعث ترمیم آکسون ها و بازیابی هدایت عصبی شود.

به طور خلاصه، اگرچه هیچ ارتباط ضروری بین دژنراسیون آکسون و ایمنی وجود ندارد، یک سیستم ایمنی سالم می‌تواند حفاظت و حمایت لازم را برای بیماران مبتلا به دژنراسیون آکسون فراهم کند. بنابراین، ما باید به اهمیت حفظ سیستم ایمنی توجه کنیم و از جنبه هایی مانند رژیم غذایی و عادات زندگی شروع کنیم و به طور فعال سطح ایمنی بدن را ارتقا دهیم تا پایه ای محکم برای سلامت و طول عمر ایجاد کنیم. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانچ دسرتیکولا می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد زیرا سیستانچ دسرتیکولا یک ماده دارویی سنتی چینی است که اثرات منحصر به فرد بسیاری دارد که یکی از آنها بهبود حافظه است. اثربخشی گوشت چرخ کرده از ترکیبات فعال مختلفی که شامل اسید، پلی ساکاریدها، فلاونوئیدها و غیره است، ناشی می شود. این مواد می توانند به طرق مختلف سلامت مغز را تقویت کنند.

روی 10 روش برای بهبود حافظه کلیک کنید

مهارکننده‌های فارنسیل ترانسفراز (FTIs) اخیراً برای تغییر موقعیت به سمت درمان اختلالات عصبی مورد بررسی قرار گرفته‌اند و از عملکرد فارنسیل ترانسفراز (FTase) برای کاتالیز کردن فارنسیلاسیون، یک اصلاح پس از ترجمه که پروتئین‌های دخیل در عملکرد لیزوزوم و پایداری میکروتوبول‌ها را تنظیم می‌کند، جلوگیری می‌کنند. در مغزهای AD پس از مرگ، FTase و سیگنال دهی پایین دست آن تنظیم مثبت می شوند. با این حال، تاثیر FTIs بر آسیب شناسی آمیلوئید و نوریت های دیستروفیک ناشناخته است.

مواد و روش ها:

ما اثرات FTIR LNK-754 و lonafarnib را در مدل موش 5XFAD پاتولوژی آمیلوئید آزمایش کردیم.

نتایج:

در موش‌های {{0}ماهه 5XFAD که به‌مدت 3 ماه تحت درمان مزمن قرار گرفتند، LNK{4}} بار پلاک آمیلوئید و هیپرفسفوریلاسیون تاو را کاهش داد و تجمع BACE1 و LAMP1 را در نوریت‌های دیستروفیک کاهش داد. در موش‌های 5-ماهه 5XFAD که به‌مدت 3 هفته تحت درمان حاد قرار گرفتند، LNK{11}} اندازه نوریت دیستروفیک و تجمع LysoTracker-Green را در غیاب تأثیر بر رسوبات A کاهش داد. درمان حاد با LNK{13}} باعث بهبود حافظه و نقص یادگیری در موش‌های آمیلوئید hAPP/PS1 شد.

بر خلاف LNK{0}}، درمان با لونافارنیب در کاهش پلاک‌ها، هیپرفسفوریلاسیون تاو و نوریت‌های دیستروفیک کمتر مؤثر بود، که می‌توانست ناشی از کاهش قدرت در برابر FTase در مقایسه با LNK-754 باشد. ما اثرات FTIs را بر قاچاق آکسونی اندامک‌های اندولیزوزوم بررسی کردیم و دریافتیم که lonafarnib و LNK{2}} انتقال آکسونی رتروگراد را در نورون‌های اولیه افزایش می‌دهند، که نشان می‌دهد FTIs می‌تواند از بلوغ آندوزوم‌های دیررس آکسونی به لیزوزوم پشتیبانی کند. علاوه بر این، درمان FTI سطوح LAMP1 را در نورون‌های اولیه موش و مغز موش‌های 5XFAD افزایش داد و نشان داد که FTI‌ها بیوژنز اندامک‌های اندولیزوزومی را تحریک می‌کنند.

نتیجه گیری:

ما داده‌های جدیدی را نشان می‌دهیم که نشان می‌دهد LNK{0}} قاچاق آکسونی و عملکرد بخش‌های اندولیزوزومی را ارتقا می‌دهد، که فرض می‌کنیم کاهش دیستروفی آکسونی، کاهش تجمع BACE1 و مهار رسوب آمیلوئید در موش‌های 5XFAD را نشان می‌دهد. نتایج ما با کار قبلی که FTase را به‌عنوان یک هدف درمانی برای درمان پروتئینوپاتی‌ها شناسایی می‌کرد، موافق است و می‌تواند پیامدهای درمانی مهمی در درمان AD داشته باشد.

کلید واژه ها:

بیماری آلزایمر، نوریت های دیستروفیک، مهارکننده های فارنسیل ترانسفراز.

زمینه

بیماری آلزایمر (AD) یک بیماری عصبی پیشرونده است که شایع ترین علت زوال عقل در جمعیت سالخورده است و با اختلال قابل توجه در یادگیری و حافظه مشخص می شود. در سطح مولکولی، ویژگی‌های بارز مغز AD تجمع پلاک‌های آمیلوئید (A) و وجود آخال‌های تاو هیپرفسفریله شده است.

در مراحل اولیه و بدون علامت AD، A برای بیش از دو دهه یا بیشتر قبل از شروع اختلال حافظه در مغز تجمع می یابد [1-3]. در نتیجه، کاهش سطح A مغز تمرکز اصلی استراتژی‌های درمانی برای AD بوده است [4]. در حال حاضر، تنها درمان اصلاح کننده بیماری که به طور مشروط توسط FDA تأیید شده است، یک آنتی بادی ضد A است که اشکال تجمع یافته A را از مغز پاک می کند [5] و تأیید می کند که هدف قرار دادن A در مغز یک رویکرد امیدوارکننده برای درمان AD است.

با این حال، اکثر آزمایش‌های بالینی متمرکز بر A به دلیل نگرانی‌های ایمنی یا اثربخشی شکست خورده‌اند، و اکنون بر روی اهداف مبتنی بر فرضیه‌های مختلف AD، از جمله انتشار تاو، التهاب، دیشومئوستاز کلسیم، و عوامل عصبی عروقی تأکید شده است [4، 6، 7]. ]. علاوه بر این، علاقه فزاینده ای به پتانسیل درمانی فعال کردن مسیرهای تخریبی لیزوزومی به عنوان روشی برای کاهش پروتئین های بیماری زا وجود دارد، ویژگی رایج در بیماری های عصبی [8-12].

اختلال عملکرد گسترده مسیرهای اندولیزوزومی و اتوفاژیک به عنوان یک رویداد اولیه پاتوژنز AD به خوبی مستند شده است. بسیاری از جایگاه های ژنتیکی حساسیت AD با حمل و نقل اندولیزوزومی درون سلولی و عملکرد لیزوزوم [13] مرتبط هستند و اندامک های اندولیزوزومی و اتوفاژیک ناکارآمد بزرگ شده در مغز AD در نوریت های دیستروفیک تجمع می یابند [14، 15].

به نظر می‌رسد نوریت‌های دیستروفیک پس از آسیب عصبی شروع می‌شوند و در AD این بی‌ثباتی میکروتوبول‌ها توسط A [16] پیشنهاد می‌شود. این منجر به تورم های کانونی آکسون می شود که مسیرهای قاچاق و تخریب طبیعی پروتئین های کلیدی درگیر در تولید A از جمله BACE1 را مختل می کند [16، 17]. در نتیجه، دیستروفی ها A 42 تولید می کنند و به طور قابل توجهی به رسوب پلاک خارج سلولی و دیستروفی آکسونی [18] کمک می کنند، و یک مسیر پیشروی را آغاز می کنند که منجر به از دست دادن سیناپسی، تخریب عصبی، و نقص شناختی می شود [16].

استراتژی‌های درمانی که انتقال و فعالیت اندامک‌های اندولیزوزومی و اتوفاژیک را بهبود می‌بخشد، می‌تواند از دیستروفی عصبی جلوگیری کند، تخریب پروتئین‌های بیماری‌زا را حفظ کرده و مکانیسمی حیاتی برای کاهش سطوح BACE1 و A در AD باشد.

همانطور که جستجو برای درمان موثر AD ادامه دارد، تعداد داروهای مورد استفاده مجدد در آزمایشات بالینی برای AD به طور قابل توجهی افزایش یافته است زیرا داروهای ارزیابی شده بالینی دارای مشکلات ایمنی و کارایی شناخته شده هستند، بنابراین روند توسعه دارو را تسریع می کند [7، 19]. در سال‌های اخیر، مطالعات FTIs را به عنوان دسته‌ای از داروها با پتانسیل استفاده مجدد برای درمان بیماری‌های نورودژنراتیو شناسایی کرده‌اند.

FTI ها فارنسیلاسیون را مهار می کنند، یک اصلاح پس از ترجمه که پروتئین هایی را تنظیم می کند که در آن فارنسیل پیروفسفات به طور کووالانسی به باقی مانده های سیستئین در پروتئین هایی که حاوی یک موتیف CAAX هستند تغییر می یابد [20]. FTIها در ابتدا برای مسدود کردن فعالیت انکوژنیک Ras با مهار پرنیلاسیون آن طراحی شده بودند، اما در آزمایشات بالینی برای درمان سرطان به دنبال کشف مسیرهای جایگزین Ras پرنیلاسیون متوقف شدند [21، 22].

با این حال، بسیاری از بسترهای FTase وجود دارد [23-25]، که منجر به ارزیابی FTIs برای طیف گسترده ای از اختلالات، از جمله بیماری های قلبی عروقی، هپاتیت D و پروگریا می شود [20، 26]. علاوه بر این، FTI ها نسبت به بیماری های نورودژنراتیو که با تجمع توده های پروتئین مشخص می شوند، نویدبخش هستند. در مدل‌های کشت سلولی و جوندگان پروتئینوپاتی‌ها، FTIها فعالیت لیزوزومی و پروتئولیز پروتئین‌های سمی خاص بیماری را تحریک می‌کنند [8، 9، 27، 28].

قبلاً، ما نشان دادیم که LNK-754، یک FTI آزمایش شده در آزمایشات سرطان، افزایش قاچاق هیدرولاز لیزوزومی و کاهش تجمعات آلفا سینوکلئین (-synuclein) در نورون های مشتق شده از بیماری پارکینسون (PD) و مدل های موش PD [8] ].

مطالعات دیگر نتایج مشابهی را از FTI در جهت کاهش تجمعات پروتئینی گزارش کرده اند. درمان مدل‌های کشت سلولی PD با FTI{0}} کاهش یافته -سینوکلین [28] و لونافارنیب، یک FTI مورد تایید FDA برای درمان پروگریا [29]، افزایش فعالیت لیزوزومی و کاهش آخال‌های تاو در مدل موش تائوپاتی [28]. 9]. علاوه بر این، یک مطالعه اخیر نشان داد که حذف ژنتیکی FTase عصبی در مدل موش APP/PS1 AD مانع از یک نسل شد [30]. تمرکز مطالعات گذشته در ارزیابی FTI ها برای پروتئینوپاتی ها، نقش سوبستراهای FTase در فعالیت لیزوزوم و اتوفاژی بوده است.

با این حال، FTIها همچنین به عنوان تقویت کننده پایداری میکروتوبول (MT) و هم افزایی با داروهای تثبیت کننده MT برای افزایش استیلاسیون توبولین، از طریق یک مسیر مستقل از Ras شناخته شده اند [31-33]. تثبیت MT آسیب شناسی AD را در موش های APP/PS1 مهار می کند [34]، و در حال حاضر، چندین عامل تثبیت کننده MT از نظر بالینی برای درمان AD مورد بررسی قرار می گیرند [35]. بنابراین، شواهد قابل‌توجهی نشان می‌دهد که FTIs ممکن است برای بیماری‌هایی که با مکانیسم‌های هموستاز پروتئین ناکارآمد مانند AD مشخص می‌شوند، مفید باشد. با این حال، اهداف و مسیرهایی که فارنسیلاسیون پروتئین را با کاهش تجمعات پروتئینی در بیماری‌های نورودژنراتیو مرتبط می‌کنند، به طور کامل شناخته نشده‌اند.

در این مطالعه، ارزیابی کردیم که آیا درمان دارویی با FTIs می‌تواند آسیب‌شناسی AD مرتبط با A را بهبود بخشد. ما اثرات LNK-754 و lonafarnib، دو FTI شناخته شده برای کاهش تجمع پروتئین در اختلالات نورودژنراتیو، بر بار پلاک و نوریت های دیستروفیک در مدل موش 5XFAD آسیب شناسی آمیلوئید را ارزیابی کردیم. نتایج ما بینش هایی را در مورد مسیرهای تحت تأثیر مهار FTase ارائه می دهد و به شدت از تحقیقات بیشتر در مورد استفاده مجدد از FTIs به عنوان درمانی برای AD و سایر بیماری های عصبی که با تجمع پروتئین مشخص می شوند، پشتیبانی می کند.

مواد و روش ها

حیوانات و درمان های دارویی

تمام کارهای حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه نورث وسترن (IACUC) انجام شد. موش‌ها با رژیم غذایی استاندارد جوندگان و آب به صورت آزاد تغذیه شدند و با چرخه استاندارد 12-ساعت نور/تاریکی در خانه قرار گرفتند. موش‌های 5XFAD روی پس‌زمینه C57BL6 (آزمایشگاه‌های جکسون) با تلاقی موش‌های نر همزیگوت C57BL6 با ژن مثبت با موش‌های ماده C57BL6 تراریخته منفی (آزمایشگاه‌های جکسون) نگهداری شدند.

در پروتکل درمان مزمن ما، درمان‌های دارویی از 2 ماهگی، یعنی سنی که رسوب پلاک در آن شروع می‌شود، آغاز شد [36، 37]. در پروتکل درمان حاد، درمان دارویی در سن 5 ماهگی شروع شد که پس از آن رسوب پلاک و دژنراسیون آکسون گسترده است [38، 39].

LNK{0}} توسط Link Medicine (ماساچوست ایالات متحده آمریکا) سنتز شد و lonafarnib از شرکت شیمیایی Cayman (Ann Harbor، MI) تهیه شد. برای تیمارهای حیوانی، LNK-745 و lonafarnib در محلول گرم شده کربوکسی متیل سلولز 0.5 درصد (سیگما آلدریچ) به عنوان یک وسیله نقلیه با غلظت 0.10 میلی گرم در میلی لیتر تا حل شدن تهیه و محلول حل شد. روشن

مقدار کمی برای تزریق در دمای 20- درجه منجمد شد و سپس ذوب شد و در دمای 4 درجه برای هر هفته از درمان نگهداری شد. موش ها به دنبال یک پروتکل تعیین شده برای افزایش فعالیت لیزوزوم [8] تحت درمان قرار گرفتند. در پروتکل درمان مزمن، موش‌های 5XFAD یک ماهه به مدت 12 هفته با تزریق داخل صفاقی (IP) با هر دو وسیله نقلیه، LNK754 یا لونافارنیب روزانه با استفاده از سرنگ انسولین گیج به مدت 12 هفته تزریق شدند. ماهه در رژیم درمانی حاد، به موش‌های 5-ماهه 5XFAD روزانه به مدت 3 هفته تزریق شد.

پس از اتمام درمان، موش ها بیهوش و پرفیوژن شدند و مغزها برای تجزیه و تحلیل های بیشتر جمع آوری شد (به بخش های زیر مراجعه کنید). برای آزمایش‌های کشت سلولی، LNK{0}} و لونافارنیب در DMSO حل شده و به مدت 48 ساعت به کشت‌های عصبی اولیه موش در غلظت 10 نانومولار اضافه شدند. تیمار وسیله نقلیه یک مقدار معادل DMSO بود. سلول‌ها جمع‌آوری و به شرح زیر آنالیز شدند.

آنتی بادی ها

آنتی بادی‌های مورد استفاده برای آزمایش‌های ایمونوفلورسانس عبارت بودند از anti-LAMP1 موش (#1D4B، DSHB)، خرگوش anti-A 42 (#700254، Invitrogen)، خرگوش anti-BACE1 (#ab108394، Abcam)، خرگوش ضد III توبولین (#ab18207، Abcam). برای ایمونوبلات، آنتی‌بادی‌های مورد استفاده عبارت بودند از: ضد اکتین خرگوش (#926–42210، LI-COR)، خرگوش antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101، Cell Signaling Technology)، ضد خرگوش-44}/42 (Erk1/2) (#CS137F5، فناوری سیگنال‌دهی سلولی)، ضد LAMP1 خرگوش (#CS3234، فناوری سیگنال‌دهی سلولی)، ضد ماوس ضد BACE (3D5؛ ژائو و همکاران، 2007)، ضد APP موش (6E10) #803001، BioLegend)، ضد p-tau خرگوش (ser404) (#CS20194، فناوری سیگنال‌دهی سلولی)، ماوس anti-Tau1 (#MAB3420، Millipore Sigma)، prelamin-A، (#MABPT858، Millipore Sigma) و آنتی ماوس -HDJ-2 (#sc-59،554، سانتا کروز). آنتی بادی های ثانویه ضد خرگوش یا موش از Vector Laboratories برای ایمونوبلات استفاده شد.

تست رفتاری

حیوانات و درمان دارویی

آنالیزهای رفتاری توسط reMYND، Inc. با استفاده از مدل موش hAPP/PS1 با بیان خاص نورون جهش یافته بالینی پروتئین پیش ساز آمیلوئید انسانی همراه با جهش بالینی پرسنیلین 1 انسانی انجام شد [4{15}}]. این موش تراریخته دوگانه تجمع خود به خود و پیشرونده A را در مغز نشان می‌دهد که در نهایت منجر به ایجاد پلاک‌های آمیلوئید در سابیکولوم، هیپوکامپ و قشر مغز در 6 ماهگی می‌شود. 48 موش ماده hAPP/PS1 در پس‌زمینه FVB x C57Bl/6J با سن 6 ماهه، در ترکیب با 12 گروه کنترل ماده وحشی همسان با سن در پس‌زمینه FVB x C57Bl/6J مورد استفاده قرار گرفتند. تجویز 0.9mg/kg/day LNK{17}} در هر گاواژ خوراکی، یک بار در روز، به مدت 12 روز متوالی انجام شد. قربانی کردن حیوانات 2 ساعت پس از دوز نهایی انجام شد.

همه موش‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در سن 3 هفتگی ژنوتیپ شدند و پس از مشخص شدن نتایج PCR، یک شماره هویت منحصر به فرد دریافت کردند. همه موش‌ها قبل از شروع مطالعه توسط PCR دوم بررسی شدند. همه موش ها به صورت تصادفی نابینا و همسان با سن بودند. به موش ها یک عدد تصادفی توسط کامپیوتر داده شد و به صورت تصادفی به یک تیمار اختصاص داده شد. حیوانات 15 روز قبل از شروع مطالعه مجدداً توسط گروه درمان در قفس قرار گرفتند تا آنها بتوانند با بافت قفس جدید آشنا شوند. موش ها به آب از پیش فیلتر شده و استریل و غذای استاندارد موش دسترسی آزاد داشتند (Snif® Ms-H، Snif Spezialdiäten GmbH، Soest، آلمان). مواد غذایی در شرایط خشک و خنک در یک انبار با تهویه مناسب نگهداری می شد. مقدار آب و غذا روزانه چک می‌شد، در مواقع لزوم تامین می‌شد و هفته‌ای یک‌بار تازه‌سازی می‌شد. موش ها در ابتدا تحت یک ریتم معکوس روز-شب (14 ساعت روشنایی / 10 ساعت تاریکی) از ساعت 7 بعد از ظهر در قفس های فلزی استاندارد نوع RVS T2 (مساحت 540 سانتی متر مربع) قرار گرفتند.

قفس ها با کف جامد و لایه های بستر بستر مجهز شده اند. تعداد موش ها در قفس توسط قوانین محلی در مورد رفاه حیوانات محدود شده بود. 15 روز قبل از شروع درمان، موش‌ها در قفس‌های ماکرولون T2 تهویه‌شده انفرادی دوباره در قفس قرار گرفتند و برای سازگاری با محیط آزمایشگاه به منظور آماده‌سازی برای درمان به آزمایشگاه منتقل شدند. در آزمایشگاه، ریتم روز و شب از ساعت 7 بعد از ظهر به 12 ساعت روشنایی / 12 ساعت تاریکی تغییر یافت.

پیچ و خم آبی موریس

ماز آبی موریس در روزهای 8 تا 12 درمان انجام شد و حیوانات مستقیماً پس از آزمایش کاوشگر قربانی شدند. استخر (یک ظرف سفید و دایره‌ای به قطر 1 متر) حاوی آب در دمای 20 درجه با دی اکسید تیتانیوم به عنوان یک افزودنی بی بو و غیر سمی برای پنهان کردن سکوی فرار (1 سانتی متر زیر سطح آب) بود. شنای هر موش ضبط شد و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (Ethovision، Noldus Information Technology، Wageningen، هلند). قبل از آموزش، هر موش به مدت 15 ثانیه در بالای سکو قرار گرفت. برای آزمایش‌های ناوبری مکان، موش‌ها برای یافتن سکوی پنهان در هفت بلوک سه آزمایشی در چهار روز متوالی آموزش دیدند.

هر آزمایش شامل یک تست شنای اجباری حداکثر 120 ثانیه است و پس از آن 10 دقیقه استراحت انجام می شود. زمان مورد نیاز هر موش برای مکان یابی سکو اندازه گیری شد. هفت بلوک متوالی منجر به یک منحنی یادگیری می شود. 24 ساعت پس از آخرین تمرین، هر حیوان یک آزمایش کاوشگر با سکوی برداشته شد. به موش‌ها اجازه داده شد تا 60 ثانیه جستجو کنند و زمان جستجوی ربع و عبور از موقعیت سکوی اصلی اندازه‌گیری شد. در طول آزمایش نهایی کاوشگر، موش ها اجازه یافتند تا مکان قبلی سکو را به مدت 60 ثانیه پس از برداشتن سکو جستجو کنند.

کشت نورون اولیه

مغزهای جلویی در محلول نمک متعادل هنکس (HBSS) (Thermo Fisher #14185-052) از موش‌های باردار نوع وحشی C57BL6 (جکسون) در E15.5 تشریح شد تا نورون‌های اولیه به دست آید. پیش مغزهای جدا شده در 2.5 درصد تریپسین در دمای 37 درجه به مدت 20 دقیقه هضم شدند. برای جداسازی نورون ها در HBSS از پیپت پاستور صیقلی شده با آتش استفاده شد. سپس نورون ها روی یک صفحه شش چاهی پوشش داده شده با پلی-L-لیزین، 2×106 نورون در هر چاهک در محیط نوروبازال حاوی 2% B{19}}، 500 میکرومولار گلوتامین، 10% سرم اسب و 2.5 میکرومولار قرار گرفتند. گلوتامات (همه از Thermo Fisher).

محیط 2 ساعت بعد به Neurobasal با 2٪ B-27، 500 میکرومولار گلوتامین و 2.5 میکرومولار گلوتامات تغییر یافت. 24 ساعت بعد، محیط به Neurobasal به اضافه 2% B-27 و 500μM گلوتامین تغییر یافت. نیمی از رسانه ها هر 2 تا 3 روز یکبار تغییر می کردند. نورون های اولیه به مدت 7 روز کشت داده شدند و با غلظت حامل (DMSO) یا 10 نانومولار LNK{14}} یا لونافارنیب به مدت 48 ساعت تیمار شدند. سپس نورون ها ثابت یا زنده تصویربرداری شدند که در زیر توضیح داده شده است.

برای تثبیت، نورون‌ها به مدت 20 دقیقه در 4% پارافورمالدئید، 0.12M ساکارز در 1XPBS، نفوذپذیری در 0.5% Triton X-100 و با آنتی‌بادی‌های اولیه در طول شب انکوبه شدند. آنتی‌بادی‌های ثانویه کونژوگه با الکسافور موش الاغ (پروب‌های مولکولی، 1:1000) و رنگ‌آمیزی با 300 نانومولار DAPI. روکش‌ها با استفاده از Prolong Gold (کاوشگرهای مولکولی) نصب شدند و تصاویر بر روی یک میکروسکوپ کانفوکال نیکون A1 با هدف 60X (NA 1.4) و نرم‌افزار NIS Elements به دست آمد.

تصویربرداری زنده از نورون ها

برای آزمایش‌های تصویربرداری زنده، نورون‌ها مانند بالا آماده شدند و در ظروف ته شیشه‌ای 35 میلی‌متری (MatTek # P35G-1.5-14C) به مدت 7 روز در کشت قرار گرفتند. سپس 10 نانومولار LNK-754 یا lonafarnib به محیط های شرطی شده اضافه شد، کشت های کنترل با DMSO به عنوان یک وسیله درمان شدند. پس از 48 ساعت درمان، محیط با محیط های شرطی شده از صفحات موازی نورون های درمان نشده جایگزین شد. 25 نانومتر LysoTracker-Green DND{11}} (#L7526، Invitrogen) به محیط شرطی شده اضافه شد و نورون ها به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شدند.

تصویربرداری تایم لپس از نورون ها با استفاده از میکروسکوپ میدان وسیع Ti2 انجام شد. تصویربرداری بلافاصله در 30 دقیقه شروع شد و بیش از 30 دقیقه ادامه یافت. نوردهی‌های 1- هر دقیقه گرفته می‌شد و 20 تا 30 ناحیه جداگانه در هر ظرف ظرف 30 دقیقه تصویربرداری می‌شد. کمی سازی فاصله و سرعت ذرات LysoTracker و تجزیه و تحلیل کیموگراف با استفاده از نرم افزار NIS Elements انجام شد و در زیر به تفصیل توضیح داده شد. در آزمایش‌های جداگانه، 1μM Lysosensor-Green DND{10}} (#L7535، Invitrogen) به رسانه‌های شرطی اضافه شد و تصاویر گرفته شده از نورون‌های زنده به مدت حداکثر 15 دقیقه با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال Nikon A1 با شیئی 60X گرفته شد. (NA 1.4) و نرم افزار NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com