نحوه بیان در کلیه و مجاری ادراری انسان توسط دیفنسین انسان 5

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

جان دیوید اسپنسر و همکاران

خلاصه

زمینه:مکانیسم های حفظ عقیمی در دستگاه ادراری به طور کامل شناخته نشده است. مطالعات اخیر اهمیت پپتیدهای ضد میکروبی (AMP) را در محافظت از دستگاه ادراری در برابر عفونت نشان داده اند. در اینجا، بیان و ارتباط AMP انسانی آلفا-دفنسین 5 (HD5) را در انسان مشخص می‌کنیم.کلیهو مجاری ادراری در افراد سالم و عفونی.

روش شناسی / یافته های اصلی:استفاده از RNA جدا شده از انسانکلیه، حالب و بافت مثانه، ما PCR کمی را در زمان واقعی انجام دادیم تا نشان دهیم که DEFA5، ژن کد کننده HD5، به طور اساسی در سراسر دستگاه ادراری بیان می شود. با پیلونفریت، بیان DEFA5 به طور قابل توجهی افزایش یافتکلیه. با استفاده از تجزیه و تحلیل immunoblot، تولید HD5 نیز با پیلونفریت افزایش یافت. ایمونوهیستوشیمی HD5 موضعی به یوروتلیوم مثانه و حالب. در کلیه، HD5 در درجه اول در نفرون دیستال و لوله های جمع کننده تولید می شود. با استفاده از روش‌های ایمونوبلات و الایزا، HD5 به طور معمول در نمونه‌های ادرار غیر آلوده انسان تشخیص داده نشد، در حالی که تولید HD5 ادراری با عفونت دستگاه ادراری E.coli افزایش یافت.

نتیجه گیری/اهمیت:DEFA5 در سراسر دستگاه ادراری در افراد غیر آلوده بیان می شود. به طور خاص، HD5 در سرتاسر یوروتلیوم دستگاه ادراری تحتانی و در لوله های جمع کننده دستگاه ادراری بیان می شود.کلیه. با عفونت، بیان HD5 در بدن افزایش می یابدکلیهو سطح آن در ادرار قابل تشخیص است. طبق دانش ما، یافته‌های ما اولین موردی است که بیان و تولید HD5 را در کلیه انسان اندازه‌گیری می‌کند. علاوه بر این، این اولین گزارش برای تشخیص وجود HD5 در نمونه‌های ادرار آلوده است. نتایج ما نشان می دهد که HD5 ممکن است نقش مهمی در حفظ عقیمی دستگاه ادراری داشته باشد.

Cistanche UK برای بیماری کلیوی، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

مقدمه

مجاری ادراری، جدای از مجرای ادرار، با وجود مجاورت با فلور مدفوعی، معمولاً عقیم است. مکانیسم های دقیقی که توسط آن دستگاه ادراری عقیمی خود را حفظ می کند به خوبی شناخته نشده است. مکانیسم‌های پیشنهادی که به دفاع از دستگاه ادراری کمک می‌کنند شامل جریان ادرار، تغییر در pH و اسمولاریته ادرار، تخلیه منظم مثانه، اجزای شیمیایی دفاعی اورواپیتلیوم، و ریزش/هجوم سلول‌های ایمنی مؤثر با تحریک باکتریایی اپیتلیال می‌شود [1]. علاوه بر این، اخیراً نشان داده شده است که پپتیدهای ضد میکروبی (AMPs) نقش مهمی در حفظ عقیمی دستگاه ادراری دارند [2].AMPs که به عنوان آنتی بیوتیک طبیعی تولید شده توسط تقریباً همه ارگانیسم ها عمل می کنند، جزء همه جا حاضر سیستم ایمنی ذاتی هستند. AMP ها مولکول های کاتیونی هستند که توسط سلول های سفید فاگوسیتی و سلول های اپیتلیال بیان می شوند. در انسان و سایر پستانداران، دفنسین ها خانواده اصلی AMP ها هستند. دیفنسین ها معمولاً دارای فعالیت ضد میکروبی وسیع الطیف علیه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، ویروس ها، قارچ ها و تک یاخته ها هستند [2،3]. دفنسین ها در ابتدا به عنوان پیش پروتئین سنتز می شوند و تحت پردازش قرار می گیرند تا به پپتیدهای بالغ و فعال بیولوژیکی تبدیل شوند [4]. در انسان، دفنسین ها بسته به الگوی پل زدن دی سولفیدی به یکی از دو خانواده طبقه بندی می شوند - آلفا-دفنسین ها یا بتا-دفنسین ها [5].

در دستگاه ادراری، بتا-دفنسین ها به طور گسترده در سراسر اورواپیتلیوم بیان می شوند. سلول های اپیتلیال پوششکلیهحلقه هنله، توبول دیستال و مجرای جمع‌آوری بتا-دفنسین 1 انسانی (hBD1) را بیان می‌کنند. اگرچه سطوح ادراری hBD1 برای کشتن باکتری‌های مهاجم کافی نیست، hBD1 یک پوشش ضد میکروبی سریع الاثر از لومن‌های لوله‌ای ایجاد می‌کند و با مهار اتصال باکتری به یوروتلیوم از عفونت جلوگیری می‌کند [6]. مطالعات اخیر نشان می دهد که حالت ردوکس hBD1 به طور قابل توجهی بر قدرت ضد میکروبی تأثیر می گذارد، به طوری که پپتید کاهش یافته بسیار قوی تر از شکل اکسید شده مرتبط با دی سولفید است [7]. اهمیت این در سطح مجرای ادرار مشخص نشده است. دفنسین دیگر، بتا-دفنسین 2 انسانی (hBD2) به طور اساسی در بافت سالم کلیه بیان نمی شود. با این حال، بیان hBD2 توسط عفونت القا می شود [8].

برخلاف بتا-دفنسین ها، نقش آلفا-دفنسین های مشتق از اپیتلیال به خوبی در دستگاه ادراری توصیف نشده است. بیان و عملکرد آلفا-دفنسین های HD5 و HD6 بیشتر در روده کوچک گزارش شده است، جایی که آنها توسط Panethcells در کریپت های روده ترشح می شوند و به تعادل میکروبیوتای روده کمک می کنند [9]. HD5 همچنین در دستگاه تناسلی مردانه و زنانه موضعی شده است، با شواهدی که حاکی از آن است که در ریشه کنی عفونت قابل القاء و مهم است [10،11،12]. HD5 ادراری در بیمارانی که تحت بازسازی مثانه ایلئوم و انحراف مجرای ادراری قرار گرفته‌اند، شناسایی شده است که به موجب آن منبع تولید HD5 عمدتاً به سلول‌های پانت روده نسبت داده می‌شود [13،14]. HD5 دارای فعالیت ضد باکتریایی در برابر باکتری‌های گرم مثبت و باکتری‌های گرم منفی رایج بیماری‌زای ادراری است [15]. HD5 همچنین دارای فعالیت ضد میکروبی در برابر ویروس های بیماری زا مانند آدنوویروس و ویروس BK است [16،17،18]. در این مطالعه، ما توصیف اولیه و کمی بیان HD5 را در انسان ارائه می دهیمکلیهو بیشتر بیان آن را در دستگاه ادراری تحتانی در هنگام عقیمی و عفونت تعریف کنید.

نتایج

mRNA DEFA5 به طور اساسی در مثانه، حالب و کلیه انسان بیان می شود

PCR کمی و زمان واقعی نشان می دهد که تمام نمونه های مثانه، حالب و کلیه آزمایش شده بدون عفونت به طور اساسی DEFA5 را بیان می کنند. بیان DEFA5 در دستگاه ادراری تحتانی به طور قابل توجهی بیشتر از دستگاه ادراری فوقانی بود (014/0= 0). در مثانه (n=4)، میانگین بیان DEFA5 4656637 رونوشت در هر 10 نانوگرم RNA بود و در حالب (n=4) میانگین بیان DEFA5 41126170 رونوشت در هر 10 ncRNA بود (شکل 1A) . در کلیه (n=6)، میانگین بیان DEFA5 29376274 رونوشت در هر 10 نانوگرم RNA بود. بیان DEFA5 به طور جداگانه در قشر کلیه، مدولا و لگن مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

بیان DEFA5 و پپتید HD5 با پیلونفریت افزایش می یابد

تجزیه و تحلیل کمی PCR در زمان واقعی انجام شده بر روی بافت های کلیه مبتلا به پیلونفریت، افزایش قابل توجهی در بیان DEFA5 در مقایسه با بافت های کلیه غیر عفونی نشان داد. با پیلونفریت (n= 6)، میانگین بیان DEFA5 به 782961052 رونوشت در هر 10 نانوگرم RNA افزایش یافت (p{9}}.019) (شکل 2A).

برای ارزیابی بیشتر این افزایش بیان با پیلونفریت، ما آنالیز ایمونوبلات را بر روی همان بافت کلیه که برای آنالیز بلادرنگ PCR استفاده شده بود، انجام دادیم تا افزایش همزمان تولید پپتید HD5 را ارزیابی کنیم (شکل 2B، پانل میانی). تجزیه و تحلیل ایمونوبلات، با استفاده از آنتی سرم پلی کلونال HD5، تولید پپتید HD5 را به طور قابل توجهی در بافت های کلیه مبتلا به پیلونفریت (n=6) در مقایسه با بافت های کلیه غیر عفونی (n=6) بیشتر نشان داد. بافت‌های کلیه غیر عفونی 0625 نانوگرم HD5/گرم وزن بافت مرطوب را بیان کردند در حالی که بافت کلیه مبتلا به پیلونفریت 600621 نانوگرم HD5/گرم وزن بافت مرطوب را بیان کرد (0001/0 p,0). لکه ها مجدداً با GAPDH کاوش شدند تا به عنوان یک کنترل بارگذاری عمل کنند (شکل 2B، پانل میانی) و یک لکه نقره نیز برای تأیید بارگیری پروتئین برابر انجام شد (شکل 2B، پانل بالایی).

پپتید HD5 در کلیه و مجاری ادراری انسان تولید می شود

ایمونوهیستوشیمی برای بومی سازی تولید HD5 در دستگاه ادراری انجام شد. ایمونوهیستوشیمی (IHC) نشان داد که رنگ‌پذیری HD5 در سرتاسر اوروتلیوم حالب و مثانه همه نمونه‌های مورد بررسی وجود دارد (n=4، شکل 3). نمونه ها (n= 6، شکل 4). ایمونوفلورسانس (IF) نشان داد که بیان HD5 در نفرون دیستال و توبول های جمع کننده بیشترین میزان را دارد (شکل 5). بینابینی و گلومرول ها رنگپذیری HD5 را نشان ندادند. رنگ آمیزی ایمنی نشان داده شده در شکل های 3، 4 و 5 با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال ضد HD5 موش (8C8) که پروپپتید HD5 را تشخیص می دهد (Abcam, Cambridge, MA) انجام شد. نتایج در هنگام استفاده از آنتی بادی ضد HD5 پلی کلونال خرگوش که پروپپتید HD5 و پپتید بالغ را تشخیص می دهد (داده ها نشان داده نشده است) مشابه بود - که نشان می دهد HD5 به عنوان پروپپتید ذخیره می شود.

با پیلونفریت، رنگ‌آمیزی HD5 به طور قابل توجهی افزایش یافت. رنگ‌پذیری HD5 در سراسر نفرون پروگزیمال، نفرون دیستال و لوله‌های جمع‌کننده افزایش یافت (شکل 4 و شکل 5). همانطور که در نمونه های غیر آلوده، گلومرول ها و بینابینی هیچ بیان HD5 همراه با عفونت را نشان ندادند. کنترل منفی هیچ رنگپذیری HD5 را نشان داد.

ادرار انسان آلوده حاوی قابل اندازه گیری است

غلظت پپتید HD5

تجزیه و تحلیل ایمونوبلات، با استفاده از آنتی سرم پلی کلونال خرگوش که پیش ساز proHD5 را شناسایی می کند و فرم های پردازش شده بیشتر، سطوح قابل اندازه گیری HD5 را در 13 نمونه از 15 نمونه ادرار آزمایش شده آلوده به اشریشیاکلی اروپاتوژنیک شناسایی کرد (شکل 6A و B). در صورت وجود، سطح HD5، نرمال شده به کراتینین ادرار، از 299.8-669.7630 نانوگرم HD5/mg ادرار کروم (110.67 ng/mL-276.67 نانوگرم در میلی لیتر)، که مربوط به 11.10-27.67 نانومول در لیتر است. نمونه‌های ادرار آلوده (n=15)، HD5 در حد تشخیص (50 نانوگرم) یا کمتر از آن بود. سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) روی همان نمونه های ادرار، با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال موش (8C8) که فقط پیش ساز proHD5 را تشخیص می دهد، سطوح قابل اندازه گیری proHD5 را در 13 مورد از 15 نمونه آلوده مورد آزمایش تشخیص داد. غلظت proHD5 ادراری در صورت وجود بین 122.78-490.060.03 نانوگرم HD5/mg ادرار کروم (30.02 نانوگرم در میلی‌لیتر تا 200.5 نانوگرم در میلی‌لیتر) بود (شکل 7).

بحث

در این مطالعه، ما مشخصات اولیه HD5 را در کلیه، حالب و مثانه انسان ارائه می‌کنیم. نشان داده شده است که HD5 یک AMP مهم است که از عفونت تهاجمی در روده جلوگیری می کند و در طول عفونت در دستگاه تناسلی تنظیم می شود[11،18،19،20،21]. نشان داده شده است که AMP های مشتق شده از اپیتلیال، مانند HD5، در حفظ عقیمی در دستگاه ادراری مهم هستند [8،22،23،24]. کمبود در این دفاع های مخاطی ذاتی ممکن است منجر به عفونت حاد و/یا مزمن شود [25،26].

نتایج کمی PCR ما در زمان واقعی نشان می‌دهد که DEFA5 به طور اساسی در کلیه‌ها، حالب‌ها و مثانه انسان بیان می‌شود. بیان DEFA5 از دستگاه ادراری فوقانی به دستگاه ادراری تحتانی افزایش می یابد - به دنبال جریان ادرار و نزدیک شدن فزاینده به نقطه تهاجم میکروبیوتا. با توجه به دانش ما، این اولین مطالعه ای است که بیان DEFA5 را در کلیه و مثانه انسان تعیین می کند. اخیراً تاونز و همکاران نشان دادند که حالب دیستال طبیعی می تواند DEFA5 را بیان کند [14]. نتایج ما همچنین نشان می دهد که DEFA5 به طور اساسی توسط حالب دیستال بیان می شود. اگرچه بیان DEFA5 در دستگاه ادراری تقریباً 100-برابر کمتر از آنچه در بافت‌های دستگاه گوارش یافت می‌شود، بیان اوروپیتلیال پایه DEFA5 با بیان تقویت‌کننده‌های مسیر ادراری که قبلاً توضیح داده شده است مانند cathelicidin، hBD{10}}، hBD قابل مقایسه است. -2 و ریبونوکلئاز 7[6،8،22،24،27]. برخلاف دستگاه گوارش بالغ که در آن DEFA5 در سطوح بالایی در هر دو حالت سلامت و عفونت/التهاب بیان می‌شود، در زمان واقعی کمی ما داده های PCR نشان می دهد که بیان DEFA5 در کلیه به طور قابل توجهی با عفونت تنظیم می شود [27،28،29]. این الگوی القایی بیان مشابه بیان DEFA5 در دستگاه تناسلی زنان است که در آن بیان DEFA5 با سالپنژیت افزایش می‌یابد [30]. در دستگاه ادراری، تاونز و همکاران روندی به سمت بیان بیشتر حالب DEFA5 در بیماران مبتلا به عفونت ادراری که تحت انحراف مجرای ادراری قرار گرفته اند نشان داده اند [14].

تجزیه و تحلیل immunoblot ما با نشان دادن اینکه تولید پپتید HD5 با پیلونفریت افزایش می‌یابد، داده‌های PCR بلادرنگ را تکمیل می‌کند. این الگوی القایی تولید HD5 مشابه آن چیزی است که در برخی از اعضای خانواده بتا-دفنسین دیده می شود. نشان داده شده است که تولید پپتید HD5 در قسمت بالایی دستگاه تناسلی زن و مجرای ادرار مردانه همراه با التهاب افزایش می یابد [11،30].

با استفاده از رنگ آمیزی ایمنی، نشان می دهیم که HD5 به طور یکنواخت در سراسر یوروتلیوم حالب و مثانه تولید می شود. از آنجایی که اکثریت قریب به اتفاق عفونت‌های ادراری ناشی از فلور مدفوعی است که به مثانه صعود می‌کند، این نتایج نشان می‌دهد که بیان HD5 در مکان‌هایی وجود دارد که قرار گرفتن در معرض میکروبی اغلب رخ می‌دهد [33]. بنابراین، HD5 به طور ایده آل برای جلوگیری از عفونت میکروبی صعودی قرار دارد. در کلیه، HD5 در درجه اول در نفرون دیستال و لوله جمع کننده تولید می شود. این یافته‌ها نشان می‌دهد که HD5 در مکان‌هایی تولید می‌شود که در آن قرار می‌گیرد تا فعالیت ضد میکروبی بهینه داشته باشد. مطالعات قبلی نشان داده اند که خواص ضد میکروبی دیفنسین ها به غلظت نمک وابسته است - با غلظت های بالاتر نمک باعث کاهش فعالیت ضد میکروبی می شود [23،34،35]. ما حدس می زنیم که غلظت کم نمک نفرون دیستال و لوله های جمع کننده محیطی مطلوب برای فعالیت ضد میکروبی HD5 فراهم می کند.

Immunoblot و تجزیه و تحلیل ELISA همچنین نشان می دهد که HD5 در سطوح پایین در ادرار ترشح می شود. با توجه به اندازه (8.1 کیلو دالتون و 3.7 کیلو دالتون) و بار مثبت proHD5 و HD5 کاملاً پردازش شده، ممکن است که برخی از پپتید HD5 ادرار، حداقل تا حدی، از فیلتر پلاسما منشا گرفته باشند. با این حال، شواهد کمی وجود دارد که نشان دهد HD5 در پلاسما باقی می ماند [27]. علاوه بر این، برای ظاهر شدن در ادرار، HD5 باید از مکانیسم های جذب پپتید کارآمد در لوله پروگزیمال فرار کند [6،36]. در نهایت، نمونه‌های ادرار مورد استفاده قبل از انجام آزمایش‌ها تحت سانتریفیوژ قرار گرفتند و منابع سلولی HD5 حذف شدند. در غلظت‌های شناسایی‌شده، بعید است که HD5 ادرار مستقیماً علیه میکروارگانیسم‌های بیماری‌زای ادراری ضد میکروبی باشد، زیرا HD5 کاملاً فرآوری شده دارای حداقل غلظت بازدارنده (MIC) بین 6 تا 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر در برابر باکتری‌های اوروپاتوژن معمولی گرم منفی است [15]. با این حال، غلظت سطح مخاطی احتمالاً بالاتر است. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل immunoblot نشان می دهد که غلظت HD5 به طور قابل توجهی در کلیه بیشتر است. این نتایج نشان می دهد که HD5 در دفاع مخاطی دستگاه ادراری نقش دارد. یک الگوی مشابه با hBD1 دیده می شود، که در آن غلظت های ادراری hBD1 برای نشان دادن فعالیت ضد میکروبی کافی نیست اما غلظت های بالاتر پپتید در نزدیکی لوله های کلیوی تشخیص داده می شود [6،31].

از آنجا که IHC نشان می دهد که proHD5 شکل اصلی HD5 در کلیه است و از آنجا که هم بالغ و هم proHD5 در ادرار شناسایی می شوند، ما حدس می زنیم که HD5 در درجه اول به عنوان یک مولکول پیش ساز ترشح می شود و سپس تحت پردازش پروتئولیتیک قرار می گیرد تا اشکال بالغ تولید کند - شبیه به دستگاه گوارش. و مجاری ادراری تناسلی [11،30،37]. در روده کوچک، سلول‌های Paneth تریپسین تولید می‌کنند که پروپپتید HD5 را می‌شکند به طوری که پپتید کاملاً پردازش شده شکل غالب در لومن روده است [37]. در مجرای ادرار مردانه، آنزیم های کلیدی پردازش و فعال کننده HD5، پروتئازهای نوتروفیل هستند که توسط

نوتروفیل های جذب شده به محل عفونت [11]. نقش تریپسینوژن اپیتلیال، تریپسین ادرار و/یا پروتئازهای نوتروفیل در پردازش HD5 در دستگاه ادراری در طول عفونت هنوز مشخص نیست. علاوه بر این، اثرات تغییرات در محیط ادراری بر عملکرد HD5 (تغییر در اسمولاریته، pH و غلظت کاتیونی) نیز باید تعیین شود.

در نتیجه، این اولین مطالعه برای شناسایی و کمیت بیان و تولید HD5 در دستگاه ادراری است. نتایج ما نشان می دهد که HD5 یک AMP مشتق شده از اپیتلیال است که ممکن است نقش مهمی در ایمنی ذاتی اوروپیتلیوم انسانی داشته باشد و از انتقال پاتوژن های مهاجم به گردش خون جلوگیری کند. توضیح عواملی که تولید HD5 را تنظیم می کنند ممکن است بینش جدیدی در مورد پاتوژنز UTIs در بیماران در معرض خطر UTIs و بیماران مبتلا به عفونت های مزمن ارائه دهد.

مواد و روش ها

تایید مطالعه

رضایت کتبی آگاهانه از تمامی بیماران شرکت کننده در این مطالعه اخذ شد. برای افراد کمتر از 18 سال، رضایت کتبی والدین / قیم اخذ شد. هیئت بازبینی سازمانی Nationwide Children's Hospital (NCH) این مطالعه را همراه با فرآیند رضایت و اسناد (IRB07-00383) تأیید کرد.

نمونه های بافت انسانی و ادرار

بافت دیستال حالب و مثانه غیر عفونی (n= 4) از کودکانی که به دلایلی غیر از عفونت مکرر تحت کاشت مجدد حالب قرار گرفتند، تهیه شد. نمونه کلیه غیر عفونی (n=6) از بیمارانی که برای تومورهای کلیوی نفرکتومی شده بودند، تهیه شد. نمونه های بافت عاری از علائم ماکروسکوپی بیماری یا التهاب بودند. بافت کلیه بیماران مبتلا به پیلونفریت مزمن توسط شبکه بافت انسانی تعاونی (n=6) [38] ارائه شد. دو پاتولوژیست مستقل تشخیص هیستوپاتولوژیک پیلونفریت را تایید کردند. نمونه‌های بافت به‌صورت فوری منجمد شدند یا به‌عنوان بخش‌های تعبیه‌شده در پارافین ثابت با فرمالین خنثی نگهداری شدند. بخش‌هایی از بافت کلیه غیر عفونی قبل از ذخیره‌سازی در قشر، مدولا یا لگن کلیه جدا شد (n=4).

نمونه های ادرار غیر عفونی و عفونی از کودکانی که به بخش اورژانس NCH یا کلینیک نفرولوژی مراجعه می کردند، تهیه شد. بر اساس دستورالعمل آکادمی اطفال آمریکا [39]، تشخیص UTI با کشت ادرار مثبت انجام شد. تمام نمونه های ادرار آلوده دارای 106 CFU/ml E.coli بودند. مقادیر pH ادرار از 5.5 تا 8.5 (میانگین ادرار 6.9) متغیر بود. ترکیب یونی ادرار اندازه گیری نشد. نمونه های ادرار برای حذف رسوب ادرار سانتریفیوژ شدند و یک کوکتل بازدارنده پروتئاز به آن اضافه شد (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).