تصویربرداری از کلیه: از نور تا میکروسکوپ با وضوح فوق العاده

مخاطب: ali.ma@wecistanche.com

ماریا لوسیا آنجلوتی^1,2، جولیا آنتونلی^1,2 کارولینا کونته^1,2و پائولا رومانیانی^1,2

چکیده

دستاوردهای مهم درکلیهمکانیسم های فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی را می توان تا حد زیادی به پیشرفت در فناوری میکروسکوپ نسبت داد. بسیاری از آنچه ما در مورد معماری می دانیمکلیهبر اساس توصیفات اساسی میکروسکوپیست های آناتومیک با استفاده از میکروسکوپ نوری و بعداً توسط تجزیه و تحلیل فراساختاری ارائه شده توسط میکروسکوپ الکترونی است. این دو تکنیک برای اولین سیستم های طبقه بندی بیماری های کلیوی و برای به روز رسانی مداوم آنها استفاده شد. اخیراً، مجموعه ای از تکنیک های جدید تصویربرداری، تجزیه و تحلیل را در ابعاد بیشتر زمان و مکان اضافه کردند. میکروسکوپ کانفوکال به ما این امکان را می‌دهد که به‌طور متوالی بخش‌های نوری را در امتداد محور z تجسم کنیم و در دسترس بودن نرم‌افزار آنالیز خاص، رندر سه‌بعدی از نمونه‌های بافت ضخیم‌تر را ارائه می‌دهد. میکروسکوپ مولتی فوتونی به ما اجازه داد که به طور همزمان بررسی کنیمکلیهعملکرد و ساختار در زمان واقعی میکروسکوپ تصویربرداری طول عمر فلورسانس به ما اجازه داد تا توزیع فضایی متابولیت ها را مطالعه کنیم. میکروسکوپ با وضوح فوق العاده حساسیت و وضوح را تا سطوح نانومقیاس افزایش داد. با میکروسکوپ کرایو الکترونی، محققان می‌توانند بیومولکول‌های فردی را در سطوح اتمی مستقیماً در بافت‌ها تجسم کنند و تعامل آنها را در سطوح درون سلولی درک کنند. در نهایت، طیف‌سنجی جرمی تصویربرداری واجذب/یونیزاسیون لیزری به کمک ماتریس، امکان اندازه‌گیری صدها مولکول مختلف را به طور همزمان در بخش‌های بافت با وضوح بالا فراهم کرد. این بررسی یک نمای کلی از موجود را ارائه می دهدکلیهاستراتژی‌های تصویربرداری، با تمرکز بر تأثیر احتمالی جدیدترین پیشرفت‌های فناوری.

کلید واژه ها:ایمونوهیستوشیمی،کلیهبیوپسی، پودوسیت ها،پروگزیماللوله، سلولهای بنیادی

گیاه سیستانچ برای بیماری کلیوی، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

مقدمه

اینکلیه هاپیچیدگی ساختاری جذاب برای انجام عملکردهای فیزیولوژیکی متنوع آن مورد نیاز است. در ابتدا، مطالعهکلیهمحدود به مشاهدات ماکروسکوپی بود و سهم آنها در تشخیص بیماری های کلیوی غیرقابل انکار محدود بود. تظاهرات بالینی توصیف شد اما مکانیسم های پاتوژنتیک زمینه ای ناشناخته بود. دستاوردهای درک فیزیولوژی کلیه و پاتوفیزیولوژی را می توان تا حد زیادی به پیشرفت مداوم در زمینه میکروسکوپی نسبت داد. تلاش درکلیهتصویربرداری خیلی وقت پیش شروع شد [1]. در سال 1666، آناتومیست Malpighi بررسی کردکلیهبافتی با یک میکروسکوپ نوری که توان آن بین 25 تا 30 تخمین زده می شود و برای اولین بار گلومرول را به عنوان "غده ای که در آن ادرار از خون جدا می شود" توصیف می کند. این مشارکت تا سال 1842 نادیده گرفته شد، زمانی که ساختارهای نفرون با میکروسکوپ نوری 10 برابر قدرتمندتر توسط سر ویلیام بومن کشف شد. بومن کپسول پری گلومرولی (که بعداً کپسول بومن نامیده شد) را کشف کرد که از نظر تشریحی به قسمت اول لوله متصل است [3]. در سال 1862، ژاکوب هنل بخش لوله حلقه مانندی را که نام او را به خود اختصاص داد، توصیف کرد و لوله های قشری و پاپیلای کلیه را به هم متصل می کند.

به لطف معرفی میکروسکوپ نوری، یک طبقه بندی هیستومورفولوژیکی ازکلیهبیماری هاممکن شد [1]. شانس مشاهده آنچه در کلیه‌های بیمار رخ می‌دهد به فرد این امکان را می‌دهد که بفهمد تغییرات پاتولوژیک بین بیماران با تظاهرات بالینی مشابه به طور قابل‌توجهی متفاوت است. با این حال، اولین مطالعات در مورد تغییرات پاتولوژیک در بافت کلیه بر روی نمونه های کالبد شکافی انجام شد که بیشتر به توصیف بیماری های مزمن منجر شد. فقدان اطلاعات در مورد تکامل آسیب شناسی کلیه و مشکل فنی پدیده های اتولیتیک، مرتبط با استفاده از بافت های پس از مرگ، دانش بیماری های انسانی را محدود می کند. در سال 1951، معرفیکلیهبیوپسی امکان مشاهده و مطالعه مستقیم نه تنها بیماری های مزمن بلکه حاد کلیه را فراهم می کند. در همین حال، میکروسکوپ با افزایش تدریجی حساسیت و وضوح تا سطوح نانومقیاس، به تدریج پیچیده‌تر شد. در این بررسی، مروری بر اکتشافات اساسی کلیه که با پیشرفت‌های فناوری میکروسکوپی امکان‌پذیر شده است، با تمرکز بر احتمالات حاصل از جدیدترین پیشرفت‌های فنی ارائه خواهیم کرد.

مشاهده ایمونوپاتولوژی کلیه

برچسب گذاری ایمنی و میکروسکوپ فلورسانس

امکان به دست آوردن یک قطعه نماینده از بافت زنده، استفاده از تکنیک‌های نوظهور را که به حفظ حداکثری بافت نیاز دارند، مانند روش‌های ایمونوهیستوشیمی (ابتدا فلورسنت، سپس آنزیمی) اجازه می‌دهد. در واقع، در سال 1950، کونز روش برچسب گذاری آنتی بادی ها با ایزوسیانات فلورسینات، یعنی ایمونوفلورسانس، بدون از بین بردن ظرفیت واکنش اختصاصی با آنتی ژن های بافتی خود را توسعه داد. از آن زمان، ایمونوفلورسانس در روش تشخیصی برای ارزیابی نمونه‌های بیوپسی کلیه منجمد گنجانده شده است. برای اولین بار، این تکنیک‌ها مشاهده ایمونوگلوبولین‌های داخل کلیوی (Igs) و رسوبات مکمل را در بیماران مبتلا به گلومرولونفریت مجاز می‌سازد، که به تمایز پاتوفیزیولوژی‌های مختلف زیربنای ضایعات بافتی غیراختصاصی، به عنوان مثال، در گلومرولونفریت هلالی کمک می‌کند [4]. علاوه بر این، امکان مشاهده یک الگوی رنگ‌آمیزی مشخص و جفت شدن فلورسین با آنتی‌بادی‌هایی غیر از ایمونوگلوبولین G (IgG) منجر به شناسایی رسوبات ایمونوگلوبولین A (IgA) در نفروپاتی IgA و همچنین رسوبات مکمل در گلومرولونفیت پس از عفونی شد. و گلومرولونفریت غشایی پرولیفراتیو [4].

میکروسکوپ کانفوکال

میکروسکوپ فلورسانس با معرفی میکروسکوپ کانفوکال در اواخر دهه 1980 بهبودهای فنی قابل توجهی را تجربه کرد. عناصر کلیدی در میکروسکوپ کانفوکال عبارتند از نور نقطه متمرکز و اسکن شده بر روی نمونه و یک روزنه کانفوکال متغیر (پین هول) در جلوی آشکارساز که امکان جمع آوری نور را تنها از یک بخش نازک در اطراف صفحه کانونی (به نام بخش نوری) می دهد. میکروسکوپ کانفوکال اولین مطالعات in vivo کلیه را در مدل‌های تجربی و مشاهده جذب و انتقال مولکول‌های فلورسنت از طریق لوله‌های دست نخورده را امکان‌پذیر کرد.کلیه هاپس از میکروپانچر این امکان مطالعات عملکرد لوله در شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک را فراهم کرد [5].

The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 نانومتر، به دلیل محدودیت پراش نور مرئی، فوتوبلیچینگ و سمیت نوری.

درک سد فیلتراسیون گلومرولی: میکروسکوپ الکترونی

اولین تلاش برای غلبه بر محدودیت تفکیک نور و میکروسکوپ های فلورسانس در سال 1931 بود که ارنست روسکا و ماکس نول میکروسکوپ الکترونی (EM) را اختراع کردند که از پرتوی از الکترون های شتاب دار به جای پرتو نور به عنوان منبع تحریک استفاده می کند. و قدرت تفکیک بالاتری نسبت به میکروسکوپ های نوری دارد (تا 0.2 نانومتر). برای این نوآوری، در سال 1986، ارنست روسکا جایزه نوبل فیزیک را دریافت کرد. به لطف افزایش قدرت تفکیک، به زودی مشخص شد که گلومرول صرفاً یک فیلتر مکانیکی نیست، بلکه یک اندام بسیار پیچیده است که از سه لایه تشکیل شده است: سلول‌های اندوتلیال، غشای پایه گلومرولی (GBM)، و پودوسیت‌ها [9]. انتقال EM (TEM) امکان تجسم سلول‌های گلومرولی را از داخل فراهم کرد [10] و نشان داد که سلول‌های اندوتلیال دارای بدنه‌های سلولی نازک هستند، در حالی که پودوسیت‌ها دارای بدنه سلولی بزرگ هستند و فرآیندهای اولیه و ثانویه «پا» را گسترش می‌دهند که به GBM لنگر می‌زنند و از طریق به هم متصل می‌شوند. اتصالات خطی (دیافراگم خفیف) (شکل 1B). علاوه بر این، اسکن EM (SEM)، گرفتن الکترون‌های پراکنده عقب، امکان تجسم سلول‌های گلومرولی را از سطح بیرونی آن‌ها [10] فراهم کرد و نشان داد که فرآیندهای پا در پودوسیت‌های همسایه به هم متصل شده و GBM را پوشانده است (شکل 1C). EM یک ابزار قدرتمند نه تنها برای درک فراساختار طبیعی گلومرولی بلکه برای درک باقی مانده است.کلیهفیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی [11]. مطالعات متعددی که بر روی نمونه‌های انسانی یا در مدل‌های تجربی انجام شده است، نشان داده‌اند که فرآیندهای بیماری‌های مختلف با مجموعه‌ای از الگوهای متمایز تغییرات فراساختاری مرتبط هستند، که به‌روزرسانی‌های بیشتر در سیستم طبقه‌بندی در حال تکامل را نشان می‌دهد.کلیهبیماری ها توانایی فنی برای تجسم پیچیدگی بیشتر فراساختار کلیه، تخصص "نفرو" آسیب شناسان را تایید کرد.

یک تکنیک اخیر SEM، بر اساس یک آشکارساز بسیار حساس، امکان مطالعه عمیق‌ترین بخش دیافراگم شکاف را فراهم کرد و نشان داد که منافذ با اندازه‌های متفاوت مشخص می‌شود [12]. در موش‌ها، شروع پروتئینوری با منافذ بزرگ همراه بود و این احتمال را افزایش داد که تغییرات فراساختاری دیافراگم شکاف می‌تواند باعث تغییرات در نفوذپذیری گلومرولی شود [12]. به عنوان یک پیشرفت فنی بیشتر، SEM بلوکی اجازه عبور از یک نمای 2 بعدی به یک نمای 3 بعدی از سد فیلتراسیون گلومرولی را با وضوح کافی برای دنبال کردن نانوساختار نازک ترین فرآیندهای سلولی در موش های سالم، موش های بیمار و در طول آن داد.کلیهتوسعه [13، 14].

در نهایت، جفت شدن EM به یک سیستم میکروآنالیز اشعه ایکس (میکروسکوپ اشعه ایکس) امکان تجزیه و تحلیل عنصری سلول‌ها یا بخش‌هایی از سلول‌ها را در سطح فراساختاری فراهم کرد. میکروسکوپ اشعه ایکس از یک TEM روبشی با یک پرتو الکترونی باریک برای تحریک نمونه استفاده می کند. برخورد الکترون های پرانرژی پرتو با اتم های موجود در نمونه ها باعث تولید انرژی به شکل فوتون های پرتو ایکس می شود. این سیگنال اشعه ایکس که با یک آشکارساز نیمه هادی پراکنده انرژی جمع آوری می شود، برای شناسایی عناصر موجود در نمونه، با وضوح، در بهترین حالت، 30 نانومتر استفاده می شود. درکلیهدر میدان، میکروآنالیز اشعه ایکس با موفقیت توسط Beck و Thurau برای مطالعه انتقال یون لوله ترانس اپیتلیال [15] و غلظت عنصر درون سلولی در سلول های لوله ای [16] مورد استفاده قرار گرفت.

تجسم فیزیولوژی کلیه با میکروسکوپ چند فوتونی

میکروسکوپ چند فوتونی (MPM) پیشرفت بیشتری در این زمینه ایجاد کردکلیهتحقیق، یعنی امکان بررسی همزمان عملکرد کلیه و روابط ساختاری در زمان واقعی [17]. بر خلاف میکروسکوپ های نوری معمولی، تحریک دو فوتونی به جذب همزمان دو فوتون با طول موج دوبرابر تحریک بستگی دارد که برای تحریک فلوروفور در تحریک کلاسیک تک فوتونی لازم است (شکل 1D). استفاده از لیزرهای مادون قرمز پالسی در دسترس تجاری با تحریک کم انرژی، نفوذ بافت عمیق را افزایش داد و سمیت نوری را به حداقل رساند (شکل 1D). این به محققان امکان داد تا فرآیندهای سلولی پویا را مستقیماً در حیوانات زنده تجسم کنند، ویژگی که قبلاً با هیچ تکنیک دیگری قابل دستیابی نبود. MPM امکان تعیین کمیت عملکردهای اساسی کلیوی و تغییرات پاتولوژیک مانند نفوذپذیری گلومرولی، جریان خون عروقی، نرخ فیلتراسیون گلومرولی تک نفرون و جریان لوله ای [17] را فراهم می کند (شکل 1E و F). علاوه بر این، MPM امکان مطالعه فرآیندهای درون سلولی در پاسخ به آسیب، از جمله مرگ و ریزش سلولی، چرخش لکوسیت، و استخدام و اختلالات GBM را فراهم می‌کند [17]. پیشرفت‌های فنی بیشتر امکان تصویربرداری طولانی‌مدت درون حیاتی را طی چند روز تا هفته‌ها فراهم کرده است [18] که در ترکیب با موش‌های تراریخته که پروتئین‌های فلورسنت را بیان می‌کنند، برای ردیابی سرنوشت تک سلولی مستقیماً در داخل بدن در کلیه‌های سالم و آسیب‌دیده استفاده شده است [19] و مکانیسم های گردش و بازسازی سلول های کلیوی را بهتر درک کنید.

تکنیک‌های تصویربرداری بدون برچسب نیز با MPM امکان‌پذیر بود و از اتوفلورسانس طبیعی نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید هیدرات (NADH) برای مطالعه وضعیت ردوکس سلول‌های لوله‌ای پس از آسیب استفاده می‌کرد [20]. علاوه بر این، نسل دوم هارمونیک از کلاژن فیبریلار برای تعیین کمیت رسوب کلاژن، نشانگر فیبروز کلیه استفاده شد [21]. نسل دوم هارمونیک یک فرآیند نوری غیر خطی است که در آن دو فوتون تحریک با طول موج یکسان با ساختارهای غیر مرکز متقارن در بافت‌های بیولوژیکی مانند کلاژن یا میکروتوبول‌ها برهمکنش می‌کنند و یک فوتون جدید با نیمی از طول موج تولید می‌کنند.

یک نوآوری اخیر در میکروسکوپ داخل حیاتی، معرفی یک آندوسکوپ چند فوتونی کوچک بود که با موفقیت برای تصویربرداری از کلیه‌ها در موش‌های زنده بیهوش استفاده می‌شد [22]. این MPM با حداقل تهاجم ممکن است راه را برای تشخیص در زمان واقعی in vivo، بدون برداشتن بافت و در مدت زمان بسیار کوتاه هموار کند.

کلیه در سه بعدی: تکنیک های پاکسازی بافت و میکروسکوپ انبساط

با وجود پیشرفت های تکنولوژیکی، یکی از محدودیت های اصلی برای تصویربرداری حجمی عمیق تر، کدورت بافت کلیه است که باعث می شودکلیهیکی از چالش برانگیزترین اندام های نوری به همین دلیل است که تکنیک های پاکسازی بافت توجه زیادی را به خود جلب کرده است [23]. هدف از این رویکردها تبدیل یک بافت مات به یک بافت شفاف، حفظ پروتئین ها و در نهایت نشانگرهای فلورسنت، برای تصویربرداری از برش های بافت ضخیم است. ترکیب پاکسازی نوری با میکروسکوپ پیشرفته امکان تجزیه و تحلیل مورفومتریک، مانند تعیین کمیت حجم و تعداد گلومرولی را در بافت های ضخیم یا حتی در کلیه دست نخورده فراهم می کند [24]. کاربردهای دیگر عبارتند از تجزیه و تحلیل بخش های مجزای لوله [25]، عملکرد آنها [26] و کمی سازی از دست دادن سلول های پودوسیت [27].

برای تصویربرداری حجم زیادی از بافت و در عین حال، حل جزئیات ساختاری ظریف، اخیراً یک رویکرد فنی جدید معرفی شده است، یعنی میکروسکوپ انبساط (ExM). ایده این است که به صورت فیزیکی کل یک اندام 4- تا 5-تا شود و در عین حال ساختار کلی و محتوای پروتئوم سه بعدی حفظ شود. با استفاده از یک پلیمر در حال انبساط، که مستقیماً در داخل نمونه سنتز می‌شود، مولکول‌های نزدیک‌تر از حد پراش نور به صورت همسانگرد در فضا تا فواصل بزرگ‌تر از هم جدا می‌شوند و بنابراین می‌توانند حتی با یک میکروسکوپ فلورسنت معمولی به صورت نوری تفکیک شوند. علاوه بر این، ExM شفافیت نوری بیشتری را فراهم می کند و پراکندگی نور را کاهش می دهد و به فرد اجازه می دهد حجم بیشتری از بافت را تجسم کند. با استفاده از این رویکرد، مکان یابی چندین پروتئین در دیافراگم شکاف و GBM را می توان حتی با یک میکروسکوپ کانفوکال معمولی تشریح کرد [28]. به عنوان مثال، می‌تواند در موش‌های پروتئینوریک، فرآیند پا را در دو بعدی و سه بعدی، با وضوح نانومتری که قبلاً هرگز به آن نرسیده بود، نشان دهد [29]. اخیراً ExM برای ارزیابی منطقی هیستوپاتو بالینی نمونه‌های جاسازی‌شده در پارافین که قبلاً با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شده‌اند استفاده شده است [30]. این تکنیک می‌تواند از بین بردن فرآیند پا را در سطح نانومقیاسی که قبلاً فقط با EM امکان‌پذیر بود، انجام دهد. پیشرفت‌ها در تصویربرداری حجمی امکان تجزیه و تحلیل سه‌بعدی با وضوح بالا را از کل اندام فراهم می‌کند، به گونه‌ای که محدودیت اصلی برای تصویربرداری عمیق اکنون با ظرفیت نفوذ آنتی‌بادی‌ها به بافت نشان داده می‌شود.

مطالعه نمایه متابولیک: میکروسکوپ تصویربرداری فلورسانس دامنه فرکانس - طول عمر

اینکلیهیک اندام متابولیک با محتوای بالای میتوکندری است. شکل کاهش یافته NADH و سایر متابولیت ها به طور طبیعی فلورسنت هستند و این اتوفلورسانس می تواند به عنوان شاخصی از حالت ردوکس استفاده شود [20]. با این حال، طیف انتشار این فلوروفورهای درون زا با هم تداخل دارند و شناسایی آنها به طور جداگانه غیرممکن بوده است. اما طول عمر فلورسانس (یعنی فروپاشی زمانی فلورسانس) به طور قابل توجهی متفاوت بود. از این رو میکروسکوپ تصویربرداری طول عمر فلورسانس (FLIM) امکان مطالعه پروفایل های متابولیک را فراهم می کند [31]. اخیراً، با استفاده از ترکیبی از MPM و FLIM، مشخص کردن امضاهای متابولیک سلولی و نظارت بر تغییرات متابولیک در داخل بدن در طول زمان ممکن شده است.کلیهبیماری [32]. انتظار می رود FLIM بینش های بیشتری را در این زمینه ارائه دهدکلیهمتابولیسم in vivo در سلامت و بیماری

فشار دادن وضوح فراتر از محدودیت ها: تصویربرداری با وضوح فوق العاده از کلیه

میکروسکوپ نوری استاندارد با محدودیت وضوح نوری فراتر از 200 نانومتر مواجه است. فناوری‌های جدید که به آن تصویربرداری با وضوح فوق‌العاده گفته می‌شود، اکنون به میکروسکوپ فلورسنت اجازه می‌دهد تا فراتر از حد پراش خود به عنوان نقطه شروع عصر نانوسکوپی تصویربرداری کند [33]. این رویکردها وضوح نانوسکوپی را با مزایای برچسب‌گذاری فلورسانس چند رنگ ترکیب می‌کنند. با توجه به تأثیر بالقوه این نوآوری ها، جایزه نوبل شیمی 2014 به اریک بتزیگ، استفان هل و ویلیام مورنر برای توسعه میکروسکوپ فلورسانس فوق تفکیک شده اهدا شد. استراتژی‌های مختلف تصویربرداری با وضوح فوق‌العاده را می‌توان برای رسیدگی به سوالات مختلف بیولوژیکی به کار برد. این رویکردها را می‌توان به دو دسته اصلی دسته‌بندی کرد، بسته به اینکه از وضوح فوق‌العاده در سطح تک مولکول‌ها یا در مجموعه‌ها استفاده شود [33].

تکنیک های گروه محور

تکنیک های مبتنی بر مجموعه با تعدیل زمانی و مکانی پرتو نور تحریک، حد پراش را می شکنند. در میان آن‌ها، تصویربرداری کاهش انتشار تحریک‌شده با وضوح فوق‌العاده (STED) از دو لیزر، یک لیزر تحریک و یک لیزر تخلیه با جابجایی قرمز (STED)، با شکل دونات برای سرکوب انتشار فلورسانس از فلوروفورهای واقع در خارج استفاده می‌کند. مرکز برانگیختگی این سرکوب از طریق انتشار تحریک شده به دست می‌آید و اجازه می‌دهد فقط سیگنالی را که از یک نقطه کانونی با ابعادی کمتر از حد پراش نشات می‌گیرد جمع‌آوری کرد (شکل 2A). تصویربرداری STED برای تصویربرداری از دیافراگم شکاف در حالت پاکسازی نوری استفاده شدکلیهبافت ها (شکل 2B-c') و امکان محلی سازی توزیع فضایی پودوسین و نفرین در مقیاس نانومتری تا حداقل 30 میلی متر عمق [34] را فراهم کرد. بعلاوه، امکان مشاهده و کمیت ریزش فرآیند پا در یک مدل تجربی می تواند تصویربرداری STED را برای مطالعات سد فیلتراسیون گلومرولی مفید کند [34].

میکروسکوپ STED به پروتکل های خاصی برای آماده سازی نمونه، فلوروفورهای خاص و آموزش فنی نیاز دارد. به همین دلیل، در چند سال اخیر توجه بیشتری به تکنیک فوق‌العاده دیگری، میکروسکوپ روشنایی ساختاریافته (SIM) شده است، که می‌تواند حد پراش را با ضریب دو به صورت جانبی و محوری افزایش دهد. سیم کارت از یک تنظیم میکروسکوپ میدان گسترده با الگوی روشنایی با نوارهای ریز استفاده می‌کند که امکان ثبت اطلاعات با فرکانس بالا (مرتبط با جزئیات دقیق در نمونه) را در فرکانس‌های فضایی پایین‌تر فراهم می‌کند. با به دست آوردن تصاویر متعدد با الگوهای روشنایی فازها و جهت های مختلف، می توان یک تصویر با وضوح بالا را بازسازی کرد (شکل 3A). سیم کارت با فلوروفورهای استاندارد سازگار است، نیازی به آماده سازی نمونه خاصی ندارد و اجازه تجسم سه بعدی را می دهد. با توجه به تمام این مزایا، مطالعات مختلفی برای ارزیابی امکان استفاده از سیم کارت به عنوان یک ابزار تشخیصی سریع [35] انجام شد، به عنوان مثال، با زمان چرخش بالقوه کوتاه‌تر از EM. اخیراً یک سیم‌کارت سه‌بعدی و پردازش تصویر خودکار به‌عنوان یک ابزار تشخیصی سریع برای برداشتن فرآیند پا با استفاده از بخش‌های معمول پارافین از نمونه‌برداری‌های بیماران با بیماری حداقل تغییر [36] استفاده شده است (شکل 3B و C). این ظرفیت برای شناسایی موفقیت‌آمیز تغییرات در بیماری‌هایی که آسیب‌شناسی در مقیاس نانو را نشان می‌دهند، سیم کارت را به عنوان ابزاری امیدوارکننده برای تشخیص‌های معمول تأیید کرد.

روش های تصویربرداری مبتنی بر محلی سازی تک مولکولی

این تکنیک‌ها بر امکان روشن و خاموش کردن چرخه‌ای مولکول‌های فلورسنت تکی که خیلی نزدیک به آن هستند تکیه می‌کنند. در این رویکردها، مولکول‌ها در یک منطقه محدود پراش را می‌توان در نقاط زمانی مختلف فعال کرد تا بتوان آنها را به‌صورت جداگانه تصویربرداری کرد و متعاقباً با یافتن محاسباتی مراکز آنها با دقت نانومتری محلی‌سازی شد (شکل 3D). در میان این رویکردها، میکروسکوپ بازسازی نوری تصادفی (STORM) برای اولین بار درکلیهتحقیق در سال 2013، با مطالعه‌ای که سازمان‌دهی مولکولی پیچیده GBM را با دقت نانومتری، از جمله جهت‌گیری مولکول‌ها در داخل [37] نشان داد. در یک مدل موش از یک سندرم نفروتیک مادرزادی نادر، STORM یکپارچگی و جهت گیری صحیح لامینین 521 را در داخل GBM به دنبال تزریق داخل وریدی نشان داد و راه را برای گزینه های درمانی پیشرفته برای بیماران باز کرد [38]. مطالعه دیگری سازماندهی اسکلت سلولی اکتین را در سلولهای پادوسیت در مقیاس مولکولی توصیف کرد [39] (شکل 3E-I). به عنوان یک یافته جدید، پودوسیت ها حاوی بسته های اکتین انقباضی مرتبط با بسته های اکتین غیر انقباضی در فرآیندهای پا هستند. در مدل‌های آسیب پودوسیت، ساختار اکتین در پا از هم جدا می‌شود که منجر به فروپاشی ساختار انقباضی در بدن اصلی می‌شود [39].

تجسم ساختارهای سه بعدی بیومولکول های اساسی در سطح اتمی: میکروسکوپ کرایو الکترونی

تا همین اواخر، امکان مطالعه ساختار زیست مولکول های بنیادی به میکروسکوپ الکترونی با وضوح چند نانومتر محدود می شد. موانع فنی، مانند آسیب نمونه توسط پرتوهای الکترونی شدید، کنتراست تصویر کم، و حرکات مولکول پس از برهمکنش با الکترون‌ها یا مشکلات حفظ آب در نمونه‌های بیولوژیکی در خلاء اعمال شده در داخل محفظه EM، که تشخیص مولکول‌های زیر این اندازه را غیرممکن می‌کند. . خنک کردن نمونه می تواند تبخیر آب و آسیب ناشی از الکترون را کاهش دهد [40]. از این ایده، cryo-EM در دهه 1950 معرفی شد. چند سال پیش، معرفی آشکارساز شمارشگر تک الکترونی جدید سرانجام وضوح را فراتر از محدودیت های قبلی برد. در سال 2017، جایزه نوبل شیمی به ژاک دوبوشه، یواخیم فرانک و ریچارد هندرسون برای «توسعه میکروسکوپ الکترونی کرایو برای تعیین ساختار با وضوح بالا بیومولکول‌های موجود در محلول» اهدا شد. این پیشرفت ها اکنون امکان تعیین ساختاری مولکول های زیستی در محلول را فراهم می کند [41].

که درکلیهتحقیقات، ساختار پروتئین های بنیادی در سطح اتمی تعیین شد [42، 43]. از جمله ساختار پلی سیستین انسانی-2 که جهش های آن مسئول پلی کیستیک اتوزومال غالب است.کلیهبیماری [44]، و ساختار کانال 6 یونی متعارف بالقوه گیرنده گذرا، که جهش آن باعث ایجاد FSGS در انسان می شود [43]، با وضوح چند آنگستروم [44] تعیین شد.

درک پایه مولکولی بیماری های کلیوی: میکروسکوپ کلیوی یکپارچه

در چند سال اخیر، شاهد افزایش علاقه به روش‌های بدون برچسب بوده‌ایم که می‌توانند به طور خاص و همزمان طیف کل مولکول‌ها را در بافت‌ها نقشه‌برداری کنند [45]. در میان آنها، طیف سنجی جرمی تصویربرداری واجذب/یونیزاسیون لیزری با ماتریس (MALDI-IMS) امکان اندازه گیری صدها مولکول مختلف را به طور همزمان روی مقاطع بافتی با وضوح بالا فراهم می کند. در آزمایش MALDI-IMS، یک بخش بافت نازک، منجمد یا جاسازی شده با پارافین، با ماتریکسی پوشانده می‌شود که انرژی لیزر را جذب می‌کند و باعث یونیزاسیون آنالیت‌های بافت می‌شود. تجزیه و تحلیل در طیف سنج جرمی یک طیف برای هر مختصات x/y ایجاد می کند. پس از اندازه گیری MALDI، همان بخش بافت را می توان با روش های سنتی هیستوشیمیایی و ایمونوهیستوشیمی رنگ آمیزی کرد تا الگوی مولکولی با جزئیات بافت شناسی ادغام شود. در تحقیقات کلیوی، MALDI-IMS برای مطالعه داروها، متابولیت ها، لیپیدها، پپتیدها و پروتئین ها در بافت های نرمال و بیمار استفاده می شود [45].

یکی از رایج ترین کاربردهای MALDI-IMS شناسایی نشانگرهای مولکولی برای طبقه بندی کارسینوم سلول کلیوی [46] و ایجاد حاشیه واقعی بین بافت سرطانی و طبیعی در سطح مولکولی و همچنین بافت شناسی است [47]. MALDI-IMS همچنین با موفقیت برای مطالعه سمیت داروهای کلیوی برای تشخیص زودهنگام سموم استفاده شده است.کلیهمکانیسم های آسیب با واسطه نامزدهای دارویی [48]. علاوه بر این، MALDI-IMS برای مطالعه لیپیدها و نقش آنها در پاتولوژی های کلیوی، مانند نفروپاتی دیابتی [49]، آسیب حاد کلیه [50] و پلی کیستیک استفاده می شود.کلیهبیماری [51]، و همچنین برای آشکار کردن پروفایل های متابولیک درون زا برای درک عمیق تر مکانیسم های مرتبط با بیماری [52]. شناسایی پروفایل های مولکولی نیز برای نشانگرهای زیستی احتمالی که می توانند نشانگرهای زیستی تشخیصی و پیش آگهی بالقوه جدیدی باشند، نهایی شد [53، 54].

نتیجه گیری و چشم اندازهای آینده

پیشرفت های مداوم در تکنیک های تصویربرداری به تدریج بسیاری از موانع فنی حیاتی را حل کرده استکلیهتحقیقات انجام شده و به تصویری پویا از ساختار و عملکرد کلیه های نرمال و بیمار اجازه داده اند. در واقع، ظهور فن‌آوری‌های میکروسکوپی جدید اکتشافات علمی بنیادی را امکان‌پذیر کرده است و متعاقباً دیدگاه ما را نسبت به فیزیولوژی و پاتوفیزیولوژی کلیه تغییر داده است که اکنون می‌توان آن‌ها را به صورت سه‌بعدی تجسم کرد و حتی در فیلم‌ها فیلم‌برداری کرد، جایی که زمان نمایانگر بعد چهارم است. با نوآوری فناوری اخیر میکروسکوپ با وضوح فوق العاده و پیشرفت تکنیک های تصویربرداری مولکولی، محققان اکنون می توانند مولکول های زیستی فردی را مستقیماً در بافت ها تجسم کنند و نحوه تعامل آنها در سطوح سلولی و درون سلولی را تعیین کنند.

امکان استفاده از این ابزارها برای آسیب شناسیکلیهنمونه ها با تمرکز بر جزئیات مولکولی و درون سلولی در بیوپسی های بالینی، باید به طبقه بندی مجدد بیماری کمک کنند. در حال حاضر مشخص نیست که آیا و چه زمانی این امر بر تشخیص بیماری کلیوی یا حتی مدیریت بیمار تأثیر می گذارد.

منابع مالی

بودجه توسط شورای تحقیقات اروپا تحت برنامه تحقیقات و نوآوری افق 2020 اتحادیه اروپا (توافقنامه کمک مالی 648274) ارائه شده است.

منابع

1. ویینگ جی جی، جنت جی سی. نقاط عطف تاریخی در آسیب شناسی کلیه Virchows Arch 2012; 461: 3-11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. بولونیا 1666

3. Bowman W. در مورد ساختار و استفاده از بدن Malpighian ازکلیه، با مشاهدات روی گردش خون از طریق آن غده. Philos Trans R Soc A 1842؛ 132:57-80

4. D'Agati VD، Mengel M. ظهور آسیب شناسی کلیه در نفرولوژی: ساختار عملکرد را روشن می کند. من جیکلیهدیس 2013; 61: 1016-1025

5. Ohno Y، Birn H، Christensen EI. میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال in vivo و میکروپانکچر در موش‌های دست نخورده. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S، Angelotti ML، Antonelli G. CXCL12 محاصره ترجیحاً سلول‌های از دست رفته را در نفرون‌های قشر مغز با هدف قرار دادن یک مکانیسم بازخورد ذاتی پودوسیت-پیش‌ساز بازسازی می‌کند.کلیهInt 2018; 94:1111-1126

7. Lazzeri E، Angelotti ML، Paired A و همکاران. هیپرتروفی سلول های توبولی مرتبط با اندوسکل و تکثیر پیش ساز، عملکرد کلیه را پس از حاد بهبود می بخشد.کلیهصدمه. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M، Kriz W. بینش های جدید در مورد الگوهای ساختاری در گلومرولواسکلروزیس. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184-191 9. Tisher CC. آناتومی عملکردیکلیه. Hosp Pract 1978; 13

10. Liapis H. میکروسکوپ الکترونی درکلیهتحقیق: دیدن باور کردن است. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340-345

11. قوی ML، Evers P. بعد سوم در تشخیص کلیه. میکروسکوپ الکترونی روبشی کلیه های طبیعی و غیر طبیعی. S Afr Med J 1979; 55:174-177

12. Gagliardini E، Conti S، Benigni A و همکاران. تصویربرداری از فراساختار متخلخل شکاف فیلتراسیون اپیتلیال گلومرولی. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F، Tian X، Inoue K و همکاران. وینکولین برای حفظ یکپارچگی سد گلومرولی مورد نیاز است.کلیهInt 2018; 93: 643-655

14. Ichimura K، Kakuta S، Kawasaki Y و همکاران. فرآیند مورفولوژیکی رشد سلول‌های پودوسیت با میکروسکوپ الکترونی روبشی بلوک صورت آشکار شد. J Cell Sci 2017; 130: 132-142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX et al. ریزآنالیز اشعه ایکس الکترون پروب انتقال یون ترانس اپیتلیال. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245-259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. غلظت عناصر درون سلولی در سلول های لوله کلیوی تجزیه و تحلیل میکروپروب الکترونی Klin Wochenschr 1979؛ 57: 993-999

17. پتی-پتردی جی، کیدوکورو کی، ریکیر-بریسون آ. تکنیک های جدید در داخل بدن برای تجسمکلیهآناتومی و عملکرد Kidney Int 2015; 88: 44-51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. تحریک چند فوتونی با طول موج بلند برای درون حیاتی سودمند استکلیهتصویربرداریکلیهInt 2016; 89: 712-719

19. Hackl MJ، Burford JL، Villanueva K و همکاران. ردیابی سرنوشت سلول‌های اپیتلیال گلومرولی در داخل بدن با استفاده از تصویربرداری مولتی فوتونی سریال در مدل‌های جدید موش با برچسب‌های اصل و نسب فلورسنت. Nat Med 2013; 19: 1661-1666

20. هال AM، Unwin RJ، Parker N، و همکاران. تصویربرداری چند فوتونی تفاوت‌هایی را در عملکرد میتوکندری بین بخش‌های نفرون نشان می‌دهد. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293-1302