سرطان معده (GC) اولین شیوع و دومین مرگ و میر پیشرو در سرطان های دستگاه گوارش بود.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه

درمان دارویی پلاتین یکی از غالب ترین استراتژی های شیمی درمانی برای بیماران مبتلا به سرطان معده (GC) است. با این حال، اثر درمانی کمتر از رضایت بخش است، که عمدتا به دلیل مقاومت اکتسابی به داروهای پلاتین است. بنابراین، درک بهتر مکانیسم های زمینه ای می تواند تا حد زیادی اثربخشی درمانی GC را بهبود بخشد. در این مطالعه، هدف ما بررسی عملکردها/مکانیسم‌های مرتبط با مقاومت شیمیایی و اهمیت بالینی پروتئین 75 تنظیم‌شده با گلوکز (GRP75) در GC بود. در اینجا، داده‌های ما نشان داد که در مقایسه با سلول‌های SGC7901، بیان GRP75 در مقاومت به سیس‌پلاتین به‌طور قابل‌توجهی بالاتر بود (سلول‌ها (SGC7901 *). نابودی GRP75 حفظ پتانسیل غشای میتوکندری (MP) را لغو کرد و فاکتور هسته‌ای اریتروئید را مهار کرد{{{ 10}}فاکتور مرتبط 2 (NRF2)، فسفاتیدیل 3 کیناز/پروتئین کیناز B (Pl3K/AKT)، فاکتور القای هیپوکسی 1a (HIF{17}}a)، و c-myc، که منجر به مسدود کردن فعال شدن این فرآیندها توانایی ضد اکسیداسیون/آپوپتوز را کاهش داد و برنامه‌ریزی مجدد متابولیک را در سلول‌های SGC7901 تغییر داد که منجر به حساس شدن مجدد این سلول‌ها به سیس پلاتین شد. با این حال، بیان بیش از حد GRP75 در سلول‌های SGC7901 باعث اثرات معکوس شد. یک مدل زنوگرافت در بیماران GC دریافت کننده شیمی درمانی پلاتین و متاآنالیز، سطح بالای GRP75 به طور مثبت با ویژگی های تهاجمی و پیش آگهی ضعیف از جمله، اما نه محدود به معده، همراه بود. سرطان روده، و یک پیش بینی مستقل برای بقای کلی بود. در مجموع، مطالعه ما نشان داد که GRP75 در مقاومت GC به سیس پلاتین نقش دارد و GRP75 می‌تواند یک هدف درمانی بالقوه برای بازگرداندن پاسخ دارویی در سلول‌های مقاوم به پلاتین و یک ابزار پیش آگهی افزودنی مفید در هدایت مدیریت بالینی بیماران GC باشد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

مقدمه

سرطان معده (GC) اولین شیوع و دومین مرگ و میر پیشرو سرطان های دستگاه گوارش در چین بود. درمان‌های فعلی برای GC پیشرفته، عمل جراحی همراه با شیمی‌درمانی سیستمیک بود، اما میزان بقای طولانی‌مدت به دلیل عود بالای بعد از جراحی کمتر از رضایت‌بخش بود. در عمل بالینی، داروهای پلاتین یکی از داروهای خط اول برای پیشرفته بودند شیمی درمانی GC3. با این حال، مقاومت اکتسابی به داروها همیشه پس از چندین دوره درمان مبتنی بر پلاتین رخ می دهد و نشان دهنده پیش آگهی ضعیف است.سیستانچبنابراین، روشن کردن مکانیسم‌های بالقوه و شناسایی استراتژی‌های درمانی جدید برای غلبه بر مقاومت به داروهای پلاتین در بیماران GC ضروری بود.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

پروتئین 75 تنظیم شده با گلوکز (GRP75) همراه مولکولی القایی استرس بود که به خانواده پروتئین شوک حرارتی تعلق داشت. بیان بیش از حد GRP75 ارتباط تنگاتنگی با پیشرفت تومور در سرطان های مختلف انسانی دارد{6}}. در اینجا، از طریق کاوش در یک متاآنالیز، متوجه شدیم که سطح بالای GRP75 نشان دهنده پیش آگهی ضعیف قابل توجهی در چندین سرطان دستگاه گوارش (سرطان کولورکتال، کلانژیوکارسینوما و سرطان پانکراس) است. برای مقاومت دارویی، مهار GRP75 مقاومت به سیس پلاتین و دوکسوروبیسین را در سرطان کبد و سرطان تخمدان معکوس کرد." تومورهای مثبت در مقایسه با تومورهای منفی GRP75 در GC با عملکرد طبیعی p53 پیش آگهی بدتری داشتند، اما p53 یکی از ژن‌های متداول جهش‌یافته در GC بود (بیش از 50 درصد بیماران را تحت تأثیر قرار می‌دهد). بنابراین ما فرض کردیم. که علاوه بر سرکوب کلاسیک فعالیت p53، GRP75 ممکن است در القای/حفظ مقاومت دارویی پلاتین در GC از طریق استفاده از روشی مستقل دخیل باشد.

در این مطالعه، بیان بالاتر GRP75 به مقاومت سیس پلاتین در سلول‌های SGC7901 و در مدل زنوگرافت کمک کرد. از نظر مکانیکی، GRP75 مقاومت به سیس پلاتین را از طریق تنظیم توانایی‌های ضد اکسیداسیون/آپوپتوز و خواص برنامه‌ریزی مجدد متابولیک، القاء یا حفظ کرد.cistanche استرالیادر بیماران GC، بیان بیش از حد GRP75 به ویژگی های تهاجمی و پیش آگهی ضعیف کمک کرد. نتایج ما نشان داد که GRP75 مقاومت به سیس پلاتین را در GC ارتقا می‌دهد و می‌تواند نشانگر زیستی برای پیش‌بینی پاسخ به درمان دارویی پلاتین باشد.مزایای سیستانچهدف قرار دادن GRP75 ممکن است درک جدیدی از شیمی درمانی سیستمیک GC ارائه دهد.

نتایج

اثرات GRP75 بر مقاومت به سیس پلاتین در سنجش زنده‌مانی سلول‌های GC برای تأیید مقاومت سلول‌های SGC7901 ~ استفاده شد، Ipsos (uM) سیس پلاتین برای سلول‌های SGC7901 و SGC7901CR: 5.518 در مقابل 72.46 بود (شکل. بر اساس پایگاه های داده KM-Plotter، افزایش بیان GRP75 نشان دهنده پیش آگهی ضعیف است (شکل 1B). علاوه بر این، بیان GRP75 در سلول‌های SGC7901CR در مقایسه با سلول‌های SGC7901 والدین آن (شکل 1C) به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافته است، که نشان می‌دهد GRP75 ممکن است به مقاومت در برابر سیس پلاتین کمک کند. برای تأیید این فرضیه، سلول‌های SGC7901~ توسط siRNA اسکرامبل یا GRP75 ترانسفکت شدند و IC50s (uM) سیس‌پلاتین برای سلول‌های SGC7901CK ترانسفکت‌شده با siRNA یا GRP75 به ترتیب: 50.83 در مقابل 20 بود.{29} . 1D). متقابلا،

بیان بیش از حد GRP75 با ترانسفکشن پلاسمیدهای GRP75 به سلولهای SGC7901 نشان داد که IC50های سیس پلاتین برای سلولهای SGC7901 ترانسفکت شده با پلاسمیدهای GRP75 3.825 در مقابل 6.98 (شکل 1E) بود. در مجموع، این نتایج نشان داد که GRP75 نقش مهمی در حفظ/القای مقاومت به سیس‌پلاتین در GC ایفا می‌کند، اما مکانیسم‌ها همچنان تحقیقات بیشتری را انجام می‌دهند.

مکانیسم های بالقوه زیربنایی GRP75 باعث مقاومت در برابر سیس پلاتین شد

مجموعه داده های ریزآرایه GSE122130 (SGC7901CR در مقابل SGC7901) و GSE14209 (بافت ها، مقاوم به سیس پلاتین در مقابل حساس به سیس پلاتین) را از GEO دانلود کردیم، سپس فرآیند GO-Biological و KEGG-Pathway را تجزیه و تحلیل کردیم بر اساس DAV1 غنی سازی. نتایج در شکل 2A-D نشان داده شده است. تفاوت‌های اساسی فرآیندهای بیولوژیکی بین سلول‌های SGC7901C* و سلول‌های SGC7901 شامل کاهش اکسیداسیون، فرآیند آپوپتوز (شکل 2A)، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی KEGG-Pathway نشان داد که مجموعه‌های DEGs با مسیرهای متابولیک و فسفاتیدیلی‌نوزیتول B3 پروکیناز/کیناز/3 مرتبط هستند. مسیر (PI3K/AKT) (شکل 2B). پاسخ به دارو در تفاوت‌های اساسی فرآیندهای بیولوژیکی بین بافت‌های تومور مقاوم به سیس پلاتین و حساس به سیس پلاتین گنجانده شد و مسیر متابولیک نیز پیوند اصلی در تحلیل غنی‌سازی KEGG-Pathway بود (شکل 2C، D). علاوه بر این، شبکه ای از 60 پروتئین که به طور قابل توجهی با GRP75 تعامل داشتند با استفاده از پایگاه داده String ساخته شد، سپس تجزیه و تحلیل KEGG-Pathway نشان داد که مسیرهای متابولیک نقش مهمی بین GRP75 و برهم کنش های آن ایفا می کند (شکل 2E). بر اساس این نتایج، ما حدس زدیم که آنتی اکسیداسیون / آپوپتوز و برنامه ریزی مجدد متابولیک ممکن است بقا و رشد GC را افزایش دهد که منجر به مقاومت در برابر سیس پلاتین می شود. با این حال، مکانیسم های مشارکت GRP75 در تنظیم نیاز به مطالعه بیشتر داشت (شکل 2F).

اثرات GRP75 بر ضد اکسیداسیون و ضد آپوپتوز در اینجا، سطح ROS داخل سلولی در سلول‌های SGC7901CR در مقایسه با همتایان والدین خود (شکل 3A) افزایش یافته است، که نشان می‌دهد سلول‌های SGC7901Ck در معرض شرایط استرس اکسیداتیو نسبتاً بالاتری قرار دارند. یک مطالعه قبلی نشان داد که GRP75 در تثبیت MMP، منبع مهم تولید ROS نقش داشته است. در اینجا، نابودی GRP75 حفظ MMP را در سلول های SGC7901CK القا شده توسط سیس پلاتین لغو کرد، و بیان بیش از حد GRP75 اثر معکوس در سلول های SGC7901 داشت (شکل 3B).کلسترول سیستانچسپس، ما رابطه بین GRP75 و آنتی اکسیداسیون و ضد آپوپتوز را تأیید کردیم. همانطور که در شکل 3C نشان داده شده است، از بین رفتن GRP75 سطح فاکتور هسته ای اریتروئید{5}}مربوط به فاکتور 2 (NRF2) و ژن های هدف پایین دست آن (HO{8}} و NQO-1) را در SGC7901 کاهش داد. سلول های ~، و بیان بیش از حد GRP75 اثر معکوس در سلول های SGC7901 نشان داد. علاوه بر این، نابودی GRP75 یا NRF2 در سلول‌های SGC7901CR باعث افزایش بیشتر تولیدات ROS درون سلولی، آپوپتوز (شکل 3D) و فعالیت‌های کاسپاز{17}} (شکل تکمیلی S1) ناشی از سیس پلاتین شد. در مقابل، بیان بیش از حد GRP75 در سلول‌های SGC7901 به طور قابل‌توجهی باعث کاهش تولیدات ROS ناشی از سیس پلاتین، آپوپتوز سلولی (شکل 3E) و فعالیت‌های کاسپاز{24}} شد (شکل تکمیلی S1). این نتایج نشان داد که GRP75 حفظ/مقاومت ناشی از سیس پلاتین ممکن است از طریق القای ضد اکسیداسیون و ضد آپوپتوز در سلول‌های GC باشد.

اثرات GRP75 بر برنامه ریزی مجدد متابولیک در مرحله بعد، ما بیشتر بررسی کردیم که به موجب آن GRP75 باعث تغییر برنامه ریزی مجدد متابولیک می شود. شواهد فزاینده نشان داد که متابولیسم سلول های تومور یک تغییر غیر طبیعی در یک مسیر متابولیک منفرد نیست، بلکه برنامه ریزی مجدد کل شبکه متابولیک سلولی است. بسیاری از انکوژن‌های کلاسیک یا مسیرهای سیگنالینگ به طور مستقیم یا غیرمستقیم در برنامه‌ریزی مجدد متابولیک دخیل بودند، مانند PI3K/AKT، فاکتور القای هیپوکسی la (HIF-la)، c-myc، و غیره"'819. بنابراین، ما تأیید کردیم که آیا GRP75 در برنامه ریزی مجدد متابولیک سلول های GC نقش دارد. همانطور که در شکل 4A نشان داده شده است، ما سطوح p-AKT، HIF-la و c-myc را در سلول های SGC7901CR در مقایسه با سلول های SGC7901 والدین آن مشاهده کردیم. GRP75 سطح پروتئین p-AKT، HIF-la و c-Myc ناشی از سیس پلاتین و اهداف پایین دست مربوط به گلیکولیز را کاهش داد (HK2: هگزوکیناز 2؛ PDK1: پیروات دهیدروژناز کیناز L؛ و LDHA: زنجیره لاکتات دهیدروژناز A). در مقابل، بیان بیش از حد GRP75 در سلول‌های SGC7901 اثر معکوس را نشان داد (شکل 4B، C). علاوه بر این، کاهش GRP75 یا AKT در سلول‌های SGC7901CR کاهش قابل‌توجهی در جذب گلوکز و زنده‌مانی/رشد سلولی ناشی از سیس پلاتین نشان داد. بیان بیش از حد GRP75 در سلول های SGC7901 به طور قابل توجهی افزایش توانایی جذب گلوکز و زنده ماندن/رشد سلولی ناشی از سیس پلاتین (شکل 1). 4D-F). در مجموع، این داده‌ها نشان داد که GRP75 مقاومت به سیس‌پلاتین را در سلول‌های GC حفظ/القا می‌کند، ممکن است از طریق شرکت در برنامه‌ریزی مجدد متابولیک با واسطه p-AKT، HIF-la، و c-myc باشد.

تایید داده های آزمایشگاهی در یک مدل پیوند زنوگرافت سپس ارتباط بالینی بالقوه GRP75 را در داخل بدن بررسی کردیم. داده های پیوند زنوگرافت نشان داد که درمان با سیس پلاتین به تنهایی یا حذف GRP75 به تنهایی می تواند رشد تومور را مهار کند. با این حال، درمان سیس پلاتین همراه با ناک داون GRP75 به طور قابل توجهی مهار رشد تومور ناشی از سیس پلاتین را تسهیل کرد (شکل 5A). علاوه بر این، سنجش IHC و qPCR نشان داد که سیس پلاتین به همراه siRNA GRP75 به طور قابل توجهی بیان Ki67، GRP75، NRF2، p-AKT و اهداف پایین دستی را در مقایسه با تیمار سیس پلاتین به تنهایی کاهش داد، اما آپوپتوز را افزایش داد (همانطور که با رنگ‌آمیزی TUNEL، شکل 5B تعیین شد. ، ج). در مجموع، این نتایج نشان داد که از طریق تنظیم توانایی‌های ضد اکسیداسیون/ضد آپوپتوز و برنامه‌ریزی مجدد متابولیک، GRP75 بقا و رشد in vivo را تحریک کرد که به نوبه خود منجر به مقاومت GC در برابر سیس پلاتین شد.

شناسایی GRP75 به عنوان یک عامل مشخصه محرک سرطان و اهمیت بالینی GRP75 در GC

سپس بیان GRP75 را در بخش‌های متوالی نمونه‌های GC ارزیابی کردیم. همانطور که در شکل 6A نشان داده شده است، در مقایسه با بافت های مجاور غیر توموری معده، افزایش قابل توجهی از بیان GRP75 در بافت های GC مشاهده شد. بیان بیش از حد GRP75 در بافت های GC با نمره شدت IHC نشان داده شد (شکل 6B). رنگ آمیزی قوی تر برای GRP75 نیز با افزایش TNM طبقه بندی مرحله تومورهای بدخیم مشاهده شد (شکل 6C، D). سپس، این 116 نمونه GC را به دو گروه تقسیم کردیم ("GRP75 کم" در مقابل "GRP75 بالا"، با توجه به شدت IHC، شکل 6E). قطر عرضی تومورها در گروه "GRP75 high" به طور قابل توجهی بزرگتر از قطرهای در گروه "GRP75 low" بود (شکل 6F). ما بیشتر پیش آگهی بالینی GRP75 را در GC تأیید کردیم. تجزیه و تحلیل بقای Kaplan-Meier همچنین نشان داد که بیماران GC در گروه "GRP75 بالا" بقای کلی بدتری نسبت به گروه "GRP75 low" داشتند (شکل 6G).

تجزیه و تحلیل چند متغیره مشخص کرد که GRP75 یک پیش بینی مستقل برای بقای کلی است (جدول 1).عوارض جانبی cistanche deserticolaبه طور خلاصه، این نتایج نشان می دهد که GRP75 نقش مشخصی در پیشروی پیشرفت GC، مقاومت به سیس پلاتین و پیش آگهی ضعیف دارد. متاآنالیز سطح بالای GRP75 با نمودار جریان پیش آگهی جستجو و انتخاب متون و متاآنالیز در شکل تکمیلی S2 نشان داده شده است. مدل اثر تصادفی و مدل اثر ثابت برای محاسبه و تجزیه و تحلیل ارزش HR استفاده شد، هر دو نشان دادند که سطوح بالای GRP75 به طور قابل‌توجهی با نتایج ضعیف بیمار مرتبط است. HR ادغام شده 1.91 (95 درصد فاصله اطمینان (CI): 1.62 تا 2.25) بود، با ناهمگنی (I'=0.0 درصد ,p =0.559) (شکل 7A). سپس ما یک تجزیه و تحلیل زیر گروهی انجام دادیم که نشان داد سطح بیان GRP75 در سرطان دستگاه گوارش (HR ترکیبی 1.99،95 درصد فاصله اطمینان (CI): 1.64 تا 2.43 بود)، ارتباط معنی‌داری با پیش‌آگهی بقای ضعیف دارد. مطمئناً نتایج مشابهی در سایر تومورها نیز یافت شد (HR ترکیبی 1.74،95 درصد فاصله اطمینان (CI): 1.29 تا 2.33 بود) (شکل 7B). هر دو

نمودار قیف بگ و آزمون ایگر برای ارزیابی سوگیری انتشار احتمالی مطالعات وارد شده استفاده شد. در تجزیه و تحلیل ارتباط بین GRP75 و OS، مقدار p آزمون Begg و آزمون Egger به ترتیب 0 بود.076 و 0.024 (شکل 7C و D). با این حال، آزمون Egger حساسیت بالاتری در ارزیابی سوگیری انتشار دارد. بنابراین، از روش trim and fill برای معتبرتر کردن نتایج ما استفاده شد. همانطور که در شکل 7E نشان داده شده است، HR تنظیم شده در مدل اثر ثابت 1.785 بود (95 درصد فاصله اطمینان (CI): 1.530 تا 2.081، p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

بحث

در این مطالعه از یکی از داروهای خط اول شیمی درمانی برای بیماران مبتلا به GC، داروهای پلاتین استفاده شد. به طور کلاسیک، داروهای پلاتین می توانند به طور کووالانسی به گوانین در زنجیره DNA متصل شوند و بنابراین، تکثیر و رونویسی DNA2 را مسدود کنند. با این حال، به دلیل مقاومت دارویی و عوارض جانبی نامطلوب، شناسایی استراتژی‌های درمانی جدید برای مقاومت معکوس در بیماران GC ضروری بود. علاوه بر این، بیماران GC پس از دریافت چندین دوره سیس پلاتین، مقاومت دارویی ایجاد کردند و نتایج ما نشان داد که سلول‌های SGC7901 در مقایسه با سلول‌های SGC7901 مقاومت قابل‌توجهی نسبت به سیس پلاتین نشان دادند.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) نقش کلیدی در تنظیم شروع و پیشرفت سرطان‌های انسانی داشت-7. اخیراً مشخص شده است که GRP75 نیز نقش مهمی در مقاومت در برابر شیمی درمانی دارد. علاوه بر GRP75، سایر پروتئین های شوک حرارتی از طریق PI3K/AKT/NF-KB و سایر مسیرها نقش مهمی در مقاومت به سیس پلاتین ایفا می کنند{8}} با این حال، مکانیسم مولکولی GRP75 و مقاومت به سیس پلاتین به ندرت گزارش شده است. در اینجا، مطالعه ما نشان داد که GRP75 توانایی‌های ضد اکسیداسیون/آپوپتوز را ارتقا می‌دهد و برنامه‌ریزی مجدد متابولیک را تغییر می‌دهد که منجر به مقاومت به سیس پلاتین در سلول‌های GC می‌شود. سلول‌های SGC7901 و در نمونه‌های بافتی از بیماران، و با مقاومت دارویی، حمایت از بقا، رشد و پیامدهای ضعیف مرتبط بود. در همین حال، تجزیه و تحلیل چند متغیره مشخص کرد که GRP75 یک پیش‌بینی‌کننده مستقل برای بقای کلی است. علاوه بر این، متاآنالیز نشان داد که سطح بالای GRP75 پیش آگهی ضعیفی از جمله GC را نشان داد، اما نه محدود به آن، که بسیار با تحقیقات ما سازگار بود. انتظار می رود به یک رویکرد جدید برای معکوس کردن مقاومت به سیس پلاتین و بهبود پیش آگهی بیماران GC تبدیل شود.

تحت شرایط فیزیولوژیکی، سلول ها به ناچار در معرض ROS ناشی از عوامل خارجی و متابولیسم هوازی درون سلولی قرار گرفتند. به عنوان یک شمشیر دو لبه، ROS مناسب مولکول های سیگنال مهمی بودند که عملکرد طبیعی سلول ها را تنظیم می کردند، در حالی که ROS بیش از حد منجر به آپوپتوز می شد. بنابراین، یک سیستم تنظیم آنتی اکسیدانی دقیق در بدن برای حفظ تعادل اکسیداسیون و کاهش و فرآیندهای آپوپتوز وجود داشت. سیستم آنتی اکسیدانی در سلول های تومور، به ویژه برای سلول های تومور مقاوم به دارو{4}}. نتایج ما تأیید کرد که سلول‌های SGC7901CR سطح نسبتاً بالاتری از ROS را در مقایسه با سلول‌های SGC7901 نشان دادند و GRP75 ظرفیت‌های ضد اکسیداسیون/آپوپتوز را افزایش داد. سلول های تومور دارای سابقه طولانی ناهنجاری های متابولیک بودند. در اوایل دهه 1930، اتو واربورگ کشف کرد که سلول های تومور گلیکولیز را ترجیح می دهند. حتی تحت شرایط اکسیژن کافی، سلول‌های تومور همچنان نرخ بالای گلیکولیز را برای تولید ATP حفظ می‌کنند. این الگوی متابولیک غیرطبیعی "اثر واربورگ" 3031 نامیده شد. تغییرات متابولیکی ناشی از اثر واربورگ اخیراً به عنوان برنامه‌ریزی مجدد متابولیک نامیده می‌شود و مطالعات این تغییرات درک عمیق‌تری از متابولیسم سلول‌های GC ارائه می‌دهد. نشان داده شده بود که سلول‌های GC و سلول‌های نرمال نه تنها در متابولیسم گلوکز بلکه در متابولیسم لیپیدها و اسیدهای آمینه نیز تفاوت‌های متابولیکی از خود نشان می‌دهند. پیوندهای حفظ رشد سلولی، در نهایت منجر به مقاومت به سیس پلاتین GC می شود.

همانطور که اشاره کردیم، انکوژن های کلاسیک و مسیرهای سیگنالینگ مانند PI3K/AKT، HIF-la، و c-myc به طور مستقیم یا غیرمستقیم در برنامه ریزی مجدد متابولیک دخیل بودند. فعال‌سازی مسیر PI3K/AKT در سلول‌های تومور، بسیاری از فعالیت‌های متابولیکی را افزایش داد. ابتدا به سلول ها اجازه می دهد تا گلوکز، اسیدهای آمینه و سایر مواد مغذی را جذب کنند. دوم، AKT گلیکولیز و تولید لاکتات را از طریق اثرات آن بر بیان ژن و فعالیت آنزیم افزایش داد و برای القای اثر War-burg در سلول‌های سرطانی کافی بود. سوم، فعال‌سازی این مسیر، بیوسنتز ماکرومولکول‌ها را افزایش داد و بیان ژن‌های لیپوژنیک و سنتز لیپید را تحریک کرد. علاوه بر این، GRP فعال AKT و پروتئین کینازهای تنظیم‌شده با سیگنال خارج سلولی 1 و 2، تغییرات ساختاری Bax و آپوپتوز 8 را مهار کرد. سلول‌های توموری با هیپوکسی سازگار شدند که شامل برنامه‌ریزی مجدد متابولیک از طریق تنظیم مثبت ژن‌های هدف HIF-la برای تحریک جذب گلوکز، گلیکو می‌شود. تولید و ترشح اسید لاکتیک، ذخیره گلیکوژن، دفع گلوتامین گربه و ترویج تجمع تری گلیسیرید در قطرات لیپیدی. اخیراً مشخص شده است که GRP75 می تواند به طور خاص به HIF-la متصل شود و غشای میتوکندری خارجی را هدف قرار دهد. VDAC1 و HK2 که از آپوپتوز جلوگیری کردند. C-myc می‌تواند برنامه‌ریزی مجدد متابولیک را به روش‌های مختلفی واسطه کند، و برنامه‌ریزی مجدد متابولیک با واسطه c-myc تا حد زیادی با تأثیر بر میتوکندری به دست آمد. از یک طرف، c-myc همچنین با تنظیم مستقیم بیان آنزیم های مرتبط با گلیکولیز، از جمله LDHA، HK2، و PDK11938، گلیکولیز را ارتقا داد. گلوتامین توسط میتوکندری در سلول های تومور. این اثر "گلوتامینولیز" نامیده می شود. علاوه بر این، بیان بیش از حد GRP{27}} Cyclin-B1 را کاهش داد و Cyclin-D1 و c-myc را افزایش داد تا رشد سلول های سرطانی تخمدان را تقویت کند*. بر اساس نتایج حاضر، ما درک جدیدی از مقاومت به سیس پلاتین GC از طریق GRP75 به عنوان یک پیوند بالقوه مهم در تنظیم شبکه‌های برنامه‌ریزی مجدد متابولیک تومور ارائه کردیم.

نتیجه گیری

در نتیجه، ما نشان دادیم که بیان بیش از حد GRP75 می‌تواند بقا/رشد را در سلول‌های GC با تنظیم شبکه‌های ضد اکسیداسیون/آپوپتوز و برنامه‌ریزی مجدد متابولیک افزایش دهد و در نتیجه باعث ایجاد مقاومت در برابر سیس پلاتین شود.

مواد و روش ها

سلول ها، معرف ها و شرایط کشت

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.{1}} درصد خلوص)، از Sigma-Aldrich (شانگهای، چین) خریداری شد. سلول‌ها در محیط کشت RPMI{3} (Gibco، Grand Island، NY، USA)، تکمیل شده با 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 100 U/ml پنی‌سیلین، 100 ug/ml استرپتومایسین (Gibco) و انکوبه شدند. در 5 درصد CO2 در 37 درجه. برای حفظ فنوتیپ مقاومت به سیس پلاتین، سلول های SGC7901CR در محیطی حاوی سیس پلاتین (5μM) انکوبه شدند.

زنوگرافت و درمان

این مطالعه توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی دانشگاه پزشکی نانجینگ تایید شد و با حیوانات به صورت انسانی و با توجه به کاهش رنج رفتار شد. موش های برهنه BALB/c از مرکز حیوانات آزمایشگاهی SLRC (شانگهای، چین) به دست آمدند و به طور معمول همانطور که قبلاً توضیح دادیم نگهداری می شدند. برای مطالعه پیوند زنوگرافت، سلول‌های 2×10 درجه SGC7901CK در 100 میلی‌لیتر ماتریژل به مدت 5 هفته به صورت زیر جلدی به پهلوی موش‌ها تزریق شد. برای تعیین اثرات GRP75 بر مقاومت سیس پلاتین GC، ما روش تزریق داخل توموری و داخل صفاقی را انجام دادیم. به طور خلاصه، موش ها به طور تصادفی به 4 گروه (5 موش در هر گروه) تقسیم شدند: (1) MOCK، (2) GRP75KD، (3) MOCK-سیس پلاتین، و (4) GRP75 KD-سیس پلاتین. 100 میکرولیتر siRNA (si-Con یا si-GRP75، 100nM) هر 3 روز یکبار تزریق داخل توموری انجام شد. گروه‌های تحت درمان با سیس پلاتین (5 میلی‌گرم بر کیلوگرم) تزریق داخل صفاقی 3 بار در هفته و سایر گروه‌ها با حجم مساوی سالین پرفیوژن شدند. تومورها هر هفته اندازه‌گیری و حجم آن‌ها با فرمول V{22}}Y (طول ۲) محاسبه شد. پس از 5 هفته، موش‌ها قربانی شدند و بافت‌های تومور برای بررسی بیشتر برداشته شدند.

بیماران و نمونه های بافتی

این مطالعه توسط کمیته اخلاق پزشکی بیمارستان وابسته دوم، دانشگاه پزشکی نانجینگ، و بیمارستان شماره 2 Changzhou وابسته به دانشگاه پزشکی نانجینگ تایید شد و رضایت آگاهانه کتبی شرکت‌کننده از هر بیمار اخذ شد. داده های کلینیک-پاتولوژیک در جدول تکمیلی S1 فهرست شده است. ریزآرایه بافت توسط Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (شانگهای، چین) ساخته شده است که قبلاً توضیح دادیم *

ترانسفکشن سلولی

برای ترانسفکشن، scrambled و pcDNA-3.1-GRP75-پرچم توسط General Biotech (شانگهای، چین) سنتز شد. در حالی که siRNA ها در جدول تکمیلی S2 فهرست شده بودند. طبق پروتکل سازنده، سلول ها به طور موقت از طریق معرف لیپوفکتامین 3000 (Invitrogen، Carlsbad، ایالات متحده آمریکا) ترانسفکت شدند. به طور خلاصه، سلول ها روی صفحات چاهک با تراکم 1×10 درجه در محیط RPMI 1640 حاوی 10 درصد FBS بدون آنتی بیوتیک قرار گرفتند. پس از انکوباسیون به مدت 24 ساعت، سلول ها به طور موقت با 5 نانوگرم در میلی لیتر یا GRP{12}Flag، یا 20 نانومولار si-Con یا si-GRP75 به مدت 12 ساعت ترانسفکت شدند. پس از ترانسفکشن، سلول ها قبل از استفاده برای آزمایش های دیگر در محیط تازه حاوی 10 درصد FBS به مدت 24 ساعت دیگر کشت داده شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qPCR) آغازگرهای مورد استفاده در جدول تکمیلی S3 فهرست شده اند. جداسازی RNA کل، رونویسی RNA به cDNA، و عملکرد qRT-PCR با دستگاه Applied Biosystems 7300HT همگی مطابق مطالعه قبلی ما بودند. تغییرات برابری در بیان هر ژن با روش سیکل آستانه مقایسه ای (Ct) با استفاده از فرمول 2-(4ACt) محاسبه شد.

این مقاله از دای و همکاران استخراج شده است. Cell Death Discovery (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w