در طراحی سیلیکونی واکسن چند اپی توپی کایمریک بی‌رویه علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس قسمت 1

خلاصه

سل (TB) یک تهدید جهانی برای سلامتی است و سالانه حدود 1.5 میلیون نفر را می کشد. ریشه کنی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، عامل اصلی بیماری سل، به دلیل ظهور سویه های مقاوم به دارو به طور فزاینده ای چالش برانگیز است. واکسیناسیون به عنوان یک راه موثر برای محافظت از میزبان در برابر عوامل بیماری زا در نظر گرفته می شود، اما تنها واکسن تایید شده بالینی سل، Bacillus Calmette-Guérin (BCG)، حفاظت محدودی در بزرگسالان دارد. واکسن‌های چند اپی توپی با ترکیب انتخابی اپی توپ‌ها از چندین پروتئین کاندید، ایمنی را در برابر بیماری‌ها تقویت می‌کنند.

سل یک بیماری عفونی ناشی از باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس است که عمدتاً ریه ها را درگیر می کند اما ممکن است سایر اندام ها را نیز درگیر کند. ایمنی نقش مهمی در ایجاد و درمان سل دارد.

در صورت عدم ایمنی کافی، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می تواند به راحتی به بدن انسان حمله کند و به سل تبدیل شود. به عنوان مثال، سیستم ایمنی ضعیف ناشی از بیماری ها یا درمان های پزشکی خاص، خطر ابتلا به سل را افزایش می دهد. علاوه بر این، عواملی مانند سوءتغذیه، کیفیت پایین زندگی و استرس بیش از حد نیز ممکن است ایمنی را تضعیف کرده و منجر به ایجاد سل شود.

بنابراین حفظ سلامتی و تقویت سیستم ایمنی برای پیشگیری از سل بسیار مهم است. ایمنی را می توان از طریق یک رژیم غذایی سالم، سبک زندگی منظم، ورزش مناسب و خواب کافی تقویت کرد که می تواند به طور موثر خطر ابتلا به بیماری های مختلف از جمله سل را کاهش دهد.

هنگامی که سل قبلاً رخ داده است، ایمنی نیز برای درمان و بهبودی مهم است. هرچه سیستم ایمنی قوی‌تر باشد، بدن می‌تواند به طور مؤثرتری از خود در برابر حمله باسیل سل دفاع کند و آنتی‌بادی‌های کافی برای مبارزه با این بیماری تولید کند. بنابراین، حفظ تغذیه کافی، ورزش مناسب و نگرش مثبت می تواند ایمنی را بهبود بخشد و بهبودی را بهبود بخشد.

در نتیجه، یک رابطه قوی بین ایمنی و سل وجود دارد. حفظ سلامتی و تقویت سیستم ایمنی یکی از راه های مهم پیشگیری و درمان سل است. بیایید با زندگی مثبت روبرو شویم، سبک زندگی سالمی داشته باشیم و از بیماری ها دوری کنیم. از این منظر، ما باید ایمنی خود را تقویت کنیم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد، زیرا خاکستر گوشت حاوی انواع مختلفی از اجزای فعال بیولوژیکی مانند پلی ساکاریدها، دو قارچ، هوانگ لی و غیره است.

روی فواید سلامتی سیستانچ کلیک کنید

این مطالعه با هدف طراحی یک واکسن چند اپی توپی علیه سل با استفاده از رویکرد ایمونو انفورماتیک انجام شد. از طریق غنی سازی عملکردی، ما هشت پروتئین ترشح شده توسط M. tuberculosis را شناسایی کردیم که یا برای پاتوژنز لازم هستند، یا به فضای خارج سلولی ترشح می شوند، یا هر دو. سپس اپی توپ های این پروتئین ها را تجزیه و تحلیل کردیم و 16 اپی توپ لنفوسیت T کمکی با فعالیت القای اینترفرون، 15 اپی توپ لنفوسیت T سیتوتوکسیک و 10 اپی توپ سلول B خطی را انتخاب کردیم و آنها را با ادجوانت و Pan HLA DR-binding epie مناسب (PADRE) کونژوگه کردیم. پیوند دهنده ها

علاوه بر این، ما ساختار سوم این واکسن، تعامل بالقوه آن با گیرنده Toll-Like-4 (TLR4) و پاسخ ایمنی که ممکن است ایجاد کند را پیش‌بینی کردیم. نتایج نشان داد که این واکسن میل ترکیبی قوی با TLR4 دارد که می‌تواند سلول‌های CD4 پلاس و CD8 پلاس را برای ترشح فاکتورهای ایمنی و لنفوسیت‌های B برای ترشح ایمونوگلوبولین‌ها برای به دست آوردن ایمنی هومورال و سلولی خوب تحریک کند. به طور کلی، این پروتئین چند اپی توپی پایدار، ایمن، بسیار آنتی ژنی و بسیار ایمنی زا پیش بینی شده بود که این پتانسیل را دارد که به عنوان یک واکسن جهانی علیه سل عمل کند.

1. معرفی

سل (TB)، یک بیماری بسیار مسری که توسط مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایجاد می شود، توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) به عنوان اولین علت مرگ و میر ناشی از یک عامل عفونی واحد رتبه بندی شده است [1-3]. در سال 2021، تعداد تخمینی مرگ و میر ناشی از سل و موارد جدید به ترتیب به 1.6 میلیون و 10.6 میلیون نفر رسید [4]. در حال حاضر، درمان بالینی سل نسبتاً کمیاب است و ترکیبی از داروهای ضد میکروبی متعدد عمدتاً استفاده می شود.
این چرخه شیمی درمانی بسیار طولانی است، معمولاً نه تا دوازده ماه یا حتی بیشتر طول می کشد [5]، که خطر جهش های مقاوم به دارو در M. tuberculosis را افزایش می دهد [6،7]. در سال‌های اخیر، شیمی‌درمانی به دلیل ظهور و افزایش نسبت M. tuberculosis با چند دارو و به شدت مقاوم به دارو، کمتر مؤثر بوده است [6]. پیشگیری از ابتلا به سل ممکن است موثرتر از درمان آن باشد. واکسیناسیون به خوبی شناخته شده است که یک راه موثر برای محافظت از میزبان در برابر باکتری های بیماری زا است [8].

در حال حاضر، Bacillus Calmette-Guérin (BCG) که بیش از 100 سال پیش ساخته شد، تنها واکسن سل مورد تایید بالینی است [9]. متأسفانه، BCG فقط از نوزادان و نوزادان محافظت می کند و تا حد زیادی در برابر نوجوانان و بزرگسالان بی اثر است [2،10]، اگرچه WHO گزارش می دهد که 89 درصد موارد سل در سال 2021 بزرگسالان بودند [4]. بنابراین، نیاز فوری به ساخت واکسن جدید و موثر ضد سل، به ویژه برای نوجوانان و بزرگسالان وجود دارد.

توسعه واکسن سل توسط ویژگی های متعدد مایکوباکتری ها، مانند عفونت نهفته، تداوم و فرار سیستم ایمنی پیچیده است [11-13]. یک واکسن ایده‌آل سل باید برای هدف قرار دادن پروتئین‌ها/مسیرهای مسئول این ویژگی‌ها در M. tuberculosis طراحی شود و بتواند به طور موثری پاسخ‌های ایمنی با واسطه سلول‌های T CD4 و CD8 را القا کند [14].

علاوه بر این، یک واکسن موثر باید کمپلکس‌های سازگاری بافتی میزبان (MHC) را که به شدت پلی‌مورفیک هستند، هدف قرار دهد [15]. این ویژگی ها الزامات بسیار بالایی را برای تطبیق پذیری واکسن مطرح می کند، که بدیهی است که با یک پروتئین طبیعی نمی توان به آن دست یافت. واکسن چند اپی توپی، یک پروتئین نوترکیب متشکل از مجموعه ای از اپی توپ ها (پپتیدها) [16] که همپوشانی دارند، یک نوع جدید از واکسن نامزد است که ممکن است مسائل فوق را برطرف کند.

در سال‌های اخیر، واکسن‌های چند اپی توپی به دلیل مزایای ایمنی بالاتر و حساسیت‌زایی کمتر نسبت به واکسن‌های معمولی، توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند [17،18]. در حال حاضر، واکسن‌های چند اپی توپی علیه بسیاری از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا از جمله Shigella spp طراحی شده‌اند. [19]، ویروس تب برفکی [20]، هلیکوباکتر پیلوری [21،22]، ویروس هپاتیت B [23]، توکسوپلاسما گوندی [24]، لیشمانیا اینفانتوم [25]، ویروس نیپا [26]، Onchocerca volvulus [27]، سودوموناس آئروژینوزا [28] و ویروس لوکوز [29].

به طور خاص، ظهور همه‌گیری COVID{0}} کاربرد این فناوری را تقویت کرده است [16,30-32]. در مورد سل، چندین واکسن چند اپی توپی برای هدف قرار دادن سل ذاتا فعال [33-39] و سل نهفته [40،41] طراحی شده است. در میان آنها، سه نامزد واکسن به شکل DNA طراحی شدند [34،36،40]، و دو تای آنها اپی توپ هایی را در ستون فقرات پروتئینی برای تولید واکسن های نوترکیب وارد کردند [34،36].

لازم به ذکر است که پروتئین های کاندید برای برخی از واکسن های چند اپی توپی فوق به صورت تصادفی انتخاب می شوند و پوشش جمعیتی این واکسن ها نیاز به مطالعات بیشتری دارد.

علاوه بر این، دو کاندید واکسن سل چند اپی توپی با پوشش جمعیتی وسیع طراحی شدند، یک اپی توپ از پروتئین های وزیکول اگزوزوم ایمونوژنیک با خواص بیماری زایی [39] انتخاب شد، و دیگری بر روی پروتئین های کاندید تمرکز نمی کند، اما مستقیماً بسیار حفاظت شده و تایید شده تجربی را انتخاب می کند. اپی توپ ها از پایگاه داده اپی توپ ایمنی (IEDB) [38]. با این حال، این پروتئین‌های کاندید فاقد غنی‌سازی عملکردی هستند، و توانایی واکسن‌های کاندید برای القای ترشح اینترفرون (IFN-) همچنان باید بهبود یابد.

یک مطالعه قبلی استنباط کرده است که بهینه سازی منطقی اپی توپ ها را می توان با ترکیبی از ظرفیت اتصال MHC و توانایی اپی توپ برای واکنش با گیرنده های سلول T بدست آورد [42]. علاوه بر این، آن‌ها پیش‌بینی کردند که واکسن‌هایی با اپی توپ‌های اتصال لنفوسیت T سیتوتوکسیک (CTL) A1، A2، A3، A24 و B7 تقریباً 100 درصد در گروه‌های قومی اصلی (سیاه‌پوستان، آسیایی‌ها، اسپانیایی‌ها و قفقازی‌ها) پوشش دارند.

با این حال، تاکنون رویکرد مشابهی برای طراحی واکسن سل وجود نداشته است. در این مطالعه، ما یک واکسن سل چند اپی توپی با استفاده از ویژگی‌های آنتی ژنی مختلف هشت پروتئین غنی‌شده با عملکرد طراحی کردیم. نامزد واکسن کایمریک دارای 15 اپی توپ CTL، 16 اپی توپ لنفوسیت T کمکی (HTL) با خواص القای IFN{4}} و 10 اپی توپ سلول B خطی است. تجزیه و تحلیل ایمونو انفورماتیک نشان داد که این نامزد واکسن "همه‌جانبه" است و آن را به سنگ بنای بالقوه برای دستیابی به "استراتژی پایان سل" تبدیل می‌کند.

2. مواد و روش

2.1. انتخاب پروتئین و بازیابی توالی

برای ساختن یک واکسن چند اپی توپی علیه سل، ابتدا پروتئین های کمپلکس M. tuberculosis را انتخاب کردیم که در پایگاه داده IEDB [43] سپرده شده و به عنوان اپی توپ های اتصال MHC کلاس I و II تایید شده اند. توالی اسید آمینه (ساختار اولیه) پروتئین ها از سویه M. tuberculosis H37Rv از پایگاه داده UniProt [44] به دست آمد. پیش‌بینی‌های مستقل از هم‌ترازی آنتی‌ژن‌های آینده نگر بر اساس ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی از سرور VaxiJen 2.{6}} [45] به‌دست آمد که تحت تبدیل خودکار و کوواریانس متقاطع (ACC) توالی‌های پروتئین به یک ناقل یکنواخت از اسید آمینه اصلی قرار گرفت. ویژگی‌ها، با آستانه آنتی‌ژنیسیته 0.4 برای هر پروتئین باکتری [45،46].

حاشیه نویسی عملکردی پروتئین ها با استفاده از پایگاه داده برای حاشیه نویسی، تجسم، و کشف یکپارچه (DAVID) 6.8 [47] ارزیابی شد. پروتئین های ترشح شده با استفاده از دو دسته بیشتر غنی شدند: فضای خارج سلولی و پاتوژنز به ترتیب از طریق پایگاه داده های DAVID و BioCyc [48]. پروتئوم Homo sapiens GRCh38.p13 در قالب FASTA از پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) دانلود شد [49]. از BLASTp برای پیش‌بینی همولوژی (E-value =1e-5) بین پروتئین‌های ترشح شده و پروتئین H. sapiens استفاده شد.

2.2. پیش بینی اپی توپ سلول T

پیش‌بینی و انتخاب اپی توپ‌ها مراحل بسیار مهمی در ساخت واکسن‌های چند اپی توپی است. مولکول های MHC I به پپتیدهای کوتاه (9-11 اسید آمینه) متصل می شوند زیرا شکاف اتصال پپتید مولکول های MHC I متشکل از یک زنجیره واحد بسته است [50]. NetMHCpan{5}}.1 [51] آزادانه در دسترس برای پیش‌بینی اپی توپ‌های CTL استفاده شد، که از NNAlign_MA برای تولید رتبه‌های درصد (رتبه درصد) بر اساس ترکیبی از پیوندهای پیوندی MHC I و لیگاندهای شسته شده استفاده می‌کند. .

"درصد رتبه بندی" یک دنباله پرس و جو با مقایسه امتیاز پیش بینی آن با توزیع نمرات پیش بینی برای MHC مربوطه محاسبه شده با استفاده از مجموعه ای از پپتیدهای بومی به طور تصادفی انتخاب شده تعیین شد. اپی توپ‌هایی با درصد رتبه‌بندی <{0}}.5 درصد باین‌کننده‌های قوی در نظر گرفته شدند، در حالی که اپی توپ‌هایی با درصد رتبه‌بندی کمتر از 2 درصد بایندرهای ضعیف در نظر گرفته شدند [51].

اگرچه تا 12 اپی توپ سوپرتایپ MHC کلاس I را می توان در سرور پیش بینی کرد، ما فقط از A1، A2، A3، A24 و B7 استفاده کردیم زیرا این پنج سوپرتیپ 1{9}}0 درصد از نژادهای اصلی انسان را پوشش می دهند [42] . ما بایندرهای قوی را انتخاب کردیم و آنتی ژنی آنها را با استفاده از VaxiJen2.0 [45] پیش‌بینی کردیم، سپس، ایمنی‌زایی کلاس I را با استفاده از پایگاه بین‌المللی اپی توپ (IEDB) [52] پیش‌بینی کردیم که از اعتبارسنجی متقاطع 3-استفاده می‌کند.

در نهایت، اپی توپ هایی را که هم آنتی ژنی و هم ایمنی زا بودند بر اساس رتبه بندی درصد مرتب کردیم و 15 اپی توپ با امتیاز پایین را انتخاب کردیم، سه اپی توپ برای هر سوپرتیپ و حداقل یک اپی توپ برای هر پروتئین کاندید، به جز یک پروتئین کاندید که نمی توانست اپی توپ اتصال قوی CTL داشته باشد. که آنتی ژن و ایمنی زا است. در نهایت، مقادیر IC50 برای هر اپی توپ CTL از NetMHC{3}}.0 [53] پیش‌بینی شد.
مولکول های کلاس II MHC به پپتیدهای آنتی ژنی متصل می شوند و کمپلکس حاصل را می توان با HTL تشخیص داد. به طور معمول، طول پپتیدهای آنتی ژنی از 12 تا 20 باقیمانده اسید آمینه متغیر است، اما پپتیدهایی بین 13 تا 16 باقی مانده در طول اغلب مشاهده می شوند [54].

مرهای {0}} فراوان‌ترین اپی توپ‌های MHC II برای M. tuberculosis بودند و در IEDB نهشته شده‌اند. در نتیجه، ما از NetMHCIIpan-4.0 [51,55] برای پیش‌بینی اتصال پپتیدهای 15-مر به آنتی‌ژن لکوسیت انسانی-DR (HLA-DR)، HLADQ، HLA-DP، استفاده کردیم. و H-2–1 آلل. این پیش‌بینی همچنین بر اساس NNAlign{11}}MA با درصد رتبه‌بندی <2 درصد و <10 درصد به‌ترتیب به‌عنوان بایندرهای قوی و ضعیف در نظر گرفته شد [51].

همچنین، ما با استفاده از سرور IFNepitope [56] که از یک رویکرد ترکیبی ماشین بردار پشتیبانی استفاده می‌کند که امکان غربالگری مجازی پپتید/اپی‌توپ القاکننده IFN در یک پپتید را فراهم می‌کند، 15-اپی توپ‌های القاکننده IFN را برای پروتئین‌های کاندید پیش‌بینی کردیم. کتابخانه ای متشکل از IFN{3}}القایی و غیر القایی بایندرهای MHC II که سلول های T-helper را فعال می کنند. سپس آنتی ژنی اپی توپ‌های القاکننده IFN [45] را پیش‌بینی کردیم و در نهایت، 16 اپی‌توپ ناخوشایند را که اتصال قوی به MHC-II، القاکننده IFN و آنتی‌ژن بودند، انتخاب کردیم.

توجه به این نکته مهم است که پپتیدهای سیگنال قبل از پیش‌بینی اپی توپ از پروتئین‌های کاندید حذف شدند. در این مطالعه، پپتیدهای سیگنال با استفاده از SignalP 5.0 [57] و TargetP2.0 [58] غربالگری شدند.

2.3. پیش بینی اپی توپ سلول B خطی

اپی توپ های سلول های B خطی (16-mers) با استفاده از ABCpred [59،6{4}}] با آستانه پیش فرض 0.51 پیش بینی شد. علاوه بر این، برای افزایش قابلیت اطمینان نتایج پیش‌بینی، از BepiPred 2.{11}} [61] نیز برای پیش‌بینی اپی توپ‌های سلول‌های B خطی استفاده کردیم. اپی توپ های به دست آمده از این دو نرم افزار بیشتر در معرض پیش بینی آنتی ژنیسیته با استفاده از VaxiJen2.0 قرار گرفتند [45]. در نهایت، ما ده اپی توپ خطی سلول B را بر اساس نمرات ABCpred بالا و آنتی ژنی انتخاب کردیم که حداقل یک اپی توپ برای هر پروتئین کاندید انتخاب شد.

2.4. ساخت واکسن کاندید چند اپی توپی با خواص کایمریک

واکسن چند اپی توپی طراحی شده شامل یک ادجوانت HBHA (هماگلوتینین متصل به هپارین)، یک اپی توپ DR-بایدکننده Pan HLA (PADRE)، 15 CTL، 16 HTL، 10 اپی توپ سلول B خطی و یک برچسب His× 6 (شکل 2). 3). پیوند دهنده ها برای پیوستن به اپی توپ ها، جلوگیری از تولید اپی توپ های اتصال، و افزایش روند و بازسازی اپی توپ های منفرد در واکسن های کایمریک استفاده شدند [62].

برای ساخت این واکسن، ادجوانت HBHA (شناسه UniProt: P9WIP9) در انتهای N قرار داشت و از طریق یک پیوند دهنده EAAAK به پایین دست PADRE متصل شد. سپس، اپی توپ های HTL که توسط پیوند دهنده های GPGPG به PADRE متصل شدند. علاوه بر این، اپی توپ های CTL که توسط پیوند دهنده AAY به اپی توپ های HTL متصل شده اند از طریق لینکر HEYGAEALERAG، که همچنین واحد اپی توپ CTL را به اپی توپ های سلول B خطی که با استفاده از پیوندهای KK متصل شده اند، متصل می شوند. در نهایت، یک برچسب His× 6 به C-پایانه پروتئین کایمریک متصل شد.

2.5. خاصیت آنتی ژنی، حساسیت زایی و فیزیکوشیمیایی

آنتی ژنی واکسن چند اپی توپی و پروتئین های هشت جزء توسط سرور VaxiJen 2.{2}} [45] پیش بینی شد، در حالی که حساسیت زایی این پروتئین ها توسط سرور AllerTOP 2 پیش بینی شد.0 [ 63]. AllerTOP 2.{8}} از توصیفگرهای اسید آمینه E، تبدیل ACC توالی پروتئین و k-نزدیکترین همسایه (kNN) برای طبقه بندی آلرژن استفاده می کند.

این روش با اعتبارسنجی متقاطع 5- برابری 85.3 درصد را به دست آورد. برای پیش‌بینی خواص فیزیکوشیمیایی مانند نیمه عمر، نقطه ایزوالکتریک، شاخص ناپایداری، شاخص آلیفاتیک و میانگین کل هیدروپاتیک (GRAVY) این واکسن چند اپی توپی، از سرور ExPASy ProtParam [64] استفاده شد.
علاوه بر این، حلالیت پپتید واکسن چند اپی توپی با استفاده از سرور proteinSol (PROSO II) [65] بر اساس طبقه‌بندی‌کننده‌ای که از تفاوت‌های ظریف بین پروتئین‌های نامحلول معروف TargetDB و پروتئین‌های محلول از TargetDB و PDB استفاده می‌کند، ارزیابی شد. 66]. هنگامی که با استفاده از اعتبارسنجی متقاطع 10- برابری ارزیابی شد، دقت 71.0 درصد (ناحیه زیر منحنی ROC=0.785) به دست آمد.

2.6. شبیه سازی ایمنی

برای توصیف پروفایل پاسخ ایمنی و ایمنی زایی واکسن، شبیه سازی های ایمنی در سیلیکو با استفاده از سرور C-ImmSim [67] انجام شد. C-ImmSim فعل و انفعالات ایمنی را با استفاده از ماتریس‌های امتیازدهی موقعیت خاص که از تکنیک‌های یادگیری ماشین برای پیش‌بینی پپتید مشتق شده‌اند، پیش‌بینی می‌کند.
به طور همزمان سه بخش را شبیه سازی می کند که نشان دهنده سه ناحیه تشریحی مجزا است که در پستانداران یافت می شود: (1) مغز استخوان، جایی که سلول های بنیادی خونساز برای تولید لنفوسیت ها و سلول های میلوئیدی جدید شبیه سازی شدند. (ب) تیموس، که در آن سلول های T ساده برای جلوگیری از خودایمنی انتخاب شدند. و (iii) اندام لنفاوی مانند غدد لنفاوی.

برای پرایم موثر و تقویت واکسن، رویکرد [68] را دنبال کردیم که در آن دو تزریق به فاصله چهار هفته انجام شد. تمام پارامترهای شبیه‌سازی روی مقادیر پیش‌فرض، با مراحل زمانی ۱۰ و ۹۴ تنظیم شدند (هر مرحله زمانی هشت ساعت است).

2.7. پیش بینی منطقه نابسامان

مناطق نابسامان ذاتی (IDRs) در بسیاری از پروتئین ها وجود دارند. منطقه بی نظم با استفاده از DISOPRED3 [69] پیش بینی شد که از DISOPRED2 و دو ماژول دیگر مبتنی بر یادگیری ماشینی آموزش دیده بر روی IDR های بزرگ برای شناسایی باقیمانده های بی نظم استفاده می کند. آنها سپس anno بودند

2.8. پیش بینی ساختار ثانویه و سوم

ساختار ثانویه واکسن طراحی شده توسط سرور PSIPRED 4.{1}} [70] پیش‌بینی شده بود که ابتدا از PSI-BLAST برای شناسایی توالی‌هایی که نزدیک به پروتئین پرس و جو هستند استفاده می‌کند. ساختار سوم این واکسن با استفاده از سرور I-TASSER [71] Iterative Threading Assembly Refinement پیش‌بینی شد.

چهار مرحله کلیدی در مدل سازی ITASSER وجود دارد. الف) شناسایی الگوی نخی؛ ب) شبیه سازی مونتاژ ساختار تکراری. ج) انتخاب و اصلاح مدل؛ و د) حاشیه نویسی عملکردی مبتنی بر ساختار [72،73].

I-TASSER پنج مدل را تولید کرد که با استفاده از ProSA-web [74] غربالگری شدند و مدل با کمترین امتیاز Z برای اصلاح بیشتر انتخاب شد. ProSA-web نمرات مدل به‌دست‌آمده از ساختارهای تأییدشده تجربی سپرده‌شده در PDB را مقایسه می‌کند. نمودار نمره کیفیت محلی به شناسایی مناطق مشکل‌دار در مدل کمک می‌کند و همان نمرات با استفاده از کد رنگی در ارائه ساختار سه‌بعدی نشان داده شد. این برای تعیین اولیه و اصلاح ساختار مفید است.

2.9. اصلاح ساختار سوم

مدل سه بعدی "درشت" نامزد واکسن به دست آمده توسط ITASSER در دو مرحله با استفاده از دو سرور پالایش شد. ابتدا با ModRefiner [75] و سپس GalaxyRefine [76]. ModRefiner از ردپای C برای تأثیر بر ساخت و پالایش پروتئین‌های به‌دست‌آمده از حداقل‌سازی انرژی در سطح اتمی دو مرحله‌ای استفاده می‌کند.

ابتدا، ردپای C برای ساخت زنجیره اصلی، و به دنبال آن اصلاح روتامرهای زنجیره جانبی و اتم‌های ستون فقرات با استفاده از میدان‌های نیروی ترکیبی مبتنی بر فیزیک و دانش مورد استفاده قرار گرفت. GalaxyRefine از چندین الگو برای تولید ساختارهای اصلی قابل اعتماد استفاده می‌کند، در حالی که حلقه‌ها یا پایانه‌های غیرقابل اعتماد با مدل‌سازی مبتنی بر بهینه‌سازی تولید می‌شوند.

2.10. اعتبار سنجی ساختار سوم

ساختار تصفیه‌شده واکسن کاندید توسط نمودارهای Ramachandran تولید شده از پایگاه‌های داده PROCHECK [77] و MolProbity [78] تأیید شد. نمودارهای راماچاندران ساختار ستون فقرات پروتئین ها را با تقسیم بقایای اسید آمینه به دو ناحیه مجاز و غیرمجاز ارزیابی می کنند. PROCHECK از استریوشیمی برای ارزیابی کیفیت خالص ساختارهای پروتئینی با مقایسه آنها با ساختارهای تصفیه شده در همان وضوح و سپس ارائه مناطقی که نیاز به تجزیه و تحلیل بیشتر دارند، استفاده می کند.

Molprobity مدل‌های ماکرومولکول محلی و جهانی (پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک) را با ترکیبی از معیارهای اشعه ایکس، NMR، محاسباتی و cryoEM تأیید می‌کند [79]. قدرت و حساسیت برای بهینه‌سازی مکان‌یابی هیدروژن و آنالیز تماس تمام اتم‌ها به طور گسترده در نسخه به‌روز شده معیارهای هندسه کووالانسی و زاویه پیچش استفاده می‌شود [80].

2.11. اپی توپ های ناپیوسته سلول B

اپی توپ های ناپیوسته سلول B در ساختار پروتئین بومی با استفاده از ElliPro [81] پیش بینی شد. ElliPro سه الگوریتم را برای تقریب شکل پروتئین به‌عنوان یک بیضوی پیاده‌سازی می‌کند، شاخص برآمدگی باقیمانده (PI) را محاسبه می‌کند، و باقیمانده‌های همسایه را بر اساس مقادیر PI آنها خوشه‌بندی می‌کند. ElliPro هر اپی توپ خروجی را با یک امتیاز توصیف شده به عنوان مقدار میانگین PI برای باقیمانده اپی توپ ارائه می دهد. یک بیضی با مقدار PI 9.9 0 از 90 درصد باقیمانده های پروتئینی تشکیل شده است، در حالی که 10 درصد باقی مانده ها در خارج از بیضی قرار دارند. برای هر باقیمانده اپی توپ، مقدار PI از مرکز جرم باقی مانده در خارج از بزرگترین بیضی ممکن محاسبه می شود.

2.12. اتصال مولکولی پروتئین های کایمریک

اتصال مولکولی واکسن طراحی شده (لیگاند) با گیرنده ایمنی Toll-like (TLR4) (PDB ID: 3FXI) با استفاده از Patchdock [82] انجام شد. سپس 10 مدل برتر با استفاده از FireDock [83] اصلاح شدند. PatchDock نمایش سطح نقطه Connolly از مولکول ها را با تکه های مقعر، محدب و مسطح جایگزین می کند.

سپس مدل ها بر اساس برازش هندسی و تجزیه اتمی امتیازدهی شدند. [82]. FireDock ساختارهای زنجیره جانبی و جهت گیری بدنه سفت و سخت را بهینه می کند و خروجی یک مجتمع تصفیه شده سه بعدی را بر اساس انرژی اتصال ایجاد می کند [83]. ما اولین مدل Firedock را بر اساس انرژی جهانی به عنوان مجتمع docking انتخاب کردیم. در نهایت، انرژی اتصال و محتوای تفکیک در مجتمع docking با استفاده از سرور PRODIGY [84] پیش‌بینی شد.

2.13. شبیه سازی دینامیک مولکولی

شبیه‌سازی‌های دینامیکی مولکولی با استفاده از وب سرور سریع و آزادانه، سرور تجزیه و تحلیل حالت عادی مختصات داخلی (iMODS) [85] روی پروتئین‌ها انجام شد و نتایج اتصال سازگار و بهینه از سرور PatchDock-FireDock به‌دست آمد. در مختصات داخلی، آنالیز حالت عادی (NMA) حرکات جمعی حیاتی برای عملکرد ماکرومولکولی ایجاد می کند. iMODS مکانیسم‌هایی را برای بررسی این حالت‌ها به‌عنوان تحلیل ارتعاش، انیمیشن‌های حرکتی و مسیرهای شکل‌گیری ارائه می‌کند که تقریباً به صورت تعاملی در وضوح‌های مختلف انجام می‌شوند [85].

2.14. ترجمه معکوس، بهینه‌سازی کدون و شبیه‌سازی سیلیکو واکسن

برای بیان موثر واکسن در سلول های اشریشیا کلی، cDNA در سیلیکون از طریق بهینه سازی کدون و ترجمه معکوس با استفاده از ابزار سازگاری کدون جاوا (JCAT) [86] تولید شد.

بهینه‌سازی شامل (1) اجتناب از پایان‌دهنده‌های رونویسی مستقل از rho، دوم) اجتناب از سایت‌های اتصال ریبوزوم پروکاریوتی، (iii) اجتناب از محل برش آنزیم‌های محدود NcoI و XhoI، که به عنوان مکان‌های محدود N-ترمینال و C-ترمینال برای درج cDNA عمل می‌کند. الگوی واکسن، و (IV) تنها بهینه‌سازی جزئی برای اعمال جهش‌زایی جهت‌دهی به سایت. شاخص انطباق کدون (CAI) و محتوای GC کیفیت cDNA را با کدون توقف عقیق (TGA) که بعد از تگ His× 6 درج شده است، پیش بینی می کند. سپس، قطعه DNA بهینه‌شده نامزد واکسن کایمریک با استفاده از ابزار SnapGene [87] در رشته معکوس pET{5}}a( plus ) ادغام شد.

For more information:1950477648nn@gmail.com