چگونه پلی ساکارید سیستانچ ملانوژنز را کاهش می دهد و استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد؟

برای اطلاعات بیشتر لطفا تماس بگیرید:Joanna.jia@wecistanche.com

سیستانچ دسرتیکولا پلی ساکارید ملانوژنز را در ملانوسیت ها تحریک می کند و استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد.

1بخش پوست، بیمارستان سوم شیانگیا، دانشگاه مرکزی جنوبی، چانگشا، چین

2بخش اورولوژی، بیمارستان سوم شیانگیا، دانشگاه مرکزی جنوبی، چانگشا، چین

مرکز تجربی 3Medicine، بیمارستان سوم شیانگیا، دانشگاه مرکزی جنوبی، چانگشا، چین

سیستانچدسرتیکولااثرات زیادی دارد، برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

خلاصه: به عنوان بخش اصلی اختلالات رنگدانه، بیماری های دپیگمانتاسیون پوست مانند ویتیلیگو و نایووس آکرومیک بسیار شایع هستند و در حال حاضر بیشتر مورد توجه قرار گرفته اند. پاتوژنز دپیگمانتاسیون شامل اختلال عملکرد و از دست دادن ملانوسیت است که احتمالاً به دلیل وراثت، خودایمنی و استرس اکسیداتیو ایجاد می شود. در میان آنها،استرس اکسیداتیونقش کلیدی ایفا می کند؛ با این حال، درمان های بالینی کمی می توانند با استرس اکسیداتیو مقابله کنند. همانطور که گزارش شده،سیستانچدسرتیکولا پلی ساکارید(CDP) یک آنتی اکسیدان موثر است. بر این اساس، ما نقش آن را در ملانوسیت ها ارزیابی کردیم و مکانیسم ها را بیشتر نشان دادیم. در این مطالعه، ما دریافتیم که CDP می‌تواند ملانوژنز را در ملانوسیت‌های اپیدرمی انسانی (HEMs) و سلول‌های ملانوم B16F10 موش ترویج کند، همچنین باعث ایجاد رنگدانه در گورخرماهی می‌شود. علاوه بر این، CDP می‌تواند مسیر سیگنال پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) را فعال کند، سپس بیان فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) و ژن‌های پایین‌دست TYR، TRP1، TRP2 و RAB27A را افزایش دهد. در غیر این صورت، ما دریافتیم که CDP می‌تواند سمیت سلولی و آپوپتوز ناشی از H2O2-در ملانوسیت‌ها را کاهش دهد. شواهد بیشتر نشان داد که CDP می‌تواند مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{11}} را بهبود بخشد و ROS درون سلولی را از بین ببرد. به طور خلاصه، CDP می تواند ملانوژنز را تقویت کند و از آسیب استرس اکسیداتیو ملانوسیت ها جلوگیری کند، که نشان می دهد CDP به حفظ وضعیت طبیعی ملانوسیت ها کمک می کند. بنابراین، CDP ممکن است یک داروی جدید برای درمان بیماری های دپیگمانتاسیون باشد.

کلید واژه ها:

Cistanche deserticola پلی ساکاریدبیماری دپیگمانتاسیون، ملانوسیت، ملانوژنز، NRF2،استرس اکسیداتیو

1. مقدمه

بیماری های رنگدانه پوست، مانند ویتیلیگو و نایووس آکرومیک، با رنگدانه های پوستی تکه تکه یا گسترده مشخص می شوند. اگرچه ضایعات پوستی به ندرت باعث آسیب فیزیکی شدید می شوند، اما بر ظاهر بیمار تأثیر می گذارند و بار روانی شدید، حتی اختلالات سلامت روانی ایجاد می کنند. تغییرات پاتولوژیک عمده در رنگدانه شامل اختلال در عملکرد و از دست دادن ملانوسیت است که بر سنتز و انتقال ملانین تأثیر زیادی می گذارد، بنابراین منجر به تجمع ناکافی ملانین در پوست می شود.

مکانیسم های دخیل در دپیگمانتاسیون در حال حاضر ناشناخته است، اما مطالعات برخی از عوامل مرتبط را شناسایی کرده اند. از یک طرف، عملکرد ملانوسیت تا حدی به فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) بستگی دارد، که برای ترویج بیان ژن‌های مرتبط با ملانوژنز از جمله تیروزیناز (TYR)، پروتئین مربوط به تیروزیناز 1 (TRP1)، مربوط به تیروزیناز به خوبی شناخته شده است. پروتئین 2 (TRP2)، پروتئین مرتبط با ras Rab{9}}a (RAB27A) و پروتئین بسته‌بندی کننده اکتین فاسین 1 (FSCN1).4 در میان این ژن‌ها، TYR نقش کلیدی در سنتز ملانین از طریق اکسید کردن l-dopa ایفا می‌کند. دوپاکینون.5 از سوی دیگر، مطالعات ترکیبی از چندین عامل را پیشنهاد می‌کنند که ممکن است مسئول از دست دادن ملانوسیت‌ها باشند، از جمله وراثت، محیط، خودایمنی و استرس اکسیداتیو.{17}} در میان این عوامل، استرس اکسیداتیو مهمترین در نظر گرفته می‌شود. .

مکانیسم هایاسترس اکسیداتیوایجاد رنگدانه تا حدی آشکار شده است. اضافه بار گونه های اکسیژن فعال (ROS) یکی از عوامل کلیدی است. 10 اضافه بار ROS در رنگدانه شامل عدم تعادل بین سیستم های پرو و ​​آنتی اکسیدان است. فاکتور 2/عنصر پاسخ آنتی اکسیدانی (NRF2/ARE) اختلال در مسیر آنتی اکسیدانی.12 مسیر شامل NRF2 و آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند هم اکسیژناز{10}} (HMOX{11}}، HO{12}}) کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون پراکسیداز 1 (GPX1)، و NAD(P)H کینون دهیدروژناز 1 (NQO1). زمانی که ملانوسیت ها در معرض ROS بیش از حد قرار می گیرند، NRF2 می تواند به هسته منتقل شود و به ARE حفظ شده متصل شود، سپس ارتقا یابد. بیان آنزیم های آنتی اکسیدان با این حال، در برخی از بیماری‌های دپیگمانتاسیون، مانند ویتیلیگو، یک مسیر آنتی‌اکسیدانی NRF2/ARE مختل نمی‌تواند به طور مؤثری ROS را از بین ببرد. درمان‌های بالینی که معمولاً در رنگ‌زدایی استفاده می‌شوند عبارتند از کورتیکواستروئیدهای موضعی یا سیستمیک، مهارکننده‌های کلسینورین، اشعه ماوراء بنفش با باند باریک B (NBUVB) ، 308-نور اگزایمر، پیوند اپیدرم اتولوگ و درمان طب سنتی چینی (TCM). کورتیکواستروئیدها و مهارکننده‌های کلسینورین می‌توانند فعال‌سازی غیرطبیعی سیستم ایمنی را کاهش دهند، در حالی که فتوتراپی‌ها به عنوان درمان‌های خط اول استفاده می‌شوند. به ویژه، NBUVB تکثیر ملانوسیت ها و تخریب سلول های T را تحریک می کند، در حالی که نور اگزایمر {28} نانومتری آپوپتوز سلول های T را القا می کند. برای بهبود دپیگمانتاسیون مفید هستند، اما کنترل پیشرفت بیماری همچنان چالش برانگیز است. توسعه درمان های جدید، به ویژه برای استرس اکسیداتیو، که قبلا مورد غفلت قرار گرفته بود، ضروری است.

Cistanche deserticolaبه عنوان "جین سینگ صحرا" شناخته می شود. اجزای آن در آسیب کبدی ناشی از اتانول و هیپرپلازی التهابی روده مفید است. همچنین می تواند به عنوان یک معرف ضد خستگی، ضد التهاب و ضد تومور استفاده شود.{5}} اخیراً Guo و همکاران گزارش کردند کهCistanche deserticola پلی ساکارید(CDP)، یکی از اجزای اصلی آن، دارای فعالیت آنتی اکسیدانی و محافظت از کبد است. دو مطالعه دیگر نقش آن را در محافظت از سلول‌ها از آسیب در شرایط محرومیت از اکسیژن-گلوکز/پرفیوژن مجدد و پوکی استخوان شناسایی کردند. با این حال، نقش CDP در بیماری‌های دپیگمانتاسیون مشخص نشده است. در اینجا، هدف ما تایید این بود که آیا CDP cاسترس اکسیداتیوبر ملانوژنز تأثیر می گذارد و ملانوسیت ها را از استرس اکسیداتیو محافظت می کند.

2.|مواد و روش ها

2.1|مواد شیمیایی و آنتی بادی ها

Cistanche deserticolaپلی ساکارید(CDP) و l-dopa از Yuanye Biotec (خلوص بیشتر یا برابر 98 درصد؛ شانگهای، چین) خریداری شد. پراکسید هیدروژن (H2O2)، دی متیل سولفوکسید (DMSO)، NaOH، تریتون X{4}}، 4،5-دی متیل تیازول-2-ایل-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید ( MTT)، و یک کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC از Sigma-Aldrich خریداری شد. 4 درصد پارافورمالدئید خنثی از Biosharp (Hefei، چین) خریداری شد. و یک کیت رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس (الکسا فلور 488) و 2 دی کلرو فلورسین-دی استات (DCFH-DA) از Beyotime Biotec (شانگهای، چین) خریداری شد. یک کیت رنگ آمیزی Fontana-Masson و یک کیت استخراج پروتئین نوکلئوپلاسمی از Sloarbio (پکن، چین) خریداری شد. مکمل رشد ملانوسیت انسانی (HMGS)، محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و محیط 254 از Gibco خریداری شد. سرم جنین گاوی (FBS) از BI (Kibbutz Beit-Haemek، اسرائیل) خریداری شد. آنتی بادی های اولیه برای -اکتین، TYR، TRP2، RAB27A، FSCN1، ERK، p-ERK، JNK، p-JNK،

p38، p-p38، NRF2 و HO-1 از Cell Signaling Technology، یک آنتی بادی اولیه برای MITF از آزمایشگاه سنت جان، یک آنتی بادی اولیه برای p-MITF از Affinity Biosciences، یک آنتی بادی اولیه خریداری شد. برای GAPDH از Bioworld خریداری شد، و آنتی بادی اولیه برای TRP1 از EMD Millipore خریداری شد.

2.2| کشت و درمان سلولی

سلول های ملانوم B16F10 موش در محیط DMEM حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد مخلوط آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند. ملانوسیت های اپیدرمی انسانی (HEMs) از پوست ختنه گاه انسان جدا شدند (به مطالعه قبلی ما مراجعه کنید) و در محیط 254 حاوی HMGS، 5 درصد FBS و 1 درصد ترکیب آنتی بیوتیک پنی سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند. تمامی سلول ها در انکوباتور مرطوب در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 کشت داده شدند. CDP در DMSO حل و رقیق شد

با محیط قبل از استفاده، غلظت نهایی DMSO کمتر از 0.1 درصد بود. H2O2 قبل از استفاده با محیط رقیق شد.

2.3|پرورش و درمان گورخرماهی

جنین و محیط گورخرماهی از EzeRinka Biotech خریداری شد. پروتکل آزمایشی مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه مرکزی جنوب قرار گرفت. گورخرماهی در 12-صفحات چاهک در 37 درجه دور از نور کشت داده شد و با غلظت‌های مختلف CDP تیمار شد. از یک میکروسکوپ معکوس برای مشاهده و ثبت روزانه ملانین ها در سر و دم گورخرماهی استفاده شد. پس از مشاهده، محیط را تغییر دادیم و CDP را دوباره اضافه کردیم. چگالی ملانین در دم گورخرماهی با Image J اندازه‌گیری شد و مقادیر به صورت چگالی نوری یکپارچه (IOD) ارائه می‌شوند.

2.4| زنده ماندن سلولها

زنده ماندن سلول ها با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. برای بررسی سمیت سلولی CDP، سلول‌های HEM و B16F10 در 96-صفحه چاهی با تراکم 2×1{{3{39}}}}3 سلول/چاه کاشته شدند و تا زمانی که کشت داده شدند. سلول ها به صفحات متصل شدند. سپس سلول ها با غلظت های مختلف (0، 2.5، 5، 10، 20، 40، 80، 160 و 320 میکروگرم بر میلی لیتر) CDP به مدت 24، 48 یا 72 ساعت تیمار شدند. قبل از اندازه گیری، 20 میکرولیتر MTT به هر چاهک اضافه شد و پلیت ها در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت انکوبه شدند. پس از آن، مایع رویی را دور انداختیم و 160 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه کردیم تا بلورهای فورمازان حل شوند. مقدار جذب در 490 نانومتر توسط یک صفحه خوان چند حالته (PerkinElmer) اندازه گیری شد. برای بررسی اثر CDP در شرایط سمیت سلولی ناشی از H2O{24}}، سلول‌های HEM و B16F10 در صفحات چاهک با تراکم 4 × 103 سلول در چاهک قرار گرفتند. سلول ها با غلظت های مختلف CDP (0، 20، 40، یا 80 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت تیمار شدند، در این مرحله H2O2 (غلظت نهایی: 500 میکرومتر برای سلول های HEM و 1.0 میلی متر برای سلول های B16F10) به هر چاه اضافه شد. و سلول ها را به مدت 24 ساعت دیگر انکوبه کردند. ما گروه های تحت درمان با CDP و کنترل منفی (NC) را راه اندازی کردیم. مراحل تشخیص همان است که قبلا توضیح داده شد.

2.5|سنجش NaOH محتوای ملانین

سلول‌ها در ظرف‌های پتری {{0}} میلی‌متری کشت و با CDP در غلظت‌های مختلف (۰، ۲۰، ۴۰ و ۸۰ میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت ۴۸ ساعت تحت تیمار قرار گرفتند، سپس با تریپسین هضم و در ۱ جمع‌آوری شدند. 5-میلی لیتر لوله. سلول ها را دو بار با آب دوبار تقطیر شستیم، آنها را مجدداً در 1 میلی لیتر اتانول معلق کردیم و آنها را گرداب کردیم تا ملانین آزاد شود. سپس مخلوط را (200 گرم، 5 دقیقه) سانتریفیوژ کردیم و مایع رویی را دور انداختیم، 1 میلی لیتر DMSO 10 درصد (رقیق شده با محلول NaOH 1 میلی متر) به هر لوله اضافه کردیم و رسوب را به حالت تعلیق درآوریم. سوسپانسیون را در یک حمام آب در دمای 80 درجه به مدت 1 ساعت انکوبه کردیم تا ملانین حل شود. در نهایت، ما 200 میکرولیتر از مایع را به یک صفحه چاه 96- منتقل کردیم و از یک صفحه خوان چند حالته برای اندازه گیری مقدار جذب در 470 نانومتر استفاده کردیم.

2.6|اندازه گیری فعالیت تیروزیناز

سلول‌ها در ظرف‌های پتری {{0}} میلی‌متری کشت داده شدند و قبل از اندازه‌گیری با CDP تیمار شدند، با تریپسین هضم شدند و در لوله‌های 1.5- میلی‌لیتری جمع‌آوری شدند و دو بار با سالین بافر فسفات (PBS) شستشو شدند. ). ما 106 سلول از هر نمونه را به یک لوله جدید منتقل کردیم و پس از سانتریفیوژ، مایع رویی را دور انداختیم، سپس 1 میلی لیتر 0.5 درصد Triton X-100 را به گلوله سلولی اضافه کردیم و آن را ذخیره کردیم. مخلوط در 0 درجه به مدت 15 دقیقه. پس از آن، 1 میلی لیتر L-dopa (1 میلی متر، رقیق شده با 0.1 مولار بافر فسفات) به عنوان بستر اضافه کردیم و محلول را مخلوط کردیم، 200 میکرولیتر از مخلوط را به یک صفحه چاه منتقل کردیم. بلافاصله، و مقدار جذب (A0) را در 475 نانومتر با استفاده از صفحه خوان چند حالته اندازه گیری کرد، اندازه گیری را در 10 دقیقه تکرار کرد (A10). فعالیت تیروزیناز با (A{22}}A0)/105 محاسبه شد و نتایج به صورت درصد (درصد) در مقابل کنترل منفی بیان شد.

2.7| رنگ آمیزی ملانین فونتانا- ماسون

سلول‌ها تا رسیدن به تراکم 50 درصد در 12-صفحه‌های چاهک کشت داده شدند. پس از تیمار، سلول ها با 4 درصد پارافورمالدئید خنثی به مدت 30 دقیقه تثبیت شدند و با آب مقطر شسته شدند. سپس 500 میکرولیتر محلول آمونیاک-نقره فونتانا را به هر چاهک اضافه کردیم و صفحات را به مدت 16 ساعت در تاریکی نگهداری کردیم تا ملانین رنگ شود. سپس سلول ها را با آب مقطر 5 بار (هر بار 1 دقیقه) شستیم و به مدت 5 دقیقه در 500 میکرولیتر هیپوسولفیت خیس کردیم. در نهایت هیپوسولفیت را خارج کرده و مجدداً سلول ها را با آب مقطر به مدت 1 دقیقه شستشو دادیم. سپس از یک میکروسکوپ معکوس برای مشاهده و ثبت ملانین ها استفاده کردیم.

2.8|استخراج RNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی

سلول ها در 6-صفحه های چاهک کشت داده شدند. پس از درمان، سلول ها با تریپسین هضم و در لوله های 1.{2}} میلی لیتری جمع آوری شدند. سلول ها را دو بار با PBS شستیم، سپس به 1 میلی لیتر بافر لیز اضافه کردیم، مخلوط را گرداب کردیم و لوله ها را به مدت 5 دقیقه روی یخ قرار دادیم تا سلول ها کاملاً لیز شوند. RNA با استفاده از کیت توتال RNA (Omega Bio-Tek) استخراج و با استفاده از ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO) رونویسی معکوس (RT) انجام شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی (PCR) با استفاده از KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO) انجام شد. حجم واکنش مخلوط RT 20 میکرولیتر بود، در حالی که حجم واکنش مخلوط PCR 20 میکرولیتر بود (cDNA 1-8 میکرولیتر، MIX 10 میکرولیتر، پرایمر F 1 میکرولیتر، پرایمر R 1 میکرولیتر، DEPC H2O را به 20 میکرولیتر اضافه کنید. ). آزمایش ها طبق پروتکل ها انجام شد. توالی پرایمرها در جدول S1 آمده است.

2.9|استخراج پروتئین و وسترن بلات / ایمونوفلورسانس

سلول ها در ظرف های پتری 100- میلی متری کشت شدند. پس از درمان، سلول ها با تریپسین هضم و در لوله های 1.{2}} میلی لیتری جمع آوری شدند. سلول ها را دو بار با PBS شستیم، سپس به 500 میکرولیتر از بافر لیز RIPA (Thermo Fisher) همراه با 1 میلی متر فنیل متیل سولفونیل فلوراید (ترمو فیشر) و کوکتل بازدارنده فسفاتاز رقیق شده 1:100 (روش) اضافه کردیم. پروتئین هسته و سیتوپلاسم با استفاده از کیت استخراج پروتئین نوکلئوپلاسمی طبق پروتکل سازنده استخراج شد. لوله ها را به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار دادیم و هر 5 دقیقه یکبار آنها را چرخاندیم تا سلول ها کاملاً لیز شوند. ما سلول ها را سانتریفیوژ کردیم (200 گرم، 4 درجه، 15 دقیقه)، مایع رویی را به یک لوله جدید منتقل کردیم و غلظت کل پروتئین را با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (KeyGEN Biotec) اندازه گیری کردیم. ما پروتئین ها را با بافر بارگذاری 5× (بیوتیم بیوتک، چین) در 100 درجه به مدت 10 دقیقه جوشاندیم، سپس آنها را در دمای 80- درجه نگهداری کردیم. از روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE) در وسترن بلات استفاده شد و 20 گرم پروتئین از هر گروه جدا و به غشای پلی وینیلیدین فلوراید منتقل شد. پس از انسداد آنتی ژن، غشا را در یک آنتی بادی اولیه رقیق شده 1:1000 به مدت 16 ساعت در دمای 4 درجه انکوبه کردیم، سپس غشا را با PBST شستیم و در آنتی بادی ثانویه 1:{22}} فلورسنت رقیق شده به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه کردیم. . شدت فلورسانس با استفاده از یک سیستم تصویربرداری Odyssey CLx (LI-COR) شناسایی شد. ایمونوفلورسانس با استفاده از کیت رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس (الکسا فلور) انجام شد.

488) با رقت 1:100 آنتی بادی اولیه.

2.10|اندازه گیری آپوپتوز سلولی

سلول‌ها در ظرف‌های پتری {0}} میلی‌متری کشت داده شدند و با غلظت‌های مختلف (0، 20، 40 و 80 میکروگرم در میلی‌لیتر) CDP به مدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند و H2O2 اضافه شد. غلظت نهایی: 500 میکرومتر برای HEM ها، 1.0 میلی متر برای سلول های B16F10) در هر چاهک و 24 ساعت دیگر انکوبه شد. ما همچنین گروه های تحت درمان با CDP و NC را راه اندازی کردیم. پس از درمان، سلول ها را با تریپسین بدون EDTA هضم کردیم و در لوله ها جمع آوری کردیم، سپس سلول ها را دو بار با PBS شستیم و مجدداً در 100 میکرولیتر PBS معلق کردیم. سلول ها با کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC مطابق پروتکل رنگ آمیزی شدند و با فلوسیتومتری (FCM) شناسایی شدند. برای تجزیه و تحلیل میزان آپوپتوز از نرم افزار FlowJo استفاده شد.

2.11| اندازه گیری ROS داخل سلولی

سلول‌ها در {0}}پلیت‌های چاهک کشت داده شدند و با غلظت‌های مختلف (0، 20، 40 و 80 میکروگرم در میلی‌لیتر) CDP به مدت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند و H2O2 (غلظت نهایی: 500) به آن اضافه شد. میکرومتر برای HEM ها،

1.0 میلی‌متر برای سلول‌های B16F10) به هر چاهک، آنها را برای چاه دیگری انکوبه کنید.

24 ساعت و راه اندازی گروه های تحت درمان با CDP و NC. پس از درمان، سلول ها را دو بار با PBS شستیم تا تمام محیط و FBS حذف شود، سپس پروب DCFH-DA را با محیط تا 1:1000 رقیق کردیم و به هر چاهک اضافه کردیم. سلول ها را در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه کردیم و سه بار با محیط بدون سرم شستیم. ما از یک استفاده کردیم

میکروسکوپ فلورسانس معکوس برای مشاهده و ثبت فلورسانس، سپس از ImageJ برای اندازه گیری شدت فلورسانس استفاده کرد.

2.12|آمار و تجزیه و تحلیل

داده های این کار به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شده است و تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از GraphPad Prism (نسخه 7.0) یا SPSS (نسخه 22.{3}}) و Student's انجام شد. برای مقایسه چند گروهی از آزمون t یا آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) استفاده شد. مقدار خاکستری نوارهای پروتئین WB با GAPDH یا -اکتین استاندارد شد. مقادیر P <.05 معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="" شد.="" تمام="" آزمایشات="" حداقل="" سه="" بار="" تکرار="">

3|نتایج

3.1|CDP ملانوژنز را در سلول های HEM و B16F10 القا کرد

قبل از شروع، ما از روش MTT برای بررسی سمیت سلولی بالقوه CDP بر روی سلول‌های HEM و ملانوم B16F1 موش استفاده کردیم. سلول ها با CDP در غلظت های مختلف به مدت 24، 48 یا 72 ساعت تیمار شدند. آزمایش زنده ماندن HEM نشان داد که وقتی غلظت‌ها کمتر از 32{28}} میکروگرم در میلی‌لیتر بود، CDP هیچ تأثیری بر زنده‌مانی سلول نداشت. با این حال، زنده ماندن به طور قابل توجهی کاهش یافت زیرا غلظت به 320 میکروگرم در میلی لیتر در 24، 48 و 72 ساعت رسید (P <.05؛ شکل="" 1a).="" زنده‌مانی="" سلول‌های="" b16f10="" نیز="" در="" ساعت‌های="" 48="" و="" 72="" کاهش="" یافت="" که="" cdp="" به="" ug/ml="" 320="" رسید="" (01/0="" p=""><) اما="" در="" غلظت‌های="" پایین‌تر="" تغییری="" مشاهده="" نشد="" (شکل="" 1b).="" سپس="" نقش="" cdp="" را="" در="" ملانوژنز="" بررسی="" کردیم="" و="" اثرات="" آن="" را="" با="" هورمون="" محرک="" ملانوسیت="" (-msh؛="" غلظت:="" 20،="" 100="" و="" 400="" نانومتر)="" و="" dmso="" (0.1="" درصد)="" در="" hems="" مقایسه="" کردیم.="" نتایج="" رنگ‌آمیزی="" ملانین،="" فعالیت="" تیروزیناز="" و="" سنجش="" محتوای="" ملانین="" نشان="" داد="" که="" cdp="" برای="" ارتقای="" ملانوژنز="" با="" -msh="" قابل="" مقایسه="" است،="" در="" حالی="" که="" درمان="" 0.1="" درصد="" dmso="" هیچ="" تفاوتی="" ایجاد="" نمی‌کند="" (شکل="">

بر این اساس اکتشاف خود را بیشتر اصلاح کردیم. HEM ها با CDP در غلظت های مختلف (20، 40 و 80 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 48 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سنجش‌های رنگ‌آمیزی ملانین، محتوای ملانین و فعالیت تیروزیناز انجام شد و همه افزایش‌های قابل‌توجهی پس از درمان CDP به روشی وابسته به غلظت نشان دادند که در گروه 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر به اوج خود رسید (P <0.05، شکل="" 2a-c)="" .="" سپس="" سطوح="" mrna="" و="" پروتئین="" ژن‌های="" مرتبط="" با="" ملانوژنز="" (mitf،="" tyr،="" trp1،="" trp2،="" rab27a="" و="" fscn1)="" را="" اندازه‌گیری="" کردیم.="" cdp="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" سطوح="" mrna="" این="" ژن="" ها="" را="" در="" hem="" ها="" افزایش="" داد="" (p=""><.05؛ شکل="" s2a).="" علاوه="" بر="" این،="" سطح="" پروتئین‌های="" mitf،="" tyr،="" trp1،="" و="" rab27a="" افزایش="" یافت،="" همانطور="" که="" نسبت="" mitf="" فسفریله="" شده="" به="" کل="" mitf="" افزایش="" یافت="" (0.05="" p=""><)، در="" حالی="" که="" trp2="" و="" fscn1="" تفاوتی="" را="" نشان="" ندادند="" (شکل="" 2d،="" e).="" نتایج="" نشان="" داد="" که="" cdp="" می‌تواند="" ملانوژنز="" را="" ارتقا="" دهد="" و="" بیان="" ژن‌های="" مرتبط="" با="" ملانوژنز="" را="" در="" ملانوسیت‌های="" انسانی="" تنظیم="">

علاوه بر این، مجدداً اثرات CDP را با سلول‌های B16F10 تأیید کردیم و دریافتیم که محتوای ملانین سلول‌های B16F10 به طور قابل‌توجهی افزایش یافته است (P <.01؛ شکل="" s2b).="" علاوه="" بر="" این،="" cdp="" به="" طور="" قابل="">

3.2|CDP ملانوژنز را در گورخرماهی ترویج کرد

برای بررسی اینکه آیا CDP می تواند ترویج کند یا خیرملانوژنزدر داخل بدن از جنین گورخرماهی استفاده کردیم. جنین های گورخرماهی به چهار گروه تقسیم شدند و به طور مداوم با محیط به تنهایی (NC) یا CDP در غلظت های مختلف (20، 40 و 80 میکروگرم بر میلی لیتر) تیمار شدند. تراکم و توزیع گرانول ملانین هر روز مشاهده و ثبت شد. با رشد جنین گورخرماهی، متوجه شدیم که تراکم ملانین به تدریج در سر و دم افزایش می یابد. در روز سوم، تفاوت‌های بین گروهی قابل تشخیص بود و این تفاوت همچنان افزایش می‌یابد تا اینکه آزمایش را در روز ششم به پایان رساندیم (شکل 3A). ما از Image J برای اندازه گیری تراکم ملانین در دم گورخرماهی استفاده کردیم. چگالی ملانین در گروه های تحت درمان با CDP به طور قابل توجهی بیشتر از گروه کنترل بود (P<0.05؛ شکل="">

3.3|CDP مسیر سیگنال MAPK را در سلول های HEM و B16F10 فعال کرد

برای آشکار ساختن مکانیسم هایی که توسط آن CDP ترویج می شودملانوژنزما HEM ها را با CDP در غلظت های مختلف (20، 40 و

80 ug/mL) به مدت 48 ساعت و سپس سطوح فسفریله و کل پروتئین های ERK، JNK و p38 در مسیر سیگنالینگ MAPK بررسی شد. همانطور که توسط وسترن بلات اندازه گیری شد، سطوح p-ERK، p-JNK، و p-p38 پس از درمان CDP افزایش یافت (0.05 < p)،="" در="" حالی="" که="" سطح="" کل="" آنها="" تغییر="" نکرد="" (شکل="" 4a،="" b).="" آزمایش‌ها="" با="" سلول‌های="" b16f10="" تکرار="" شد="" و="" سطوح="" فسفریله="" پروتئین‌های="" erk،="" jnk="" و="" p38="" افزایش="" یافت="" (05/0="">P)، اما سطوح MAPK کل تغییر نکرد (شکل 4C، D)، مطابق با نتایج در HEMs .

3.4|ناشی از H2O{3}}تضعیف CDP

سمیت سلولی و آپوپتوز در سلول های HEM و B16F10

ما از H2O2 برای شبیه سازی استفاده کردیماسترس اکسیداتیومحیط زیست و نقش CDP در ملانوسیت ها را بیشتر مورد بررسی قرار داداسترس اکسیداتیو. غلظت نهایی H2O2 مورد استفاده در HEM ها 500 میکرومتر بود، در حالی که در سلول های B16F10 1.0 میلی متر بود. برای بررسی اثر CDP بر سمیت سلولی ناشی از H2O، سلول‌های HEM و B16F10 را با CDP در غلظت‌های مختلف (20، 40 و 80 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت پیش تیمار کردیم، سپس H2O2 اضافه کردیم و به درمان ادامه دادیم. به مدت 24 ساعت قبل از انجام مشاهده و سنجش MTT.

H2O2 باعث ایجاد حباب ظاهری غشاء و انقباض سلولی در HEMها شد، در گروه‌های تحت درمان با CDP، وضعیت کاهش یافت. درمان با CDP به تنهایی هیچ تاثیری نداشت (شکل 5A). سنجش MTT نتیجه مشابهی را نشان داد که درمان H2O2 باعث کاهش زنده ماندن HEM شد، در حالی که CDP به طور قابل توجهی این تأثیر مضر را بهبود بخشید.

3.5|ROS درون سلولی ناشی از H2O{3}}در سلول‌های HEM و B16F10 حذف شده توسط CDP

برای بررسی مکانیسم‌های CDP برای کاهش سمیت سلولی و آپوپتوز ناشی از H2O، ما ROS داخل سلولی را در سلول‌های HEM و B16F10 با استفاده از فلورسانس DCFH-DA شناسایی کردیم.

4|بحث و نتایج

در این مطالعه، ما نقش CDP را در سلول‌های HEM و B16F10 بررسی کردیم. برای اولین بار، متوجه شدیم که CDP می تواند تبلیغ کندملانوژنزدر ملانوسیت ها و افزایش رنگدانه در گورخرماهی. آزمایش بعدی نشان داد که مسیر سیگنالینگ MAPK تحت درمان CDP فعال شد. ما نقش آن را بیشتر بررسی کردیماسترس اکسیداتیوو دریافت که CDP می تواند سمیت سلولی و آپوپتوز ناشی از H2O2- را در ملانوسیت ها کاهش دهد. در همین حال، CDP می‌تواند مسیر آنتی‌اکسیدانی NRF2/HO{3}} را فعال کند و ROS درون سلولی را تحت تأثیر قرار دهد.استرس اکسیداتیوشرایط

پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن یک مسیر حیاتی است که در تنظیم MITF، یک فاکتور رونویسی کلیدی که بیانملانوژنزژن‌های مرتبط و متعاقباً بر سنتز و انتقال ملانین تأثیر می‌گذارد. 26،27 در مطالعه ما، فعال‌سازی ERK، JNK و p38 در ملانوسیت‌ها پس از درمان CDP به‌طور قابل‌توجهی افزایش یافت. در همین حال، عبارات MITF/p-MITF و TYR، TRP1، TRP2 و RAB27A مبتنی بر MITF

بر این اساس تنظیم شدند. بنابراین، ما پیشنهاد می کنیم که CDP می تواند

ترویجملانوژنزاز طریق فعال کردن مسیر MAPK، اما اینکه چگونه CDP MAPK ها را فعال می کند ناشناخته باقی مانده است. بر اساس مطالعات اخیر، گیرنده شبه 4 (TLR4) به میزان زیادی در ملانوسیت ها بیان می شود و در ملانوژنز نقش دارد. مطالعات گزارش کردند که LPS می تواند ملانوژنز را القا کندپلی ساکاریدهابر اساس گزارش ها، استخراج شده از گیاهان یا قارچ ها TLR ها و مسیرهای سیگنال دهی پایین دستی مانند MAPK و فاکتور هسته ای کاپا بتا (NF-κB) را فعال می کند. مسیر لینگ و ترویج می کندملانوژنز. علاوه بر این، گیرنده‌های شبه دامنه الیگومریزاسیون متصل شونده به نوکلئوتید (NLRs) شناخته شده‌اند که لیگاندهای داخل سلولی را شناسایی کرده و باعث فعال‌سازی مسیرهای سیگنالینگ MAPK و NF-kB می‌شوند. همانطور که گزارش شده است، پلی ساکاریدهای استخراج‌شده از گانودرما لوسیدوم و گون می‌توانند وارد سلول شوند. و NLRs را تحت تأثیر قرار می دهد. بنابراین، ممکن است CDP بتواند وارد ملانوسیت ها شود و مسیر سیگنال دهی MAPK را از طریق NLR ها تنظیم کند. با این حال، مطالعات بیشتری برای تأیید این فرضیه مورد نیاز است.

برخی از مطالعات تا به امروز کاربرد گیاهی را گزارش کرده اندپلی ساکاریدهادر ملانوژنز برای مهار تولید ملانین. 37،38 با این حال، در این مطالعه، CDP ملانوژنز را در

ملانوسیت ها، و این اثر پس از مقایسه با -MSH بیشتر تایید شد. CDP نیز نوعی استپلی ساکاریداستخراج شده از گیاهان، ما گمان می کنیم که اثر معکوس CDP ممکن است به تفاوت های ساختاری بین CDP و سایر موارد مرتبط باشد.پلی ساکاریدها. پلی ساکاریدها از پلیمریزاسیون مونوساکاریدها تشکیل می شوند، اما از نظر نوع مونوساکارید، ترکیب مونو ساکارید، پیوند گلیکوزیدی، ساختار زنجیره جانبی و وزن مولکولی متغیر هستند. تصور می‌شود که این عوامل عملکردهای بیولوژیکی آنها را تعیین می‌کنند. مطالعات موجود ساختار CDP را پیشنهاد کرده‌اند و پیشنهاد کرده‌اند که ساختار CDP متعاقباً بر عملکرد آن تأثیر می‌گذارد.

ملانوژنز یک مکانیسم حفاظتی مهم برای مقاومت است

آسیب اشعه ماوراء بنفش و حفظ هموستاز بدن43. در همان

زمان، ملانوسیت ها به راحتی در معرض محیط های نامطلوب مانند اضافه بار ROS قرار می گیرند. شناخته شده است که ROS در ترویج مشارکت دارد.ملانوژنزیکی از مکانیسم ها فعال کردن MAPK ها است.44 اما مطالعات همچنین نشان داد که این اثر فقط در یک سطح ROS خاص وجود دارد، در حالی که اضافه بار ROS به طور قابل توجهی ملانوژنز را مختل می کند. تعادل بین سیستم های پرو و ​​آنتی اکسیدان به وضوح مهم است. در بیماری های رنگدانه مانند ویتیلیگو، یک سیستم آنتی اکسیدانی نامتعادل و اضافه بار غیرقابل کنترل ROS به ملانوسیت ها آسیب می رساند و زنده ماندن سلولی را کاهش می دهد. H2O2 نسبت به سلول های B16F10. هنگامی که ملانوسیت ها تحت درمان H2O2 قرار گرفتند، زنده ماندن و سرعت آپوپتوز آنها بدتر شد، اما

پیش تیمار CDP می تواند تا حدی روند را معکوس کند. در همان زمان، ROS پاکسازی شد. همانطور که گزارش شد، فعال‌سازی مسیر آنتی‌اکسیداسیون NRF2/ARE یک روش اصلی برای مهار ROS در سلول‌های پوست است. در آزمایش‌های ما، سطح پروتئین NRF2 و HO{3}} در ملانوسیت‌ها پس از درمان H2O2 بدون CDP تنظیم شد. این بدان معناست که H2O2-القا شده استاسترس اکسیداتیومی تواند مسیر NRF2/HO{1}} را فعال کند، اما برای حفظ تعادل اکسیداسیون و کاهش و محافظت از سلول در برابر آسیب کافی نیست. با این حال، پیش تیمار CDP مسیر آنتی اکسیدانی NRF2/HO{3}} را افزایش داد و تعادل را بازیابی کرد. بنابراین، ما پیشنهاد می‌کنیم که CDP می‌تواند ملانوسیت‌ها را از طریق فعال کردن مسیر آنتی‌اکسیداسیون NRF2/HO{5}} و حذف ROS از آسیب‌های استرس اکسیداتیو محافظت کند.

ما دریافتیم که درمان CDP به تنهایی تأثیری بر ROS یا NRF2/HO{1}} در ملانوسیت ها ندارد. این نتیجه نشان می‌دهد که CDP می‌تواند بر تعادل ردوکس تحت استرس اکسیداتیو تأثیر بگذارد، اما نه در شرایط عادی. علاوه بر این، مسیر آنتی‌اکسیداسیون NRF2/HO{3}} طبق گزارش‌ها توسط مسیرهای سیگنالینگ PI3K، NF-kB، و MAPK تنظیم می‌شود. در مطالعه ما، CDP توانست مسیر سیگنالینگ MAPK را فعال کند. این امکان وجود دارد که CDP بتواند مسیر NRF2/HO-1 را از طریق MAPKهای تنظیم کننده بالا فعال کند. همانطور که اسلومینسکی گزارش کرد، ملانوسیت ها حسگرهای استرس هستند که در یک شبکه تنظیمی دخیل هستند و عملکرد آنها می تواند به سرعت در پاسخ به محیط تغییر کند. سیستم در شرایط عادی، اما تعادل اکسیداسیون و کاهش را در زیر بازگردانداسترس اکسیداتیوشرایط بنابراین، عملکرد ملانوسیت و بقا را می توان به دو روش مختلف توسط CDP حفظ کرد. CDP به ملانوسیت ها کمک می کند تا هموستاز را حفظ کنند، که این نیز یک عملکرد مهم ملانوژنز است.50،51

در نتیجه، CDP می تواند ارتقاء دهدملانوژنزاز ملانوسیت ها

از طریق فعال کردن مسیر سیگنالینگ MAPK. CDP می‌تواند بقای ملانوسیت‌ها را از طریق فعال کردن مسیر آنتی‌اکسیدانی NRF2/HO{1} و حذف ROS داخل سلولی تحت شرایط استرس اکسیداتیو بهبود بخشد. یافته‌های ما معنادار هستند زیرا نشان می‌دهند که CDP می‌تواند هر دو را ارتقا دهدملانوژنزو از ملانوسیت ها محافظت می کنداسترس اکسیداتیوآسیب، که احتمالاً مسئول اختلال عملکرد و از دست دادن ملانوسیت است. یافته‌های این مطالعه نشان می‌دهد که CDP می‌تواند یک داروی جدید در درمان بیماری‌های دپیگمانتاسیون باشد.

قدردانی

این کار توسط بنیاد ملی علوم طبیعی چین (شماره 81703101)، پروژه‌های استعدادهای جدید شیانگیا از بیمارستان سوم شیانگیا دانشگاه مرکزی جنوبی (شماره JY201623 و شماره 20170301)، بنیاد علوم طبیعی استان هونان ( شماره 2018JJ3788 و شماره 2018JJ3793) و پروژه کمیسیون بهداشت هونان (شماره C2019173). دکتر ییبو هو بخش اصلی مطالعه را انجام داد و نسخه خطی را نوشت. پروفسور جینگ چن و چینگهای زنگ مطالعه را طراحی کردند و نگارش نسخه خطی را هدایت کردند. پروفسور Jinhua Huang، Lihua Huang و Hong Xiang پشتیبانی فنی ارائه کردند و داده ها را تجزیه و تحلیل کردند. دکتر Yixiao Li، Ling Jiang، Yujie Ouyang، Yumeng Li، Lun Yang و Xiaojiao Zhao در بخشی از آزمایشات مشارکت داشتند.

تضاد منافع

نویسندگان تأیید می کنند که هیچ تضاد منافع وجود ندارد.

بیانیه در دسترس بودن داده ها

داده‌هایی که یافته‌های این مطالعه را پشتیبانی می‌کنند، در صورت درخواست معقول از نویسنده مسئول در دسترس هستند.

منابع

1. Bleuel R، Eberlein B. مدیریت درمانی ویتیلیگو. J Dtsch Dermatol Ges. 2018؛ 16: 1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. آیا باید مداخلات روانشناختی را در مدیریت ویتیلیگو در اولویت قرار دهیم؟ J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018؛ 32: 2053-2054.

3. Picardo M, Dell'Anna ML, Ezzedine K, et al. ویتیلیگو پرایمرهای Nat Rev Dis. 2015؛ 1:15011.

4. Slominski A، Tobin DJ، Shibahara S، Wortsman J. رنگدانه ملانین در پوست پستانداران و تنظیم هورمونی آن. Physiol Rev. 2004؛ 84:1155-1228.

5. Slominski A، Zmijewski MA، Pawelek J. L-tyrosine و L-dihydroxyphenylalanine به عنوان تنظیم کننده های هورمون مانند عملکرد ملانوسیت. پیگمنت سل ملانوم Res. 2012؛ 25: 14-27.

6. Spritz RA. روابط ژنتیکی مشترک زمینه ساز ویتیلیگوی عمومی و بیماری خودایمنی تیروئید. تیروئید. 2010؛ 20: 745-754.

7. Lin X، Tang LY، Fu WW، Kang KF. ویتیلیگوی دوران کودکی در چین: پروفایل های بالینی و یافته های ایمونولوژیک در 620 مورد. درماتول جی کلین هستم. 2011؛ ​​12: 277-281.

8. Boehncke WH، Brembilla NC. لنفوسیت های T خود واکنشی در بیماری های التهابی پوست. جلو ایمونول. 2019؛ 10:1198.

9. Iannella G، Greco A، Didona D، و همکاران. ویتیلیگو: پاتوژنز، انواع بالینی و رویکردهای درمانی. Autoimmun Rev. 2016; 15:335-343.

10. Forrester SJ، Kikuchi DS، Hernandes MS، و همکاران. گونه های فعال اکسیژن در سیگنال دهی متابولیک و التهابی Circ Res. 2018؛ 122: 877-902.

11. Denat L، Kadekaro AL، Marrot L، و همکاران. ملانوسیت ها به عنوان محرک ها و قربانیان استرس اکسیداتیو. J Invest Dermatol. 2014؛ 134: 1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Oxidative stress and vitiligo: the Nrf2-ARE

اتصال سیگنالینگ J Invest Dermatol. 2014؛ 134: 2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. شبکه تنظیمی Nrf2 یک رابط بین اکسیداسیون و کاهش و متابولیسم واسطه را فراهم می کند. Trends Biochem Sci. 2014؛ 39: 199-218.

14. Marrot L، Jones C، Perez P، Meunier JR. اهمیت Nrf2

مسیر در پاسخ استرس اکسیداتیو (عکس) در ملانوسیت ها و کراتینوسیت های اپیدرم انسان پیگمنت سل ملانوم Res. 2008؛ 21: 79-88.

15. van Geel N، Speeckaert R، Mollet I، و همکاران. مدل القاء و درمان ویتیلیگو در داخل بدن: یک کارآزمایی بالینی تصادفی دوسوکور. پیگمنت سل ملانوم Res. 2012؛ 25: 57-65.

16. Nicolaidou E, Antoniou C, Stratigos A, Katsambas AD. فتوتراپی فرابنفش باند باریک B و لیزر اگزایمر 308- نانومتری در درمان ویتیلیگو: مروری. جی ام آکاد درماتول. 2009؛ 60: 470-477.

17. Novak Z، Bonis B، Baltas E، و همکاران. لیزر فرابنفش B زنون کلراید

در درمان پسوریازیس و در القای آپوپتوز سلول T موثرتر از اشعه ماوراء بنفش با باند باریک B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002؛ 67: 32-38.

18. Xu P، Su S، Tan C، و همکاران. اثرات عصاره های آبی Eclipse herba، Polygoni multiflora radix preparator و Rehmanniae radix preparator بر ملانوژنز و مهاجرت ملانوسیت های انسانی. جی اتنوفارماکول. 2017؛ 195: 89-95.

19. وانگ تی، ژانگ ایکس، زی دبلیو.Cistanche deserticolaYC Ma، "Desertginseng": یک بررسی. ام جی چین مد. 2012؛ 40: 1123-1141.

20. Guo Y، Cao L، Zhao Q، و همکاران. خصوصیات اولیه، فعالیت آنتی اکسیدانی و محافظ کبدیپلی ساکاریداز جانبCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016؛ 93: 678-685.

21. Cai RL، Yang MH، Shi Y، و همکاران. فعالیت ضد خستگی عصاره غنی از فنیل اتانوئید ازCistanche deserticola. Phytother Res. 2010؛ 24: 313-315.

22. Zhang H، Xiang Z، Duan X، و همکاران. اثرات ضد توموری و ضد التهابی الیگوساکاریدها ازCistanche deserticolaعصاره در مورد آسیب نخاعی Int J Biol Macromol. 2019؛ 124: 360-367.

23. لیو یو، وانگ اچ، یانگ ام، و همکاران.Cistanche deserticola پلی ساکاریدهامحافظت از سلول های PC12 در برابر آسیب های ناشی از OGD/RP. Biomed Pharmacother. 2018؛ 99: 671-680.

24. آهنگ D، Cao Z، Liu Z، و همکاران.Cistanche deserticola پلی ساکاریداز طریق مهار سیگنال دهی RANKL و تولید گونه های اکسیژن فعال، استئوکلاستوژنز و تحلیل استخوان را کاهش می دهد. J Cell Physiol. 2018؛ 233: 9674-9684.

25. فو سی، چن جی، لو جی، و همکاران. کاهش TUG1 باعث افزایش ملانوژنز و ملانوژنز ناشی از UVB می شود. Exp Dermatol. 2019؛ 28: 730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. یک برنامه دودمان ملانوسیت به مهار مسیر MAP کیناز مقاومت می کند. طبیعت. 2013؛ 504: 138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "فیزیولوژی رونویسی" تشکیل رنگدانه در ملانوسیت ها: نقش مرکزی MITF. Exp Dermatol. 2010؛ 19: 617-627.

28. یو ان، ژانگ اس، زو اف، و همکاران. ملانوسیت‌های انسانی کشت‌شده گیرنده‌های عملکردی شبه 2-4، 7 و 9 را بیان می‌کنند. J Dermatol Sci. 2009؛ 56: 113-120.

29. Ahn JH، Park TJ، Jin SH، Kang HY. ملانوسیت های انسانی گیرنده Toll مانند عملکردی را بیان می کنند. Exp Dermatol. 2008؛ 17: 412-417.

30. رید اس جی، کارتر دی، کاسپر سی، و همکاران. همبستگی فعالیت های کمکی خانواده GLA. سمین ایمونول. 2018؛ 39: 22-29.

31. Guo MZ، Meng M، Feng CC، و همکاران. رمانپلی ساکاریدبه‌دست‌آمده از Craterellus cornucopioides فعالیت تعدیل‌کننده ایمنی را در مدل‌های موش سرکوب‌کننده سیستم ایمنی از طریق تنظیم مسیر TLR4-NF-kappaB افزایش می‌دهد. عملکرد غذا 2019؛ 10 (8): 4792-4801.

32. Wei W، Xiao HT، Bao WR، و همکاران. TLR{1}} ممکن است مسیرهای سیگنالینگ گون را واسطه کندپلی ساکاریدRAP بیان سیتوکین سلول های RAW264.7 را القا کرد. جی اتنوفارماکول. 2016؛ 179: 243-252.

33. چن اچ، یانگ دی، هان اف، و همکاران. عامل باکتریایی T6SS EvpP با مهار مسیر MAPK-Jnk وابسته به Ca(2 plus) از فعال شدن التهاب NLRP3 جلوگیری می کند. میکروب میزبان سلولی 2017؛ 21: 47-58.

34. Levy M، Shapiro H، Thaiss CA، Elinav E. NLRP6: یک حسگر ایمنی چندوجهی در Nate. Trends Immunol. 2017؛ 38: 248-260.

35. Chen YS، Chen QZ، Wang ZJ، Hua C. اثرات ضد التهابی و محافظتی کبدی گانودرما لوسیدومپلی ساکاریدهادر برابر آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن در موش کونمینگ فارماکولوژی. 2019؛ 103: 143-150.

36. Tian Z، Liu Y، Yang B، و همکاران. گونپلی ساکاریدکولیت موش را از طریق مهار التهاب NLRP3 کاهش می دهد. Planta Med. 2017؛ 83: 70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J, et al. گانودرما لوسیدومپلی ساکاریدبا مهار اثرات پاراکرین کراتینوسیت ها و فیبروبلاست ها از طریق مسیر IL-6/STAT3/FGF2، ملانوژنز را کاهش می دهد. J Cell Physiol. 2019؛ 234: 22799-22808.

38. Cai ZN، Li W، Mehmood S، و همکاران. اثرپلی ساکاریدFMP{0}} از Morchella esculenta در مورد ملانوژنز در سلول‌های B16F10 و گورخرماهی. عملکرد غذا 2018؛ 9: 5007-5015.

39. Zhang C، Li Z، Zhang CY، و همکاران. ویژگی های مولکولی، و زیست فعالیپلی ساکاریدهااز یونجه (Medicago sativa L.). مواد مغذی. 2019؛ 11:1181.

40. Coconi Linares N, Di Falco M, Benoit-Gelber I, et al. وجود اجزای کمیاب به طور قابل توجهی پاسخ مولکولی آسپرژیلوس نایجر به صمغ گوار را گسترش می دهد. بیوتکنول جدید 2019؛ 51: 57-66.

41. Ma H، Zhang K، Jiang Q، و همکاران. خصوصیات گیاهپلی ساکاریدهااز Dendrobium officinale با تکنیک های کروماتوگرافی متعدد و طیف سنجی جرمی. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q، Yao J، Fang JN، Ding K. خصوصیات ساختاری و فعالیت ایمونولوژیکی دو قابل استخراج با آب سردپلی ساکاریدهااز جانبCistanche deserticolaYC Ma. کربوهیدرات Res. 2007؛ 342: 1343-1349.

43. Slominski AT، Zmijewski MA، Plonka PM، و همکاران. چگونه اشعه ماوراء بنفش مغز و سیستم غدد درون ریز را از طریق پوست لمس می کند و چرا؟ غدد درون ریز. 2018؛ 159: 1992-2007.

44. Schalke S. داده های جدید در مورد اختلالات هایپرپیگمانتاسیون. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017; 31 (ضمیمه 5): 18-21.

45. گلسمن اس جی. ویتیلیگو، گونه های فعال اکسیژن و سلول های T. Clin Sci. 2011؛ ​​120: 99-120.

46. ​​Ristow M. کشف حقیقت در مورد آنتی اکسیدان ها: mitohormesis مزایای سلامتی ناشی از ROS را توضیح می دهد. نات مد. 2014؛ 20: 709-711.

47. Balogun E، Hoque M، Gong P، و همکاران. کورکومین از طریق تنظیم Nrf2 و عنصر پاسخ دهنده به آنتی اکسیدان، ژن هم اکسیژناز-1 را فعال می کند. Biochem J. 2003; 371:887-895.

48. Paine A، Eiz-Vesper B، Blasczyk R، Immenschuh S. سیگنالینگ به

هم اکسیژناز-1 و پتانسیل درمانی ضد التهابی آن.

بیوشیم فارماکول. 2010؛ 80: 1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Melanocytes به عنوان سلول های "حسی" و تنظیم کننده در اپیدرم. جی تئور بیول. 1993؛ 164: 103-120.

50. Slominski RM، Zmijewski MA، Slominski AT. نقش رنگدانه ملانین در ملانوما Exp Dermatol. 2015؛ 24: 258-259.

51. اسلومینسکی A، کیم تی کی، بروزینا AA، و همکاران. نقش ملانوژنز در تنظیم رفتار ملانوما: ملانوژنز منجر به تحریک بیان آلفا و مسیرهای همراه وابسته به HIF می شود. Arch Biochem Biophys. 2014؛ 563: 79-93.