HLA-G به طور گسترده توسط ماست سل ها در مناطق فیبروز اندام در کبد، ریه و کلیه بیان می شود.

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه:ما قبلا نشان دادیم که ماست سل ها بیانگر HLA-G با مناطقی از ویروس هپاتیت C مرتبط هستند.کبدفیفیبروز در اینجا، هدف ما تعیین این بود که آیا بیان HLA-G در ماست سل ها به علت ویروسی اختصاصی است یا خیر.کبدیا به فرآیند کلی فیفیبروز. ما سلول‌های HLA-G پلاس و ماست سل‌ها را با روش ایمونوهیستوشیمی (i) برشمردیم.کبدبلوک از 41 مورد سیروز الکلی، (2) 10 مورد فیبروز ریوی ایدیوپاتیک (IPF)، و (iii) 10 مورد از رناlفیفیبروز ماهیت سلول های HLA-G پلاس توسط ایمونوفلورسانس چندگانه با استفاده از نرم افزار مشخص شد. بیش از نیمی از تمام سلول های HLA-G پلاس ماست سل ها در نواحی فیفیبروتیک سیروز الکلی و IPF بودند. درکلیه ها,سلول‌های HLA-G پلاس که در معرض فیفیبروز قرار گرفتند، در واقع ماست سل بودند اما قابل شمارش نبودند. علاوه بر این، در موارد خاصی ازکبدو ریه، تعدادی از گره‌های سلولی را مشاهده کردیم که فولیکول‌های ثانویه یا سوم بودند، که در آنها HLA-G به‌شدت توسط لنفوسیت‌های B بیان شد. در نتیجه، HLA-G به علاوه ماست سل ها را می توان در مناطق فیبروتیک تمام اندام های مورد مطالعه مشاهده کرد. مطالعات قبلی نقش محافظتی HLA-G به علاوه ماست سل ها را در برابر التهاب و فیفیبروز نشان می دهد. فولیکول‌های مشاهده‌شده با لنفوسیت‌های B که HLA-G را بیان می‌کنند نیز ممکن است نقش ضد فیبروتیک آنها را تقویت کنند.

کلید واژه ها:فیبروز؛ HLA-G; ماست سل ها؛ فولیکول ها؛ لنفوسیت های B؛ آنتی فیبروتیک؛ کلیه؛ کبد

مقدمهبیماری‌های مزمنی که منجر به فیبروز اندام می‌شوند با مرگ و میر و عوارض قابل‌توجهی همراه هستند و تا 45 درصد از مرگ‌ها را در کشورهای توسعه‌یافته تشکیل می‌دهند [1]. شیوع بیماری های فیفیبروتیک به طور پیوسته در حال افزایش است و یک مشکل مهم بهداشت عمومی است. بیماری های فیبروتیک می توانند همه اندام ها را تحت تاثیر قرار دهندکبد, کلیه ها، ریه ها و قلب فیبروز پاتولوژیک با رسوب بیش از حد اجزای ماتریکس خارج سلولی (ECM) مانند کلاژن مشخص می شود. چنین تجمعی ECM ساختار طبیعی اندام را از بین می برد و منجر به اختلال و نارسایی اندام با تغییر عملکردهای تخصصی هر اندام می شود، به عنوان مثال، برای اندام.کبد، عملکرد سم زدایی، برای ریه، عملکرد تبادل گاز، و برایکلیه،عملکرد فیلتراسیون علاوه بر این، فیفیبروز می تواند باعث پیشرفت سرطان شود. پیوند برای جایگزینی اندام فیفیبروتیک اغلب بهترین گزینه درمانی است. فرآیند فیفیبروز در پاسخ به آسیب یا آسیب بافتی به دنبال یک پاسخ التهابی مداوم یا بیش از حد قوی رخ می دهد. فیبروز که در ابتدا برگشت پذیر است، می تواند به حالت برگشت ناپذیر تبدیل شود [2]. اینکبدمی‌تواند توسط ویروس‌ها (هپاتیت B، C، D، E)، سموم قارچی، انگل‌ها، آنتی‌بادی‌های خودکار، رژیم غذایی پرچرب و مصرف بیش از حد الکل آسیب ببیند، که یک علت مکررکبدفیفیبروز [3] و حتی علت غالب در برخی کشورها. وقتی توهین ها تکرار می شود،کبدهپاتیت مزمن همراه با فیبروز و به دنبال آن فیفیبروز پیشرفته یا سیروز ایجاد می کند که یک حالت مستعد کننده برای سرطان کبد (HCC) است.

در ریه، فیبروز ریوی ایدیوپاتیک (IPF) شایع ترین بیماری در میان گروهی از بیماری ها است که شامل فیبروز حساسیت مفرط و ریه روماتوئید است. این بیماری مزمن بینابینی فیبروزان ریه با منشأ ناشناخته نادر است و سه میلیون نفر را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار می دهد. با این حال، IPF با مرگ زودرس مرتبط است. در واقع، IPF منجر به نارسایی تنفسی پیشرفته می شود و همچنین یک عامل خطر مستقل برای سرطان ریه را نشان می دهد [4]. پیوند ریه باید به عنوان یک گزینه برای بیماران جوان مبتلا به بیماری پیشرفته در نظر گرفته شود.

کلیویفیفیبروز آخرین مسیر مشترک بسیاری از پیشرونده ها استبیماری های کلیویبروز مزمنبیماری کلیوی، منجر به مرحله نهایی می شودبیماری کلیوی، به طور قابل توجهی افزایش یافته است و 10 درصد از جمعیت جهان را تحت تأثیر قرار می دهد و مرگ و میر بالایی دارد [5]. علاوه بر این، بیماران مبتلا به مزمنبیماری کلیویخطر ابتلا به آن افزایش یافته استکلیهسرطان (تا 10 برابر جمعیت عمومی)، با آسیب مکرر دو طرفه و/یا چند کانونی [6].

صرف نظر از ارگانی که فیبروز را ایجاد می کند، درک مکانیسم های دخیل در پیدایش آن برای توسعه روش های درمانی برای جلوگیری از آن مهم است. به ویژه، التهاب مزمن منجر بهکبدیاکلیهفیفیبروز، و کنترل آن ممکن است باعث محدود کردن پیشرفت آن و شروع نارسایی اندام یا سرطان شود. سیتوکین ها و کموکاین ها هم در جهت گیری پاسخ ایمنی و هم در حفظ التهاب نقش اساسی دارند [7،8]. علاوه بر این مولکول‌های ایمنی، پروتئین‌های دیگری مانند HLA-G، یک مولکول کلاس Ib HLA که به دلیل خواص تعدیل‌کننده ایمنی شناخته شده است، مورد بررسی قرار گرفته‌اند [9]. ما قبلا نشان دادیم که HLA-G توسط ماست سل ها که با ناحیه ویروس هپاتیت C مرتبط هستند بیان می شود.کبدفیفیبروز [10،11]. در مطالعه حاضر، ما بررسی کردیم که آیا بیان HLA-G در ماست سل ها برای اتیولوژی ویروسی خاص است یا خیر.کبد، یا روند فیفیبروز، صرف نظر از اندام. ما بیان HLA-G را در ماست سل ها و سلول های ایمنی بر روی بلوک های پارافینی گروه های 41 بیمار مبتلا به سیروز ناشی از الکل، 10 بیمار مبتلا به IPF و 10 بیمار مبتلا به سیروز مشخص کردیم.کلیهفیفیبروز شناسایی دقیق سلول های بیانگر HLA-G با استفاده از ایمونوفلورسانس چهارگانه بر روی مقاطع پارافینی و نرم افزاری انجام شد که فلورسانس را به طور جداگانه تجزیه و تحلیل کرده و آن را در سه مورد ادغام می کند.کبدفیبروز ناشی از الکل و دو مورد از IPF.

نتایج

بیان کمی و ماهیت سلول های HLA-G به علاوه در فیبروز ناشی از الکلیک مطالعه اولیه ایمونوهیستوشیمی روی یک سری از نمونه‌های فیبروز ناشی از الکل (n=41) انجام شد، که امکان شمارش سلول‌های HLA-G پلاس و CD117 پلاس را در کل اسلایدها با شمارش نیمه خودکار با استفاده از نرم‌افزار HALO فراهم کرد. نتایج در جدول 1 خلاصه شده است.

سلول های HLA-G plus و CD117 plus با استفاده از نرم افزار HALO با الگوریتم مناسب پس از ایمونوهیستوشیمی با 4H84 که HLA-G را تشخیص می دهد و anti-CD117/c-kit بر روی کل سطح اسلایدهای سریال 41 مورد سیروز الکلی شمارش شدند. میانگین، انحراف معیار، و محدوده برای سلول های HLA-G plus و CD117 plus نشان داده شده است: 555 ± 699 HLA-G plus /(41-2686) و 200 ± 271 CD 117 پلاس سلول (12-1113).

ویژگی‌های مورفولوژیکی سلول‌های HLA-G پلاس در توپوگرافی سیروز ناشی از الکل با ماست سل‌ها مطابقت دارد (شکل 1A). در موارد خاص، برچسب گذاری دوگانه برای CD117 و ماست سل های انسانی انجام شد و نشان داد که سلول های CD117 پلاس کبدی، ماست سل ها در ناحیه فیفیبروتیک هستند (شکل 1A). سه مورد نماینده سیروز ناشی از الکل توسط ایمونوفلورسانس چهارگانه و رنگ‌آمیزی سیریوس رد با استفاده از نرم‌افزار HALO برای شناسایی دقیق سلول‌های HLA-G پلاس مورد مطالعه قرار گرفت. میانگین سطح فیفیبروز مربوط به 19.4 درصد بودکبدبافت. شناسایی سلول‌های HLA-G پلاس نشان داد که 51 درصد ماست‌سل‌ها هستند (جدول 2؛ شکل 1A,1B1) که توسط فنوتیپ تریپتاز ماست سل انسانی به اضافه CD1177 یا تریپتاز ماست سل انسانی به اضافه رنگ‌آمیزی مشترک برای CD117 تعریف شده است. ماست سل های بیان کننده HLA-G در نواحی فیفیبروتیک قرار داشتند (شکل 1B1). برعکس، 49 درصد از سلول های HLA-G پلاس نه ماست سل ها و نه سلول های CD117 پلاس (جدول 3) بودند و به طور کلی به نظر می رسید که با هم به عنوان گره ها گروه بندی شوند (شکل 1B2). بنابراین، برچسب‌گذاری‌های دیگری بر روی مناطق مختلف برای شناسایی این سلول‌ها انجام شد (جدول 4). تقسیم مجدد انواع مختلف سلول های HLA-G پلاس بسته به منطقه متفاوت استکبدبافت مورد بررسی قرار گرفت (جدول 3 و 4). به طور کلی، 63 درصد از سلول های HLA-G پلاس در ناحیه فیفیبروتیک به نظر می رسد که ماست سل ها هستند در حالی که تنها 3 درصد در گره ها هستند. علاوه بر این، 68 درصد از سلول‌های HLA-G پلاس در گره‌ها CD20، نشانگر لنفوسیت‌های B (شکل 1C1) و 3 درصد CD3 (شکل 1C2) را بیان کردند. HLA-G به علاوه CD117 ماست سل تریپتاز HLA-G به همراه CD117 HLA-G به علاوه CD117 ماست سل تریپتاز پلاس و HLA-G به علاوه CD117 به علاوه سلول های ماست سل تریپتاز به علاوه سلول های تریپتاز در سه مورد نماینده شمارش شدند.کبدفیفیبروز با استفاده از نرم افزار HALO با الگوریتم مناسب. سلول ها در دو ناحیه مختلف از نمونه سیروز الکلی، یعنی ناحیه فیفیبروتیک و گره سلولی، در یک مورد نماینده شمارش شدند.کبدفیفیبروز با استفاده از نرم افزار HALO با الگوریتم مناسب. هیچ سلول HLA-G پلاس CD31، نشانگر سلول‌های اندوتلیال یا CD1a، نشانگر سلول‌های دندریتیک را همزمان بیان نمی‌کند.

شکل 1. ماهیت سلول های HLA-G در یک مورد نمایندهکبدفیفیبروز (الف) در پاراگراف اول، دو عکس سمت چپ بیان HLA-G و CD117 را روی یک مورد نماینده نشان می‌دهند.کبدفیفیبروز از 41 مورد با استفاده از ایمونوهیستوشیمی، با 4H84 تشخیص HLA-G و CD117 آنتی بادی سلول های c-kit را تشخیص می دهد. اسلایدها با هماتوکسیلین مایر رنگ آمیزی شدند. دهانه های فیبروز توسط یک خط قرمز احاطه شده است. نواحی موجود در دایره‌ها از نظر توپوگرافی با لام‌های رنگ‌آمیزی HLA-G و CD117 مطابقت دارند. مستطیل بزرگنمایی قوی این ناحیه را نشان می دهد که نشان می دهد دو سلول HLA-G با دو سلول CD117 مطابقت دارند. علاوه بر این، مورفولوژی سازگار با ماست سل دارند. عکس با فلورسانس دوگانه (CD117/Tryptase ماست سل) با سه عکس در سمت راست مربوط به فلورسانس ساده (DAPI هسته ها را به رنگ آبی، CD117 به رنگ سبز، ماست سل تریپتاز به رنگ قرمز) نشان می دهد که اکثر سلول های دارای برچسب مشترک هستند. به رنگ زرد سلول های CD117 عمدتا ماست سل ها هستند. (ب) ایمونوفلورسانس چهارگانه در مورد نمایندهکبدفیفیبروز (از سه) با استفاده از DAPI با هسته آبی، HLA-G (با آنتی بادی 4H84) با شبه رنگ سبز، CD117 در شبه رنگ فیروزه ای، تریپتاز ماست سل در شبه رنگ قرمز، و تصویر ترکیبی یا ادغام. در سمت راست، رنگ آمیزی قرمز سیریوس نشان داده شده است. 1 و 2 مربوط به دو ناحیه مختلف هستندکبد،به ترتیب دهانه فیفیبروز و گره سلولی. اکثر سلول های HLA-G CD117 و تریپتاز ماست سل را در فیفیبروز بیان می کنند (1). در مقابل، اکثر سلول‌های HLA-G ماست سل‌های هم‌اظهارکننده نیستند، به جز سلول‌های HLA-G خاصی در حاشیه گره سلولی (2)، نزدیک یا در فیفیبروز. (C) ایمونوفلورسانس چهارگانه بر روی سلول های گره ازکبدفیفیبروز به ترتیب در B2، با DAPI، HLA-G با شبه رنگ سبز، CD20 با صورتی فوشیا، یا CD3 با شبه فیروزه ای، در 1 و 2 نشان داده شده است. تطبیق رنگ قرمز سیریوس در سمت راست است. مربع یک منطقه توپوگرافی محدود حاوی سلول های HLA-G مثبت و سلول های مربوطه در آن ناحیه را نشان می دهد. تصویر ترکیبی نشان‌بندی صورتی رنگ HLA-G و CD20 را نشان می‌دهد. هیچ رنگ آمیزی بین HLA-G با شبه رنگ سبز و CD3 با شبه فیروزه ای مشاهده نشد.

تعداد مطلق سلول های HLA-G پلاس، CD3 پلاس (لنفوسیت های T)، CD20 پلاس (لنفوسیت های B) و ماست سل تریپتاز پلاس (مست سل ها) با استفاده از نرم افزار HALO با الگوریتم مناسب بر روی یک مورد معرف تعیین شد و بیان می شود. در هر میلی متر مربع

تجزیه و تحلیل سلول های HLA-G به علاوه در IPFدر اولین مطالعه انجام شده بر روی یک سری IPF (n=10) با روش ایمونوهیستوشیمی، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تعداد سلول های HLA-G پلاس را 135 ± 62/mm2 و سلول های CD117 پلاس را تخمین زدیم. 227 ± 134/mm2 (جدول 5). سلول های HLA-G پلاس با سلول های CD117 پلاس در فیفیبروز ریه مطابقت نداشتند (شکل 2A). آنالیز HALO ایمونوفلورسانس چهارگانه و رنگ‌آمیزی سیریوس قرمز نشان داد که ماهیت سلول‌های HLA-G بسته به ناحیه بافت‌شناسی ریه متفاوت است (جدول 6). در واقع، 63 درصد از سلول های HLA-G پلاس در نواحی فیفیبروتیک، ماست سل ها (B1, C1) بودند، در حالی که آنها فقط 7 درصد از سلول های HLA-G پلاس در گره ها (B2, C2) را تشکیل می دادند. اکثر سلول های HLA-G پلاس در گره ها CD20 را با هم بیان می کنند (شکل 2B).

شکل 2. ماهیت سلول های HLA-G در یک مورد نماینده IPF. (الف) در پاراگراف اول، عکس سمت چپ رنگ قرمز سیریوس یک مورد از 10 IPF را نشان می‌دهد، عکس میانی رنگ ضد رنگ توسط مایر هماتوکسیلین را با استفاده از ایمونوهیستوشیمی نشان می‌دهد. نواحی موجود در دایره‌ها از نظر توپوگرافی بر روی لام‌های رنگ‌آمیزی HLA-G و CD117 با سلول‌های c-kit شناسایی آنتی‌بادی HLA-G و CD117 با 4H84 مطابقت دارند. مستطیل ها بزرگنمایی شدید این نواحی را نشان می دهند که نشان می دهد سلول های HLA-G با سلول های CD117 مطابقت ندارند. (ب) ایمونوفلورسانس چهارگانه در مورد نمایندهکبدفیفیبروز از دو با استفاده از DAPI با هسته آبی، HLA-G (با آنتی بادی 4H84) با شبه رنگ سبز، CD117 در شبه رنگ فیروزه ای، تریپتاز ماست سل در شبه رنگ قرمز، و تصویر ترکیبی یا ادغام. در سمت راست Sirius Red نشان داده شده است. 1 و 2 مربوط به دو ناحیه مختلف ریه، به ترتیب دهانه فیفیبروز و گره سلولی هستند. (C) ایمونوفلورسانس پنجگانه با DAPI، HLA-G با شبه رنگ سبز، تریپتاز با شبه رنگ قرمز، CD3 با شبه رنگ فیروزه ای، CD20 با شبه رنگ صورتی فوشیا، در همان مورد IPF نشان داده شده در (B) . (C1) مربوط به ناحیه (B1) است. در (C1)، اکثر سلول های HLA-G مربوط به ماست سل ها در ناحیه فیفیبروز هستند، در حالی که ماست سل های بسیار نادر HLA-G در گره نشان داده شده در (C2) هستند. اکثر سلول های گره CD20 هستند. تجزیه و تحلیل HALO نشان داد که بیشتر سلول های HLA-G پلاس لنفوسیت های B هستند.

سلول های HLA-G plus و CD117 plus برای 10 مورد با استفاده از نرم افزار HALO با الگوریتم مناسب، پس از ایمونوهیستوشیمی شمارش شدند. میانگین، انحراف معیار و محدوده نشان داده شده است.

تجزیه و تحلیل سلول های HLA-G به علاوه در فیبروز کلیهدر مطالعه یک سری از 10 مورد ازکلیهفیفیبروز توسط ایمونوشیمی، 102 ± 133 HLA-G به علاوه سلول در میلی‌متر مربع و 207 ± 426 CD117 به علاوه سلول در میلی‌متر مربع یافت شد (جدول 7). هیچ تطابقی بین سلول های HLA-G plus و CD117 plus وجود نداشت (شکل 3A).

شکل 3. ماهیت سلول های HLA-G در یک مورد نماینده ازکلیهفیبروز (الف) در پاراگراف اول، عکس سمت چپ رنگ قرمز سیریوس را نشان می‌دهد، عکس میانی رنگ ضدرنگ مایر هماتوکسیلین را با استفاده از ایمونوهیستوشیمی نشان می‌دهد. نواحی موجود در دایره‌ها از نظر توپوگرافی با لام‌های رنگ‌آمیزی HLA-G و CD117 مطابقت دارند، با 4H84 که HLA-G و CD117 سلول‌های c-kit را تشخیص می‌دهند. فلش های قرمز سلول های مثبت هستند. مستطیل ها بزرگنمایی قوی این نواحی را نشان می دهند که نشان می دهد سلول های HLA-G با سلول های CD117 مطابقت ندارند. (ب) ایمونوفلورسانس چهارگانه در مورد نمایندهکبدفیبروز با استفاده از DAPI با هسته آبی، HLA-G (با آنتی بادی 4H84) با شبه رنگ سبز، CD117 در شبه رنگ فیروزه ای، تریپتاز ماست سل در شبه رنگ قرمز، و تصویر ترکیبی یا ادغام. در سمت راست، سیریوس رد نشان داده شده است. سلول‌هایی که در ادغام به رنگ زرد رنگ‌آمیزی شده‌اند مربوط به HLA-G به علاوه ماست سل‌ها هستند. (C) نواحی فیروزه ای رنگ آمیزی شده مربوط به لوله های متعددی است که فقط CD117 را بیان می کنند. سلول‌هایی که در ادغام به رنگ زرد رنگ‌آمیزی شده‌اند مربوط به HLA-G به علاوه ماست سل‌ها هستند.

سلول های HLA-G plus و CD117 plus برای 10 مورد شمارش شدندکلیهفیفیبروز با استفاده از نرم افزار HALO با الگوریتم مناسب، به دنبال ایمونوهیستوشیمی. میانگین، انحراف استاندارد و محدوده برای سلول های HLA-G plus و CD117 plus نشان داده شده است. برچسب‌گذاری چهارگانه با نرم‌افزار HALO همراه با Sirius Red و تجزیه و تحلیل مورفولوژیکی نشان‌دهنده ناهمگونی قابل‌توجهی برچسب‌گذاری بر روی بخشی ازکلیهنه تنها با توجه به ناحیه تشریحی بلکه در همان محفظه تشریحی (شکل 3B,C). بنابراین، شمارش و محاسبه درصد سلول های HLA-G پلاس در این اندام ارتباطی نداشت. در واقع، بررسی میکروسکوپی رنگ‌آمیزی قوی محیط توبول‌ها با CD117 را نشان داد که با ماست‌سل‌ها هم‌نشان‌بندی نشد (شکل 3C). سلول های HLA-G پلاس ماست سل ها هستند و در بینابینی التهابی قرار دارند (شکل 3B,C).

بحثبیان پروتئین های HLA-G برای اولین بار در سیتوتروفوبلاست ها در رابط بین جنین و مادر نشان داده شد [12]. در شرایط پایه، بیان آن تا حد زیادی به بافت‌های خاص، مانند قرنیه [13]، تیموس [14] و جزایر پانکراس [15] محدود می‌شود. با این حال، انواع خاصی از سلول ها نیز قادر به بیان آن هستند، مانند سلول های اپیتلیال برونش [16]، سلول های مزانشیمی [17]، سلول های دودمان مونوسیتی [18-20]، و پیش سازهای اریتروییدی و اندوتلیال [21]، در شرایط خاص. . ما قبلا نشان دادیم که ماست سل ها می توانند HLA-G را در حالت پایه، با افزایش بیان در برخی محیط های غنی از سیتوکین، به ویژه، فیفیبروتیک بیان کنند.بافت کبدما بررسی کردیم که آیا HLA-G می تواند توسط ماست سل های مرتبط با بیان شودکبدفیفیبروز از یک علت دیگر یا فیبروز در اندام دیگر با مطالعه 41 مورد ناشی از الکلکبدسیروز، 10 از IPF، و 10 ازکلیهفیفیبروز

عفونت‌ها، آسیب‌های سمی و متابولیک و بیماری‌های التهابی ایدیوپاتیک می‌توانند باعث ایجاد فیبروز شوند زیرا آسیب مزمن باعث آپوپتوز سلول‌های پارانشیمی می‌شود که سیتوکین‌های پروفیبروژنیک و التهابی مانند TGF- را آزاد می‌کنند. سلول های تولید کننده کلاژن در پاسخ به آسیب از سلول های مزانشیمی ساکن متمایز می شوند. انتقال اپیتلیال به مزانشیمی، پدیده ای از تغییر شکل سلولی است که برای کلانژیوسیت ها درکبد، پنوموسیت ها در ریه و سلول های اپیتلیال لوله ای درکلیه[22]. سلول های آپوپتوز باعث افزایش غلظت TGF- در تمام اندام ها می شود. با این حال، ویژگی های خاص فیفیبروژنز ممکن است در اندام های مختلف متمایز شود. درکبد،آپوپتوز مربوط به سلول های کبدی است، در حالی که سلول های اپیتلیال در ریه وکلیه[22]. بنابراین، فیبروبلاست های ساکن درکلیهو ریه به یک میوفیبروبلاست که a-SMA، کلاژن 1 را بیان می کند، فعال می شود، در حالی کهکبدمیوفیبروبلاست نشانگرهای اختصاصی عصبی خود را حفظ می کند [23].

درکبد،سلول های ستاره ای کبدی بیش از 80 درصد از کل سلول های تولید کننده کلاژن را تشکیل می دهند. در ریه ها، آسیب پنوموسیت ها با آپوپتوز سلول های اندوتلیال همراه است. نقش التهاب در IPF بحث برانگیز است. IPF معمولی هجوم سلول های التهابی را نشان نمی دهد، اما برخی از نویسندگان نقش التهاب را در تمایز فیبروبلاست های ریوی به میوفیفیبروبلاست های تولید کننده ECM پیشنهاد می کنند [24]. ضایعات اپیتلیال آلوئولی مکرر با علت ناشناخته و آپوپتوز اپیتلیال آلوئولی در IPF نقش دارند [25]. درکلیهوکبد،سلول های میلومونوسیتی از مغز استخوان جمع آوری می شوند و به ترتیب 14 تا 15 درصد و 8 تا 12 درصد از میوفیبروبلاست ها را تشکیل می دهند. هیچ برگشت پذیری فیفیبروز در ریه بر خلاف ریه مشاهده نمی شودکبدوکلیهدر صورت عدم آسیب و در صورتی که به نقطه عدم بازگشت نرسیده باشد. در واقع، فرآیندهای التهابی در IPF، به ویژه در مرحله اولیه بیماری، محدود می‌شوند، در حالی که ضایعات اپیتلیال آلوئولی مکرر با علت ناشناخته و آپوپتوز اپیتلیال آلوئولی می‌توانند تکثیر و فعال شدن فیفیبروبلاست‌های ریوی یا میوفیبروبلاست‌ها را تقویت کنند [25].

با توجه بهکبدفیفیبروز، یک فرآیند ناموفق در بهبود زخمکلیهبافت پس از آسیب مزمن و پایدار منجر به تولید و ترشح سیتوکین های التهابی پیش التهابی و همچنین TGF- می شود که نقش کلیدی در فرآیند فیفیبروتیک ایفا می کند. به عنوان مثال، درکبدفیفیبروز، TGF- که به صورت یک مقدار دقیقه در HSC ساکن بیان می شود، به سرعت توسط این نوع سلول ها تولید می شود.آسیب کبدیعلاوه بر HSC، سایر منابع TGF- به عنوان پلاکت ها، ماکروفاژها، سلول های کبدی و همچنین ماست سل ها توصیف شده اند [26]. TGF- 1 به شکل نهفته در ماتریکس ذخیره می‌شود و پس از فعال شدن، انتقال از فیفیبروبلاست به میوفیبروبلاست را که برای فرآیند فیبروز اساسی است، ترویج می‌کند. علاوه بر این، با سرکوب متالوپروتئازها و ترویج یک مهارکننده طبیعی TIMP، از تخریب ECM جلوگیری می کند. بنابراین، تولید ECM را از طریق مکانیسم‌های SMAD{3} وابسته یا غیر مرتبط با SMAD القا می‌کند [27]. در واقع، یک تعامل متقابل بین ماست سل ها و TGF- وجود دارد. TGF- یک جاذب قوی برای ماست سل ها است. در واقع، فرآیندهای پاتولوژیک با واسطه TGF- اغلب با تجمع ماست سل ها مرتبط هستند [28]. علاوه بر این، ماست سل‌ها یکی از منابع اولیه IL{10}} هستند که فیفیبروز وابسته به TGF را تحریک می‌کنند [29]. همچنین گزارش شده است که TGF- باعث ارتقا یا سرکوب عملکرد ماست سل ها می شود. در واقع، TGF- بیان گیرنده IgE با میل ترکیبی بالا Fc1RI را که ماست سل ها را فعال می کند، مهار می کند [30]. از سوی دیگر، از تکثیر ماست سل، دگرانولاسیون و تولید چندین مولکول موثر مانند هیستامین و TNF- جلوگیری می کند [31]. با توجه به افزایش MC در فیفیبروز، اثر TGF- بر عملکردهای MC می تواند در تنظیم پاسخ های التهابی که روند فیبروز را حفظ می کنند، مهم باشد.

مانند هپاتیت C ناشی از ویروسکبدفیفیبروز، ما متوجه شدیم که نیمی از سلول های HLA-G به علاوه در سیروز ناشی از الکل، ماست سل ها هستند (جدول 2) و تنها 34 درصد از ماست سل ها HLA-G را بیان می کنند، با تنوع فردی بالا که با انحراف استاندارد نشان داده شده است (جدول 1). . علاوه بر این، ما یک تقسیم مجدد متمایز را با توجه به منطقه مشاهده کردیمکبد،که در آن 63 تا 92 درصد از سلول های HLA-G پلاس در نواحی فیبروتیک، ماست سل ها بودند، در حالی که تنها 3 تا 23 درصد ماست سل ها در گره های سلولی بودند (جدول 3). به طور مشابه، الگوی متفاوتی برای ماست سل ها مشاهده می شود، زیرا 92 درصد از ماست سل ها در مناطق فیبروتیک HLA-G را بیان می کنند، در حالی که تنها 23 درصد HLA-G را در گره های سلولی بیان می کنند (داده ها نشان داده نشده است). بنابراین، بیان HLA-G به علت ویروسی محدود نمی شودکبدسیروز در واقع، ما یک نتیجه مشابه برای ریه به دست آوردیم. در IPF، 63 درصد از سلول های HLA-G پلاس در نواحی فیفیبروتیک، ماست سل ها بودند، در حالی که تنها 7 درصد از سلول های موجود در گره ها، ماست سل ها بودند (جدول 6). موارد ازکلیهفیفیبروز خاص بود. در نتیجه تعداد زیاد لوله‌ها، شمارش صحیح سلول‌ها در نواحی فیفیبروتیک ممکن نبود، زیرا ماست سل‌ها به توبول‌ها نفوذ کرده بودند. تنها مشاهدات میکروسکوپی کیفی می تواند انجام شود، که تعدادی از سلول های HLA-G پلاس را به عنوان ماست سل نشان می دهد، بدون اینکه بتوان توبول ها را از مناطق فیبروتیک متمایز کرد (شکل 3). بنابراین، به نظر می رسد HLA-G توسط ماست سل ها در بیماری فیفیبروتیک از طریق سطح سلول و مولکول های داخل سیتوپلاسمی، صرف نظر از اندام، بیان می شود. ما قبلاً نشان داده‌ایم که ماست سل‌های انسانی در کشت قادر به تولید اشکال محلول HLA-G در محیط شرطی‌شده در حالت پایه بودند و ترشح پس از تحریک با سیتوکین‌ها، از جمله IL{5}} [10] افزایش یافت.

درصد بالاتری از ماست سل ها (بیش از نیمی) که HLA-G را بیان می کنندکبدو ریه ممکن است با اجزای التهابی فیفیبروز توضیح داده شود. در واقع، به عنوان سلول های ایمنی ذاتی، تعداد ماست سل ها در شرایط التهابی افزایش می یابد و همچنین می توانند واسطه های پیش التهابی را آزاد کنند [32]. تعداد ماست سل ها در بیماری های فیفیبروتیک افزایش می یابد. در واقع، تراکم ماست سل در ریه های بیماران مبتلا به IPF نسبت به سایر آسیب شناسی های ریه [33] و ریه طبیعی بیشتر است. به همین ترتیب، انسانبیماری های کلیویبا افزایش تعداد ماست سل ها همراه استکلیهکورتکس، به ویژه در ناحیه فیبروز [34]، زیرا ماست سل ها به ندرت در افراد سالم مشاهده می شوند.کلیه ها.

انتشارات قبلی بیان کردند که ماست سل ها در کبد، ریه ها و انسان طبیعی وجود ندارند یا به ندرت یافت می شوند.کلیه ها[35]. پیشرفت دانش در مورد ماست سل ها نشان داده است که ماست سل ها به عنوان سلول های ایمنی ذاتی را می توان در تمام بافت ها مشاهده کرد، اما در مکان هایی که در معرض محیط قرار دارند، فراوان تر هستند. علاوه بر این، آنها مجموعه بزرگی از گیرنده‌ها را نمایش می‌دهند که به آنها اجازه می‌دهد به محرک‌ها پاسخ دهند و با سلول‌های دیگر تعامل داشته باشند [36].کلیویماست سل ها از نظر عملکردی شبیه سلول های ریه هستند. داده های متناقضی در مورد نقش ماست سل ها در فیفیبروز گزارش شده است. تعدادی از نویسندگان پیشنهاد کرده اند که ماست سل ها در فیفیبروز نقش دارند زیرا در التهاب حاد و مزمن که شروع کننده آن هستند، نقش دارند. علاوه بر این، ماست سل ها می توانند هیستامین، هپارین و IL{0}} ترشح کنند که تکثیر فیبروبلاست ها را افزایش می دهد. با این حال، دیگران [37،38]، از جمله ما [39]، نشان داده اند که ماست سل ها نقش ضد فیبروتیک ایفا می کنند: به عنوان مثال، در مدل های حیوانی، مانند موش های Ws/Ws دارای کمبود ماست سل و موش ها. اوکازاکی و همکاران نشان داد که فیبروز القایی در موش‌های دارای کمبود ماست سل شدیدتر از موش‌های نوع وحشی بود [38].

علاوه بر این، ماست سل ها در سرطان، مشابه ماکروفاژها، پلاریزه می شوند [40]. ماست سل های ضد التهابی سیتوکین هایی مانند IL{2}} را بیان می کنند و تعداد آنها با شدت التهاب رابطه معکوس دارد، در حالی که ماست سل های پیش التهابی به یک محیط پیش التهابی منطبق می شوند. این احتمال وجود دارد که ماست سل های ضد التهابی HLA-G را بیان کنند، به ویژه، زیرا (i) در چندین مدل ارتباط بین سطوح IL{5}} و بیان HLA-G و (ii) HLA-G نشان داده شده است. اثر ضد التهابی دارد. ماست سل های بیان کننده HLA-G ممکن است در مراحل اولیه بیماری، در مرحله التهابی، برای مقابله با التهاب، که اولین واکنش به ضایعه است، وجود داشته باشد. در ادبیات، گزارش شده است که Il{11}}، با کاهش پاسخ التهابی، ممکن است از تکثیر و سنتز کلاژن میوفیبروبلاست ها جلوگیری کند [41]. در واقع، IL{13}} ممکن است نقش محافظتی در الکلی بازی کندبیماری کبد[42]. در مقابل، سطوح سرمی بالاتر IL در بیماران مبتلا به IPF نسبت به افراد عادی و بالاترین سطح IL{2}} در لاواژ برونش آلوئولار در بیماران مبتلا به IPF در مقایسه با سارکوئیدوز یا پنومونیت با حساسیت بیش از حد نشان داده شد. [43]. می‌توانیم آن را با مولفه التهابی کمتر مهم توضیح دهیم. که درکلیهفیفیبروز، در یک مدل موش نشان داده شد که کمبود IL-10 تشدید می‌کندکلیهالتهاب و فیفیبروز [44]. در انسان، درمان با ایمونوتراپی موضعی IL-10 همراه با آنتاگونیست TGF مزمن را بهبود می بخشد.بیماری کلیوی [45].

یکی دیگر از نتایج مرتبط، مشاهده سلول های HLA-G به علاوه در گره های سلولی، در نزدیکی نواحی فیفیبروتیک در موارد نادر سیروز الکلی است. این سلول‌ها از نظر مورفولوژیکی توسط مجموعه‌ای از سلول‌های به راحتی قابل تشخیص با اندازه‌های کوچک تا متوسط ​​مشخص می‌شوند که نشان‌دهنده تجمع لنفوئیدی است. ویژگی‌های مورفولوژیکی آنها نشان‌دهنده فولیکول‌ها است که ساختارهایی هستند که عمدتاً توسط لنفوسیت‌های B تشکیل شده‌اند. ایمونوفلورسانس چهارگانه در گره‌ها این فرضیه را تأیید کرد، زیرا 68 درصد از سلول‌های HLA-G به علاوه CD20 را که نشانگر اختصاصی لنفوسیت‌های B است، بیان می‌کنند (جدول 3). ساختارهای مشابهی نیز در IPF مشاهده شد، با نتیجه مشابه، نشان می‌دهد که 76 درصد از سلول‌های HLA-G پلاس در گره‌ها لنفوسیت‌های B هستند (جدول 6). نئوژنز لنفوئیدی در فیفیبروز گزارش شده است. بنابراین، تحت شرایط پاتولوژیک خاص، مانند التهاب مداوم، توده های سلولی ممکن است به یک ساختار بسیار سازمان یافته شبیه بافت لنفاوی ثانویه، یعنی اندام های لنفاوی سوم یا فولیکول های لنفاوی نابجا تبدیل شوند [46]. چنین فولیکول های لنفاوی حاوی مناطق غنی از سلول T و فولیکول های سلول B متمایز با مراکز ژرمینال هستند [47]. مکانیسمی که توسط آن سلول‌های B نفوذی فولیکول نابجا و مرکز ژرمینال را سازماندهی می‌کنند توسط لنفوتوکسین{14}} و کموکاین‌های لنفوئیدی، مانند لیگاند CC-chemokine 19 (CCL19)، CCL21، CXC-chemokine لیگاند 12، و CXCL کنترل می‌شود. CXCL13 که خانه نشینی لنفوسیت ها را تنظیم می کند. علاوه بر لیم فوتوکسین و کموکاین ها، تحریک آنتی ژنی نیز برای القاء و حفظ تشکیل فولیکول مورد نیاز است. چنین فولیکول هایی در گروه ما از ویروس هپاتیت C القا شده مشاهده نشدکبدفیفیبروز و تنها در یکی از سه مورد ناشی از الکل یافت شدکبدفیفیبروز، نشان دهنده یک مرحله مشخص از بیماری است. در واقع، عملکرد اندام های لنفاوی نابجا و ارتباط آنها با التهاب و فیبروز هنوز مشخص نیست. تعدادی از مطالعات نقش جدید و شگفت‌انگیزی را برای سلول‌های B در تنظیم فیبروبلاست‌ها در فیفیبروز نشان داده‌اند، که در آن اثر سودآوری آن‌ها مشابه TGF- است و همچنین توسط فاکتور فعال‌کننده سلول B (BAFF) افزایش می‌یابد [48].

ارتباط منبع سلولی HLA-G در فیفیبروز نه تنها توصیفی است بلکه عملکردی نیز دارد. HLA-G از طریق گیرنده های خاص خود، مانند ILT2 و ILT4، اثر مهاری بر عملکرد انواع لنفوسیت ها [49] و سلول های دندریتیک [20،50] دارد. وجود HLA-G بر روی این سلول های ایمنی، علاوه بر اینکه نشانگر التهاب است، با کاهش التهاب نیز نشانه ای از واکنش ایمنی مناسب است. در واقع، همانطور که قبلا در شوک سپتیک نشان داده شد، HLA-G نقش محافظتی در برابر واکنش های التهابی اغراق آمیز ایفا می کند [51]. علاوه بر این، ما قبلاً تعامل متقابل بین ماست سل ها و سلول های ستاره ای کبدی را مطالعه کردیم و نشان دادیم که منجر به جذب ماست سل ها و کاهش قابل توجهی در تولید کلاژن توسط سلول های HSC از طریق تولید HLA-G می شود [39]. علاوه بر این، بیان HLA-G توسط سلول‌های B در فولیکول‌های نابجا ممکن است با مهار سلول‌های B از طریق یک مکانیسم اتوکرین، به خنثی کردن اثر سودآوری لنفوسیت‌های B بر روی میوفیبروبلاست‌ها کمک کند.

بیماران و روش ها

بیمارانگروهی از 41 نفرکبدبیماران پیوندی مبتلا به سیروز ناشی از الکل مورد مطالعه قرار گرفتند. بیماران از پروتکل مطلع شدند و عدم وجود مخالفت به دست آمد (کمیته اخلاق بیمارستان، اطلاعیه شماره 16.47). ده نمونه بلوک پارافینی ازکلیهفیفیبروز و 10 IPF (کمیته اخلاق بیمارستان، اطلاعیه شماره 16.123)، به طور کامل و غیرقابل برگشت ناشناس، مطابق با اصول اعلامیه هلسینکی مورد مطالعه قرار گرفت. ویژگی های بالینی و بیولوژیکی سه گروه به ترتیب در جداول 8-10 خلاصه شده است.

روش شناسی

ایمونوهیستوشیمی و ایمونوفلورسانسبافت ها از تکثیر شده به دست آمدندکبدوکلیهیا بیوپسی ریه مقاطع سریالی تعبیه شده با پارافین (ضخامت 4 میکرومتر) تهیه شد و رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی استاندارد، یعنی رنگ‌آمیزی HES و برچسب‌گذاری Sirius Red کلاژن انجام شد. به طور موازی، ایمونوهیستوشیمی و ایمونوفلورسانس بر روی بخش‌های سریال بخش‌های تعبیه‌شده در پارافین از همان بلوک به دنبال پارافین‌زدایی و پروتکل بازیابی آنتی‌ژن انجام شد. آنتی بادی های اولیه (mAbs) به شرح زیر بودند: موش مونوکلونال ضد HLA-G انسان (Exbio، 4H84 2 میکروگرم در میلی لیتر یا 1:100، Vestec، جمهوری چک)، خرگوش پلی کلونال ضد انسان CD117/c-kit تشخیص میلوئید و ماست سل (Dako، 1:200، کپنهاگ، دانمارک)، تریپتاز مونوکلونال ضد انسان (هوم) ماست سل موش (کلون AA1، داکو، 1:1000)، ویژه برای ماست سل ها، مونوکلونال ضد انسان CD3 (Thermo Scientifics, SP7, 1:500, Waltham, MA, USA)، مخصوص لنفوسیت های T و CD20 ضد انسان مونوکلونال (Dako, M0755, 1:600) مخصوص لنفوسیت های B.

به طور خلاصه، اسلایدهای ایمونوهیستوشیمی با آنتی بادی اولیه در یک سیستم خودکار Discovery Ultra (روش، میلان، فرانسه) انکوبه شدند. آنتی بادی اولیه متصل با استفاده از یک آنتی بادی ثانویه ضد موش یا ضد خرگوش بز ضد موش یا ضد خرگوش (Vector, ABCYS, les Ulis, France, 1:7{18}}0) و دی آمینو بنزیدین (کیت تشخیص DAB MAP, Roche) آشکار شد. ، میلان، فرانسه)، به دنبال آن رنگ هماتوکسیلین مایر. برای تعیین دقیق ماهیت سلول‌های HLA-G پلاس، سه (DAPI، CD117، تریپتاز ماست سل)، چهارگانه (DAPI، HLA-G، CD117، تریپتاز ماست سل) و پنج‌گانه (DAPI، HLA-G، CD3، CD20، ماست سل تریپتاز) رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس سپس در سه مورد نماینده سیروز ناشی از الکل و دو مورد نماینده IPF انجام شد. مکاشفه با استفاده از کیت‌های Discovery FAM، رودامین، DCC و Cy5 (سیستم‌های پزشکی Ventana، Illkirch، فرانسه) انجام شد. پس از رنگ آمیزی، تصویری از کل سطح مقطع با بزرگنمایی 20× یا 40× با استفاده از اسکنر کانفوکال (پانورامیک اسکنر، 3DHistech، بوداپست، مجارستان) دیجیتالی شد. ایمونوهیستوشیمی و رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس مالتی پلکس با استفاده از نرم افزار آنالیز دیجیتال HALO (V3.0.311) آنالیز شد. این نرم افزار برای تشخیص فیفیبروز (Sirius Red) با استفاده از ماژول کمی سازی ناحیه (V2.1.3) آموزش داده شد، در حالی که ماژول Fish-IF (v1.2.2) برای نمونه های برچسب گذاری شده با رنگ آموزش داده شد. کل بخش های هر نمونه برای تجزیه و تحلیل با الگوریتم مربوطه انتخاب شدند. داده ها برای تجزیه و تحلیل در یک نرم افزار صفحه گسترده استخراج شدند.

نتیجهاین کار مرتبط با آزمایش های داده های قبلی ما در مورد نقش ضد محافظتی ماست سل ها از طریق بیان HLA-G [39] نشان می دهد که ماست سل ها از طریق بیان HLA-G در موقعیت های فیبروتیک نقش ضد فیبروتیک و محافظتی ایفا می کنند. این نقش توسط لنفوسیت های B که HLA-G را در فولیکول های نابجا بیان می کنند، تقویت می شود. به طور کلی، این یافته ها نقش محافظتی برای HLA-G بیان شده توسط ماست سل ها در اندام های فیبروتیک را نشان می دهد.