afزبان
صفحه اصلی / دانش / محتوای

دانش

انتقال اپیتلیال به مزانشیمی ناشی از هیپوکسی در سلول های اپیتلیال لوله ای پروگزیمال از طریق MiR-545-3p-TNFSF10

Mar 30, 2022

می چوان کو 1، وی-آن چانگ 2,3و همکاران


خلاصه:هیپوکسی به عنوان یکی از مکانیسم های پاتوفیزیولوژیک آسیب کلیه و پیشرفت بیشتر در نظر گرفته می شودنارسایی های کلیه. انتقال اپیتلیال به مزانشیمی (EMT) در لوله‌های کلیه یک فرآیند مهم فیبروز کلیه است. این مطالعه از تجزیه و تحلیل رونوشت برای بررسی EMT ناشی از هیپوکسی از طریق EMT تعدیل‌شده با microRNA (miRNA) در سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال (PTECs) استفاده کرد. توالی RNA نشان داد که هشت miRNA در PTECهایی که تحت هیپوکسی کشت داده شده بودند در مقایسه با نورموکسی تنظیم مثبت و سه miRNA کاهش یافتند. در میان 11 miRNA، miR{5}}p بالاترین بیان را در PTECهای در معرض هیپوکسی دارد، و miR{6}}p سرکوب کننده لیگاند القاکننده آپوپتوز مرتبط با فاکتور نکروز تومور (TRAIL/TNFSF10). EMT ناشی از هیپوکسی در PTEC ها از طریق مدولاسیون miR{11}}p–TNFSF10، و TNFSF{13}}تضعیف شده EMT ناشی از هیپوکسی یا انتقال تقلید miR{14}}p است. این یافته‌ها برداشت‌های جدیدی از تنظیم منحصربه‌فرد تعامل miR{15}}p–TNFSF10 و اثرات درمانی بالقوه آن‌ها بر آسیب کلیه ناشی از هیپوکسی را ارائه می‌کنند.

کلید واژه ها: هیپوکسی؛ miR-545-3p; TNFSF10; انتقال اپیتلیال به مزانشیمی؛ سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال؛ تجزیه و تحلیل رونوشت

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

cistanche can improve kidney function

مزایای سیستانچ بیابانی: بهبود عملکرد کلیه و تسکین آسیب کلیه

1. مقدمه

بیماری کلیوییک موضوع بهداشت جهانی است که باعث افزایش عوارض و مرگ و میر و بدتر شدن بار سنگین مالی در سراسر جهان می شود. فیبروز کلیه نقطه عطفی از پیشرفت ضعیف بیماری های کلیوی مختلف بوده است که منجر به بیماری کلیه در مرحله نهایی می شود [1].

هیپوکسی نقش مهمی دربافت کلیه صدمهو پیشرفت بیشتر به فیبروز کلیه [2]. هیپوکسی یک تنظیم کننده قوی فرآیندهای سلولی متعدد از جمله متابولیسم، رشد و بقای سلولی از طریق مکانیسم های سنجش اکسیژن است [3]. پاسخ‌های رونویسی به محرومیت اکسیژن عمدتاً توسط عوامل القاکننده هیپوکسی (HIF) انجام می‌شود که در طول رشد طبیعی و در فرآیندهای پاتولوژیک در ارتباط با کاهش دسترسی به اکسیژن عمل می‌کنند [4]. هیپوکسی مزمن می تواند پاسخ آسیب کلیه را تحریک کند و باعث تغییر فنوتیپ برگشت ناپذیر در سلول های اپیتلیال لوله ای شود و باعث ایجاد فیبروز کلیه شود [5،6]. انتقال اپیتلیال به مزانشیمی (EMT) یک فرآیند حیاتی فیبروز کلیه است که در آن سلول های اپیتلیال ویژگی های اپیتلیالی خود را از دست می دهند و ویژگی های مزانشیمی را به دست می آورند [7،8]. فعال شدن سیگنال دهی HIF در سلول های اپیتلیال کلیه ممکن است فیبروژنز را با تسهیل EMT افزایش دهد [9]. تغییر در سطوح اکسیژن و فعال سازی سیگنالینگ هیپوکسیک از طریق HIF به عنوان محرک ها و تعدیل کننده های مهم EMT ظاهر می شوند [10]. با این حال، مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی EMT و فیبروز ناشی از هیپوکسی در کلیه‌ها به طور کامل شناخته نشده است.

MicroRNA ها (miRNA)، به عنوان عوامل تنظیم کننده پس از رونویسی، به عنوان تنظیم کننده های قدرتمند بیان ژن و فنوتیپ های سلولی در نظر گرفته می شوند. شواهد انباشته نشان می دهد که هیپوکسی بیوژنز و فعالیت miRNA ها را تعدیل می کند [11]. برخی از مطالعات بیان متفاوتی از miRNA ها و تأثیرات آنها بر ایجاد EMT و فیبروز در کلیه ها تحت هیپوکسی را گزارش کرده اند [12-14]. دو و همکاران پیشنهاد کرد که تنظیم پایین miR{4}}یک EMT ارتقا یافته در سلول های اپیتلیال لوله ای [13]. زی و همکاران نشان داد که تنظیم مثبت miR{6}} منجر به فیبروز در لوله های پروگزیمال می شود [14]. با این حال، اینکه آیا miRNA ها مسیر سیگنالینگ پاتوژنتیک EMT ناشی از هیپوکسی را در سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال (PTECs) واسطه می کنند، با استفاده از تجزیه و تحلیل رونوشت به خوبی مورد بررسی قرار نگرفته است.

بنابراین، در این مطالعه، ما از یک تجزیه و تحلیل توالی RNA کوچک از PTECs تحت شرایط نرموکسی و هیپوکسی برای بررسی مکانیسم‌های بالقوه تنظیم مسیرهای سیگنالینگ ناشی از هیپوکسی آسیب کلیه استفاده کردیم.

cistanche is good for choric kidney disease

cistanche tcmبرای بیماری کلیوی کوریک مفید است

2. مواد و روشها

2.1. کشت سلولی و مشاهده مورفولوژی

طبق پیشنهاد سازنده، PTECهای انسانی (ATCC PCS{0}}) در محیط پایه سلول اپیتلیال کلیه (ATCC PCS400030™) به اضافه 0.5 درصد سرم جنین گاوی (FBS) کشت داده شدند. سلول های HK{4}} از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ماناساس، VA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. سلول های HK{5}} در کراتینوسیت-SFM (GIBCO) با مکمل 2 درصد FBS کشت داده شدند. سلول ها تحت نورموکسی (O2، 21 درصد) و هیپوکسی (O2، 1 درصد) کشت داده شدند.

ویژگی های EMT در PTEC های انسانی با مشاهدات سریالی تغییرات مورفولوژیکی آنها با استفاده از میکروسکوپ نوری شناسایی شد (Nikon ECLIPSE TE20000-S، Nikon، توکیو، ژاپن).

2.2. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

کل پروتئین سلول‌های HK{0}} با استفاده از بافر لیز RIPA (آزمایش رسوب رادیویی) (EMD Millipore, Burlington, MA, USA) استخراج شد. پروتئین دناتوره شده با الکتروفورز 9-11 درصد SDS-PAGE جدا شد و سپس بر روی غشای PVDF به دنبال مسدود کردن و ایمونوبلات توسط آنتی بادی های اولیه و ثانویه خاص منتقل شد.

آنتی بادی علیه HIF-1 (کاتالوگ #nb100-105، Novus)، HIF-2 (کاتالوگ #7096s، سیگنالینگ سلولی)، N-cadherin (کاتالوگ #610921، BD Biosciences)، ویمنتین ( کاتالوگ #550513، BD Biosciences)، E-cadherin (کاتالوگ #610182، BD Biosciences)، اسلاگ (کاتالوگ #9585s، سیگنالینگ سلولی)، و GAPDH (کاتالوگ #MAB374، EMD Millipore) استفاده شد. سیگنال های لکه ها با استفاده از سیستم Proteinsimple plus Fluorchem Q (Alpha Innotech، San Leandro، CA، USA) گرفته شد. تراکم سنجی بلات ها با استفاده از نرم افزار Image J (Bethesda, MD, USA) محاسبه شد.

2.3. توالی یابی RNA کوچک

HK-2 cells were cultured under hypoxia or normoxia conditions for 48 h. NGS was performed to examine the miRNA profiles of HK-2 cells. Trizol® Reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA) was utilized to extract total RNA from the harvested cells, which were isolated for further RNA preparation and small RNA-seq by Welgene Biotechnology Company (Welgene, Taipei, Taiwan). The quality of the extracted RNA was evaluated by an RNA integrity number (RIN), which was measured using an Agilent Bioanalyzer (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Samples were prepared to manufacture the small RNA library and then to execute deep sequencing by the Illumina sample preparation kit. PCR amplification was performed to ligate total RNA with 30 and 50 adaptors and to reverse￾transcription into cDNA. cDNA constructs were separated using 6% polyacrylamide gel Biomolecules 2021, 11, 1032 3 of 14 electrophoreses, and 18–40 nucleotide RNA fragments (140–155 nucleotide in length with both adapters) were extracted. The sequencing of the libraries was performed using an Illumina GAIIx instrument (50 cycle single read) and then the results were processed by the Illumina software. The differentially expressed miRNAs between HK-2 cells treated with normoxia or hypoxia were defined at >2-fold change and >10 مطالعه در میلیون

2.4. در دسترس بودن داده ها

داده های توالی یابی RNA تولید شده در این نشریه در GEO تحت الحاق GSE178810 سپرده شده است.

2.5. جداسازی RNA، رونویسی معکوس، و کمی PCR در زمان واقعی (Q-PCR)

RNA کل از سلول های کشت شده در شرایط نرموکسی یا هیپوکسی یا تیمار شده با مهارکننده HIF{0}} (CAY10585, (3-(2-(4-آدامانتان-1-ایل فنوکسی )-acetylamino)-4-هیدروکسی بنزوئیک اسید متیل استر) به مدت 48 ساعت (10 میکرومولار، کاتالوگ #400092، Calbiochem) به ترتیب با استفاده از TRIzol و TRIzolLS Reagent (Life Technologies) جدا شد. miRNA ها با استفاده از Mir-X رونویسی معکوس شدند. کیت سنتز رشته اول miRNA (کاتالوگ شماره 638313 تاکارا، ژاپن). و RNA موجود در سلولها به ترتیب به کنترل داخلی U6 یا GAPDH نرمال سازی شدند.عبارات نسبی با استفاده از روش 2-∆∆Ct ارائه شد.پرایمرهای مورد استفاده در جدول S1 فهرست شده اند.

2.6. ابزارهای تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

اهداف miRNA های خاص با استفاده از دو وب سایت بیوانفورماتیک، پایگاه داده miRmap [15] و TargetScan [16] پیش بینی شدند که می توانند پیش بینی های هدف miRNA را برای ارگانیسم های مختلف ارائه دهند. هر دو نرم افزار miRmap و TargetScan اهداف miRNA خاص بالقوه را طبقه بندی می کنند و قدرت سرکوب یک هدف miRNA را بر اساس امتیازات miRmap و صدک های Context Plus Plus نشان می دهند [17].

عملکردهای بیولوژیکی اهداف miRNA انتخاب شده با استفاده از نرم افزار IPA (Ingenuity Systems، Redwood City، CA، USA)، که "تجزیه و تحلیل هسته" ژن ها/پروتئین ها را ارائه می دهد، تجزیه و تحلیل شد. مسیر متعارف، شبکه، و لیست سمیت به دست آمده از تجزیه و تحلیل هسته می تواند برای شناسایی پاتوژنز بالقوه ژن ها / پروتئین ها استفاده شود [18].

2.7. انتقال گذرا

تقلید miR{0}p (200 نانومولار) و کنترل miR منفی تقلید (miR-NC، 200 نانومولار) (GE Healthcare، USA) با استفاده از معرف ترانسفکشن Lipofectamine™ RNAiMAX (کاتالوگ شماره 13778075) به سلول‌ها منتقل شدند. , ThermoFisher Scientific, USA) با پیروی از پروتکل های سازنده. دنباله تقلیدهای miR{6}}p مورد استفاده در جدول تکمیلی S1 فهرست شده است.

2.8. سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

غلظت TNFSF10 سوپرناتانت سلول‌های HK{1}} که تحت نورموکسی، هیپوکسی، یا پس از ترانسفکشن با miR{2}}p در شرایط هیپوکسی به مدت 48 ساعت کشت شده‌اند، با کیت الایزا Quantikine1 اندازه‌گیری شد. کاتالوگ #DTRL00، سیستم های تحقیق و توسعه) طبق دستورالعمل سازنده، همانطور که قبلاً

شرح داده شده.

2.9. تحلیل آماری

متغیرهای پیوسته به عنوان میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) یا میانه (صدک 25 و 75) در صورت لزوم بیان شد، در حالی که متغیرهای طبقه بندی شده به صورت درصد بیان شدند. همبستگی بین متغیرهای پیوسته با استفاده از همبستگی اسپیرمن بررسی شد. معنی‌داری تفاوت‌ها در متغیرهای پیوسته بین گروه‌ها با استفاده از آزمون t Student یا آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و پس از آن آزمون تعقیبی که با اصلاح Tukey در صورت مناسب تنظیم شد، مورد آزمایش قرار گرفت. بیومولکول های آماری 2021، 11، 1032 4 از 14 تجزیه و تحلیل با استفاده از GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) انجام شد. معنی‌داری آماری در مقدار p دو طرفه تعیین شد<>

Cistanche has a good repairing effect on renal damage

پودر گیاه کوستانچاثر ترمیم کنندگی خوبی داردآسیب کلیوی

3. نتایج

3.1. هیپوکسی EMT را در PTEC ها القا می کند

گزارش شده است که هیپوکسی در مکانیسم های پاتوفیزیولوژیک شرکت داردآسیب کلیه[9]. برای بررسی تغییر فنوتیپی سلول‌های PTECs کلیه انسان (RPTECs) و HK{1}} در شرایط هیپوکسی، سلول‌ها تحت شرایط نرموکسی (O2، 21 درصد) و هیپوکسی (O2، 1 درصد) به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. ما دریافتیم که بیان HIF-1 و HIF-2 در سلول‌های RPTEC و HK-2 تحت شرایط هیپوکسی به مدت 6 ساعت افزایش یافته است (شکل 1A). مورفولوژی های سلولی مشاهده شد و از یک شکل گرد به یک فنوتیپ دراز و متحرک در شرایط هیپوکسی در مقایسه با شرایط نرموکسی تغییر یافت (شکل 1B).

وسترن بلات برای ارزیابی EMT در PTECs تحت شرایط نرموکسی یا هیپوکسی استفاده شد. هیپوکسی بیان N-cadherin و vimentin را افزایش داد و بیان E-cadherin را در سلول‌های PTEC انسانی (شکل 1C) و HK{3}} (شکل 1D) پس از یک دوره کمون 48- ساعت کاهش داد. بنابراین، هیپوکسی باعث ایجاد EMT در PTEC می شود.

Figure 1. Hypoxia induces EMT in PTECs. (A) HIF-1α and HIF-2α expression were assessed in RPTECs and HK-2 cells were incubated under normoxia (O2, 21%) and hypoxia (O2, 1%) conditions for 6 h using Western blotting. (B) The effect of hypoxia on morphological changes in RPTECs and HK-2 cells under normoxia and hypoxia conditions for 48 h. EMT markers (E-cadherin, N-cadherin, and vimentin) were examined in human RPTECs (C) and HK-2 cells (D) treated with normoxia and hypoxia for 48 h using Western blotting. The bar graph represents the mean ± SEM of at least three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by Student's t-test. Figure 1. Hypoxia induces EMT in PTECs. (A) HIF-1α and HIF-2α expression were assessed in RPTECs and HK-2 cells were incubated under normoxia (O2 , 21%) and hypoxia (O2 , 1%) conditions for 6 h using Western blotting. (B) The effect of hypoxia on morphological changes in RPTECs and HK-2 cells under normoxia and hypoxia conditions for 48 h. EMT markers (E-cadherin, N-cadherin, and vimentin) were examined in human RPTECs (C) and HK-2 cells (D) treated with normoxia and hypoxia for 48 h using Western blotting. The bar graph represents the mean ± SEM of at least three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by Student's t-test.

3.2. شناسایی miR-545-3p شرکت کننده در EMT ناشی از هیپوکسی در PTEC

نمودار جریان اکتشاف miRNA های بالقوه ناشی از هیپوکسی در شکل 2A نشان داده شده است. مشخصات RNA های کوچک از سلول های HK{1}} که تحت نورموکسی یا هیپوکسی به مدت 24 ساعت کشت شده بودند توسط NGS مشخص شد. بیست و یک miRNA با تغییر قابل توجه 2- برابری در سلول‌های HK-2 در معرض هیپوکسی در مقایسه با سلول‌های کشت‌شده تحت نورموکسی یافت شد.

از 21 miRNA، 10 miRNA تنظیم مثبت و 11 miRNA کاهش یافت. پس از حذف miRNA ها با تعداد خواندن خام، کمتر یا مساوی 10، 11 miRNA قابل توجه (8 مورد تنظیم مثبت و 3 مورد تنظیم پایین در شرایط هیپوکسی) با نگاشت حرارتی نمایش داده شد (شکل 2B و جدول S1). ما از RT-Q-PCR برای اعتبارسنجی بیان این miRNA ها در دو مدل آزمایشگاهی، از جمله سلول‌های RPTEC انسانی و سلول‌های HK{11}} در شرایط نرموکسی و هیپوکسی استفاده کردیم. در بین 11 miRNA، miR{13}}a{14}}p و miR{15}}p توسط qT-PCR شناسایی نشدند، و بیان ناسازگار miR{17}}a, miR{ {18}}p، miR- 33b-5p، miR-33a-5p، و miR-219a{24}}p پیدا شد در سلول‌های PTEC و HK{25}} انسان پس از درمان هیپوکسی (شکل 2C-G). سطوح miR{27}}p، miR{28}} و miR{29}}p در هر دو سلول PTEC انسانی و HK{30}} تحت شرایط هیپوکسی کاهش یافت (شکل 2H-J). بیان miR{32}}p نه تنها در بین 11 miRNA در سلول‌های HK{34}} که در معرض هیپوکسی قرار داشتند در مقایسه با سلول‌های تحت درمان با نورموکسی، در PTECهای انسانی تحت شرایط هیپوکسی نیز بالاتر بود (شکل 2K). ما بیشتر بررسی کردیم که آیا HIF{36}} در تنظیم بیان miR{37}p دخیل است (شکل S1)، و دریافتیم که مهارکننده HIF{39}} افزایش miR-545-3 را در HK سرکوب می‌کند. سلول های -2 ناشی از هیپوکسی (شکل 2L). یافته‌های بالا نشان داد که HIF{43}} بیان miR{44}}p را در لوله‌های پروگزیمال تحت شرایط هیپوکسی تنظیم می‌کند.

Figure 2. Identification of miR-545-3p participating in hypoxia-induced EMT in PTECs. (A) Flowchart of the identification of potential miRNAs associated with hypoxia-induced EMT in HK-2 cells.

با توجه به بالاترین بیان miR{0}}p در میان 11 miRNA در سلول‌های HK-2 در معرض هیپوکسی، عملکرد پاتوفیزیولوژیک اهداف بالقوه مبتنی بر miR-545-3، با امتیاز miRmap > 90 با توجه به پایگاه داده miRmap، با استفاده از تجزیه و تحلیل هسته پایگاه داده IPA تجزیه و تحلیل شد. ده مسیر اصلی آنالیز IPA نشان داد که عملکرد پاتوفیزیولوژیک miR{6}}p شامل تنظیم EMT توسط فاکتورهای رشد است (شکل 3A). تجزیه و تحلیل لیست سموم نشان داد که miR{8}}p با آسیب کلیوی و پاسخ استرس اکسیداتیو همبستگی دارد (شکل 3B). بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک، هیپوکسی ممکن است EMT را در PTECها از طریق مدولاسیون miR{10}} القا کند.

Figure 3. TNFSF10 as a direct target of miR-545-3p. (A) Top ten canonical pathways of the potential genes targeted by miR-545-3p using IPA analysis.



علاوه بر این، تجزیه و تحلیل شبکه از اهداف بالقوه miR-545-3p نشان داد که miR-545-3p و TNFSF10، به عنوان اهداف تنظیم شده توسط miR-545-3p، نیز در تکثیر سلولی و سلول نقش دارند. چرخه (جدول 3).

Table 1. Canonical pathway of the predicted target genes of miR-545-3p according to the IPA database.

miRmap و TargetScan (نسخه 7.1) برای انجام پیش‌بینی‌های بیوانفورماتیک مورد استفاده قرار گرفتند که نشان می‌دهد 3/UTR TNFSF10 حاوی توالی بذر هدف برای اتصال miR{4}}p است. نمرات mipmap احتمالی احتمال ژن‌های هدف پیش‌بینی‌شده miR-545-3 p را نشان می‌دهد (شکل 3C). توالی بذر miR{8}}p حفاظت شده در 3/ UTR TRAIL در شکل 3D نشان داده شده است. درمان هیپوکسی سطح mRNA TNFSF10 سلول‌های PTEC انسانی (شکل 3E) و سلول‌های HK{13}} را کاهش داد (شکل 3F). علاوه بر این، کاهش سطح mRNA TNFSF10 در سوپرناتانت‌های مشتق‌شده از سلول‌های HK{16}} تحت هیپوکسی در مقایسه با نورموکسی (شکل 3G) مشاهده شد. علاوه بر این، ترانسفکشن miR{18}} بیان mRNA ژن TNFSF10 کاهش یافته را در مایع رویی سلول‌های HK{20}} تقلید کرد (شکل 3H). مهارکننده HIF{22}} کاهش بیان mRNA TNFSF10 را در سلول‌های HK{24} ناشی از هیپوکسی معکوس کرد (شکل 3I). بنابراین، هیپوکسی بیان miR-545 را تنظیم کرد، که متعاقباً بیان TNFSF10 را کاهش داد، و HIF-1 ممکن است مسیر miR-545-3p–TNFSF10 را تعدیل کند.

Table 2. Tox list of the predicted target genes of miR-545-3p according to the IPA database.


3.4. هیپوکسی EMT را در سلول های HK با مدولاسیون miR-545-3p–TNFSF10 القا می کند

برای ارزیابی اینکه آیا miR{0}}p EMT القاکننده هیپوکسی را در توبول پروگزیمال تعدیل می‌کند، ما اثرات بیولوژیکی miR-545-3p و TNFSF10 را در سلول‌های HK{4}} ارزیابی کردیم. اولاً، تیمار با TNFSF10 (20 نانوگرم در میلی‌لیتر) روی زنده‌مانی سلولی سلول‌های HK{7}} تأثیری نداشت (شکل 4A). ما بیشتر بیان راز را به عنوان یکی از عوامل رونویسی برای تنظیم EMT بررسی کردیم. بیان Slug در سلول‌های HK{9}} پس از ترانسفکشن با miR{10}}p (شکل 4B) افزایش یافت و در سلول‌های HK{12}} تحت درمان با TNFSF10 (شکل 4C) تحت شرایط نرموکسی، سرکوب شد. پس از ترانسفکشن تقلید miR{15}} p، بیان E-cadherin کاهش یافت، و بیان N-cadherin و vimentin در سلول‌های HK{19}} تحت شرایط نرموکسی تنظیم مثبت شد (شکل 4D). با این حال، TNFSF10 اثر miR{22}}p در القای EMT در سلول‌های HK{23}} را معکوس کرد. علاوه بر این، درمان با TNFSF10 (20 نانوگرم در میلی‌لیتر) از کاهش تنظیم E-cadherin و سرکوب N-cadherin و ویمنتین دخیل جلوگیری کرد و EMT را در سلول‌های HK{28}} ناشی از هیپوکسی در سلول‌های HK{29}} معکوس کرد (شکل 4E). این یافته‌ها به این معنی است که هیپوکسی از طریق مدولاسیون مسیر miR{31}p– TNFSF10 به EMT در PTEC کمک می‌کند و TNFSF10 می‌تواند EMT را در PTEC‌های ناشی از هیپوکسی و miR{34}p کاهش دهد.

Figure 4. Hypoxia induces EMT in HK-cells by miR-545-3p–TNFSF10 modulation. (A) Cell viability activity was examined in HK-2 cells treated with normal control or TNFSF10 (20 ng/mL) for 48 h using the WST-1 assay.

4. بحث

هیپوکسی باعث اختلال در عملکرد مورفولوژیک و پاتوفیزیولوژیک می شودکلیه، منجر به کاهش سریع درعملکرد کلیه[16]. این مطالعه از تجزیه و تحلیل رونوشت برای بررسی miRNA های بالقوه شرکت کننده در فرآیند EMT ناشی از هیپوکسی در PTECs استفاده کرد و نشان داد که miR-545-3p در PTEC های تحت درمان با هیپوکسی، و HIF{3}} miR تعدیل شده{{{{ 4}}p و بیان TNFSF10. تنظیم مثبت miR{6}}به EMT در PTECهای تحت هیپوکسی منجر شد. علاوه بر این، TNFSF10 EMT را در PTEC های تحت درمان با هیپوکسی بهبود بخشید. بنابراین، ما با درک تنظیم منحصر به فرد miR-545-3p-TNFSF10، ادراکات جدیدی به دست آورده‌ایم، که از آن می‌توانیم پیشرفت بیماری کلیوی را تفسیر کنیم (شکل 5).

Figure 5. Illustration of the mechanism by which hypoxia induced EMT in PTECs through miR-545-3p–TNFSF10.

یافته‌های ما بیان miR{1}P تنظیم‌شده با هیپوکسی را در لوله‌های پروگزیمال نشان داد. miRNA ها نقش مهمی در تعدیل بیان یا فعالیت ژن ایفا می کنند و مکانیسم های پاتوفیزیولوژیک شروع یا پیشرفت بیماری ها را تنظیم می کنند [19]. مطالعات قبلی نشان داد که miR{3}} به عنوان یک پروموتور تومور عمل می‌کند، که تکثیر سلولی، تهاجم و مهاجرت را تنظیم می‌کند و بیشتر منجر به کارسینوم سلول‌های کبدی می‌شود [20،21]. miR{6}} یک فرآیند التهابی را القا کرد و با هدف قرار دادن Tim به سیروز کبدی مرتبط با هپاتیت B کمک کرد-3 [22]. برعکس، miR{10}p تا حدی lncRNA XIST را مسدود کرد و آپوپتوز میوبلاست‌های قلبی ناشی از هیپوکسی/اکسیژناسیون مجدد را افزایش داد [23]. با این حال، اینکه miR{12}} در پاتوژنز بیماری‌های کلیوی شرکت می‌کند به خوبی بررسی نشده است. چند مطالعه نشان داد که miR{13}}p در آسیب حاد کلیه مرتبط با سپسیس شرکت داشت [24،25]. تان و همکاران گزارش داد که circ{17}} به عنوان یک اسفنج miR{18}}p برای سرکوب آپوپتوز سلول های HK{19}} ناشی از لیپوپلی ساکارید (LPS) از طریق دخیل ترومبوسپوندین 2 عمل می کند [24]. هو و همکاران نشان داد که بیان بیش از حد طولانی غیر کدکننده حساسیت سرطان 2، آپوپتوز ناشی از LPS را در سلول‌های HK از طریق تنظیم محور گیرنده فعال‌شده توسط تکثیرکننده miR{26}p/پراکسی‌زوم کاهش می‌دهد [25]. شی و همکاران نشان داد که circPRKCI آسیب التهابی ناشی از LPS در سلول‌های HK{30}} را با سرکوب کردن miR{31}}/انگشت E-box-box 2 نجات داد [26]. این مطالعه حاضر ابتدا تأثیر miR{36}}p را بر EMT ناشی از هیپوکسی در کلیه نشان داد. هیپوکسی سطح miR{38}}p را افزایش داد و HIF{39}} بیان miR-545-3p را در PTECs تنظیم کرد. miR{41}} باعث افزایش اسلاگ شد و EMT را بیشتر ارتقا داد، از جمله سرکوب بیان miR{42}}p E-cadherin و افزایش بیان N-cadherin و vimentin در PTECs. ما یک مسیر سیگنال جدید برای تعدیل فرآیند EMT در لوله های پروگزیمال تحت هیپوکسی نشان دادیم.

همچنین گزارش شده است که هیپوکسی بیان TNFSF10 و فرآیند فیزیولوژیک را تعدیل می کند [27،28]. فانگ و همکاران پیشنهاد کرد که HIF{3}} آپوپتوز ناشی از TNFSF را از طریق افزایش بیان گیرنده فریب 1 TNFSF10 (DcR1) در آسیب مغزی تروماتیک افزایش داد [27]. هاراشیما و همکاران نشان داد که HIF{9}} حساسیت سلول های سرطانی پانکراس را به TNFSF10 در شرایط هیپوکسی افزایش می دهد [28]. با این وجود، نحوه تنظیم TNFSF10 از طریق پس از رونویسی miRNA ها، به ویژه در آسیب کلیه ناشی از هیپوکسی، روشن نیست. یافته‌های ما بینش جدیدی در این زمینه ارائه می‌کند که هیپوکسی بیان TNFSF10 را در لوله‌های پروگزیمال از طریق miR{16}} تعدیل می‌کند. هیپوکسی سطوح miR{17}p را افزایش داد، و به نوبه خود، بیان TNFSF10 را در PTECها و سوپرناتانت آنها برای القای فرآیند EMT سرکوب کرد. علاوه بر این، ما همچنین دریافتیم که هیپوکسی مسیر miR{19}}p-TNFSF10 را در لوله‌های پروگزیمال از طریق HIF تعدیل می‌کند. با این حال، مشخص نیست که آیا HIF{22}} این مسیر را در کلیه تحت محیط هیپوکسی تنظیم می‌کند یا خیر. مطالعه بیشتر برای بررسی تأثیر زیرگروه های فاکتورهای رونویسی HIF بر تنظیم miR{23}}p-TNFSF10 در آسیب کلیه ضروری است.

شواهد انباشته نشان می دهد که اعضای ابرخانواده TNF به طور فعال در پاتوفیزیولوژی توسعه و پیشرفت بیماری های کلیوی نقش دارند [29]. اعضای فوق‌خانواده TNF عملکرد سلولی مانند تمایز، تکثیر، نکروز، آپوپتوز یا فیبروز را که به مراحل مختلف آسیب کلیه بستگی دارد، تنظیم می‌کنند [30،31]. TNFSF10، به عنوان یک عامل بالقوه درمانی ضد سرطان، می‌تواند رشد سلولی را مهار کرده و آپوپتوز سلولی را از طریق اتصال به گیرنده‌های مرگ گذرنده غشایی نوع I افزایش دهد، و در نتیجه به اثربخشی درمان شیمی‌درمانی سرطان‌های مختلف کمک می‌کند [29،32]. مطالعات اخیر رابطه منفی بین TNFSF10 سرم و پیامدهای بالینی در بیماری های غیر سرطانی را نشان دادند [33،34]. با این حال، نقش TNFSF10 در بیماری های کلیوی به طور کامل بررسی نشده است. بیان افزایش یافته TRAIL در گردش در بیماران مبتلا به برخی از بیماری های کلیوی، مانند بیماری کلیوی دیابتی و بیماری با تغییرات کوچک مشاهده شد [35،36]. مهار آسیب کاهش TNFSF10 در یک مدل in vivo کلیه ایسکمی-پرفیوژن مجدد [37]. برعکس، گردش خون TNFSF10 در بیماران مبتلا به بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب در مقایسه با افراد عادی کاهش یافت [38]. در غیر این صورت، اثرات متناقض TNFSF10 بر بیماری های کلیوی نیز گزارش شده است. برخلاف اثر آپوپتوتیک بر PTEC در نفروپاتی دیابتی [30]، نگوین و همکاران. گزارش داد که TNFSF10 یک پاسخ التهابی و تکثیر سلولی در نفریت لوپوس اعمال می کند [39]. این اظهارات متناقض ممکن است مربوط به مقررات مختلف TNFSF10 در انواع و مراحل مختلف بیماری های کلیوی باشد. تا به امروز، هنوز نتیجه گیری در مورد نقش واقعی TNFSF10 در ایجاد و پیشرفت بیماری های کلیوی دشوار است. این مطالعه حاضر نشان داد که TNFSF10 بر زنده ماندن PTEC تأثیر نمی گذارد، و نشان می دهد که آپوپتوز را در این نوع سلول القا نمی کند. بیان بیش از حد TNFSF10 می تواند EMT ناشی از هیپوکسی در لوله های پروگزیمال را بهبود بخشد، که نشان دهنده اثر درمانی بالقوه miR-545-3p-TNFSF10 در آسیب کلیوی مرتبط با هیپوکسی است.


5. نتیجه گیری ها

این مطالعه نشان داد که هیپوکسی از طریق مدولاسیون miR{0}}p– TNFSF10، و مهار miR-545-3p و TNFSF10 EMT ناشی از هیپوکسی را در PTEC معکوس کرد. بنابراین، این یافته ها بینش جدیدی در مورد تنظیم منحصر به فرد miR{5}}p-TNFSF10 و اثر درمانی بالقوه آنها در آسیب کلیه ناشی از هیپوکسی ارائه می دهد.

Cistanche can regulate chronic kidney disease, click here to learn more

سیستانچمی تواند مزمن را تنظیم کندبیماری کلیوی، برای اطلاعات بیشتر اینجا کلیک کنید

منابع

1. لیو، م. لیو، ال. بای، م. ژانگ، ال. ما، اف. یانگ، ایکس. Sun, S. فعال شدن محور Twist/miR{2}}/E-cadherin ناشی از هیپوکسی باعث انتقال مزانشیمی سلول های اپیتلیال توبولار کلیوی و فیبروز کلیه می شود. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 2018، 495، 2324-2330.

2. هیمن، SN; خمایسی، م. روزن، اس. روزنبرگر، سی. هیپوکسی پارانشیم کلیه، پاسخ هیپوکسی و پیشرفت بیماری مزمن کلیه. صبح. جی. نفرول. 2008، 28، 998-1006.

3. Giaccia، AJ; سیمون، ام سی; جانسون، آر. بیولوژی هیپوکسی: نقش سنجش اکسیژن در رشد، عملکرد طبیعی و بیماری. Genes Dev. 2004، 18، 2183-2194.

4. موفق، س. کروک، اس. Vo, K. تنظیم فاکتور القاکننده هیپوکسی{2}}a توسط گونه‌های فعال اکسیژن: تحولات جدید در یک بحث قدیمی. جی. بیوشیمی سلولی. 2015، 116، 696-703.

5. Manotham، K. تاناکا، تی. ماتسوموتو، ام. اوهسه، تی. ایناگی، ر. میاتا، تی. کوروکاوا، ک. فوجیتا، تی. اینگلفینگر، جی آر. Nangaku، M. تمایز سلول های لوله ای کشت شده ناشی از هیپوکسی. کلیه بین المللی 2004، 65، 871-880.

6. خوب، ال جی; Bandyopadhyay، D.; Norman, JT آیا مکانیسم مشترکی برای پیشرفت انواع مختلف بیماری های کلیوی به جز پروتئینوری وجود دارد؟ به سمت موضوع متحد کننده هیپوکسی مزمن. کلیه بین المللی تامین 2000، 75، S22–S26.

7. لی، ی. کانگ، YS; دای، سی. بوسه، LP; ون، ایکس. Liu, Y. انتقال اپیتلیال به مزانشیمی یک مسیر بالقوه است که منجر به اختلال عملکرد سلولی و پروتئینوری می شود. صبح. جی. پاتول. 2008، 172، 299-308.

8. یاماگوچی، ی. ایوانو، م. سوزوکی، دی. ناکاتانی، ک. کیمورا، ک. هارادا، ک. کوبو، ا. آکای، ی. تویودا، م. کاواگوچی، م. و همکاران انتقال اپیتلیال - مزانشیمی به عنوان یک توضیح بالقوه برای کاهش پودوسیت در نفروپاتی دیابتی صبح. جی. کلیه دیس. 2009، 54، 653-664.

9. هیگینز، DF; کیمورا، ک. برنهارت، دبلیو ام. شریمانکر، ن. آکای، ی. هوهنشتاین، بی. سایتو، ی. جانسون، آر اس؛ کرتزلر، ام. کوهن، سی دی; و همکاران هیپوکسی فیبروژنز را در داخل بدن از طریق تحریک HIF{1}} انتقال اپیتلیال به مزانشیمی ترویج می کند. جی. کلین. تحقیق کنید. 2007، 117، 3810-3820.

10. Haase، VH Oxygen انتقال اپیتلیال به مزانشیمی را تنظیم می کند: بینش در مکانیسم های مولکولی و ارتباط با بیماری. کلیه بین المللی 2009، 76، 492-499.

11. نالامشتی، س. چان، سی. Loscalzo، J. Hypoxia: تنظیم کننده اصلی بیوژنز و فعالیت microRNA. رادیک آزاد. Biol. پزشکی 2013، 64، 20-30.

12. زل، اس. اشمیت، آر. ویتینگ، اس. Kreipe، HH; حسین، ک. هیپوکسی بکر، JU باعث بیان ژن مزانشیمی در سلول های اپیتلیال لوله کلیوی می شود: یک مدل آزمایشگاهی فیبروز پیوند کلیه. Nephron Extra 2013، 3، 50-58.

13. دو، ر. سان، دبلیو. شیا، ال. ژائو، آ. یو، ی. ژائو، ال. وانگ، اچ. هوانگ، سی. Sun, S. تنظیم پایین میکروRNA{3}a ناشی از هیپوکسی، EMT را با هدف قرار دادن مسیر سیگنالینگ Notch در سلول های اپیتلیال لوله ای ارتقا می دهد. PLoS ONE 2012, 7, e30771.

14. زی، اس. چن، اچ. لی، اف. وانگ، اس. Guo, J. microRNA ناشی از هیپوکسی{2}} فیبروز را در سلول های لوله پروگزیمال ترویج می کند. مول. پزشکی Rep. 2015, 11, 4555-4560.

15. در دسترس آنلاین:

16. در دسترس آنلاین:

17. Tsai، YC; کو، ام سی؛ آویزان، WW; وو، LY; وو، PH; چانگ، WA; Kuo، PL; Hsu، YL گلوکز بالا از طریق miR-15b{-5p آپوپتوز سلولی مزانژیال را القا می‌کند و نفروپاتی دیابتی را با تحویل وزیکول خارج سلولی ترویج می‌کند. مول. آنجا 2020، 28، 963-974.

18. لوینگتون، ای جی; سردا، ج. مهتا، RL افزایش آگاهی در مورد آسیب حاد کلیه: چشم انداز جهانی یک قاتل خاموش. کلیه بین المللی 2013، 84، 457-467.

19. Chitwood، DH; Timmermans، MC Target تقلید می کند miRNA ها را تعدیل می کند. نات. ژنت. 2007، 39، 935-936.

20. چانگجون، ال. فیژو، اچ. دژن، پ. ژائو، ال. محور Xianhai، M. MiR-545-3p/MT1M تکثیر، تهاجم و مهاجرت سلولی را در سرطان کبد تنظیم می‌کند. Biomed. داروساز. 2018، 108، 347-354.


شما نیز ممکن است دوست داشته باشید