در طراحی سیلیکونی واکسن چند اپی توپی کایمریک بی‌رویه علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس قسمت 2

 2.15. مروری بر طراحی واکسن چند اپی توپی

شکل 1 مفهوم کلی این طرح واکسن چند اپی توپی را خلاصه کرد. به طور خلاصه، ما آنتی‌ژنیسیته پروتئین‌های M. tuberculosis به‌دست‌آمده از IEDB را تجزیه و تحلیل کردیم و هشت نامزد آنتی ژنی را برای ساخت واکسن چند اپی توپی انتخاب کردیم، با توجه به طبقه‌بندی عملکردی و محلی‌سازی درون سلولی آن‌ها. سپس اپی توپ های آنتی ژنی این هشت پروتئین را پیش بینی کردیم و 15 اپی توپ CTL، 16 اپی توپ HTL و 10 اپی توپ سلول B را انتخاب کردیم که بیشتر از طریق پیوندهای مناسب به ادجوانت HBHA و PADRE مرتبط شدند. علاوه بر این، ما آنتی ژنی، حساسیت زایی، خواص فیزیکوشیمیایی و مشخصات ایمنی واکسن چند اپی توپی طراحی شده را پیش بینی کردیم. در همین حال، ما همچنین ساختارهای ثانویه و سوم واکسن را پیش بینی کردیم و تعامل بالقوه آن را با گیرنده ایمنی TLR4 تجزیه و تحلیل کردیم.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یک پاتوژن شایع است که باعث سل می شود. پروتئین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یکی از اجزای اصلی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس است که برای عملکرد سیستم ایمنی انسان بسیار حیاتی است.

پروتئین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می تواند سیستم ایمنی بدن انسان را فعال کرده و ایمنی بدن را تقویت کند. هنگامی که بدن به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس آلوده می شود، سیستم ایمنی بدن انسان مجموعه ای از پاسخ های ایمنی از جمله فعال شدن و تکثیر سلول های T خاص و سلول های B را ایجاد می کند. این سلول ها می توانند انواع مختلفی از فاکتورهای ایمنی مانند اینترفرون، اینترلوکین و غیره و همچنین آنتی بادی هایی را آزاد کنند تا به بدن در مقاومت در برابر مهاجم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمک کنند.

علاوه بر این، پروتئین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس همچنین می تواند تعادل سیستم ایمنی را تنظیم کند و از آسیب ایمنی ناشی از فعال شدن بیش از حد پاسخ ایمنی بدن جلوگیری کند. در سال‌های اخیر، تحقیق و توسعه واکسن‌های سل نیز عمدتاً بر روی استفاده از پروتئین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس متمرکز شده است که می‌تواند از طریق واکسیناسیون ایمنی سیستم ایمنی انسان را تقویت کرده و به طور موثر از بروز و گسترش سل جلوگیری کند.

بنابراین، پروتئین مایکوباکتریوم توبرکلوزیس برای تأثیر ایمنی انسان بسیار مهم است. با تقویت فعال سیستم ایمنی، از طریق ورزش مناسب و تغذیه مناسب، بهتر می توانید از سل و سایر بیماری های عفونی پیشگیری کنید و سلامت خود را حفظ کنید. از این منظر، ما باید ایمنی خود را تقویت کنیم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد زیرا پلی ساکاریدهای موجود در گوشت می توانند پاسخ ایمنی سیستم ایمنی انسان را تنظیم کنند، توانایی استرس سلول های ایمنی را بهبود بخشند و ایمنی سلول های ایمنی را تقویت کنند. اثر باکتری کش.

روی مکمل cistanche deserticola کلیک کنید

3. نتایج

3.1. بازیابی پروتئین M. tuberculosis برای ساخت واکسن چند اپی توپی

برای ساخت واکسن چند اپی توپی علیه سل، ابتدا آنتی ژنیسیته پروتئین‌ها را در M. tuberculosis H37Rv بررسی کردیم. در مجموع 492 پروتئین با خواص ایمنی تایید شده از پایگاه داده IEDB به دست آمد که 402 پروتئین (81.70 درصد) آنتی ژنی پیش بینی شد. برای توصیف عملکردی این 492 پروتئین، 353 پروتئین در پایگاه داده DAVID غنی شدند، در حالی که 139 پروتئین نبودند. تجزیه و تحلیل محلی سازی نشان داد که 97 پروتئین از 353 پروتئین غنی شده در محفظه خارج سلولی، فضای خارج از سطح سلول قرار دارند. پروتئین های موضعی در بخش خارج سلولی شامل پروتئین های غشای بیرونی و پروتئین های ترشح شده است.

از بین 97 پروتئین، 49 پروتئین ترشحی هستند. غنی‌سازی بیشتر 49 پروتئین ترشح‌شده نشان داد که پنج پروتئین به فضای خارج سلولی ترشح می‌شوند و پنج پروتئین برای پاتوژنز مورد نیاز هستند (به طور تجربی توسط BioCyc تأیید شده است) [48]. علاوه بر این، زمانی که این ده پروتئین با کل پروتئین H. sapiens هم تراز شدند، دو پروتئین (Mpt83 و Mpt70) بسیار شبیه پروتئین H. sapiens بودند. بنابراین، هشت پروتئین باقی‌مانده که مشابه پروتئین‌های H. sapiens نیستند (جدول 1) کاندیدای نهایی برای ساخت یک واکسن چند اپی توپی در نظر گرفته شدند.

3.2. پیش‌بینی اپی توپ‌های سلول T و B پروتئین‌های کاندید

قبل از پیش‌بینی اپی توپ، پپتیدهای سیگنال شناسایی و از پروتئین‌های کاندید حذف شدند. در مجموع 623 اپی توپ CTL از هشت پروتئین کاندید با 135 بایندر قوی (16 از A1، 40 از A2، 22 از A3، 19 از A24، و 38 از سوپرتیپ B7 از MHC کلاس I) توسط NetMHCpan پیش‌بینی شد{12} }.1 سرور (شکل 2A, B). از میان 135 بایندر قوی، 36 مورد هم آنتی ژن و هم ایمنی زا بودند. در نهایت، ما 15 اپی توپ از 36 CTL را با توجه به معیارهای زیر انتخاب کردیم: سه ​​اپی توپ در هر سوپرتیپ و حداقل یک اپی توپ در هر پروتئین کاندید (توجه: EsxA هیچ اتصال دهنده قوی ای نداشت که هم آنتی ژنی و هم ایمنی زا باشد) (جدول 2).

علاوه بر این، ما اپی توپ های HTL آنها (اپی توپ های کلاس II MHC) را پیش بینی کردیم. {{0}}اپی توپ های مر از چهار آلل (HLA_DRB، HLA{2}}DP، HLA_DQ، و H-2-I) با درصد رتبه‌بندی کمتر یا مساوی 2.{27}} بایندرهای قوی در نظر گرفته شدند و از پایین‌ترین تا بالاترین امتیاز رتبه‌بندی شدند. آلل های HLA-DR دارای بیشترین تعداد اتصال دهنده های MHC II (2990)، در حالی که HLA-DP کمترین (601) را داشتند (شکل 2C، D). لازم به ذکر است که پاسخ ایمنی در اختلالات گرانولوماتوز مانند سل، جذام و سارکوئیدوز تحت سلطه سلول های T-helper (Th1) تولید کننده IFN است [97]. علاوه بر این، گزارش‌های قبلی نشان داد که بیان سیتوکین‌های Th1 (IFN- و IL2) در بیماران سل کاهش یافته است [98]. بنابراین، برای تحریک سلول‌های Th1، پپتیدهای القاکننده 15-مر IFN- - این پروتئین‌ها را پیش‌بینی کردیم. در مجموع 534 اپی توپ با فعالیت القای IFN با استفاده از NetMHCIIpan 4.0 پیش‌بینی شد که از این تعداد 315 اپی توپ آنتی ژنی هستند. از این 315 اپی توپ، 103 اپی توپ فعالیت اتصال قوی به حداقل یک آلل HLA نشان دادند.

همچنین، پلی‌مورفیسم در آلل‌های HLA منجر به تنوع آللی می‌شود که منجر به ویژگی‌های اتصال به پپتید کاملاً متمایز می‌شود [55]. در نتیجه، ما یک اپی توپ با قوی‌ترین فعالیت اتصال (بی‌سریع‌ترین اپی توپ) را از هر یک از هشت پروتئین کاندید انتخاب کردیم. علاوه بر این، 95 اپی توپ باقی مانده بر اساس قدرت اتصال رتبه بندی شدند و سپس هشت اپی توپ اضافی با حداکثر دو اپی توپ در هر پروتئین کاندید انتخاب شدند. در نهایت، ما 16 اپی توپ از 103 HTL را با توجه به معیارهای زیر انتخاب کردیم: حداقل یک اپی توپ و حداکثر سه اپی توپ در هر پروتئین کاندید، قوی ترین فعالیت اتصال به ازای هر پروتئین کاندید، و بیشترین آنتی ژن و القا کننده IFN. سپس از آنها برای ساخت این واکسن چند اپی توپی استفاده کردیم (جدول 2).

برای پیش‌بینی خطی اپی توپ سلول B، از دو سرور (BepiPred2.{2}} و ABCpred) استفاده شد و 166 اپی توپ به‌دست آمد. ما آنتی‌ژنیسیته پنج اپی توپ برتر را برای هر پروتئین پیش‌بینی کردیم و سپس ده اپی توپ آنتی ژنی ({4}}مر، حداقل یکی از هر پروتئین کاندید) را انتخاب کردیم (جدول 2).

3.3. ساخت واکسن چند اپی توپی

برای ساخت واکسن چند اپی توپی، HBHA، PADRE، 16 HTL ({2}}mer)، 15 CTL، و 10 اپی توپ سلول B خطی (16-mer) از طریق پیوند دهنده های مناسب به هم متصل شدند و توسط یک His قرار گرفتند. تگ × 6 (شکل 3). ادجوانت ها اجزای مهم واکسن ها هستند که می توانند پاسخ های ایمنی ذاتی و سازگار را تقویت کنند [99]. بسیاری از پروتئین های M. tuberculosis دارای خواص کمکی هستند و برای طراحی واکسن ها استفاده شده اند [17،27،87،100-105]. یکی از پرکاربردترین ها HBHA [100-105] است که یک محرک ایمنی قوی است که بلوغ سلول های دندریتیک (DCs) را از طریق پردازش TLR4 القا می کند [105,106]. DCهای تیمار شده با HBHA سلول‌های T ساده را فعال می‌کنند، سلول‌های CD4 پلاس و CD8 پلاس T را برای ترشح IFN و ایجاد سمیت سلولی با واسطه سلول‌های T قطبی می‌کنند [47].

در این مطالعه، ما HBHA را به عنوان یک مکمل پروتئین در انتهای N قرار دادیم زیرا برای شروع سنتز ساختار واکسن از HBHA، یک پروتئین طبیعی مناسب است. HBHA قبلاً در انتهای N برخی از واکسن های چند اپی توپی به عنوان ادجوانت قرار داده شده است [105،107]. علاوه بر ادجوانت‌ها، PADRE که برای انسان بی‌خطر است، می‌تواند به طور قابل توجهی ایمنی‌زایی واکسن را افزایش دهد، زیرا با میل ترکیبی بالا به چندین آلل MHC-II موش و انسان با میل ترکیبی بالا متصل می‌شود تا پاسخ‌های با واسطه سلول Th را القا کند [47،62]. HBHA و PADRE توسط یک پیوند دهنده مارپیچ PEAK متصل شدند که در عین جداسازی دو جزء پروتئین برای افزایش کارایی و کاهش تداخل، استحکام را فراهم می کند. علاوه بر این، یک پل نمکی Glu-Lys که در داخل قطعات تشکیل شده بود، پیوند دهنده را تثبیت کرد.

از آنجایی که PADRE می تواند فعالیت اپی توپ های HTL واکسن را افزایش دهد [54]، ما 16 اپی توپ HTL را بعد از PADRE قرار دادیم. پیوند دهنده GPGPG برای پیوند اپی توپ های HTL به یکدیگر و PADRE استفاده شد زیرا پیشرفت سلول های ایمنی و ارائه اپی توپ را تسهیل می کند [108,109]. علاوه بر این، GPGPG پاسخ ایمنی HTL را القا می کند، که می تواند ایمنی زایی اتصالی را مختل کند و ایمنی زایی اپی توپ های فردی را پس از پردازش بازیابی کند [108].

برای 15 اپی توپ CTL، اپی توپ منفرد توسط یک پیوند دهنده AAY به اپی توپ متصل شد که به اپی توپ کمک می کند تا مکان های مناسبی برای اتصال به انتقال دهنده TAP ایجاد کند و نمایش اپی توپ را افزایش دهد [47]. بعلاوه، کل زیرواحد اپی توپ CTL از طریق پیوند دهنده HEYGAEALERAG به اپی توپ های HTL بالادست متصل شد که دارای پنج سایت برش مناسب است (A7-L8، A{4}}E6، Y3-G4، R 10-A11 و L8-E9) برای سیستم‌های تخریب پروتئازومی و لیزوزومی یوکاریوتی ضروری است. در یوکاریوت ها، پروتئازوم ها و لیزوزوم ها مهم ترین ماشین های پروتئولیتیک هستند که به ترتیب از سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم (UPS) و مسیر اتوفاژی استفاده می کنند [110].

پیوند دهنده HEYGAEALERAG همچنین برای پیوند زیر واحد اپی توپ CTL به 10 اپی توپ سلول B خطی پایین دستی که توسط لینکرهای KK به هم مرتبط شده اند استفاده شد. بر اساس مطالعات قبلی، پیوند KK از القای آنتی بادی ها به توالی اسید آمینه ناشی از ترکیب دو پپتید جلوگیری می کند و در نتیجه نمایش اختصاصی هر پپتید به آنتی بادی را تسهیل می کند [111]. در نهایت، یک تگ His× 6 به انتهای C آخرین اپی توپ سلول B خطی برای خالص سازی و شناسایی بعدی واکسن متصل شد (شکل 3).

پروتئین کایمریک نهایی شامل 933 باقیمانده اسید آمینه است که با ادجوانت HBHA شروع می شود، سپس 41 اپی توپ و با برچسب His× 6 ختم می شود (شکل 3). از آنجایی که این پروتئین کایمریک از آنتی ژن های چند اپی توپی از هشت پروتئین تشکیل شده است، آن را MTBV8، واکسن سل چند اپی توپی مشتق شده از 8 پروتئین کاندید نامیدیم.

3.4. تجزیه و تحلیل پارامترهای آنتی ژنی، حساسیت زایی و فیزیکوشیمیایی MTBV8

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که آنتی‌ژنیسیته برای واکسن‌های انسانی برای برانگیختن پاسخ‌های ایمنی هومورال مورد نیاز است که منجر به تولید سلول‌های حافظه علیه اپی توپ‌های عوامل عفونی می‌شود [112]. بنابراین، آنتی ژنی واکسن چند اپی توپی MTBV8 را با استفاده از سرور VaxiJen 2.{4}} پیش‌بینی کردیم و آنتی ژنی 0.97 را به‌دست آوردیم که به طور قابل‌توجهی بالاتر از مقدار آستانه ({{7}) است. }.4) [45،46] برای اینکه یک پروتئین باکتریایی آنتی ژن در نظر گرفته شود. قابل‌توجه، MTBV8 آنتی ژنیک‌تر از تمام پروتئین‌های جزء بود (شکل 4)، که نشان می‌دهد می‌تواند به طور موثر پاسخ‌های ایمنی میزبان را تحریک کند.

علاوه بر این، گزارش شده است که بسیاری از ماکرومولکول‌های میکروبی دارای پتانسیل ایجاد واکنش‌های حساسیت مفرط در انسان هستند [113]. برای تجزیه و تحلیل مسئله حساسیت بیش از حد MTBV8 و هشت پروتئین تشکیل دهنده، حساسیت زایی آنها را با استفاده از سرور AllerTOP 2.0 پیش بینی کردیم. دو پروتئین از هشت جزء پروتئین (LprA و EspC) به عنوان آلرژن پیش بینی شد (جدول 1). لازم به ذکر است که اگرچه واکسن چند اپی توپی طراحی شده (MTBV8) حاوی ده اپی توپ به دست آمده از این دو پروتئین بود، اما پیش بینی شد که این واکسن غیر آلرژیک باشد که نشان دهنده بی خطر بودن این واکسن است.

برای توصیف بیشتر MTBV8، ما خواص فیزیکوشیمیایی آن را از طریق سرور ExPASy ProtParam تجزیه و تحلیل کردیم. پروتئین نوترکیب دارای وزن مولکولی 94.84 کیلو دالتون و نقطه ایزوالکتریک 8.91 است. علاوه بر این، پروتئین با شاخص ناپایداری محاسبه‌شده (II) 26.44 پایدار در نظر گرفته شد (پروتئین‌هایی با شاخص ناپایداری > 4{16}} ناپایدار در نظر گرفته شدند) [64]. نیمه عمر تخمین زده شده در شرایط آزمایشگاهی 3{19}} ساعت در رتیکولوسیت های پستانداران، بیشتر از 20 ساعت در داخل بدن در مخمر، و در داخل بدن 10 ساعت در E. coli است. علاوه بر این، شاخص آلیفاتیک MTBV8 71.91 بود، و میانگین کلی مقدار آب دوستی (GRAVY) 0.32- بود، که نشان می دهد پروتئین نوترکیب آبدوست است. در نهایت، مقدار حلالیت متناسب برای MTBV8 (0.54) بیشتر از میانگین برای مجموعه داده جمعیت (0.45) بود، که نشان می‌دهد واکسن کاندید از نیمی از پروتئین‌های E. coli محلول‌تر بود [114]. نتایج فوق نشان داد که MTBV8 خواص فیزیکی و شیمیایی خوبی دارد و برای استفاده به عنوان واکسن مناسب است.

3.5. مشخصات ایمنی MTBV8

برای ارزیابی مشخصات ایمنی زایی MTBV8، ما پاسخ های ایمنی را در سیلیکو از طریق سرور ایمنی C-IMMSIM تجزیه و تحلیل کردیم. همانطور که در شکل 5A نشان داده شده است، تیترهای IgM و IgG1 به طور قابل توجهی پس از تحریک ایمنی ثانویه توسط MTBV8 افزایش یافته است. علاوه بر این، سطح سلول های B فعال افزایش یافت و پس از هر بار ایمن سازی در سطح بالایی باقی ماند (شکل 5B). حتی برای سلول های B در پلاسما، ایزوتیپ های B IgM و IgG1 پس از ایمن سازی بالا باقی ماندند (شکل تکمیلی 1A, B). در مورد تأثیر روی سلول‌های T، سطح سلول‌های حافظه Th (y2) (شکل تکمیلی 1C) و سلول‌های Th فعال (شکل 5C) به سرعت پس از ایمن‌سازی اولیه افزایش یافت و پس از ایمن‌سازی ثانویه به طور قابل توجهی افزایش یافت. سلول های T تنظیمی (سلول های فعال در درجه اول) پس از ایمن سازی اولیه تحریک شدند و سپس به سرعت کاهش یافتند (شکل تکمیلی 1D). جالب توجه است که سطح سلول های T سیتوتوکسیک فعال (Tc) به سرعت پس از ایمن سازی اولیه افزایش یافت، در دومین ایمن سازی بالا باقی ماند و سپس به طور پیوسته کاهش یافت، در حالی که سلول های Tc در حال استراحت روند معکوس را نسبت به سلول های Tc فعال نشان دادند (شکل 5D). در مقابل، سطوح سلول‌های Tc آنرژیک (y2) (شکل 5D) و سلول‌های Tc حافظه (شکل تکمیلی 1E) پس از ایمن‌سازی بدون تغییر باقی ماندند. علاوه بر این، باید توجه داشت که سطوح فاکتورهای ایمنی IFN- و IL{18}} ترشح شده توسط سلول های T که برای پاسخ ایمنی در برابر M. tuberculosis [115] حیاتی هستند، پس از ایمن سازی MTBV8 نیز به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 1). 5E).

علاوه بر این، ما تأثیر واکسیناسیون MTBV8 را بر روی جمعیت سلول های ایمنی ذاتی پیش بینی کردیم (شکل 5F و شکل تکمیلی 1FH). ارائه{3}} سلول در DCها و ماکروفاژها با اولین ایمن سازی به سرعت افزایش یافت، در حالی که تنها یک افزایش کوچک پس از ایمن سازی دوم مشاهده شد (شکل 5F و شکل تکمیلی 1G). علاوه بر این، در ماکروفاژها، اولین ایمن سازی منجر به افزایش یا کاهش همزمان ماکروفاژهای فعال و در حال استراحت شد. چند هفته پس از ایمن سازی دوم، ماکروفاژهای فعال به سرعت کاهش یافت در حالی که ماکروفاژهای در حال استراحت به سرعت افزایش یافتند. (شکل تکمیلی 1G). قابل ذکر است، سلول های کشنده طبیعی و جمعیت سلول های اپیتلیال فعال یک الگوی نسبتا ثابت پس از ایمن سازی نشان دادند. (شکل تکمیلی 1F, H). روی هم رفته، این پیش‌بینی‌ها نشان می‌دهند که MTBV8 می‌تواند به شدت پاسخ‌های ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​را تحریک کند و آن را به یک واکسن بالقوه موثر تبدیل کند.

3.6. ساختارهای ثانویه و سوم پیش بینی شده MTBV8

برای توصیف بهتر MTBV8، ساختارهای ثانویه و سوم آن را پیش‌بینی کردیم و به دنبال آن ساختار سوم آن را اصلاح کردیم. ساختار ثانویه MTBV8 شامل 42.12 درصد مارپیچ، 11.79 درصد رشته و 46.09 درصد سیم پیچ است (شکل تکمیلی 2). بر اساس پیش‌بینی‌های DISOPRED3، 27.11 درصد از باقی‌مانده‌های اسید آمینه دچار اختلال بودند.

ساختار سوم MTBV8 توسط سرور I-TASSER پیش‌بینی شد و 5 مدل با امتیاز C خوب به‌دست آمد. امتیاز C بین −5.0 و 2.0 است و متناسب با قابلیت اطمینان پیش‌بینی است. این مدل‌ها تحت آنالیز وب ProSA قرار گرفتند و مدل 4 با توجه به ویژگی‌های زیر انتخاب شد. نمره C=−3.8، Z score=−4.4. تجزیه و تحلیل نمودار راماچاندران این سازه ثالث نشان داد که کمتر از 7{18}}.0 درصد از باقیمانده‌ها در مناطق ترجیحی قرار دارند، بنابراین، اصلاح بیشتر ساختار سوم مورد نیاز است.

ساختار سوم به دست آمده توسط I-TASSER توسط سرور ModRefiner و به دنبال آن سرور GalaxyRefine برای تولید پنج مدل اصلاح شد. در بین پنج مدل تصفیه شده، مدل 2 بهترین ساختار را با در نظر گرفتن پارامترهای زیر داشت: تست فاصله جهانی با دقت بالا ({2}}.89)، RMSD (0.58)، MolProbity (2.31)، برخورد امتیاز (14.8)، امتیاز روتامر ضعیف ({{10}}.80) و نمره طرح راماچاندران (86.5 درصد) (شکل 6A). تجزیه و تحلیل نمودار راماچاندران این ساختار با استفاده از PROCHECK نشان داد که از 753 باقیمانده غیر گلیسین، غیرپرولین و غیر پایانی، 78.9 درصد آنها در مساعدترین منطقه [A, B, L] و 17.3 درصد در منطقه قرار داشتند. علاوه بر این، منطقه مجاز [a، b، l، p]، و 1.5 درصد در منطقه مجاز به طور کلی [~a، ~b، ~l، ~p]، با تنها 2.4 درصد در منطقه غیر مجاز (شکل 6B). هنگام تجزیه و تحلیل نمودار Ramachandran ساختار تصفیه شده با استفاده از Molprobity، متوجه شدیم که 86.5 درصد از باقیمانده‌های اسید آمینه در ناحیه مطلوب قرار داشتند، که همان چیزی بود که توسط سرور GalaxyRefine به دست آمد (شکل 6C) . علاوه بر این، 98.0 درصد از باقیمانده ها در ناحیه مجاز بودند، در حالی که 19 باقیمانده خارج از محدوده (phi، psi) بودند (شکل 6C). اگرچه مدل تصفیه شده در مقایسه با مدل تولید شده توسط I-TASSER دارای باقیمانده های بیشتری در منطقه مطلوب است، اما نیاز به اعتبار سنجی بیشتری دارد.

اعتبارسنجی مدل یک مرحله کلیدی در فرآیند ساخت مدل است زیرا می تواند خطاهای احتمالی را در مدل های سه بعدی پیش بینی شده شناسایی کند [116]. برای اعتبارسنجی مدل تصفیه شده MTBV8، ProSA-web، و ERRAT تجزیه و تحلیل انجام شد. تجزیه و تحلیل وب ProSA یک امتیاز Z 5.76- را برای MTBV8 (شکل 6D) نشان داد، که کمی خارج از محدوده تعیین شده تجربی برای پروتئین های با اندازه مشابه بود. با این حال، تجزیه و تحلیل ERRAT ضریب کیفیت کلی 70.94 را برای MTBV8 تصفیه شده نشان داد. از آنجایی که نمره ERRAT بیشتر از 50 نشان دهنده یک مدل با کیفیت خوب است [117]، امتیاز 70.94 نشان داد که ما به ساختار مدل شده برای تجزیه و تحلیل بعدی اعتماد بالایی داریم.

3.7. اتصال مولکولی MTBV8 با گیرنده های سلول ایمنی

تمایل قوی واکسن ها به گیرنده های سلولی ایمنی باعث ایجاد پاسخ ایمنی پایدار می شود [118]. برای به دست آوردن بینش در مورد تعاملات بالقوه بین MTBV8 و گیرنده های سلول ایمنی، ما اتصال مولکولی بین MTBV8 و گیرنده ایمنی TLR4 را انجام دادیم (شکل 7A و B). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که لیگاندهای TLR4 می‌توانند DCها را فعال کنند، که به نوبه خود سلول‌های T ساده را فعال می‌کنند، به طور موثر سلول‌های T (سلول‌های CD4 پلاس و CD8 پلاس) را برای ترشح IFN و ایجاد سمیت سلولی با واسطه سلول T قطبی می‌کنند [106]. این فرآیندها منجر به افزایش مخزن سلول های حافظه موثر می شود [119]. از آنجایی که برهمکنش TLR4 با پپتیدهای آنتی ژنی منجر به پاسخ در برابر عفونت سل می شود، ما بر تعامل بین MTBV8 و TLR4 تمرکز کردیم (شکل 7A). نتایج اتصال مولکولی از Firedock نشان داد که مطلوب ترین مدل تصفیه شده دارای انرژی جهانی 40.28-، انرژی جذاب واندروالس (aVdW) 19- است.{20}}، انرژی دافعه (قرمز) 2.19، انرژی تماس اتمی 4.70 و سهم پیوند هیدروژنی (HB) - 1.03 (شکل 7B). علاوه بر این، Prodigy انرژی اتصال بین TLR4 و MTBV8 را 8.6- کیلوکالری در مول پیش بینی کرد. نتایج بالا نشان داد که MTBV8 تمایل زیادی به TLR4 دارد و آن را قادر می‌سازد تا یک پاسخ ایمنی پایدار ایجاد کند.

3.8. شبیه سازی دینامیک مولکولی

از شبیه سازی دینامیک مولکولی برای تجزیه و تحلیل حرکت اتم ها در واکسن استفاده شد [120]. تغییر شکل زنجیره اصلی میزان تغییر شکل یک مولکول را در هر باقیمانده تشکیل دهنده نشان می دهد. مناطق با تغییر شکل بالا موقعیت زنجیره "لولا" را نشان می دهند (شکل 7C)، و ضریب B تجربی از بانک داده PDB مربوطه به دست آمد در حالی که محاسبه با ضرب تحرک NMA در 8pi^2 انجام شد (شکل 7D) ). مقدار ویژه تخصیص داده شده به هر حالت معمولی معیاری از سختی حرکت است که مستقیماً با انرژی تغییر شکل کل سازه مرتبط است. مقدار ویژه مستقیماً با سهولت تغییر شکل متناسب است (شکل 7E). واریانس هر حالت عادی با مقدار ویژه نسبت معکوس دارد. واریانس های فردی قهوه ای رنگ می شوند در حالی که واریانس های تجمعی به رنگ سبز رنگ می شوند (شکل 7F). در ماتریس کوواریانس، جفت شدن بین جفت باقیمانده وجود دارد و حرکات همبسته (قرمز)، غیر همبسته (سفید)، و ضد همبستگی (آبی) نمایش داده شد (شکل 7G). شبکه الاستیسیته نشان دهنده جفت اتم های متصل به فنر بود و هر نقطه نشان دهنده یک فنر بین جفت اتم های متناظر بود. رنگ نقاط نشان دهنده سفتی آنها بود. نقاط خاکستری تیره‌تر فنرهای سفت‌تر را نشان می‌دهند و بالعکس (شکل 7H). شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی با استفاده از سرور iMODS نشان می‌دهد که کمپلکس اتصال بین MTBV8 و TLR4 پایدار است.

3.9. در بهینه سازی سیلیکو و شبیه سازی MTBV8

سنتز پروتئین پیش نیاز فعالیت آن است [121]. در راستای این امر، افزایش کارایی رونویسی و ترجمه ای واکسن برای بیان بیش از حد آن در سلول های E. coli از طریق یک پلاسمید خودتکثیر شونده pET28a( plus ) ضروری است [1{4}}3]. بهینه سازی آن توسط شاخص تطبیق کدون (CAI) 0.99 و محتوای GC (54.81 درصد) بین 30 تا 70 درصد به دست آمد که عموماً برای بیان پروتئین در میزبان مطلوب در نظر گرفته می شود. قطعه DNA mtbv8 را می توان با استفاده از SnapGene در یک وکتور pET{11}a( plus ) بین سایت های محدود NcoI و XhoI کلون کرد تا یک پلاسمید نوترکیب pET{12}a ( plus ) -mtbv8 (شکل تکمیلی) تولید کند. .3).

4. بحث

4.1. ظهور واکسن های چند اپی توپی علیه سل

واکسیناسیون مطمئن ترین راه برای مبارزه با عفونت سل است. برای سال‌های متمادی، دانشمندان تعداد زیادی واکسن امیدوارکننده را شناسایی کرده‌اند که می‌تواند جایگزین BCG، تنها واکسن تایید شده سل شود [8100,122-125]. اخیراً واکسن های نوترکیب سل مورد توجه فزاینده ای قرار گرفته اند. چندین واکسن نوترکیب در کارآزمایی‌های بالینی و بالینی کارایی خود را نشان داده‌اند، از جمله ID93/GLA-SE متشکل از چهار نامزد واکسن Rv2608 (خانواده PE/PPE)، Rv1813 (بیان‌شده تحت استرس/هیپوکسی)، ESXV و ESXW که امیدوارکننده هستند. کارآزمایی پیش بالینی موش [122]. برای کارآزمایی‌های بالینی، GamTBvac، که با ترکیب Ag85a و ESAT{10}}CFP10 به‌دست آمد، در آزمایش‌های فاز اول موفقیت‌آمیز بود [125]، در حالی که M72، متشکل از دو نامزد [Mtb39A (PPE18) و Mtb32A]، قدرت قابل‌توجهی در فاز داشت. آزمایشات دوم [123].

آزمایش‌های موفقیت‌آمیز این واکسن‌های نوترکیب نشان‌دهنده قدرت بیشتر واکسن‌های مبتنی بر اپی توپ است که به سادگی ویژگی‌های ایمنی پروتئین‌های کاندید مختلف را در یک پروتئین مصنوعی ترکیب می‌کند [124]. قابل توجه است که چندین واکسن زیرواحد سل از تعداد زیادی کاندید واکسن مشتق شده‌اند و به عنوان کاندیدهای بالقوه جذاب در مطالعات مدل حیوانی ظاهر شده‌اند [100]. به عنوان مثال، MP3RT، یک واکسن پپتیدی چند اپی توپی سل که شامل شش پپتید HTL ایمنی زا است، سطوح قابل توجهی بالاتری از لنفوسیت های IFN- و CD3 به علاوه IFN- پلاس T و واحدهای تشکیل دهنده کلنی پایین تر (CFUs) در ریه و طحال موش های انسانی ایجاد کرد. موش های نوع وحشی [8]. در آینده، تحقیقات برای قدرت بیشتر در این واکسن‌ها منجر به غنی‌سازی پروتئین‌های بالقوه شده است.

علاوه بر این، پروتئین‌های ترشح شده توسط M. tuberculosis نیز در طراحی MTBV8 در نظر گرفته شده‌اند (جدول 1)، زیرا برای بیماری‌زایی و بیماری‌زایی سل مهم هستند [126]. علاوه بر این، برخی از پروتئین های ترشح شده از لایه های بیرونی سلول های M. tuberculosis می توانند به عنوان آنتی ژن مفید عمل کنند. به عنوان مثال، EsxA و EsxB از کپسول M. tuberculosis [127] خالص شده اند و احتباس EsxA در کپسول در سمیت سلولی نقش دارد [128]. علاوه بر این، EsxA برای یکپارچگی دیواره سلولی باکتری مورد نیاز است [129]. به طور کلی، پروتئین های ترشح شده سطوح به اندازه کافی در معرض دید دارند به طوری که آنها هدف پاسخ های ایمنی میزبان هستند [130،131].

4.2. تحریک بالقوه سیستم ایمنی ذاتی توسط MTBV8

غربالگری اپی توپ در پروتئین های کاندید شامل فعال شدن سیستم ایمنی ذاتی و به دنبال آن شناسایی آنتی ژن توسط لنفوسیت ها است زیرا هر دو عامل برای فعال شدن بعدی سیستم ایمنی تطبیقی ​​مورد نیاز هستند [50]. برای پاسخ ذاتی، تشکیل یک کمپلکس پایدار بین MTBV8 (به کمک محرک TLR4 HBHA به عنوان یک کمکی) و TLR4 از DCها (شکل 5F) مهم است زیرا لیگاندهای TLR4 می توانند DCها را فعال کنند و DCهای فعال می توانند به نوبه خود فعال شوند. سلول‌های T ساده، به طور موثر سلول‌های CD4 پلاس و CD8 پلاس T را قطبی می‌کنند تا IFN- ترشح کنند، و باعث ایجاد سمیت سلولی با واسطه سلول T [106] و متعاقبا افزایش تعداد سلول‌های حافظه مؤثر [119] می‌شوند.

این کمپلکس احتمالاً در افزایش جمعیت سلول های حافظه (y2) در لنفوسیت های B (تکملی شکل 1A) و لنفوسیت های Th (تکملی شکل 1C) در مقایسه با سلول های غیرحافظه نقش داشته است. تحریک ایمنی توسط MTBV8 با سایر واکسن های چند اپی توپی علیه سل [33،37،39] و سایر بیماری ها [27،62،107،124،132] قابل مقایسه است. این به سازگاری مکانیسم واکسن چند اپی توپی اشاره کرد.

4.3. تحریک بالقوه سیستم ایمنی سازگار توسط MTBV8

لنفوسیت‌های B و T سلول‌های مؤثر اولیه هستند که پاسخ‌های ایمنی تطبیقی ​​را از طریق ایمنی هومورال یا با واسطه سلولی با شناسایی بخش‌هایی از پاتوژن‌های مهاجم، که به عنوان آنتی‌ژن شناخته می‌شوند، هماهنگ می‌کنند [50]. برای القای یک پاسخ ایمنی تطبیقی ​​هومورال، ما اپی توپ های سلول B با امتیاز بالا (جدول 2) را برای شناسایی و تخریب توسط آنتی بادی های بیان شده و ترشح شده توسط لنفوسیت های B ترکیب کردیم [50,133]. تحریک واکسن لنفوسیت‌های B فعال (شکل 5B)، که عمدتاً سلول‌های B را IgM- و IgG{9} ترشح می‌کنند (شکل 1A تکمیلی)، ممکن است منجر به ترشح بیش از حد IgM و IgG1 شود (شکل 5A).

آنتی ژنی بالای واکسن (شکل 4) ممکن است پیامدهای مهمی برای افزایش پاسخ آنتی بادی داشته باشد (شکل 5A). در واقع، پاسخ های ایمنی با واسطه سلول به شدت به توانایی سلول های T برای تشخیص آنتی ژن ها وابسته است [134]. برای دستیابی به این هدف، ما اپی توپ‌های CTL و HTL آنتی ژنیک قوی و متصل به MHC را انتخاب کردیم (جدول 2)، که پایداری پپتید: کمپلکس MHC (pMHC) را افزایش داد، که عامل کلیدی کنترل ایمنی پپتید MHC [135] است و نقشی در پرایمینگ سلول های CD8 پلاس و CD4 پلاس T توسط DCها، منجر به پاسخ های لنفوسیت T می شود (شکل 5C، شکل تکمیلی 1C) [136].

ادغام پیوند دهنده های مناسب و الیگوپپتیدهای مصنوعی (PADRE و HEYGAEALERAG) و موقعیت دقیق هر جزء می تواند روند و نمایش اپی توپ را تسهیل کند (شکل 3). به دلیل تنوع آللی در بین انسان ها، ما اپی توپ های CTL را بر اساس شناخت آلل های MHC-I نژادهای اصلی انسانی انتخاب کردیم.

4.4. چشم انداز توسعه MTBV8

این در طراحی واکسن سیلیکونی یک شاخص مرتبط در مراحل غربالگری از نظر سنتز و کارآیی واکسن‌های کاندید است. برای سنتز، پیش‌بینی‌های ما نشان داد که می‌توان آن را در سیستم E. coli سنتز کرد، با این حال، سیستم‌های دیگر مانند سلول‌های حشرات و پستانداران را نیز می‌توان در نظر گرفت، اگر سیستم‌های مبتنی بر E. coli مشکلاتی داشته باشند. اعتبار سنجی آزمایشگاهی مرطوب مرحله بعدی در تأیید نامزدهای واکسن پس از مطالعات سیلیکونی است. این روش در واقع به طور مؤثر در برخی از واکسن‌های کاندید استفاده شده است، که همچنین ابتدا در سیلیکون طراحی شدند و بعداً در مرحله آزمایشی مؤثر بودند [137].

5. نتیجه گیری

یکی از حمایت‌های کلیدی هدف توسعه پایدار WHO برای ریشه‌کنی کامل سل، دسترسی به یک واکسن قوی برای جلوگیری از عفونت M. tuberculosis است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که واکسن‌های چند اپی توپی کایمریک می‌توانند از خواص ایمنی/آنتی ژنیک پروتئین‌های خاص برای افزایش کارایی ایمنی استفاده کنند. در این مطالعه، ما از یک رویکرد in silico برای طراحی یک واکسن کایمریک (MTBV8) با یکپارچه‌سازی 41 اپی‌توپ ناسازگار مشتق‌شده از هشت پروتئین آنتی ژنی ترشح‌شده توسط M. tuberculosis H37Rv استفاده کردیم. پیش‌بینی شد که MTBV8 پایدار، محلول، ایمن، بسیار آنتی ژنی و ایمنی‌زا باشد.

تجزیه و تحلیل ایمونو انفورماتیک نشان داد که MTBV8 میل خوبی را برای گیرنده اصلی سلول ایمنی TLR4 نشان می دهد. نکته مهم این است که تحریک واکسیناسیون MTBV8 می تواند به طور قابل توجهی سطح سلول های B، سلول های T و جمعیت سلول های ایمنی ذاتی را افزایش دهد و تولید ایمونوگلوبولین ها (IgG1، IgM و غیره) و همچنین عوامل ایمنی (IFN-، IL{6) را تحریک کند. }}، و غیره). در مجموع، واکسن چند اپی توپی MTBV8 یک شاخص مرتبط در مرحله طراحی واکسن‌های ضد سل است و ممکن است سنگ بنای بالقوه‌ای در تحقق «استراتژی پایان سل» باشد.

بیانیه مشارکت نویسندگی اعتباری

بیندا تی آندونگما: مفهوم سازی، روش شناسی، نرم افزار، نوشتن – پیش نویس اصلی. Yazheng Huang: Data Curation، نرم افزار. نیش چن: نرم افزار، تجسم. چینگ تانگ: بررسی داده ها، تجزیه و تحلیل رسمی. مین یانگ: نرم افزار، تجسم. شان هو چو: نوشتن – بررسی و ویرایش. Xinfeng Li: مفهوم سازی، روش شناسی، نرم افزار، کسب سرمایه. جین هه: نظارت، نگارش - بررسی و ویرایش، کسب سرمایه.

اعلامیه منافع رقابتی

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع مالی رقیب یا روابط شخصی شناخته شده ای ندارند که به نظر می رسد بر کار گزارش شده در این مقاله تأثیر بگذارد.

قدردانی

این کار توسط بنیاد ملی علوم طبیعی چین (32200026، 31900057)، بودجه باز آزمایشگاه کلیدی میکروبیولوژی کشاورزی (AMLKF202108) و بنیاد علوم پسا دکتری چین (2019M662654) حمایت شده است.

ضمیمه A. اطلاعات پشتیبانی

داده‌های تکمیلی مرتبط با این مقاله را می‌توانید در نسخه آنلاین در doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019 بیابید.

منابع

[1] Boineau R، Domanski M، Troutman C، Anderson J، Johnson G، Mcnulty SE، Clappchanning N، Davidson-ray LD، Fraulo ES، Fishbein DP، و همکاران. آمیودارون یا یک کاردیوورتر-دفیبریلاتور قابل کاشت برای نارسایی احتقانی قلب. New Engl J Med 2005؛ 352 (3): 225-37.

[2] خشنود س، حیدری م، حیلی م، درنکورت م، دربان ساروخلیل د، نصیری م.ج.، لهراسبی وی. نامزدهای جدید واکسن علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس. Int J Biol Macromol 2018؛ 120 (Pt A): 180-8.

[3] Kyu HH، Maddison ER، Henry NJ، Ledesma JR، Wiens KE، Reiner R، و همکاران. بار جهانی، منطقه‌ای و ملی سل، 1990-2016: نتایج حاصل از بار جهانی بیماری‌ها، آسیب‌ها و عوامل خطر در مطالعه 2016. Lancet Infect Dis 2018؛ 18 (12): 1329-49.

[4] سازمان بهداشت جهانی (2022). گزارش جهانی سل 〈https://www. سازمان بهداشت جهانی. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F، Viney K، Linh NN، Gonzalez-Angulo L، Gegia M، Jaramillo E، Zignol M، Kasaeva T. توصیه‌های سازمان بهداشت جهانی در مورد درمان سل مقاوم به دارو، به‌روزرسانی 2020. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] احمد خان اف، فاکس جی، منزیس دی. سل مقاوم به دارو. New York: Handbook of Antimicrobial Resistance Springer; 2017. ص. 263-{4}}.

[7] میچیسون دی، دیویس جی. شیمی درمانی سل: گذشته، حال و آینده. Int J Tube Lung Dis 2012؛ 16 (6): 724-32.

[8] Gong W، Liang Y، Mi J، Jia Z، Xue Y، Wang J، Wang L، Zhou Y، Sun S، Wu X. واکسن مبتنی بر پپتید MP3RT ایمنی محافظتی در برابر عفونت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را در یک مدل موش انسانی ایجاد کرد. . Front Immunol 2021؛ 12:1-19.

[9] Lange C، Aaby P، Behr MA، Donald PR، Kaufmann SHE، Netea MG، Mandalakas AM. 100 سال مایکوباکتریوم بوویس باسیل Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022؛ 22(1):e2-12.

[10] Glaziou P، Floyd K، Raviglione MC. اپیدمیولوژی جهانی سل. Semin Respir Crit Care Med 2018؛ 39 (3): 271-85.

[11] ارنست جی دی. مکانیسم های فرار ایمنی M. tuberculosis به عنوان چالش های طراحی واکسن سل سلول میزبان میکروب 2018؛ 24 (1): 34-42.

[12] Li X، Chen F، Liu X، Xiao J، Andongma BT، Tang Q، Cao X، Chou SH، Galperin MY، He J. پروتئاز Clp و RNA آنتی سنس به طور مشترک تنظیم کننده جهانی CarD را تنظیم می کنند تا واکنش گرسنگی مایکوباکتریایی را واسطه کنند. eLife 2022؛ 11:1-22.

[13] Liu CH، Liu H، Ge B. ایمنی ذاتی در سل: دفاع میزبان در مقابل فرار پاتوژن. Cell Mol Immunol 2017؛ 14 (12): 963-75.

[14] Elvang T، Christensen JP، Billeskov R، Hoang TTKT، Holst P، Thomsen AR، Andersen P، Dietrich J. CD4، و پاسخ سلول T CD8 به M. tuberculosis Ag85B-TB10.4 ارتقا یافته توسط زیرواحد کمکی، آدنووکتور یا واکسیناسیون هترولوگ پرایم بوست. PLoS ONE 2009; 4 (4): e5139.

[15] Rossjohn J، Gras S، Miles JJ، Turner SJ، Godfrey DI، McCluskey J. شناسایی گیرنده آنتی ژن سلول T مولکول های ارائه دهنده آنتی ژن. Annu Rev Immunol 2015؛ 33: 169-200.

For more information:1950477648nn@gmail.com