عصاره گیاه گیاه سیستانچ وضعیت گلوتاتیون میتوکندری و تنفس را در قلب موش ها با القای احتمالی پروتئین های جداکننده بهبود می بخشد.

معرفی

خونرسانی مجدد یک میوکارد ایسکمیک قبلی باعث ایجاد یک سری تغییرات میتوکندری می شود، از جمله افزایش تولید گونه های اکسیژن فعال (ROS)، کلسیم.2+اضافه بار و کاهش تولید آدنوزین تری فسفات (ATP) که همگی می توانند منجر به نکروز و/یا مرگ سلولی با واسطه آپوپتوز شوند (Redegeld و همکاران، 1992؛ Lemasters و همکاران، 1998). همانطور که میتوکندری نقش مهمی در تعیین دارددر سرنوشت کاردیومیوسیت ها به دنبال یک چالش ایسکمی/پرفیوژن مجدد (I/R)، حفاظت در برابر آسیب I/R میوکارد باید در جهت حفظ یکپارچگی ساختاری و عملکردی میتوکندری باشد. حفظ متابولیسم انرژی میتوکندری بعد از چالش I/R بسیار مهم است زیرا عملکرد انقباضی قلب تقریباً به طور کامل به ATP تولید شده توسط میتوکندری وابسته است. کاردیومیوسیت هایی که زنده هستند اما منقبض نمی شوند کاربرد بسیار کمی دارند.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای تقویت ایمنی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

هربا سیستانچ، کل گیاه خشک شده ازسیستانچه deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)، یک گیاه انگلی است که عمدتاً در مناطق بیابانی شمال و شمال شرق چین رشد می کند. Herba Cistanche، که در طب چینی به عنوان یک گیاه "یانگ نشاط بخش" طبقه بندی می شود، برای کمبود کلیه، عقیمی زنان، و یبوست ناشی از خشکی روده در بیماران سالخورده تجویز می شود (چن، 1998). مطالعات قبلی در آزمایشگاه ما نشان داده است که یک متانولعصاره گیاه هربا سیستانچظرفیت تولید ATP میوکارد را افزایش می دهد (Leung & Ko, 2008) و از آسیب I/R میوکارد در موش صحرایی محافظت می کند (Leung, 2006). در حالی که تحریک ظرفیت تولید ATP با افزایش انتقال الکترون میتوکندریایی همراه بود (Leung & Ko, 2008)، محافظت قلبی در برابر آسیب I/R حاصل از درمان Herba Cistanche با کاهش کاهش ATP میوکارد همراه بود (Leung, 2006). در مطالعه حاضر، برای تعریف نقش میتوکندری در عملکرد محافظتی قلبی گیاه هربا سیستانچ، ما اثر درمان هربا سیستانچ را بر وضعیت گلوتاتیون میتوکندری، محتوای کلسیم، پتانسیل غشاء و سرعت تنفس در قلب موش بررسی کردیم. .

مواد و روش ها

مواد گیاهی

هربا سیستانچ از یک فروشنده گیاهی محلی (مستقر در هنگ کنگ) (لی هونگ کی) خریداری شد. این گیاه توسط تامین کننده تایید شد و یک نمونه کوپن (HKUST00301) در بخش بیوشیمی، دانشگاه علم و فناوری هنگ کنگ (HKUST) سپرده شد. استخراج متانولی از این گیاه بر اساس مطالعات قبلی انجام شد که نشان می‌دهد چنین عصاره‌ای تولید ATP میتوکندریایی را افزایش داده و در برابر آسیب I/R در قلب موش صحرایی محافظت می‌کند (Leung، 2006؛ Leung & Ko، 2008). به طور خلاصه، هربا سیستانچ (400 گرم) به قطعات کوچک بریده شد و با حرارت دادن تحت رفلاکس در 300 میلی لیتر متانول در دمای 60 درجه به مدت 2 ساعت، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، استخراج شد (Leung & Ko, 2008). این روش دو بار تکرار شد. عصاره مخلوط شده با تبخیر حلال تحت فشار کاهش یافته خشک شد. عملکرد 42 درصد (وزنی/وزنی) مربوط به مقدار گیاه خام بود. عصاره تا زمان استفاده در دمای 4 درجه نگهداری شد. اگرچه گیاهان چینی به طور سنتی برای مصرف خوراکی از آب استخراج می‌شوند، در مطالعه قبلی ما از متانول برای راحتی در پردازش و ذخیره‌سازی نمونه‌ها استفاده شد (Yim & Ko, 2002)، و ما دریافتیم که استخراج متانول از همه لحاظ رضایت‌بخش است.

مراقبت از حیوانات و درمان دارویی

موش های صحرایی ماده بالغ نژاد Sprague-Dawley (8 تا 10 هفتگی؛ 200-230 گرم) در اتاقی با رطوبت کنترل شده با چرخه 12 ساعته تاریکی/روشنایی در دمای تقریباً 22 درجه قرار گرفتند و به طور آزاد به غذا و آب اجازه دادند. حیوانات به طور تصادفی در گروه‌های مختلف قرار گرفتند و در هر گروه پنج حیوان قرار گرفتند. موش ها دریافت کردندعصاره گیاه سیستانچداخل معده ({{0}}.2 گرم در میلی لیتر در آب) با 0.5 گرم بر کیلوگرم یا 1.0 گرم بر کیلوگرم برای 3 روز متوالی. حیوانات کنترل (درمان نشده) فقط آب دریافت کردند. بیست و چهار ساعت پس از آخرین دوز، بافت بطن قلب از حیوانات بیهوش برای تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی به دست آمد. تمام پروتکل‌های آزمایشی توسط کمیته تمرین تحقیقاتی، HKUST تأیید شد.

آماده سازی فراکسیون های میتوکندری

بافت‌های بطنی قلب خرد شده (~{{0}}.6 گرم) در 10-برابر (وزن / حجم) بافر ساکارز سرد یخی [0.32M ساکارز، 1 میلی‌مولار اتیلن دی آمین تترااستیک اسید همگن شدند. (EDTA)، 50 میلی مولار Tris/HCl. pH 7.4] با استفاده از هموژنایزر تفلون-شیشه، در 4000 دور در دقیقه، با 25 تا 30 ضربه. گلوله های میتوکندری از هموژن های بافتی با سانتریفیوژ در 800 × گرم در دمای 4 درجه به مدت 30 دقیقه تهیه شدند و خلوص با اندازه گیری فعالیت های خاص نسبی سوکسینات دهیدروژناز و لاکتات دهیدروژناز به ترتیب در مایع رویی و پلت، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تعیین شد (ایوانز، 1992). گلوله های میتوکندری در 1 میلی لیتر بافر همگن کننده معلق شدند.

اندازه گیری میتوکندری سطح گلوتاتیون را کاهش داد و گلوتاتیون اکسید شده را کاهش داد

سطوح گلوتاتیون کاهش یافته میتوکندریایی (GSH) به صورت آنزیمی با استفاده از 5،59-dithiobis(2- نیتروبنزوئیک اسید) (DTNB) و گلوتاتیون ردوکتاز (GR)، در پروتکل اصلاح شده از Griffith (198{17}) تعیین شد. }). مقدار کمی (21{19}} میکرولیتر) از بخش میتوکندریایی با 90 میکرولیتر از 10% (v/v) 5-سولفوسالیسیلیک اسید (SSA) مخلوط شد و مخلوط در 600 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. برای اندازه گیری سطوح گلوتاتیون اکسید شده (GSSG)، مقدار 100 میکرولیتر از سوپرناتانت SSA با 10 میکرولیتر 20% (w/v) 2-وینیل پیریدین و 10 میکرولیتر تری اتانولامین 60% (v/v) در لوله های میکروفیوژ مخلوط شد. هر لوله حداقل 1 ساعت در دمای اتاق قرار گرفت. مخلوط واکنش حاوی 0.63 میلی‌مولار DTNB و 0.053 میلی‌مولار NADPH (نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات کاهش‌یافته) در بافر فسفات (0.1 مولار، با 5 میلی‌مولار Na2 EDTA؛ pH7.5) از قبل در دمای 30 درجه به مدت 2 دقیقه انکوبه شد. مقدار کمی (30 میکرولیتر) از یک مایع رویی نمونه SSA (گلوتاتیون کل) یا یک نمونه GSSG به چاهک 96-صفحه میکروتیتر چاهی، و 180 میکرولیتر از مخلوط واکنش از قبل گرم شده، حاوی 0.525U/ اضافه شد. mL GR، در مرحله بعدی اضافه شد. تغییرات جذب در 412 نانومتر به مدت 5 دقیقه به روش اسپکتروفتومتری بررسی شد. غلظت GSH و GSSG از منحنی های کالیبراسیون با استفاده از GSH و GSSG [محلول در 3٪ (w/v) SSA] به عنوان استاندارد تخمین زده شد و به عنوان پروتئین nmol/mg بیان شد. سطوح GSH با کم کردن دو برابر مقدار GSSG از کل GSH برآورد شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

اندازه گیری محتوای کلسیم{0}} میتوکندری

محتوای Ca{{0}} میتوکندری با استفاده از یک پروب فلورسانس حساس به Ca، Fluo{2}}N AM استر (پروب‌های مولکولی، یوجین، OR) با استفاده از شمارنده چند برچسبی Victor2 اندازه‌گیری شد. (مدل 142{31}}؛ PerkinElmer، Turku، فنلاند)، همانطور که در Menze et al. (2005). ثابت های تفکیک Ca{7} (مقادیر Kd) با استفاده از کیت کالیبراسیون Ca{8} معتبر در محدوده غلظت 1-1000 میکرومولار تعیین شد. با توجه به داده های سازنده کیت، مقادیر Kd تخمینی 90-100 میکرومولار، با قابلیت اطمینان بالا بود. مقدار کمی (25μL) از بخش میتوکندری (0.5mg پروتئین/mL غلظت نهایی) با 25 میکرولیتر بافر انکوباسیون {100mM KCl و 30mM MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid] مخلوط شد. pH7.2} در یک صفحه میکروتیتر سیاه 96-خوب. مخلوط در دمای 25 درجه به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. سپس 25 میکرولیتر دیژیتونین (50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و 25 میکرولیتر Fluo{29}}N AM استر (1 میکرومولار در 0.005 درصد (w/v) Pluronic F{33}}) اضافه شد. با تسهیل نفوذ غشاء، دیژیتونین باعث ورود رنگ فلورسنت به میتوکندری شد. ما دریافتیم که سطوح Fluo{34}}N در آماده‌سازی‌های میتوکندری قلب موش صحرایی در حضور دیژیتونین 20- برابر افزایش یافته است. مخلوط‌های واکنش در 25 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و قرائت‌های فلورسانس در طول موج تحریک 488 نانومتر و طول موج انتشار 532 نانومتر اندازه‌گیری شدند. محتوای Ca{40} میتوکندری با استفاده از منحنی کالیبراسیون تخمین زده شد و به صورت میکرومول در میلی گرم پروتئین بیان شد.

اندازه گیری پتانسیل غشای میتوکندری

پتانسیل غشاء (ΔΨm) با روشی اصلاح شده از روش Bonavita و همکاران ارزیابی شد. (2003)، با استفاده از یک رنگ فلورسنت، پروب کاتیونی چربی دوست 5596،{3}} تتراکلرو-1،193،39-تترااتیل بنزیمیدازولیل کربوسیانین یدید، که معمولاً JC نامیده می‌شود. مقادیر جزئی (50 میکرولیتر) فراکسیون های میتوکندری (تعدیل شده با 1 میلی گرم پروتئین در میلی لیتر) در 37 درجه با 50 میکرولیتر محلول سوبسترا (حاوی 6 میلی مولار پیروات و 6 میلی مولار مالات)، 25 میکرولیتر آدنوزین دی فسفات (محلول 30 میلی مولار) از پیش تیمار شده (محلول 30 میلی لیتر) انکوبه شدند. و 25 میکرولیتر 3 میکرومولار JC{18}}، در تاریکی. مقادیر ΔΨm با اندازه گیری فلورسانس در 535nm (FL1) در مقابل 580nm (FL2)، با استفاده از شمارنده Victor2 MultiLabel به دست آمد. JC{24}} توده‌هایی را در میتوکندری تشکیل می‌دهد که در نتیجه مقادیر فلورسانس FL2 بالاست و پتانسیل طبیعی میتوکندری را نشان می‌دهد. از دست دادن ΔΨm منجر به کاهش فلورسانس FL2 (دانه های JC{27}} به میزان کمتر) و افزایش همزمان در فلورسانس FL1 (از مونومرهای JC{29}}) می شود. داده ها به عنوان نسبت مقادیر فلورسانس FL1/FL2 بیان شد. کربونیل سیانید m-chlorophenylhydrazone (CCCP)، یک عامل فروپاشی ΔΨm، برای اعتبارسنجی سنجش استفاده شد.

اندازه گیری تنفس میتوکندریایی

میزان تنفس میتوکندری در 37 درجه با استفاده از ابزار Hansatech Oxygraph-Plus مجهز به الکترود اکسیژن نوع کلارک (Sarasota، FL، USA) اندازه گیری شد. فراکسیون‌های میتوکندری ({3}}.6 میلی‌گرم پروتئین در میلی‌لیتر) در بافر تنفسی حاوی 125 میلی‌مولار KCl، 20 میلی‌مولار MOPS، 10 میلی‌مولار تریس، 0.5 میلی‌مولار اتیلن گلیکول تترااستیک اسید (EGTA) و 2 میلی‌مولار KCl معلق شدند. pH 7.2. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه به مدت 2 دقیقه، هر نمونه 50 میکرولیتر محلول بستر (5 میلی مولار پیروات و 5 میلی مولار مالات) دریافت کرد. میزان تنفس در حضور (وضعیت 3) 1 میلی مولار ADP و پس از فسفوریلاسیون تمام ADP به ATP (وضعیت 4) اندازه گیری شد. نسبت نرخ‌های تنفس حالت 3: حالت 4 شاخص کنترل تنفسی است که نشان‌دهنده تنگی جفت بین تنفس و فسفوریلاسیون است (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). قبل از افزودن محلول بستر، میزان تنفس حالت 1 تا شروع تنفس حالت 2 اندازه گیری شد و میزان تنفس حالت 2 قبل از افزودن ADP تخمین زده شد.

تحلیل آماری

داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) برای مقایسه چند گروهی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقادیر کمترین اختلاف معنی‌دار (LSD) برای شناسایی تفاوت‌های معنی‌دار بین دو گروه زمانی که مقادیر p <{1}}.05 بود، استفاده شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

نتایج

همانطور که در شکل های 1 و 2 نشان داده شده است، تیمار با متانولعصاره گیاه هربا سیستانچ({0}}.5 یا 1.0g/kg/day×3) وضعیت گلوتاتیون میتوکندریایی را به طور قابل توجهی در قلب موش افزایش داد، همانطور که با افزایش وابسته به دوز در سطوح GSH (11-30٪) و کاهش در سطوح GSSG (31%).

درمان هربا سیستانچ وابسته به دوز باعث کاهش سطح کلسیم میتوکندری در قلب موش در مقایسه با گروه کنترل شد. سرکوب 41 درصد در دوز 1.{4}} گرم بر کیلوگرم بود (شکل 3).

درمان Herba Cistanche، ΔΨm میتوکندری را افزایش داد، همانطور که با کاهش (14-16٪) در نسبت FL1 / FL2 مشهود است. CCCP (100 میکرومولار) باعث فروپاشی ΔΨm شد، همانطور که با افزایش نسبت FL1/FL2 نشان داده شد (شکل 4).

درمان هربا سیستانچافزایش تنفس میتوکندریایی، همانطور که با نرخ قابل توجهی بالاتر از تنفس حالت 3 (84٪) در حیوانات آزمایش در مقایسه با گروه شاهد مشهود است (جدول 1). سطح تنفس حالت 2 و حالت 4 به ترتیب 47 و 80 درصد افزایش یافت، اما تحریک تنفس حالت 4 به طور کامل توسط 1 میلی مولار گوانوزین-5'-دی فسفات، یک مهارکننده پروتئین جداشدگی 2/3، سرکوب شد. درمان هربا سیستانچ بر شاخص کنترل تنفسی تأثیری نداشت، همانطور که با نسبت نرخ تنفس حالت 3/حالت 4 تخمین زده شد.

بحث

میتوکندری های جدا شده از قلب موش های تحت درمان با Herba Cistanche وضعیت گلوتاتیون افزایش یافته را نشان دادند، همانطور که با افزایش سطح GSH و کاهش سطح GSSG نشان داد. حفظ وضعیت ردوکس گلوتاتیون میتوکندری برای محافظت از قلب در برابر آسیب I/R حیاتی است (Chiu & Ko, 2{10}}03). محتوای Ca{2}} سیتوزولی در طول ایسکمی میوکارد از طریق جذب توسط غشای داخلی Ca{3}} uniporter افزایش می‌یابد (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990) و منجر به Ca میتوکندری می‌شود{6} } تجمع. نتایج ما نشان می‌دهد که درمان با عصاره گیاه هربا سیستانش وضعیت گلوتاتیون ردوکس میتوکندری را افزایش داده و سطح کلسیم میتوکندری را کاهش می‌دهد، که ممکن است محافظت در برابر آسیب I/R میوکارد را فراهم کند (Leung, 2006). ناتوانی درمان هربا سیستانچ، با دوز بالاتر 1.0 گرم بر کیلوگرم، برای کاهش بیشتر سطوح GSSG و Ca در میتوکندری

میتوکندری یک شیب پروتون الکتروشیمیایی در سراسر غشای داخلی، با انتقال الکترون ایجاد می کند. این گرادیان توسط ATP سنتاز برای فسفریله کردن ADP به ATP استفاده می شود. کاهش پتانسیل غشای میتوکندری، مانند هیپوکسی/ اکسیژن‌رسانی مجدد پس از آسیب کاردیومیوسیت‌های کشت‌شده (چیو و همکاران، 2008)، منجر به کاهش تولید ATP می‌شود. درمان Herba Cistanche، که ممکن است پتانسیل غشای میتوکندری میوکارد را افزایش دهد، احتمالاً تولید ATP را، به ویژه در جریان خونرسانی مجدد پس از ایسکمیک، افزایش می دهد. مجدداً، وجود یک مکانیسم تنظیمی خود محدود شونده ممکن است توضیح دهد که چرا اثرات درمان Herba Cistanche بر پتانسیل غشای میتوکندری وابسته به دوز نیست.

درمان Herba Cistanche به میزان زیادی نرخ تنفس State 3 را در میتوکندری قلب موش افزایش داد، همانطور که با مصرف اکسیژن ارزیابی شد. این یافته با نتایج به دست آمده از اندازه گیری های آزمایشگاهی و درجا ظرفیت تولید ATP میتوکندریایی مطابقت دارد (Leung & Ko, 2008). به طرز جالبی، اگرچه درمان هربا سیستانچ سطح پایدار ATP میوکارد را کاهش داد (داده‌ها نشان داده نشده است)، درمان باعث افزایش تولید ATP میتوکندری شد. درگیر شدن تنفس بدون جفت ممکن است این مشاهدات متناقض را توضیح دهد. فسفوریلاسیون اکسیداتیو بدون جفت زمانی اتفاق می‌افتد که پروتون‌ها در سراسر غشای داخلی میتوکندری به داخل ماتریکس میتوکندری منتقل می‌شوند، بنابراین پتانسیل غشایی تشکیل‌شده توسط زنجیره انتقال الکترون از بین می‌رود. این منجر به کاهش نیروی محرکه پروتون می شود که تشکیل ATP را هدایت می کند (گاروی، 2003). در نتیجه، غلظت Ca{5}} و تولید ROS در میتوکندری به طور چشمگیری کاهش می یابد (Teshima و همکاران، 2003). این پیشنهاد با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارد که کاهش سطح کلسیم میتوکندریایی را در قلب‌های درمان‌شده با هربا سیستانچ نشان داد. در مورد تنفس بدون جفت، سنتز پروتئین‌های جداکننده (UCPs) ممکن است با درمان هربا سیستانچ القا شود. شناخته شده است که UCPها فسفوریلاسیون اکسیداتیو را از هم جدا می کنند و بیان UCP1 در قلب موش های تراریخته از آسیب میوکارد ناشی از I/R محافظت می کند (Hoerter et al., 2004). اثر جداشدگی UCP ها توسط پورین نوکلئوتیدی دی فسفات ها و تری فسفات ها (مانند ADP، ATP، گوانوزین دی فسفات (GDP) و GTP) مهار شد (Echtay et al., 2002). در مطالعه حاضر، پارامترهای میتوکندری مانند پتانسیل غشاء و سرعت تنفس در حضور ADP (به عنوان سوبسترا) اندازه‌گیری شد. بنابراین اثر جداسازی UCPها مهار شد. با این حال، زمانی که میزان تنفس حالت 4 میتوکندری در غیاب ADP اندازه‌گیری شد، این میزان در میتوکندری‌های تهیه‌شده از قلب‌های تیمار شده با Herba Cistanche بیشتر از قلب افراد کنترل‌نشده بود. نرخ تنفس حالت 4 منعکس کننده مصرف اکسیژن توسط میتوکندری است زمانی که پروتون ها از طریق مکانیسمی که F1 F{17}}ATPase را درگیر نمی کند به ماتریکس میتوکندری نشت می کنند (گاروی، 2003). دخالت احتمالی UCPها در افزایش ناشی از هربا سیستانچ در تنفس حالت 4 با این یافته پشتیبانی می‌شود که این افزایش توسط تولید ناخالص داخلی سرکوب شده است (بنتو و همکاران، 2007).

در نتیجه، درمان با Herba Cistanche ممکن است وضعیت گلوتاتیون میتوکندری را بهبود بخشد، سطح کلسیم میتوکندری را کاهش دهد، و پتانسیل غشای میتوکندری و سرعت تنفس را در قلب موش افزایش دهد. افزایش وضعیت گلوتاتیون میتوکندری و توانایی عملکردی، و القای احتمالی UCPs، ممکن است به محافظت قلبی ایجاد شده توسطدرمان هربا سیستانچپس از آسیب I/R

گیاه سیستانچ توبولوزا طبیعی عصاره سیستانچ PHGS75% ECH 30% ACT 12%