رسوب آمیلوئید P سرم یک ویژگی حساس و خاص گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG ماسک شده است.

تماس: emily.li@wecistanche.com

کریستوفر پی. لارسن1، شری جی. شارما1، تیفانی ان. کازا1، دانیل جی. کنان1، آرون جی استوری2، ریکی دی. ادموندسون2، کریستین هرتزوگ2، و جان ام. آرتور2

کلید واژه ها:گلومرولونفریت؛ رسوبات نقاب دار؛ طیف سنجی جرمی؛ گلومرولوپاتی غشایی مانند؛ رسوبات زیر اپیتلیال

سیستانچ می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG ماسک دار (MGMID) یک الگوی گلومرولونفریت با هیستوپاتولوژی منحصر به فرد است که اخیراً توصیف شده است. این الگو با ساب اپیتلیال و/یا مزانژیال مشخص می شودمصونرسوباتی که به رنگ آمیزی ایمونوگلوبولین با ایمونوفلورسانس معمول "نقاب" شده اند، اما پس از هضم پروتئاز به شدت برای IgG و زنجیره سبک کاپا رنگ می شوند. بیماران مبتلا به این الگوی گلومرولونفریت اغلب زنان جوان هستند که با پروتئینوری و سابقه مبهم بیماری خودایمنی مانند آنتی بادی های ضد هسته ای با تیتر پایین مراجعه می کنند. در اینجا ما مشخصات طیف‌سنجی جرمی گلومرول‌های میکرودیسکس شده با لیزر را از 9 بیوپسی کلیه MGMID با هشت نمونه‌برداری که الگوهای دیگری از گلومرولوپاتی غشایی را نشان می‌دهند، مقایسه کردیم. پروتئینی که به طور قابل توجهی در MGMID افزایش یافته، آمیلوئید P سرم بود. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی نشان داد آمیلوئید P سرم با IgG در گلومرول های MGMID کلوکالیزه شده است، اما نه با گلومرولوپاتی غشایی مرتبط با PLA2R. آمیلوئید P سرم در گلومرول تمام 32 بیوپسی MGMID مثبت بود اما در بیوپسی انواع دیگر گلومرولوپاتی های غشایی مانند آنهایی که با PLA2R و THSD7A مرتبط هستند منفی بود. در بین 173 نمونه برداری که معیارهای MGMID یا آمیلوئیدوز را نداشتند، چهار بیوپسی با رنگ آمیزی آمیلوئید P سرم گلومرولی وجود داشت. هر چهار بیوپسی با رنگ آمیزی آمیلوئید P سرم مثبت دارای یک الگوی غشایی گلومرولوپاتی با رسوبات کاپا IgG بودند که تنها با فقدان "پوشاندن" با MGMID متفاوت بود. بنابراین، رنگ آمیزی مثبت در رسوبات گلومرولی برای آمیلوئید سرم، یک شکل منحصر به فرد از گلومرولونفریت را مشخص می کند که احتمالاً مکانیسم پاتوفیزیولوژیک مشترک بیماری را دارد.

گلومرولوپاتی شبه غشایی با رسوبات کاپا IgG پوشانده شده (MGMID) یک الگوی هیستوپاتولوژیک گلومرولونفریت است که در سال 2014 توصیف شد، که اولین توصیف از آنچه رسوبات گلومرولی پوشانده نامیده می شود بود. سپرده با محدودیت کاپا IgG. عجیب است، اگرچه رنگ‌آمیزی جزء 3 (C3) اغلب با ایمونوفلورسانس معمولی روی بافت منجمد مشهود است، رنگ‌آمیزی Ig اغلب پنهان می‌شود، به این معنی که رنگ‌آمیزی منفی کاذب با ایمونوفلورسانس معمولی را نشان می‌دهد اما در صورت تکرار روی بافت پارافینی پس از هضم پروتئاز، رنگ‌آمیزی مثبت را نشان می‌دهد. بنابراین، مگر اینکه پاتولوژیست شاخص بالایی از سوء ظن را برای این موجودیت حفظ کند، ممکن است به اشتباه به عنوان گلومرولوپاتی C3 تشخیص داده شود. موجودات دیگری که برای نشان دادن این پدیده پوششی در رسوبات گلومرولی توصیف شده اند عبارتند از: گلومرولونفریت غشایی پرولیفراتیو با رسوبات Ig مونوتیپی پوشانده و گلومرولونفریت کرایوگلوبولینمیک.

بیمارانی که در بیوپسی MGMID دارند، معمولاً زنان جوان هستند<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 درصد) با الکتروفورز پروتئین سرم برای Igs مونوکلونال منفی بودند و هیچ موردی در ارتباط با بدخیمی هماتولوژیک زمینه ای مشاهده نشده است.

فرض بر این بود که یافته‌های آسیب‌شناسی بالینی مشترک در میان بیماران MGMID ممکن است نشان‌دهنده یک مکانیسم پاتوفیزیولوژیک مولکولی مشترک باشد که باعث بیماری آنها می‌شود. هدف ما در اولین گزارش این موجودیت، تعریف یک گروه برای تجزیه و تحلیل بیشتر بود. ما در اینجا حضور پروتئین سرم جزء آمیلوئید p (SAP) را که به طور منحصر به فرد در رسوبات گلومرول های MGMID یافت می شود، شرح می دهیم. رنگ آمیزی ایمنی برای SAP در رسوبات گلومرولی یک تکنیک حساس و اختصاصی برای تشخیص MGMID است که بینش بیماری زا را نیز ارائه می دهد.

شکل 1|آمیلوئید P-component سرم (SAP) به طور قابل توجهی در گلومرول های ریز جدا شده از بیماران مبتلا به گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG ماسک شده غنی شده است. مقادیر کمی مطلق مبتنی بر شدت نرمال شده از MaxQuant (موسسه بیوشیمی ماکس پلانک، Planegg، آلمان) برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شد. خطوط بریده بریده های اکتشافی برای تغییر تا و P-value را نشان می دهند. (الف) نمودار آتشفشانی که 3 مورد غشایی مثبت گیرنده فسفولیپاز A2 (PLA2R) را با موارد دیگر مقایسه می‌کند، 2 پروتئین را شناسایی می‌کند که در ربع بالا سمت راست نقاط پرت هستند. (ب) نمودار آتشفشانی که 2 مورد غشایی مثبت دارای 7A (THSD7A) حاوی دامنه ترومبوسپوندین نوع 1 را با موارد دیگر مقایسه می‌کند، 2 پروتئین را شناسایی می‌کند که نقاط پرت واضح هستند با THSD7A که بیشترین تغییر برابری را نشان می‌دهد. (ج) یک نمودار آتشفشانی که نمونه‌های گلومرولوپاتی غشایی مانند را با رسوبات کاپا IgG ماسک‌دار با سایر انواع موارد غشایی مقایسه می‌کند، 6 پروتئین را شناسایی می‌کند که در ربع بالا سمت راست نقاط پرت هستند. C6، جزء مکمل 6; C7، جزء 7 مکمل؛ CFHR1، پروتئین مرتبط با فاکتور H مکمل 1. HP1BP3، پروتئین هتروکروماتین 1 اتصال پروتئین 3; HPRT1، هیپوگزانتین فسفریبوزیل ترانسفراز 1. IGHG3، گامای ثابت سنگین Ig 3.

نتایج

طیف سنجی جرمی گلومرول های ریز جدا شده با لیزر

تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی گلومرول‌های میکرودیسکس شده با لیزر از 9 مورد MGMID با 8 مورد گلومرولوپاتی غشایی (MG) از جمله 3 مورد گیرنده فسفولیپاز A2 (PLA2R) - MG مثبت، 2 مورد ترومبوسپوندین حاوی دامنه 17-A-مقایسه شد. THSD7A) - MG مثبت و 3 مورد لوپوس MG. در مجموع 1695 پروتئین در این تجزیه و تحلیل شناسایی شد. تجزیه و تحلیل اثبات اصل به منظور آزمایش اینکه آیا پروتئین های دخیل در پاتوژنز بیماری MG را می توان با طیف سنجی جرمی تشخیص داد انجام شد. برای هر نوع غشایی شناخته شده، فراوانی دیفرانسیل پروتئین در برابر گروه های باقی مانده با استفاده از مقادیر کمی مطلق مبتنی بر شدت نرمال شده (iBAQ) مقایسه شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون t Welch انجام شد و نتایج بر روی نمودار آتشفشانی مشاهده شد. PLA2R به طور قابل توجهی در موارد MG مرتبط با PLA2R فراوان تر بود و قوی ترین تغییر چین را نشان داد (شکل 1a). THSD7A قوی ترین تغییرات برابری را در MG مرتبط با THSD7A نشان داد، البته با مقدار P بزرگتر به دلیل حجم نمونه پایین در این گروه (n ¼ 2؛ شکل 1b). به طور کلی، این تجزیه و تحلیل اثبات اصل نشان داد که طیف‌سنجی جرمی گلومرول‌های میکرودیسکس شده با لیزر می‌تواند پروتئین‌های مهم در پاتوژنز بیماری در گلومرولوپاتی غشایی را شناسایی کند.

ما در مرحله بعد به دنبال شناسایی پروتئین هایی بودیم که به طور بالقوه در پاتوژنز MGMID با استفاده از این رویکرد درگیر هستند. در مجموع 6 پروتئین در نمونه های MGMID نسبت به سایر گروه ها به طور قابل توجهی فراوان تر بودند (جدول 1). پروتئین با بیشترین تغییر برابر SAP بود (شکل 1c). پروتئین‌های باقی‌مانده شامل IgG Kappa، 3 پروتئین مکمل، و پروتئین هتروکروماتین 1-پیوندنده 3 (HP1BP3) بود. SAP کاندید برتر در نظر گرفته شد زیرا در تمام نمونه های MGMID شناسایی شد و بیشترین تفاوت را در فراوانی نسبت به نمونه های غیر MGMID نشان داد. تمام Igهای شناسایی شده توسط طیف سنجی جرمی در گلومرول های میکرودیسکس شده با لیزر از موارد گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG در جدول تکمیلی S1 نشان داده شده است. شمارش طیفی با نمونه‌برداری از تمام پروتئین‌هایی که نشان‌دهنده افزایش log2 1 دلاری در نمونه‌های MGMID و P-value #{15}}.1 در جدول تکمیلی S2 نشان داده شده‌اند.

سیستانچمی شود بهترش کردکلیهعملکرد

رنگ آمیزی SAP در موارد گلومرولوپاتی شبه غشایی

یک آنتی بادی پلی کلونال خرگوش علیه پروتئین SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) رنگ‌آمیزی مثبت قوی در امتداد غشای پایه گلومرولی موارد با MGMID نشان داد که با تجزیه و تحلیل کانفوکال با IgG کلوکالیزه شد. SAP کلوکالیزاسیون با IgG را در گلومرول ها از MG مرتبط با PLA2R نشان نداد (شکل 2). یک آنتی بادی پلی کلونال خرگوش علیه HP1BP3 در 4 بیوپسی با MGMID مورد آزمایش قرار گرفت و رنگ آمیزی منفی در رسوبات گلومرولی هر 4 مورد نشان داد.

رنگ آمیزی SAP روی 211 مورد انجام شدکلیهبیوپسی هابا گلومرولونفریت (جدول 2). در مجموع 36 مورد با رسوبات نوع ایمنی برای SAP مثبت رنگ آمیزی شدند. همه مواردی که رنگ‌آمیزی مثبت کردند، ویژگی‌های هیستوپاتولوژیک خاصی از جمله وجود رسوبات مزانژیال و زیر اپیتلیال با محدودیت کاپا IgG و بدون تغییرات اندوکاپیلاری یا غشایی پرولیفراتیو با میکروسکوپ نوری داشتند. SAP در همه موارد منفی بود، با رسوبات پوشانده شده که MGMID نبودند، از جمله 3 مورد گلومرولونفریت کرایوگلوبولینمیک و 3 مورد گلومرولونفریت غشایی پرولیفراتیو پوشیده شده. همچنین در تمام 19 مورد گلومرولونفریت پرولیفراتیو با رسوبات Ig مونوکلونال (PGNMID)، از جمله موارد با IgG1 کاپا (4 مورد)، IgG2 لامبدا (1 مورد)، IgG 3 کاپا (8 مورد) و IgG3 لامبدا (6 مورد) منفی بود. ). همه 30 مورد گلومرولوپاتی غشایی پلی کلونال (PLA2R، THSD7A، لوپوس و سگمنتال) برای SAP منفی بودند. اشکال اضافی گلومرولونفریت نیز مورد مطالعه قرار گرفت و منفی بود. در میان گلومرولونفریت های مرتبط با عفونت، 7 مورد برای رنگ آمیزی IgG مثبت و 6 مورد دارای شواهدی از رسوبات قوز زیر اپیتلیال بودند. همانطور که انتظار می رفت، هر 6 مورد آمیلوئیدوز دارای رنگ آمیزی مثبت در رسوبات آمیلوئیدی بودند. با این حال، الگوی لکه‌دار رسوب در تضاد کامل با رنگ‌آمیزی دانه‌ای موجود در موارد MGMID بود. فتومیکروگراف های نماینده گلومرول ها بر روی رنگ SAP از انواع بیماری های کلیوی مختلف در شکل تکمیلی S1 نشان داده شده است.

همه 32 موردی که قبلاً به عنوان MGMID شناسایی شده بودند برای SAP مثبت بودند. علاوه بر این، رنگ‌آمیزی مثبت برای SAP در گلومرول‌ها از 4 مورد از 25 مورد گلومرولوپاتی غشایی با رسوب یکنواختی IgG وجود داشت که به‌طور معمول پوشش داده نمی‌شد.

ایمونوفلورسانس، شامل 4 مورد از 13 مورد با کاپا IgG1، 0 از 2 مورد با IgG1 لامبدا، 0 از 5 مورد با کاپا IgG2، 0 از 4 مورد با کاپا IgG3، و {{ 12}} از 1 مورد با کاپا IgG4. به طور کلی، 32 مورد از 36 (89 درصد) گلومرولوپاتی SAP مثبت پوشانده شده و در دسته MGMID قرار گرفتند، در حالی که 4 مورد دیگر از 36 (11 درصد) نقاب برداشته شدند و به عنوان MG با رسوبات کاپا IgG1 تشخیص داده شدند. بیماران مبتلا به گلومرولوپاتی غشایی مونوتیپی که ماسک نمی‌کردند اما برای SAP مثبت بودند، میانگین سنی 33 سال با نسبت زن به مرد 4:0 داشتند. موارد مبتلا به گلومرولوپاتی غشایی مونوتیپی که ماسک نکردند اما برای SAP منفی بودند، میانگین سنی 59.3 سال با نسبت زن به مرد 15:4 داشتند.

جدول 1|پروتئين ها در گلومرول هاي بيماران به طور معني داري افزايش يافتگلومرولوپاتی غشایی مانندبا رسوبات کاپا IgG پوشانده شدههمانطور که توسط طیف سنجی جرمی نشان داده شده است

واکنش سرم به SAP

سرم 22 بیمار مبتلا به MGMID، 12 بیمار با گلومرولوپاتی غشایی PLA2R مثبت و 6 فرد سالم از نظر واکنش پذیری IgG به SAP با روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) مورد آزمایش قرار گرفتند. اگر چه مقداری تنوع در بین بیماران در هر گروه وجود داشت، تفاوت معنی داری در واکنش IgG نسبت به SAP بین گروه ها وجود نداشت (شکل تکمیلی S2).

شکل 2|کولوکالیزاسیون IgG و آمیلوئید P-component سرم (SAP). (الف-ج) آزمایش‌های ایمونوفلورسانس انجام شده بر روی نمونه بیوپسی کلیه از بیمار مبتلا به گلومرولوپاتی شبه غشایی با رسوبات کاپا IgG ماسک‌دار، رنگ‌آمیزی غشای پایه گلومرولی دانه‌ای برای (الف) SAP و (ب) IgG را نشان می‌دهد. ج) کولوکالیزاسیون قوی SAP و IgG در رسوبات غشای پایه گلومرولی وجود دارد. (d-f) آزمایش‌های ایمونوفلورسانس انجام شده بر روی نمونه بیوپسی کلیه از یک بیمار مبتلا به گلومرولوپاتی‌های غشایی گیرنده A2 مثبت 3 فسفولیپاز نشان می‌دهد (د) رنگ‌آمیزی غشای پایه گلومرولی منفی برای SAP و (ه) رنگ‌آمیزی غشای پایه گلومرولی گرانولار مثبت G برای I. (و) در این بیمار با 3 گلومرولوپاتی غشایی مرتبط با گیرنده A2 فسفولیپاز کمبود کولوکالیزاسیون وجود دارد. برای بهینه سازی مشاهده این تصویر، لطفاً نسخه آنلاین این مقاله را در جدول 2|نتایج رنگ آمیزی جزء آمیلوئید p سرم (SAP) در بیوپسی کلیه

AA، آمیلوئید A؛ AL، زنجیره سبک آمیلوئید؛ C3، جزء مکمل 3; GBM، غشای پایه گلومرولی؛ MG، گلومرولوپاتی غشایی؛ MGMID، گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا پوشانده شده IgG. MPGN، غشا پرولیفراتیو؛ گلومرولونفریت؛ PGMNID، گلومرولونفریت پرولیفراتیو با رسوبات کاپا IgG مونوکلونال. PLA2R، گیرنده فسفولیپاز A2. THSD7A، ترومبوسپوندین نوع 1 حاوی 7A.

بحث

MGMID یک الگوی گلومرولوپاتی به تازگی توصیف شده و منحصر به فرد است که با رسوبات زیر اپیتلیال و مزانژیال مشخص می شود که برای IgG کاپا توسط پارافین IF رنگ می شود (شکل 3). بیماران مبتلا به این الگوی گلومرولوپاتی معمولاً زنان جوان هستند (سن<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP یک پروتئین پنتامری 25-kDa در خانواده پنتراکسین است که توسط ژن APCS رمزگذاری شده است و در سرم و به عنوان جزئی از غشای پایه گلومرولی فراوان است. برای تعامل در پلاسما با طیف وسیعی از پروتئین‌ها، از جمله اجزای مکمل، آپولیپوپروتئین‌ها، و تنظیم‌کننده‌های انعقاد و پروتئولیز.6 با لیگاندهای خود، از جمله پروتئین‌ها، لیپوپروتئین‌ها و DNA، برهمکنش‌های وابسته به کلسیم پایداری ایجاد می‌کند و از آنها در برابر تخریب محافظت می‌کند. SAP به عنوان یک مولکول تشخیص الگوی محلول درگیر در پاسخ ایمنی ذاتی، شناسایی انواع الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن و آسیب، از جمله اجزای میکروبی و بقایای سلول آپوپتوز عمل می کند. الگوها با اتصال مستقیم به جزء 1q (C1q) و فعال کردن مسیر کمپلمان کلاسیک، پاکسازی بقایای سلولی آپوپتوز را با واسطه کمپلمان ترویج می‌کنند. علیرغم فعال شدن کمپلمان، SAP شناخته شده است که باعث تنظیم ایمنی، کاهش نوتروفیل می شود.التهابدر داخل بافت ها از طریق کاهش چسبندگی اندوتلیال، 8 کاهش عملکرد الاستاز، 9 و کاهش بازگشت به بافت ها.

در بیماری، SAP به عنوان بخشی از رسوبات آمیلوئیدوز شناخته شده است. اگرچه کمتر مورد مطالعه قرار گرفته است، اما شواهدی نیز وجود دارد که می تواند در مدل های انسانی و حیوانی بیماری خودایمنی نقش داشته باشد. آنتی بادی های SAP در بیماران مبتلا به شناسایی شده استخود ایمنیبیماری هاو کاهش بیان SAP نشان داده شده است که باعث ارتقاء می شودخود ایمنیدر مدل های موش آنتی‌بادی‌ها علیه SAP در 44 درصد از بیماران مبتلا به لوپوس اریتماتوز سیستمیک شناسایی می‌شوند که تیتر آنتی‌بادی با فعالیت بیماری مرتبط است. کمبود SAP منجر به ایجاد خودایمنی خود به خودی در موش‌های C57BL/6 مستعد خودایمنی و در موش‌های غیرخودایمنی می‌شود. موش‌های مستعد 129/Sv هنگامی که با موش‌های C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13 تلاقی داده می‌شوند، اما نه تنها در سویه 129/Sv، نشان می‌دهد که ممکن است حساسیت ژنتیکی زمینه‌ای برای کمبود SAP برای القای خودایمنی مورد نیاز باشد. موش ها تولید آنتی بادی های ضد هسته ای، ضد DNA تک رشته ای، آنتی بادی های ضد DNA دو رشته ای و فاکتورهای روماتوئیدی را نشان می دهند. آنها یک تکثیر ایجاد می کنندمصونگلومرولونفریت با واسطه پیچیده، اغلب در زنان. 13 در مدل موشی نفریت لوپوس که گلومرولونفریت با تزریق خود DNA فعال شده در سرم القا می شود، ژن درمانی SAP توسط یک ناقل پلاسمید تولید آنتی بادی های ضد DNA دو رشته ای را کاهش داد. رسوب کمپلکس ایمنی و التهاب کلیه و جلوگیری از شروع نفریت لوپوس.15

شکل 3|یافته های بیوپسی کلیه در گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG پوشانده شده. فتومیکروگراف های بیوپسی نشان داده شده در شکل 2 در اینجا نشان داده شده است. (الف) سنبله‌های قطعه‌ای در امتداد غشای پایه گلومرولی، توسط رنگ نقره متنامین جونز (بزرگ‌نمایی اصلی × 400) وجود دارد. (ب) میکروسکوپ الکترونی رسوبات زیر اپیتلیال موجود در امتداد غشای پایه گلومرولی را نشان می دهد (بزرگنمایی اصلی×12،000). (ج) لکه گلومرولی برای IgG منفی با ایمونوفلورسانس معمول بر روی بافت تازه (ایمونوفلورسانس مستقیم؛ بزرگنمایی اولیه × 400). (د) گلومرول های همان مورد پس از هضم پروتئاز روی بافت پارافین جاسازی شده مثبت می شوند (ایمونوفلورسانس مستقیم؛ بزرگنمایی اولیه × 400). (ه) گلومرول ها رنگ آمیزی برای کاپا و (f) نه لامبدا را روی بافت پارافین جاسازی شده هضم شده با پروتئاز نشان می دهند (ایمونوفلورسانس مستقیم؛ بزرگنمایی اولیه × 400). برای بهینه سازی مشاهده این تصویر، لطفا نسخه آنلاین این مقاله را در www.کلیه-international.org

علیرغم محدودیت زنجیره سبک که در بیوپسی مشاهده می شود، در حال حاضر هیچ مدرکی دال بر ارتباط این موجود با اختلالات لنفوپرولیفراتیو زمینه ای یا Igs مونوکلونال در گردش وجود ندارد. زمان. نقش اتوآنتی بادی های SAP نیز نامشخص است. برخلاف سایر اشکال گلومرولوپاتی غشایی با پروتئینی که به طور خاص در رسوبات ایمنی وجود دارد، مانند بیماری مرتبط با PLA2R، به نظر نمی رسد MGMID 16 توسط اتوآنتی بادی های ضد SAP هدایت شود، زیرا ما نتوانستیم واکنش آنتی بادی سرم را در برابر SAP در بیماران MGMID تشخیص دهیم. . یک توضیح جایگزین این است که کاپا IgG در نتیجه برهمکنش طبیعی بین این 2 پروتئین به جای یک برهمکنش آنتی ژن-آنتی بادی خودایمنی وجود دارد، زیرا زنجیره Ig کاپا به عنوان بخشی از اینتراکتوم طبیعی SAP سرم شناخته شده است. اگرچه برای تشخیص بافتی این موجودیت مفید است، اما آزمایش آنتی بادی های SAP در سرم در حال حاضر به عنوان یک تشخیص غیرتهاجمی عمل نمی کند و عامل اصلی این بیماری همچنان یک راز باقی مانده است.

نتایج بالینی در MGMID بسیار متغیر است، از بهبودی خود به خودی تا پیشرفت تا مرحله نهایی را شامل می‌شود.کلیهمرضبا عود در پیوند تجزیه و تحلیل گذشته نگر هیچ ارتباطی را بین درمان استفاده شده و پیامد بالینی نشان نداده است. درمان‌هایی که مستقیماً SAP را هدف قرار می‌دهند، در درمان آمیلوئیدوز امیدوارکننده‌ای زودهنگام هستند. به‌علاوه، نتایج طیف‌سنجی جرمی نشان می‌دهد که درمان‌هایی که آبشار مکمل را هدف قرار می‌دهند، ممکن است در درمان این شکل از گلومرولونفریت مفید باشند، با توجه به اینکه بیشتر پروتئین‌هایی که افزایش یافته‌اند. در گلومرول های MGMID مربوط به مکمل هستند. مطالعات بیشتری برای شناسایی بیومارکرهای فعالیت این بیماری و همچنین درمان‌ها مورد نیاز است.

دلیل پوشاندن رسوبات ایمنی در بیوپسی های MGMID در ایمونوفلورسانس معمول همچنان یک راز باقی مانده است. وجود SAP در کانسارها توضیحات احتمالی جدیدی را برای این پدیده در موارد MGMID ارائه می کند. به عنوان مثال، فعل و انفعالات پروتئین SAP به شدت وابسته به Ca2þ شناخته شده است، و بسیاری از رسانه های انتقال و بافرهای مورد استفاده در پردازش بافت بیوپسی کلیه برای ایمونوفلورسانس فاقد Ca2þ هستند. این عدم وجود Ca2þ در شرایط آزمایشگاهی می‌تواند منجر به اختلال در رسوبات ایمنی شود به طوری که دیگر برای شناسایی توسط ایمونوفلورسانس روی بافت منجمد در دسترس نیستند. رسوبات کمپلکس ایمنی برای تشخیص در بافت ثابت شده با فرمالین در دسترس باقی می مانند، با این حال، به عنوان یک نتیجه از پیوندهای شیمیایی کووالانسی ناشی از فرمالین بین پروتئین ها در بافت.

ما در اینجا، برای اولین بار، حضور منحصر به فرد SAP را در رسوبات گلومرولی MGMID توصیف می کنیم. علاوه بر این، ما آن رنگ آمیزی را نشان می دهیمکلیهبیوپسی هابرای SAP مواردی را با ویژگی‌های بالینی آسیب‌شناسی مشابه با MGMID، بدون پوشش، با ایمونوفلورسانس معمول شناسایی می‌کند. با توجه به این نتایج، ما معتقدیم که رنگ‌آمیزی مثبت در رسوبات گلومرولی برای SAP، شکل منحصربه‌فردی از گلومرولونفریت را شناسایی می‌کند که مکانیسم پاتوفیزیولوژیک مشترک بیماری را دارد. تا قبل از توصیف اخیر MGMID، این موارد در دسته‌های متفاوت متعددی از گلومرولوپاتی C3 گرفته تا گلومرولونفریت مرتبط با عفونت تا گلومرولوپاتی غشایی آتیپیک تشخیص داده می‌شدند. طیف سنجی برای ارائه بینش پاتوفیزیولوژیک در مورد گلومرولونفریت با واسطه ایمنی

مواد و روش ها

تکنیک های پردازش بیوپسی کلیه

روش‌های استاندارد پردازش بیوپسی کلیه، از جمله نور، ایمونوفلورسانس، و میکروسکوپ الکترونی مورد استفاده قرار گرفت. همه نمونه‌های میکروسکوپ نوری با هماتوکسیلین و ائوزین، نقره متنامین جونز، تری کروم ماسون، و معرف اسید پریودیک شیف رنگ‌آمیزی شدند. تمام مقاطع ایمونوفلورسانس مستقیم در 4 میلی متر برش داده شد و با آنتی بادی های ضد انسان خرگوش پلی کلونال برچسب شده با فلورسین نسبت به IgG، IgA، IgM، C3، C1q، فیبرینوژن و زنجیره های سبک k- و l واکنش دادند (Dako، Carpenteria، CA) به مدت 1 ساعت، و شستشو؛ یک پوشش با استفاده از محیط های نصب آبی اعمال شد. موارد منتخب برای آنتی‌بادی‌های ضد انسانی پلی کلونال موش با برچسب فلورسئین به IgG1، IgG2، IgG3، و IgG4 رنگ‌آمیزی شدند (سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO). ایمونوفلورسانس پارافین پس از هضم پروتئاز همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد. در مجموع 9 نمونه بیوپسی MGMID و 8 نمونه بیوپسی شاهد مقایسه با گلومرولوپاتی غشایی از انواع دیگر برای تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی انتخاب شدند. پروتکل مطالعه توسط هیئت بررسی نهادی راه حل ها تایید شد و با اصول اعلامیه هلسینکی مطابقت داشت.

قوطی سیستانچتونیزه کردنکلیه

طیف سنجی جرمی گلومرول های ریز جدا شده با لیزر

بافت بیوپسی کلیه از بافت پارافین تثبیت شده با فرمالین به ضخامت 10 میلی‌متر بر روی اسلایدهای قاب غشایی لایکا PET (Leica، Wetzlar، آلمان) بریده شد. سپس این لام ها با هماتوکسیلین رنگ آمیزی شدند. گلومرول ها با استفاده از میکروسکوپ Leica DM60{{2{24}}}}{30}}B در لوله های میکروسانتریفیوژ ریز جدا شدند. گلومرول های ریز جدا شده در 2 درصد سدیم دودسیل سولفات و 0.1 مولار دی تیوتریتول در دمای 99 درجه به مدت 1 ساعت لیز شدند و با تهیه نمونه با فیلتر (FASP) پردازش شدند. ، گوتینگن، آلمان). سدیم دودسیل سولفات با شستشوی مکرر با 8 مولار اوره در 0.1 مولار تریس (هیدروکسی متیل) - آمینو متان / کلر، pH 8.5 حذف شد. سپس نمونه ها با 0.05 مولار یدوااستامید آلکیله شدند. Iodoacetamide با 3 شستشو با 8 مولار اوره / 0.1 مولار تریس (هیدروکسی متیل) - آمینو متان / کلر، pH 8.5، و به دنبال آن 3 شستشو با 0.05 مولار بی کربنات آمونیوم حذف شد. پروتئین ها با تریپسین (گرید توالی یابی، پرومگا، مدیسون، WI) با نسبت وزنی به وزن 40:1 در دمای 37 درجه به مدت 16 ساعت هضم شدند. پپتیدها با سانتریفیوژ جمع‌آوری شدند و روی C{36}}نوک‌های مرحله (Thermo Scientific, Waltham, MA) نمک زدایی شدند.

پپتیدهای هضم شده با استفاده از طیف‌سنج جرمی Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) توسط طیف‌سنجی جرمی NanoLC- پشت سر هم مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. پپتیدها روی یک ستون تله فاز معکوس (Integra-Frit, New Objective, Woburn, MA) حاوی رزین هیبریدی سطحی باردار 2.5 میلی متری Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) بارگذاری شدند. X 0.{14}}ستون تحلیلی 75 میلی‌متری حاوی همان رزین فاز معکوس که در تله استفاده می‌شود. سپس از یک سیستم کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده nanoAcquity (Waters Corp.) برای تولید یک گرادیان 60- دقیقه ای از 98:2 تا 60:40 بافر نسبت A: B (بافر A ¼ 0.1 درصد اسید فرمیک) استفاده شد. 0.5 درصد استونیتریل؛ بافر B ¼ 0.1 درصد اسید فرمیک، 99.9 درصد استونیتریل).

پپتیدها با یک نوک اسپری یکپارچه (Picofrit، New Objective) از ستون شسته شدند و با الکترواسپری (2.{1}} kV) یونیزه شدند و پس از آن تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم با استفاده از تفکیک ناشی از برخورد با انرژی بالاتر (HCD) انجام شد. اسکن های بررسی پیش سازهای پپتیدی با وضوح 240K (در 400 متر برز) با هدف شمارش یون 5×105 انجام شد. طیف سنجی جرمی پشت سر هم با جداسازی در 1.6 Th با چهار قطبی، تکه تکه شدن HCD با انرژی برخورد نرمال 30 و تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی اسکن سریع در تله یونی انجام شد. داده‌های طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم به‌دست‌آمده با جدیدترین پایگاه داده انسانی Uniprot که شامل ورودی‌های Swiss Prot و TREMBLE است، جستجو شد.

MaxQuant (موسسه بیوشیمی ماکس پلانک، Planegg، آلمان). تجسم داده ها با استفاده از Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR) انجام شد. نرخ کشف نادرست برای تطابق پپتید به طیف 1 درصد تعیین شد. مقادیر عادی iBAQ از MaxQuant برای کمی سازی استفاده شد. توزیع iBAQ برای هر نمونه برای کنترل تفاوت‌ها در بارگذاری به‌طور متوسط ​​تنظیم شد. مقادیر iBAQ برابر با صفر از مجموعه داده حذف شد. برای آزمون فرضیه های آماری، یک 2-t-test Welch's نمونه برای هر پروتئین با استفاده از مقادیر نرمال iBAQ برای دو گروه انجام شد. اگر پروتئینی فقط در یک گروه تشخیص داده شد، یک 1-آزمون t نمونه ولش با استفاده از کوچکترین مقدار iBAQ شناسایی شده به عنوان فرضیه صفر انجام شد.

رنگ آمیزی SAP

مقاطع پارافینی تثبیت شده با فرمالین، برش 3 میلی متری، پارافین زدایی شدند و بازیابی آنتی ژن در 99 درجه انجام شد. برش ها با آنتی بادی پلی کلونال ضد SAP پلی کلونال خرگوش (1:400؛ ThermoFisher, Waltham, MA) و سپس یک ثانویه ضد خرگوش بز کونژوگه با رودامین قرمز X که در فاز جامد جذب شده بود برای اطمینان از حداقل واکنش متقاطع با انسان واکنش نشان دادند. IgG (1:100؛ آزمایشگاه های تحقیقات ایمنی جکسون، وست گرو، PA). هر مورد با کنترل مثبت و منفی اجرا شد. رنگ با میکروسکوپ ایمونوفلورسانس استاندارد ارزیابی شد. اگر رنگ آمیزی حلقه مویرگی دانه ای مثبت در گلومرول ها وجود داشته باشد مثبت ارزیابی می شود و اگر حلقه مویرگی وجود نداشته باشد منفی است.

رنگ آمیزی در گلومرول ها کولوکالیزاسیون IgG و SAP در غشاهای پایه گلومرولی توسط میکروسکوپ کانفوکال با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy، Jena، آلمان) مورد بررسی قرار گرفت. برای این تجزیه و تحلیل، پلی کلونال (فلورسئین ایزوتیوسیانات کونژوگه) خرگوش ضد IgG انسانی (1:40؛ Agilent، Santa Clara، CA) با بافت گرمای بازیابی شده پس از رنگ‌آمیزی برای SAP همانطور که در بالا توضیح داده شد، واکنش نشان داد. کنترل های منفی برای اطمینان از اختصاصیت آنتی بادی با حذف آنتی بادی های اولیه انجام شد. چهار مورد از MGMID برای حضور HP1BP3 (1:100؛ ترمو فیشر، والتهام، MA) با رنگ‌آمیزی ایمونوپروکسیداز مورد آزمایش قرار گرفتند.

آزمایش آنتی بادی های سرم به SAP

پروتئین SAP (R & D Systems، Minneapolis، MN؛ {{0}}SAB-050) تا 3 نانوگرم در میلی لیتر در بافر کربنات-بی کربنات (pH 9.6) رقیق شد و روی یک {{{1} پوشش داده شد. 6}}ورق Immulon H2 (Thermo Scientific) یک شب در دمای 4 درجه. صفحات x3 با استفاده از 2{18}}{52}} میلی‌لیتر بافر شستشو (1×سالین بافر فسفات و 0.05 درصد توئین) شسته شدند و به مدت 2 ساعت با بافر مسدودکننده (1×سالین بافر فسفات، 0.05 درصد) مسدود شدند. بین، 1 درصد ژلاتین ماهی). سپس پلیت ها با 200 میلی لیتر بافر شستشو 3×3 شسته شدند. 20 میکرولیتر سرم رقیق شده (1:100 در بافر شستشو) به هر چاهک اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. صفحات 7×7 با 200 میلی لیتر بافر شستشو و به دنبال آن آنتی بادی تشخیص، anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories؛ 309-035-003) شسته شدند. صفحات 7×200 میلی لیتر بافر شستشو شسته شدند. سپس، سوبسترای 3،3'، 5،5'-تترا متیل بنزیدین پراکسیداز و سوبسترای پراکسیداز Sol B با نسبت 1:1 مخلوط شدند و 100 میلی لیتر به صفحه اضافه شد. واکنش با افزودن 100 میلی لیتر H2SO4 2M، به مدت 20 دقیقه روی نیمکت قبل از خواندن در 450 نانومتر متوقف شد. برای کنترل برای اطمینان از اتصال پروتئین SAP به صفحه، ما از ضد SAP خرگوش (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA{47}}) در یک رقت سریال و سپس IgG-HRP ضد خرگوش (Jackson ImmunoResearch Laboratories) استفاده کردیم. ؛ 111-035-144). شاهد همبستگی خوبی بین رقت آنتی بادی و جذب با میانگین R-squared مقدار 0.95 نشان داد.

سیستانچ برای بهبودکلیهعملکرد

افشای

همه نویسندگان هیچ علاقه رقیبی را اعلام نکردند.

تکمیلی

فایل تکمیلی MATERIAL (PDF)

شکل S1. تصاویری از رنگ آمیزی گلومرولی SAP از انواع بیماری های کلیوی.

شکل S2. مطالعات سرمی ضد SAP با روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم.

جدول S1. همه Igs با طیف‌سنجی جرمی در گلومرول‌های ریز جداشده با لیزر از موارد گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG شناسایی شدند.

جدول S2. شمارش طیفی با نمونه‌برداری از همه پروتئین‌ها نشان داد که log2 $1 فراوانی در نمونه‌های MGMID و P-value # 0.1 افزایش یافته است.

منابع

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG پوشانده شده.کلیهبین المللی 2014؛ 86: 154-161.

2. Messias NC، Walker PD، Larsen CP. ایمونوفلورسانس پارافین در آزمایشگاه آسیب شناسی کلیه: بیش از یک تکنیک نجات Mod Pathol. 2015؛ 28:854-860.

3. Larsen CP، Messias NC، Walker PD، و همکاران. گلومرولونفریت ممبرانوپرولیفراتیو با رسوبات ایمونوگلوبولین مونوتیپی پوشانده شده. کلیه بین المللی 2015؛ 88: 867-873.

4. Larsen CP، Boils CL، Cossey LN، و همکاران. ویژگی های بالینی آسیب شناسی گلومرولوپاتی غشایی مانند با رسوبات کاپا IgG پوشانده شده. Kidney Int Rep. 2016؛ 1:299-305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. ساختار جزء آمیلوئید P سرم انسانی پنتامر. طبیعت. 1994؛ 367: 338-345.

6. Poulsen ET، Pedersen KW، Marzeda AM، و همکاران. اینتراکتوم جزء آمیلوئید P سرم (SAP) در پلاسمای انسانی حاوی سطوح فیزیولوژیکی کلسیم. بیوشیمی. 2017؛ 56:896-902.

7. Agrawal A، Singh PP، Bottazzi B، و همکاران. تشخیص الگو توسط پنتراکسین ها Adv Exp Med Biol. 2009؛ 653:98-116.

8. Bottazzi B، Inforzato A، Messa M، و همکاران. پنتراکسین PTX3 و SAP در ایمنی ذاتی، تنظیم التهاب و بازسازی بافت. جی هپاتول. 2016؛ 64: 1416-1427.

9. لی جی جی، مک آدام کی پی. جزء آمیلوئید P انسانی: یک مهارکننده الاستاز. Scand J Immunol. 1984؛ 20:219-226.

10. Cox N، Pilling D، Gomer RH. آمیلوئید P سرم: تنظیم کننده سیستمیک پاسخ ایمنی ذاتی. J Leukoc Biol. 2014؛ 96:739-743.

11. Kravitz MS، Pitashny M، Shoenfeld Y. مولکول های محافظتی- پروتئین واکنشی C (CRP)، آمیلوئید P سرم (SAP)، پنتراکسین3 (PTX3)، لکتین اتصال به مانوز (MBL) و آپولیپوپروتئین A1 (Apo A1)، و اتوآنتی بادی های آنها: شیوع و اهمیت بالینی در خودایمنی جی کلین ایمونول. 2005؛ 25:582-591.

12. زندمان-گودارد جی، بلنک ام، لانگویتز پی، و همکاران. آنتی بادی های آنتی بادی P جزء آمیلوئید ضد سرم در بیماران مبتلا به لوپوس اریتماتوز سیستمیک با فعالیت بیماری مرتبط است. آن رئوم دیس. 2005؛ 64: 1698-1702.

13. Bickerstaff MC، Botto M، Hutchinson WL، و همکاران. جزء آمیلوئید P سرم تخریب کروماتین را کنترل می کند و از خودایمنی ضد هسته ای جلوگیری می کند. نات مد. 1999؛ 5:694-697.

14. گیلمور جی دی، هاچینسون دبلیو ال، هربرت جی، و همکاران. خودایمنی و گلومرولونفریت در موش با حذف هدفمند ژن جزء آمیلوئید P سرم: کمبود SAP یا ترکیب سویه؟ ایمونولوژی. 2004؛ 112:255-264.

15. Zhang W، Wu J، Qiao B، و همکاران. بهبود نفریت لوپوس توسط ژن درمانی جزء آمیلوئید P سرم با مکانیسم های متمایز در مراحل مختلف بیماری متفاوت است. PloS One. 2011؛ ​​6: e22659.

16. Beck LH، Bonegio RG، Lambeau G، و همکاران. گیرنده فسفولیپاز A2 نوع M به عنوان آنتی ژن هدف در نفروپاتی غشایی ایدیوپاتیک N Engl J Med. 2009؛ 361:11-21.

17. Richards DB، Cookson LM، Berges AC، و همکاران. پاکسازی درمانی آمیلوئید توسط آنتی بادی‌ها به جزء آمیلوئید P سرم. N Engl J Med. 2015؛ 373: 1106-1114.

18. Richards DB، Cookson LM، Barton SV، و همکاران. تکرار دوزهای آنتی بادی به جزء آمیلوئید P سرم، رسوبات آمیلوئید را در بیماران مبتلا به آمیلوئیدوز سیستمیک پاک می کند. Sci Transl Med. 2018؛ 10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. دستورالعمل های عملی برای بیوپسی کلیه Mod Pathol. 2004؛ 17: 1555-1563.

20. Walker PD. بیوپسی کلیه Arch Pathol Lab Med. 2009؛ 133:181-188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. روش تهیه نمونه جهانی برای آنالیز پروتئوم روش‌های Nat 2009؛ 6: 359-362.