فریستاتین II به طور موثری از تکثیر SARS-CoV-2 در سلول های Vero جلوگیری می کند

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

خلاصه

سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) همچنان تأثیر قابل توجهی بر سلامت عمومی جهانی دارد. مکانیسم های متعددی برای ورود به سلول SARS-CoV{1} شرح داده شده است. با این حال، نقش گیرنده ترانسفرین 1 (TfR1) در عفونت SARS-CoV{5} کمتر مورد توجه قرار گرفته است. ما از فریتین II برای القای تخریب TfR1 در سطح سلول‌های Vero و بررسی پیامدهای این درمان بر روی زنده‌مانی سلول‌ها و تکثیر SARS-CoV{8}} استفاده کردیم. ما نشان دادیم که فریتین II برای سلول های Vero در غلظت های تا 400 میکرومولار غیر سمی است. با توجه به داده های میکروسکوپ کانفوکال، توزیع ترانسفرین نشاندار شده و دامنه اتصال گیرنده (RBD) پروتئین Spike به طور قابل توجهی تحت تاثیر پیش تیمار 18 ساعته با 100 میکرومولار فریتین II در یک محیط کشت قرار می گیرد. جذب پروتئین RBD تقریباً به طور کامل توسط تیمار فریتین II مهار می شود، اگرچه این پروتئین روی سطح سلول محدود می شود. این یافته ها با مهار قابل توجه عفونت SARS-CoV{15}} سلول های Vero توسط فریتین II با مقادیر IC50 27 میکرومولار (برای ویروس D614G ووهان) و 40 میکرومولار (برای ویروس دلتا) به خوبی تأیید شد. کاهش قابل توجهی در تیتر عفونی نوع Omicron SARS-CoV{21}} در غلظت فریتین II کمتر از 6.25 میکرومولار مشاهده شد. ما فرض می کنیم که فریتین II ورود سلول میزبان با واسطه TfR1-SARS-CoV{26}} را مسدود می کند. با این حال، مطالعات بیشتری برای روشن کردن مکانیسم‌های کامل مهار این ویروس، از جمله تأثیر فریتین II بر سایر گیرنده‌های SARS-CoV{28}، مانند ACE2، Neuropilin{30}} و CD147 مورد نیاز است. مهار ورود ویروس با هدف قرار دادن گیرنده روی سلول های میزبان، به جای پروتئین مستعد جهش ویروسی، یک استراتژی درمانی امیدوارکننده برای کووید{33}} است.

کلمات کلیدی: SARS-CoV-2;گیرنده ترانسفرین 1; فریتین II; دامنه اتصال گیرنده (RBD)؛ سلول های Vero

الکسی سوکولوف، ایرینا ایساکووا-سیواک *، ناتالیا گرودینینا، داریا مزنسکایا، النا لیتاسووا، والریا کوستویچ، اکاترینا استپانووا، الکساندرا راک، ایوان سیچف، اولگا کریک و لاریسا رودنکو

موسسه پزشکی تجربی، 197376 سنت پترزبورگ، روسیه

1. مقدمه

بیماری همه گیر کروناویروس 2019 (COVID-19) ناشی از سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) همچنان بار اجتماعی و اقتصادی قابل توجهی را برای جمعیت جهان ایجاد می کند. آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) به عنوان گیرنده اصلی سلول میزبان در نظر گرفته می شود که SARS-CoV{9}} برای ورود به سلول ها استفاده می کند [1-4]. با این حال، چندین گیرنده و گیرنده جایگزین که قادر به تسهیل ورود و عفونت SARS-CoV{14}} به سلول هستند، مانند Neuropilin-1، CD147، گیرنده تیروزین-پروتئین کیناز UFO (AXL) و موارد دیگر شناسایی شده‌اند. [5-10]. علاوه بر این، دو مرحله برش پروتئولیتیک برای ورود موثر SARS-CoV{21}} به سلول‌ها پس از درگیری گیرنده سلول میزبان توسط پروتئین اسپایک ویروسی (S) مورد نیاز است. مرحله اول شامل برش مرز S1-S2 توسط فورین پروتئاز در یک سلول آلوده است، در حالی که برش محل S20 وابسته به پروتئازهای سلول هدف، مانند TMPRSS2 و کاتپسین L است که پروتئین های S را در غشای پلاسما و در غشای پلاسما فعال می کنند. اندولیزوزوم، به ترتیب (در [11] بررسی شده است).

سیستانچ برای فروشبرایتوانایی ایمنی

جدای از اهداف ورود به سلول میزبان SARS-CoV{2}} که به خوبی مطالعه شده‌اند، شواهدی وجود دارد که گیرنده ترانسفرین 1 (TfR1) می‌تواند یک گیرنده جایگزین برای ورود SARS-CoV{7}} باشد [12]. TfR1، یک گلیکوپروتئین غشایی همودایمر نوع II با 95 کیلو دالتون، به وفور بر روی غشای پلاسمایی اکثر سلول‌های انسانی بیان می‌شود و واسطه ورود ترانسفرین (Tf) به سلول‌ها برای تحویل آهن است [13]. در واقع، طیف گسترده‌ای از ویروس‌های انسانی و مشترک بین انسان و دام وجود دارد که می‌توانند از طریق تعامل با TfR1 و سایر عوامل در مسیر جذب آهن به سلول‌های میزبان حمله کنند، از جمله آرنا ویروس‌های دنیای جدید، ویروس نقص ایمنی انسانی، پاروویروس‌ها، ویروس هپاتیت C، آلفا ویروس‌ها و غیره. [14]. بنابراین، هدف قرار دادن مسیر ورود ویروسی با واسطه TfR{14}} یک استراتژی درمانی امیدوارکننده برای عفونت SARS-CoV{16}} است. مطالعات غربالگری اولیه دو ترکیب با اندازه کوچک (NCI11079 و NCI306711) را شناسایی کردند که اثر مهاری قابل‌توجهی بر جذب آهن با واسطه Tf توسط سلول‌های HeLa داشتند. ترکیب NCI306711 TfR1 را با القای درونی سازی و تخریب آن هدف قرار می دهد و به دلیل خاصیت غیرمعمول آن در مهار انتقال آهن از طریق مسیر وابسته به کلسترول، «فریتین» نامیده شد [15]. یک مولکول کوچک دیگر، فریتین II (NSC{25}})، به شیوه ای مشابه فریتین عمل می کند و TfR1 را از طریق یک مسیر قایق لیپیدی حساس به نیستاتین تجزیه می کند [16]. با توجه به این داده‌ها، ما سعی کردیم توانایی فریتین II برای مهار تکثیر SARS-CoV{30}} در سلول‌های Vero-CCL81 را ارزیابی کنیم و مکانیسم‌های بالقوه این مهار را بررسی کنیم.

2. مواد و روشها

2.1. ویروس ها، پروتئین ها و ترکیبات شیمیایی

SARS-CoV-2 hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (نسب D614G ووهان)، hCoV-19 را جدا می‌کند /Russia/SPE-RII-32759V/2021 (دولای دلتا)، و hCoV-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (نسب Omicron) از موسسه تحقیقاتی Smorodintsev به دست آمد. آنفولانزا (سن پترزبورگ، روسیه). تمام کار با ویروس های عفونی در آزمایشگاه ایمنی زیستی سطح 3 (BSL{15}}) انجام شد. یک پروتئین نوترکیب مربوط به دامنه اتصال گیرنده (RBD) پروتئین SARS-CoV{18}} توسط BIOCAD JSC (سنت پترزبورگ، روسیه) در سلول‌های یوکاریوتی بیان شد. سرم انسانی اشباع شده از آهن TF (Fe{20}}TF) با کروماتوگرافی تبادل یونی روی DEAE-Toyopearl، UNOsphere S و فیلتراسیون ژل روی Sephadex G-75 Superfine از سرم خون انسان جدا شد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد. [17]. Ferristatin II (شکل 1) از سیگما (C{26}}، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. این ترکیب در 150 میلی‌مولار NaCl، 10 میلی‌مولار بافر Na-phosphate، pH 7.4 (PBS) تا غلظت نهایی 4 میلی‌متر رقیق شد و محلول از طریق یک غشای استریل با اندازه منافذ 0.22 میکرومتر (Sartorius، آلمان) فیلتر شد. .

2.2. انتشار ویروس SARS-CoV{3}} و ارزیابی ظرفیت مهار ویروس فریستاتین II

ویروس ها بر روی سلول های Vero CCL81 با استفاده از DMEM تکمیل شده با 1× آنتی بیوتیک-ضد قارچ، 10 میلی مولار HEPES و 2 درصد FBS (همه از Capricorn، Ebsdorfergrund، آلمان)، (DMEM/2 درصد FBS) تکثیر شدند. تیترهای عفونی با روش 50 درصد دوز عفونت کشت بافت (TCID50) تعیین شد، همانطور که در [18] توضیح داده شد و بر حسب lgTCID50/mL بیان شد.

برای ارزیابی ظرفیت خنثی‌سازی ویروس فریتین، از روش ریز خنثی‌سازی اصلاح‌شده استفاده کردیم. یک روز قبل از آزمایش، سلول‌های Vero در {{0}}صفحه‌های کشت چاهی (3 × 104 سلول در هر چاه) در DMEM حاوی 1× آنتی‌بیوتیک-ضد میکروب و 10 درصد FBS کشت داده شدند. روز بعد، محیط برداشته شد و سلول ها با 100 TCID50 SARS-CoV{9}} تهیه شده روی DMEM/2 درصد FBS به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2 آلوده شدند. چندین چاه به عنوان کنترل منفی بدون آلودگی باقی ماندند. سپس تلقیح برداشته شد و سلول ها با 150 میکرولیتر رقت فریتین II دو برابری تهیه شده بر روی DMEM/2 درصد FBS پوشانده شدند، در حالی که چاهک های کنترل منفی و مثبت فقط با محیط پوشانده شدند. هر رقت فریتین II در سه تکرار ارزیابی شد. پلیت ها به مدت 48 ساعت (برای ویروس Wuhan G614D) یا 72 ساعت (برای ویروس های Delta و Omicron) در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2 انکوبه شدند تا زمانی که یک اثر سیتوپاتیک واضح در چاهک های کنترل مثبت مشاهده شد. مواد رویی با دقت در لوله های 0.2 میلی لیتری برای تعیین کمیت تیتر ویروس جمع آوری شدند و سلول ها با فرمالدئید 10 درصد در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت ثابت شدند.

صفحات ثابت برای یک روش الایزا مبتنی بر سلول به آزمایشگاه BSL{{0}} منتقل شدند. این شامل شستشو با PBST (PBS با 0.05 درصد Tween 20)، نفوذپذیری سلول با 0.1 درصد Triton X{7}} در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه، مسدود کردن با 3 درصد شیر بدون چربی در دمای 37 درجه سانتیگراد بود. به مدت 1 ساعت و شستشوی فشرده با PBST. سپس آنتی بادی ضد RBD خرگوش پلی کلونال خالص شده (BIOCAD JSC، سنت پترزبورگ، روسیه) با غلظت 1.5 میکروگرم در میلی لیتر به مدت 1 ساعت اضافه شد و سپس شستشو با PBST و افزودن ثانویه ضد خرگوش ضد IgG HRP- اضافه شد. آنتی بادی کونژوگه (BioRad, Hercules, CA, USA) به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد. صفحات با استفاده از محلول زیرلایه 1-Step Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) توسعه یافتند. واکنش با محلول 1M H2SO4 متوقف شد و نتایج در طول موج 450 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر xMark Microplate (BioRad, Hercules, CA, USA) خوانده شد. برای محاسبه تیتر IC50، از آنالیز رگرسیون غیر خطی چهار پارامتری استفاده شد که بر اساس مقادیر OD450 سلول های ویروس منفی و ویروس مثبت، همانطور که در [18] توضیح داده شد، استفاده شد.

از کجا سیستانچ بخریم

تیترهای SARS-CoV-2 در سوپرناتانت های سلولی با روش کمی RT-PCR محاسبه شد. RNA از 100 میکرولیتر محیط کشت سلولی و همچنین از SARS-CoV{6}} با تیترهای شناخته شده برای تولید منحنی‌های استاندارد سنجش خالص شد. نمونه‌های RNA با کیت استخراج RNA (Biolabmix، Novosibirsk، روسیه) طبق پروتکل سازنده خالص شدند. واکنش RT-PCR در دو نسخه با پرایمر فورواردینگ 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 و پرایمر معکوس 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] با استفاده از یک لوله RT-PCR SYBR انجام شد. کیت (Evrogen، مسکو، روسیه) در Quantstudio 1 Real-Time PCR System (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, USA)، با افزودن 50x Rox به عنوان رنگ مرجع.

چرخه آستانه (Ct) برای هر نمونه با نرم افزار طراحی و تحلیل QuantStudio v1.5.1 محاسبه شد و منحنی استاندارد در هر صفحه واکنش ایجاد شد. تیتر ویروس در هر چاه با استفاده از مقادیر Ct نرمال شده به منحنی های استاندارد محاسبه شده بر اساس تیتراسیون استاندارد ویروس محاسبه شد و بر حسب lgTCID50/mL بیان شد. برای تعیین اینکه آیا فریتین II می تواند مراحل اولیه اتصال ویروسی به سلول ها را مهار کند، 100 TCID50 SARS-CoV{7}} با رقت های فریتین II مخلوط شد و پس از 1 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد، این مخلوط به Vero اضافه شد. سلول ها، به دنبال آن یک انکوباسیون اضافی در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت. پس از جذب ویروسی، مایه تلقیح برداشته شد و سلول ها با 150 میکرولیتر از محیط کشت تازه DMEM/2 درصد FBS پوشانده شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2 و CPE قابل مشاهده در سلولهای کنترل مثبت، پلیتها ثابت شدند و طبق آنچه در بالا توضیح داده شد تحت الایزای مبتنی بر سلول قرار گرفتند.

2.3. ارزیابی اثر سیتوتوکسیک فریستاتین II

سمیت سلولی فریتین II برای سلول‌های Vero توسط {0}}(4,{2}}دی متیل تیازول{3}}یل){4}}،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید ( MTT) سنجش کاهش [20]. رقت‌های دو برابری فریتین II در محیط DMEM/2 درصد FBS با شروع غلظت 400 میکرومولار تهیه شد و به چاهک‌های 96-چاه پلیت با تک‌لایه‌های سلولی Vero اضافه شد. پس از 48 ساعت انکوباسیون، محیط خارج شده و سلول ها به آرامی با PBS گرم شسته شدند. معرف MTT 0.5 میلی گرم بر میلی لیتر به هر چاهک در حجم 100 میکرولیتر اضافه شد و پلیت بیشتر در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انکوبه شد. سپس معرف حذف شد و سلول ها با PBS شسته و در هوا خشک شدند و سپس 100 میکرولیتر اتانول 96 درصد برای حل کردن بلورهای فورمازان اضافه شد. شدت رنگ با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 535 نانومتر ثبت شد. چاه های پلیت بدون سلول های Vero به عنوان کنترل منفی استفاده شد. مهار 50 درصدی زنده ماندن سلولی (CC50) با استفاده از آنالیز رگرسیون غیر خطی چهار پارامتری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prizm محاسبه شد.

2.4. برچسب گذاری ترانسفرین سرم انسانی و پروتئین RBD نوترکیب

واکنش برچسب‌گذاری در دمای +4 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت با افزودن محلول 5 میلی‌مولار NHS-استر 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) در دی متیل سولفوکسید به محلول‌های Fe2-TF یا RBD 30 میکرومولار انجام شد. در 200 میلی مولار NaHCO3، حفظ نسبت 5-TAMRA: پروتئین=8:1 (mol/mol). پس از حذف رنگ اضافی، درجه برچسب گذاری با نسبت A541 و A280 برآورد شد که به ترتیب 3.5 و 3.2 مول TAMRA بر مول Fe{19}}TF و RBD بود.

2.5. مطالعه اثر فریستاتین II جذب TF و RBD توسط سلول های Vero

سلول‌های Vero به مدت 18 ساعت در DMEM/2 درصد FBS بدون فریتین Il و با افزودن 1{8}}0 uM فریتین Il با پوشش‌هایی برای میکروسکوپی که قبلاً در پایین صفحات کشت قرار داده شده بودند، کشت داده شدند. سپس، محیط به مدت 15 ساعت با محیطی بدون FBS حاوی 1.2 میکرومولار Fe2-TF-TAMRA (0.25 mg/mL) یا 1.2 میکرومولار RBD-TAMRA (0.1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) جایگزین شد. پس از انکوباسیون، سلول ها به آرامی دو بار با PBS شسته شدند، با 4 درصد پارافورمالدئید (w/) در PBS به مدت 10 دقیقه تثبیت شدند، دو بار با PBS به مدت 30 دقیقه شسته شدند. سپس، هسته سلول ها با DAPI 360 نانومولار به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند، با PBS و ورقه های پوششی شسته شدند و با استفاده از رزین پلیمریزاسیون برای میکروسکوپ فلورسانس (DAKO، Glostrup، دانمارک) بر روی لام ها نصب شدند. تصاویر با استفاده از یک میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss، Jena، آلمان)، با یک هدف Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 تهیه شد. لیزر A561 نانومتری برای تحریک فلورسانس TAMRA، یک { {28}} فیلتر نانومتری برای ثبت فلورسانس، از لیزر 405 نانومتری برای تحریک DAPI استفاده شد. و یک فیلتر {30}} نانومتری برای ضبط فلورسانس استفاده شد. تصاویر با استفاده از نرم افزار ارائه شده با میکروسکوپ تهیه و پردازش شدند.

3. نتایج

برای ارزیابی توانایی فریتین II در مهار تکثیر ویروس در سلول‌های Vero، از دو سویه SARS-CoV-2 که از نظر آنتی ژنی دور بودند، استفاده کردیم. در مرحله اول، مهار ویروسی را در حضور ثابت ترکیب در محیط کشت ارزیابی کردیم. تشخیص آنتی ژن ویروسی در ELISA مبتنی بر سلول نشان داد که مقادیر IC5{14}} برای فریتین II به ترتیب 26.5 و 40.4 میکرومولار برای ویروس‌های Wuhan D614G و Delta بود (شکل 2A). کمی‌سازی تیترهای ویروس در محیط کشت تأیید کرد که آزادسازی ویروس از سلول‌های آلوده به محیط کشت توسط فریتین II با شروع غلظت 25 میکرومولار مهار شد و مقادیر IC50 محاسبه‌شده از کاهش تیتر TCID50 24.0 و 25.2 بود. میکرومولار برای ویروس‌های Wuhan D614G و Delta، به ترتیب. علاوه بر این، هنگامی که ترکیب در غلظت 100 میکرومولار اضافه شد، هیچ تکثیر ویروسی در سلول‌های Vero رخ نداد (شکل 2B).

سیستانچ و تونگکت علی

با توجه به تفاوت‌های قابل توجه در پروتئین‌های RBD ووهان D614G و انواع Omicron SARS-CoV{2}}، نمی‌توان دومی را در ELISA مبتنی بر سلول با استفاده از آنتی‌بادی ضد RBD در دسترس تشخیص داد، زیرا به بالا RBD سویه اصلی SARS-CoV-2. با این وجود، کاهش تیترهای ویروسی عفونی در حضور فریتین II در نوع Omicron در مقایسه با دو سویه دیگر SARS-CoV-2 حتی بارزتر بود: کاهش ده برابری در تیتر ویروس در فریتین II مشاهده شد. غلظت کمتر از 6.25 میکرومولار، بدون تکثیر ویروس در غلظت های 50 میکرومولار و بالاتر (شکل 3). توجه به این نکته ضروری است که این مهار SARS-CoV{14}} تنها زمانی رخ می‌دهد که فریتین II به طور مداوم در محیط کشت وجود داشته باشد، در حالی که این اثر زمانی که سلول‌ها با این ترکیب پیش تیمار شده بودند یا زمانی که یک ویروس/فریتین وجود داشت، مشاهده نشد. مخلوط II در مرحله جذب و سپس انکوباسیون بدون ماده مورد استفاده قرار گرفت (داده‌ها نشان داده نشده است).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 برای سویه‌های ووهان D614G، دلتا، و Omicron SARS-CoV-2.

برای کشف مکانیسم‌های احتمالی مهار SARS-CoV-2 توسط فریتین II، ما تأثیر این ماده را بر ورود ویروس با روش جذب جایگزین RBD مطالعه کردیم. بنابراین، ما تعیین کردیم که چگونه غلظت غیر سمی 100 میکرومولار فریتین II می تواند بر جذب RBD نشاندار شده با تترمتیل رودامین (TAMRA) توسط سلول های Vero تأثیر بگذارد. TfR1، هدفی برای عمل فریتین II، به عنوان واسطه ورود Tf شناخته شده است. بنابراین، TF با برچسب TAMRA به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. کشت سلول‌های Vero در حضور 100 میکرومولار فریتین II به مدت 18 ساعت بدون افزودن پروتئین‌های نشان‌دار، تأثیر قابل‌توجهی بر مورفولوژی هسته‌های سلولی نداشت (شکل 5، پانل بالایی (Mock))، که به‌طور غیرمستقیم نشان‌دهنده عدم وجود نکروز سلولی و آپوپتوز است. جوجه کشی سلول ها با TF-TAMRA بدون تیمار فریتین II منجر به تجمع پروتئین های نشاندار شده در داخل سلول ها شد، بدون اینکه بر ناحیه هسته ای رنگ آمیزی شده با DAPI تأثیر بگذارد (یک سه گانه میانی سمت چپ از تصاویر (TF-TAMRA) در شکل 5). درمان سلول ها با 100 میکرومولار فریتین II منجر به کاهش قابل توجهی در گنجاندن TF نشاندار شده (یک سه گانه راست میانی از تصاویر (TF-TAMRA) در شکل 5) شد. انکوباسیون سلول‌ها با RBD-TAMRA بدون تیمار فریتین II، مانند مورد TF نشاندار، منجر به تجمع پروتئین‌های نشاندار شده در سیتوپلاسم سلول، بدون تأثیر بر ناحیه هسته (سه‌گانه پایین سمت چپ (RBD-TAMRA) در شکل 5 شد. ). هنگامی که سلول ها با 100 میکرومولار فریتین II تیمار شدند، توزیع مجدد سیگنال TAMRA رخ داد. به جای ترکیب RBD نشاندار شده در سلولها، سیگنال TAMRA به طور یکنواخت بر روی سطح سلول توزیع شد، با تنها بخش کوچکی از برچسب که خوشه‌هایی را تشکیل می‌دهند که تا حدی با رنگ‌آمیزی DAPI هسته‌ها همپوشانی دارند، که نشان‌دهنده محلی‌سازی سطح برچسب TAMRA (پایین) است. سه گانه سمت راست (RBD-TAMRA) در شکل 5). نتایج نشان داده شده در شکل 5 نشان می دهد که تیمار سلول های Vero با 100 میکرومولار فریتین II بر ادغام RBD نشاندار شده در سلول ها تأثیر می گذارد. با توجه به اینکه در حال حاضر هیچ داده ای در مورد اثر فریتین II بر گیرنده ACE2 در دسترس نیست، نمی توان از این رد کرد که اثر مشاهده شده به دلیل اتصال RBD نشاندار شده به سطح سلول باشد، اما عدم وجود TfR1 روی سلول ها مانع از الحاق می شود. RBD در سلول های تیمار شده با فریتین II.

4. بحث

SARS-CoV{1}} از مکانیسم‌های متعددی برای حمله به سلول‌های میزبان و ایجاد عفونت ویروسی موفقیت‌آمیز استفاده می‌کند، و طیف وسیعی از مهارکننده‌های ورود به سلول میزبان در حال حاضر به عنوان استراتژی‌های درمانی COVID{2}} ارزیابی می‌شوند [21]. در مطالعه کنونی، ما نتایج اولیه مهار SARS-CoV-2 را در شرایط آزمایشگاهی با درمان سلول‌های هدف توسط فریتین II، یک مولکول با اندازه کوچک که می‌تواند به‌طور انتخابی گیرنده ترانسفرین ۱ را تجزیه کند، گزارش می‌کنیم. ترانسفرین اشباع از آهن. (Fe2-Tf یا holo-Tf) دارای میل ترکیبی بالایی با گیرنده های خود است که در سطوح بیشتر سلول های انسانی بیان می شود و در کمپلکس با holo-Tf توسط اندوسیتوز با واسطه گیرنده درونی می شود. تشکیل کمپلکس بین آهن و Tf و همچنین بین holo-Tf و TfR وابسته به pH است و باعث آزاد شدن آهن از Tf و Tf از TfR در محیط اسیدی اندوزوم می شود. بازیافت آندوزوم منجر به بازگشت TfR به غشای پلاسمایی و آزاد شدن apo-form Tf برای دور بعدی تحویل آهن به سلول می شود. جذب آهن توسط سلول‌های پستانداران فرآیند مهمی برای تنظیم رشد سلول‌های سرطانی است که فاقد عوامل دارویی با مکانیسم‌های اثر شناخته شده هستند. غربالگری 2000 ترکیب با اندازه کوچک از کتابخانه مجموعه تنوع موسسه ملی سرطان، 10 مهارکننده انتقال آهن را با مقادیر IC50 در محدوده 5 تا 30 میکرومولار شناسایی کرد [22]. فریستاتین II به عنوان مسدود کننده TfR1 در مطالعات عفونت سلولی از طریق TfR1 با ویروس هپاتیت C [23،24]، ویروس گاستروانتریت قابل انتقال [25] و reovirus [26] استفاده شده است (جدول 1). لازم به ذکر است که آزمایشات بر روی تجزیه TfR1 با فریتین II تقریباً همیشه در حضور دائمی ماده در محیط انجام می شود.

در یک تنظیم سنجش مشابه، ما دریافتیم که فریتین II برای سلول‌های Vero در طول 48 ساعت قرار گرفتن در معرض غلظت 400 میکرومولار عملاً غیرسمی بود. این غلظت برای تخریب کامل TfR1 در سطح سلول های کشت شده کافی است [16]. از یک طرف، این اثر با کاهش جذب Fe{4}}Tf نشاندار شده توسط سلول‌های Vero که با 100 میکرومولار فریتین II به مدت 18 ساعت پیش تیمار شده بودند تأیید شد. مسدود کردن غیر کامل جذب Tf نشاندار، در این مورد، می تواند با عدم وجود فریتین II در زمان افزودن پروتئین های نشاندار توضیح داده شود. از سوی دیگر، درمان سلول های Vero توسط فریتین II به طور چشمگیری جذب RBD پروتئین های Spike را تغییر داد. در این مطالعه مقدماتی، ما سطح بیان سایر گیرنده‌های SARS-CoV-2 را تحت درمان با فریتین II ارزیابی نکردیم و حذف این گیرنده‌های شناخته شده را برای اثبات نقش مستقل TfR در واسطه‌گری SARS القا نکردیم. ورود سلول -CoV{12}}، که حوزه تحقیقات بیشتر ما است.

با این وجود، اتصال نسبتاً یکنواخت RBD به سطح سلول‌های تیمار شده با فریتین II ممکن است نشان‌دهنده این باشد که برخی از گیرنده‌های SARS-CoV{1}} روی سلول‌های Vero عملکردی باقی می‌مانند و به ویروس متصل می‌شوند، اما در غیاب TfR1، ویروس نمی تواند وارد سلول شود. این گیرنده به احتمال زیاد ACE2 است زیرا Prabhakara و همکاران. افزایش جذب RBD نشاندار شده همراه با ترانسفرین نشاندار شده توسط سلولهایی که بیش از حد ACE2 را بیان می کنند، نشان داد که نشان می دهد ACE2 جذب RBD را از طریق اندوسیتوز با واسطه کلاترین، که توسط TfR1 مورد سوء استفاده قرار می گیرد، ترویج می کند [28]. علاوه بر این، شواهدی وجود دارد که نشان می‌دهد SARS-CoV{10}} می‌تواند سلول‌های ACE{11} منفی را با استفاده از مسیرهای ورودی جایگزین آلوده کند [29]. بنابراین، تجزیه و تحلیل عمیق‌تر عمل فریتین II بر روی انواع سلول‌های مختلف برای عفونت SARS-CoV مجاز است، نقش TfR1 در چرخه زندگی ویروس را روشن می‌کند. برای درک اینکه چقدر این ماده برای درمان آینده عفونت SARS-CoV{17}} امیدوارکننده است، مهم است که بدانیم چگونه این ترکیب در داخل بدن متابولیزه می شود. موش‌های تحت درمان با فریتین II سطوح پایین‌تری از TfR1 در کبد داشتند و آهن سرم و اشباع Tf را بدون تغییر در آهن غیرهم کبد کاهش دادند [16].

علاوه بر این، فریتین II بیان هپسیدین را القا کرد [16،30]. در مطالعه دیگری، بیان ژن پس از تجویز فریتین II (در روغن ذرت) در معده موش‌های صحرایی ویستار با دوز 146 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز به مدت 7 روز بررسی شد. در بین ژن های پروتئین های تنظیم کننده آهن، کاهش بیان HFE و افزایش بیان CP، GDF15 و HAMP پس از تجویز فریتین II مشاهده شد [31]. شایان ذکر است، اثر فریتین II بر روی مسیر سیگنالینگ وابسته به p{7} به احتمال زیاد مانعی است که استفاده از آن را فقط به عنوان یک مهارکننده TfR1 در کشت سلولی محدود می‌کند [31].

فریستاتین II با نام‌های مستقیم سیاه 38، کلرازول بلک E، CI 30235 یا CAS 1937- 37-7 نیز شناخته می‌شود و معمولاً به عنوان رنگ برای رنگ‌آمیزی گرانولوسیت‌ها و اونیکومیکوزیس استفاده می‌شود [32،33]. نکته مهم این است که متابولیت‌های بنزیدین مستقیم سیاه 38 که خطر بالقوه سرطان مثانه را دارند در نمونه‌های ادرار کارگران یک واحد مقیاس کوچک که این رنگ را تولید می‌کردند مشاهده شد [34]. اگرچه فریتین II نمی‌تواند مستقیماً در انسان استفاده شود، به همین دلیل، استدلالی وجود دارد که استراتژی مهار ورود SARS-CoV به سلول با مسدود کردن TfR1 امیدوارکننده است، زیرا این رویکرد گیرنده میزبان را هدف قرار می‌دهد. سلول ها به جای پروتئین مستعد جهش ویروسی. علاوه بر این، مطالعات بیشتر برای شناسایی ترکیبات شیمیایی که مانند مولکول فریتین II عمل می کنند، اما بدون تشکیل متابولیت هایی با خطرات بالقوه سلامت، ضروری است.

اختلال نعوظ cistanche

منابع

1 Scialo، F. دانیله، ا. آماتو، اف. پاستور، ال. ماترا، ام جی؛ کازولا، ام. کاستالدو، جی. Bianco، A. ACE2: گیرنده اصلی ورود سلولی برای SARS-CoV-2. ریه 2020، 198، 867-877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni، W. یانگ، ایکس. یانگ، دی. بائو، جی. لی، آر. شیائو، ی. هو، سی. وانگ، اچ. لیو، جی. یانگ، دی. و همکاران نقش آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) در COVID{4}}. کریت Care 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. شانگ، ج. بله، جی. شی، ک. وان، ی. لو، سی. آیهارا، اچ. گنگ، Q. اورباخ، آ. Li, F. اساس ساختاری تشخیص گیرنده توسط SARS-CoV{2}}. طبیعت 2020، 581، 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. وان، ی. شانگ، جی. گراهام، آر. باریک، RS; Li, F. شناسایی گیرنده توسط کروناویروس جدید از ووهان: تجزیه و تحلیل مبتنی بر مطالعات ساختاری دهه‌ای ویروس سارس. جی. ویرول. 2020، 94، e{4}}. [CrossRef] [PubMed]

5. ژانگ، Q. چن، CZ; سواروپ، م. خو، ام. وانگ، ال. لی، جی. وانگ، ای کیو؛ پرادان، م. هاگن، ن. چن، ال. و همکاران هپاران سولفات به SARS-CoV-2 در ورود به سلول کمک می کند و می تواند توسط داروهای تایید شده در شرایط آزمایشگاهی مورد هدف قرار گیرد. Cell Discov. 2020، 6، 80. [CrossRef]

6. وانگ، ک. چن، دبلیو. ژانگ، ز. دنگ، ی. لیان، جی کیو؛ دو، پ. وی، دی. ژانگ، ی. خورشید، XX; گونگ، ال. و همکاران CD{1}}پروتئین اسپایک مسیر جدیدی برای عفونت SARS-CoV-2 به سلول‌های میزبان است. انتقال سیگنال هدف. آنجا 2020، 5، 283. [CrossRef]

7. وی، سی. وان، ال. یان، س. وانگ، ایکس. ژانگ، جی. یانگ، ایکس. ژانگ، ی. فن، سی. لی، دی. دنگ، ی. و همکاران گیرنده حذف کننده HDL نوع 1 ورود SARS-CoV{4}} را تسهیل می کند. نات. متاب. 2020، 2، 1391–1400. [CrossRef]

8. دالی، جی ال. سیمونتی، بی. کلاین، ک. چن، KE; ویلیامسون، MK; آنتون پلاگارو، سی. Shoemark، DK; سیمون-گراسیا، ال. بائر، ام. هلند، آر. و همکاران نوروپیلین-1 یک عامل میزبان برای عفونت SARS-CoV-2 است. Science 2020، 370، 861–865. [CrossRef]

9. وانگ، اس. کیو، ز. هو، ی. دنگ، ایکس. خو، دبلیو. ژنگ، تی. وو، پی. زی، اس. بیان، دبلیو. ژانگ، سی. و همکاران AXL یک گیرنده کاندید برای SARS-CoV-2 است که باعث عفونت سلول های اپیتلیال ریوی و برونش می شود. Cell Res. 2021، 31، 126-140. [CrossRef]

10. Cantuti-Castelvetri، L. اوجه، ر. پدرو، LD; جاناتیان، م. فرانتس، جی. کویوانن، اس. ون در میر، اف. کالیو، ک. کایا، تی. آناستازیا، م. و همکاران نوروپیلین-1 ورود و عفونت سلولی SARS-CoV{4}} را تسهیل می‌کند. Science 2020, 370, 856–860. [CrossRef]

11. جکسون، سی بی; فرزان، م. چن، بی. Choe, H. مکانیسم‌های ورود SARS-CoV{2}} به سلول‌ها. نات. کشیش مول. سلول بیول. 2022، 23، 3-20. [CrossRef] [PubMed]

12. تانگ، ایکس. یانگ، م. دوان، ز. لیائو، ز. لیو، ال. چنگ، آر. نیش، م. وانگ، جی. لیو، اچ. خو، جی. و همکاران گیرنده ترانسفرین گیرنده دیگری برای ورود SARS-CoV-2 است. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze، MW; Muckenthaler، MU; اندروز، NC Balancing: کنترل مولکولی متابولیسم آهن پستانداران. سلول 2004، 117، 285-297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick، M. عبور از دروازه آهنی: چرا و چگونه گیرنده های ترانسفرین واسطه ورود ویروس می شوند. آنو. کشیش نوتر. 2018، 38، 431-458. [CrossRef] [PubMed]

15. هورونچیک، ال. Wessling-Resnick، M. مهارکننده انتقال آهن با مولکول کوچک فریتین/NSC306711 باعث تخریب گیرنده ترانسفرین می شود. شیمی. Biol. 2008، 15، 647-653. [CrossRef]

16. Byrne, SL; باکت، PD; کیم، جی. لو، اف. سنفورد، جی. چن، جی. انز، سی. Wessling-Resnick، M. Ferristatin II تخریب گیرنده ترانسفرین{2}} را در شرایط in vitro و in vivo ترویج می کند. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [CrossRef]

17. سوکولوف، AV; Voynova، IV; کوستویچ، ویرجینیا؛ Vlasenko، AY; زاخارووا، ای تی. Vasilyev، VB مقایسه تعامل بین سرولوپلاسمین و لاکتوفرین/ترانسفرین: اتصال یا عدم اتصال. بیوشیمی. Biokhimiia 2017، 82، 1073-1078. [CrossRef]