In Vitro And in Silico Insights Into Into Inhibitors Tyrosinase

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

هی جین جونگ a,b,c, سانگ گیون نو a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a

خلاصه

تیروزیناز یک آنزیم کلیدی مسئول بیوسنتز ملانین است و در محافظت از آسیب های پوستی ناشی از اشعه ماوراء بنفش موثر است. به عنوان بخشی از تلاش‌های مداوم برای کشف مهارکننده‌های قوی تیروزیناز، سیزده مشتق (E)-benzylidene-1-ایندانون (BID1-13) را به‌طور سیستماتیک طراحی و سنتز کرد و فعالیت‌های بازدارنده آنها را در برابر تیروزیناز تعیین کرد. در بین ترکیبات مورد ارزیابی، BID3 قوی‌ترین مهارکننده تیروزیناز قارچ بود (IC{5}}.034 میلی‌مولار، فعالیت مایکوفنولات؛ IC{7}}.39 میلی‌مولار، فعالیت دی‌فنول‌ها). مطالعات جنبشی نشان داد که BID3 یک نوع ترکیبی از مهار تیروزیناز را با مقدار Ki برابر با 2.4 میلی‌مولار با استفاده از L-DOPA به عنوان سوبسترا نشان داد. شبیه‌سازی‌های اتصال مولکولی سیلیکو نشان داد که BID3 می‌تواند به سایت‌های کاتالیزوری و آلوستریک تیروزیناز متصل شود تا فعالیت آنزیمی را مهار کند که مطالعات تجربی آزمایشگاهی بین BID3 و تیروزیناز را تأیید کرد. علاوه بر این، محتوای ملانین کاهش یافت و فعالیت تیروزیناز سلولی پس از درمان BID3 مهار شد. این مشاهدات نشان داد که BID3 یک مهارکننده قوی تیروزیناز است و به طور بالقوه می تواند به عنوان یک عامل سفید کننده برای درمان اختلالات مربوط به رنگدانه استفاده شود.

سیستانچ: گیاه سفید کننده پوست

1. مقدمه

ملانین توسط ملانوسیت‌ها در لایه واسال اپیدرم سنتز می‌شود که عموماً به خانواده رنگدانه‌هایی گفته می‌شود که معمولاً برای محافظت از پوست پستانداران در برابر آسیب ناشی از اشعه مضر UV توسط از بین بردن رادیکال‌های آزاد یا پراکنده کردن نور UV ورودی شناخته می‌شوند [1]. با این حال، تولید فراوان ملانینکان باعث هیپرپیگمانتاسیون قابل مشاهده اپیدرم می شود که ممکن است به صورت ملاسما، کک و مک، لکه های پیری یا لنتیژین های پیری آشکار باشد.

تیروزیناز (EC 1.14.18.1)، یک متالوآنزیم حاوی مس، یک آنزیم کلیدی درگیر در فرآیندهای ملانوژنیک است. تیروزیناز دو مرحله محدود کننده سرعت در ملانوژنز را کاتالیز می کند. هیدروکسیلاسیون تیروزین (فعالیت کرزولاز یا مایکوفنولات) برای تولید 3،{7}دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA) و اکسیداسیون بعدی L-DOPA (فعالیت کاتکولاز یا دیفنول) به DOPA-quinone مربوطه. هنگامی که ال-تیروزین بستر است، محصول واکنش کاتالیز شده از تیروزیناز DOPA-quinone است که سپس به ملانین تبدیل می شود [3]. این مراحل برای محافظت از پوست در برابر آسیب اشعه ماوراء بنفش بسیار مهم هستند. قارچ Agaricus برای همسانی تجاری در دسترس و بالا با آنزیم پستانداران تیروزیناز استفاده می شود که آن را به عنوان مدلی برای مطالعات ملانوژنز مناسب می کند [4]. در انسان، ملانین به محافظت از پوست در برابر آسیب های ناشی از اشعه ماوراء بنفش کمک می کند [5]. با این حال، سطح بیش از حد ملانینکان باعث اختلالات پوستی مختلفی از جمله هایپرپیگمانتاسیون، ملاسما، کک و مک و لکه های پیری می شود [6]. بنابراین، مهارکننده‌های نیوتیروزیناز که خواص دارویی مانند و سفیدکننده پوست را نشان می‌دهند، برای مهار رنگدانه بیش از حد پوست مورد نیاز است.

1-ایندانون، با اسکلت بنزوئیل-سیکلوپنتانون، به عنوان پسرعموهای سفت و سخت چالکون ها در نظر گرفته می شود، که دارای سیستم کتون غیر اشباع چالکون ها است که یک حلقه حلقوی 5 عضوی را تشکیل می دهد، که یک جزء طبیعی است که منابع گیاهی خوراکی نامتغیر را دارد [7] ]. چندین مطالعه نشان داده‌اند که ترکیبات دارای بخش 1-ایندانون دارای اهمیت دارویی هستند، زیرا فعالیت‌های بیولوژیکی مفید مختلفی از جمله ضد التهابی [8-10]، ضد سرطانی [11،12]، آنتی‌اکسیدان [13]، ضد پارکینسون را نشان می‌دهند. خواص بیماری [14]، ضد بیماری آلزایمر [15-17]، ضد میکروبی [18]، سرکوب کننده ضد ایمنی [19]، و ضد تیروزیناز [20].

چالکون ها (1،3-دیاریل-2-مناسب-1-) کتون‌های معطری هستند که از دو حلقه معطر تشکیل شده‌اند که به‌عنوان یک هسته مرکزی به یک سیستم کربونیل غیراشباع سه کربنه a،b متصل شده‌اند [21, 22]. این اجزای طبیعی موجود در گیاهان طبیعی خوراکی مختلف یافت می شوند و به عنوان ترکیبات پیش ساز برای مسیر مصنوعی فلاونوئیدها و ایزوفلاونوئیدها مانند پیرازولین ها، پیریمیدین، فلاوانول، فلاون ها، فلاوانون ها، ایزوفلاون ها، آئورون ها، آنتوسیانیدین، دی هیدروفلاوانول، و دی هیدروفلاونول، در نظر گرفته می شوند [23-25]. سیستم کربونیل غیراشباع a،b برای نوع فعالیت بیولوژیکی بسیار مهم است، زیرا این سیستم ها در بسیاری از محصولات طبیعی مانند کالکن ها و همچنین ایندانون توزیع می شوند، جایی که مولکولی نسبتاً مسطح تر است، و انتقال اثرات الکترونیکی جایگزین های آریل هدایت می شود. به گروه کربونیل [7]. بسیاری از محققین قبلی گزارش دادند که کالکون ها به عنوان یک کلاس جدید از مهارکننده های تیروزیناز در چندین نشریه برجسته شده اند [26-29]. اخیراً، کیم و همکارانش [30،31] سری هایی از مشتقات کالکن را طراحی و سنتز کردند و آنها را از نظر ضد ضد در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی کردند. تیروزیناز و فعالیت های ضد ملانوژنیک علیه ملانوسیت های موش.

با توجه به داده‌های گزارش‌شده قبلی ما، مشتقات دارای داربست کربونیل غیراشباع (E)-b-phenyl-a، b- مهار پتنتیروزیناز را نشان دادند [32-34]. (E)-Benzylidene-1-ایندانون ها می توانند یک عامل ضد ملانوژن جذاب باشند زیرا این ترکیب دارای داربست کربونیل غیراشباع (E)-b-phenyl-a,b- غیراشباع در ساختار شیمیایی خود است. قابل توجه، راداکریشنان و همکاران. (2015) [20] مجموعه‌ای از مشتقات بنزیلیدین{15}ایندانون را با پیکربندی (Z) طراحی و سنتز کرد و فعالیت ضد تیروزیناز آنها را ارزیابی کرد. اگرچه این مشتقات (Z)-بنزیلیدین{19}ایندانون فعالیت های ضد تیروزیناز و ضد ملانوژنیک مشتقات (E)-benzylidene-1-ایندانون هنوز مورد بررسی قرار نگرفته اند.

بنابراین، ما سیزده ترکیب (BID1-13) از اسکلت 1-ایندانون حاوی بنزیلیدین (E) را طراحی و سنتز کردیم. در میان این ترکیبات مصنوعی، یک گروه 2،{5}}دی هیدروکسی روی حلقه B 1-ایندانون بیشترین مهار تیروزیناز را نشان داد (تقریباً 400- برابر بیشتر از کوجیک اسید، کنترل مثبت). علاوه بر این، ما فعالیت مهاری تیروزیناز BID3 را بیشتر ارزیابی می‌کنیم و همچنین نقش تنظیمی آن را در سنتز ملانین با استفاده از سلول‌های ملانوما B16F10 مشخص می‌کنیم. در آزمایش‌های گسترده، پتانسیل ضد ملانوژنیک BID3 را ارزیابی کردیم و به دنبال شناسایی سینتیک آنزیم و مطالعات اتصال مولکولی بودیم. در آزمایش‌های متوالی، پتانسیل تیروزیناز سلولی BID3 و تولید ملانین در سلول‌های ملانوم B16F10 ناشی از a-MSH و IBMX نیز مورد بررسی قرار گرفت.

ضد اکسیداسیون و جذب کننده پوست: عصاره سیستانچ

2. مواد و روشها

2.1. معرف ها

قارچ تیروزیناز (EC 1.14.18.1)، هورمون محرک آلفا ملانوسیت (a-MSH)، 3-ایزوبوتیل-1-متیل گزانتین (IBMX)، ال-تیروزین، L{10}}،{{ 11}}دی هیدروکسی فنیل آلانین (L-DOPA)، دی متیل سولفوکسید (DMSO)، اسید کوجیک، اسید فتالیک و اسید ترانس سینامیک از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. محیط Eagle's Modified Dulbecco (DMEM)، سرم جنین گاوی (FBS)، استرپتومایسین و آمفوتریسین از WELGENE Inc. (Gyeongsan-si، کره جنوبی) خریداری شد. تمام معرف های دیگر از سیگما آلدریچ خریداری شده اند.

عصاره cistanche tubulosa

2.2. علم شیمی

2.2.1. روش های عمومی

تمام معرف ها به صورت تجاری به دست آمدند و بدون خالص سازی بیشتر مورد استفاده قرار گرفتند. کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی ستونی به ترتیب بر روی صفحات 60F245 از قبل پوشش داده شده Merck و MP سیلیس 40-63، 60 Å انجام شد. داده‌های طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (HR) بر روی یک طیف‌سنج جرمی کروماتوگرافی مایع (LC) در چهار زمان پرواز (Q-TOF) Agilent AccurateMass در حالت مثبت ESI به دست آمد. طیف‌های تشدید مغناطیسی هسته‌ای (NMR) بر روی یک طیف‌سنج Varian Unity INOVA 400 یا یک طیف‌سنج Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) برای 1H NMR (400 و 500 MHz) و برای MHz 1300 ثبت شد. . DMSO d6، CD3OD و CDCl3 به عنوان حلال های NMR برای نمونه های NMR استفاده شد. ثابت جفت (J) و مقادیر شیفتی شیمیایی به ترتیب بر حسب هرتز (هرتز) و قطعات در میلیون (ppm) اندازه‌گیری شدند. اختصارات مورد استفاده در تجزیه و تحلیل داده های 1H NMR به شرح زیر است: s (تک تک)، bs (تک تکی گسترده)، d (دوگانه)، dd (دوگانه دوتایی)، t (سه گانه)، TD (سه گانه دوتایی)، q ( کوارتت)، andm (چندین).

2.2.2. روش سنتز BID1-13

محلولی از بنزآلدئید (1.1-1.2 معادل) و 1-ایندانون (100 میلی گرم، 0.76 میلی مول) در 1 مولار در اسید استیک هیدروکلراید (0.4 میلی لیتر) در دمای اتاق به هم زده شد. برای 4-48 ساعت پس از افزودن آب، رسوبات فیلتر شده و با آب و هگزان: اتیل استات (1:1)، هگزان: دی کلرومتان (4:1-1:1) یا مخلوطی از دی کلرومتان و متانول، بسته به خواص بنزآلدئیدهای باقی مانده، شسته شدند. برای دادن (E)-benzylidene{20}}ایندانون (BID1-13) در بازده 32.8-99.1 درصد. خصوصیات ساختاری (1H و 13C NMR و داده های جرمی همه BIDها) ترکیبات سنتز شده در اطلاعات تکمیلی ارائه شده است.

2.2.2.1. (E)-2-(4-هیدروکسی بنزیلیدین)-2،3-دی هیدرو-1H-ایندن{10}}وان (BID1).

جامد زرد؛ بازدهی 93.4 درصد زمان واکنش، 6 ساعت; فرمول مولکولی، C16H12O2; mp, 224.7–225.9 C; 1H NMR (400 مگاهرتز، DMSO d6) d 10.10 (s، 1H، OH)، 7.72 (d، 1H، J=7.6 هرتز، 7- H)، 7.64-7.58 (m، 4H، 4-H، 5-H، 20-H، 60-H)، 7.43 (s، 1H، H وینیلیک)، 7.39 (t,1H, J=7.2 Hz, 6-H), 6.87 (d, 2H, J=8.0 Hz, 30-H, {{46} }}H)، 3.99 (s، 2H، CH2); 13C NMR (100 مگاهرتز، DMSO d6) d 193.9، 160.1، 150.4، 138.3، 135.1، 134.0، 133.6، 132.2، 128.2، 127.1، 128.2، 127.1.1، 128.2، 127.1، 127.1، 126، 126، 127.1، 127.1، 126.1، 127.1، 126.1، 127.1، به علاوه ح) به اضافه محاسبه 237.0910، obsd 237.0911.

2.2.2.2. (E)-2-(3،4-دی هیدروکسی بنزیلیدین)-2،3-دی هیدرو-1H-inden-1-یک (BID2).

جامد زرد؛ بازده، {{0}}.6 درصد ; زمان واکنش، 5 ساعت; فرمول مولکولی C16H12O3; mp, 251.2–252.4 C; 1H NMR (4{55}}0 مگاهرتز، DMSO d6) d 9.65 (s, 1H, OH), 9.24 (s, 1H, OH), 7.72 (d, 1H, J=7 0.6 هرتز، 7-H)، 7.66-7.61 (m, 2H, {{3{87}}}}H, 5-H), 7.42 (t, 1H, J {{35 }}.2 هرتز، 6-H)، 7.35 (s، 1H، H وینیلیک)، 7.19 (s، 1H، 20-H)، 7.08 (d،1H) , J=8.0 هرتز، 60-H)، 6.83 (d، 1H، J=8.0 Hz، 50-H)، 3.98 (s، 2H، CH2 ) 13C NMR (100 مگاهرتز، DMSO d6) d 193.8، 150.4، 148.7، 146.3،138.3، 135.1، 134.5، 132.0، 128.2، 127.3، 128.2، 127.3، 127.1، 127.2، 127.2، 127.1، 127.2، 127.1، 127.2 HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M به علاوه H) به اضافه calcd253.0859، obsd 253.0857.

2.2.2.3. (E)-2-(2،4-دی هیدروکسی بنزیلیدین)-2،3-دی هیدرو-1H-inden-1-یک (BID3).

جامد زرد؛ بازده، 5{{2{0}}.9 درصد ; زمان واکنش، 10 ساعت؛ فرمول مولکولی، C16H12O3. mp, 198.5-199.9 C (dec.)؛ 1H NMR (500 مگاهرتز، CD3OD) d 8.17 (s، 1H، H وینیلیک)، 7.82 (d، 1H، J=8.0 Hz،60-H)، 7.67-7.63 (m، 3H) , 4-H, 5-H, 7-H), 7.45 (t, 1H, J=7.0 Hz, 6-H), 6.45 (d , 1H, J=8.5 Hz, 50-H), 6.39 (s, 1H, 30-H), 4.01 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 مگاهرتز، DMSO d6) d 193.9، 161.6، 160.4، 150.3،138.6، 134.8، 131.7، 130.3، 128.7، 128.2، 128.7، 128.2، 3،1، 127، 128.2، 128.1، 128.2، 128.2، 128.2، 128.1، 127 HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M به علاوه H) به اضافه calcd253.0859، obsd 253.0858.

2.2.2.4. (E)-2-(4-هیدروکسی-3-متوکسی بنزیلیدین)-2،3-دی هیدرو-1هیندن{10}}وان (BID4).

جامد زرد؛ بازده، 52.{1}} درصد ; زمان واکنش، 4 ساعت؛ فرمول مولکولی، C17H14O3. mp, 186.9–187.4 C; 1H NMR(4{33}}0 مگاهرتز، DMSO d6) d 9.71 (s، 1H، OH)، 7.73 (d، 1H، J=7.6 هرتز، 7- H)، 7.67-7.62 (m، 2H، 4-H، 5-H)، 7.45 (d، 1H، J=2.{{50}} هرتز , 20-H)، 7.43 (t، 1H، J=7.2 هرتز، 6-H)، 7.31 (s، 1H، H وینیلیک)، 7.24 (dd، 1H، J=8.0،2.0 هرتز، 60-H)، 6.87 (d، 1H، J=8.0 Hz، 50-H)، 4.05 (s، 2H، CH2 ), 3.84 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 مگاهرتز، DMSO d6) d 193.9، 150.5،149.7، 148.5، 138.3، 135.2، 134.4، 132.3، 128.2، 127.1، 128.2، 127.3، 128.2، 127.1، 128.2، 127.1، 125، 127.1، 127.1، 127.1، 127.1، 127.1، 127.1، 127.1، 127.1، 127.1 HRMS (ESI پلاس) m/z C17H15O3 (M به علاوه H) به اضافه محاسبه 267.1016، obsd 267.1016.

2.3. ارزیابی بیولوژیکی

2.3.1. سنجش مهاری تیروزیناز قارچ

سنجش فعالیت مهاری تیروزیناز با استفاده از قارچ تیروزیناز همانطور که قبلاً توضیح داده شد، با تغییرات جزئی انجام شد[35،36]. به طور خلاصه، 10 میلی‌لیتر از غلظت مشخص از هر ترکیب (0.0005-50 میلی‌مولار) و 20 میلی‌لیتر تیروزیناز قارچ (1000 واحد در میلی‌لیتر) در بافر فسفات 50 میلی‌مولار (PH 6.5) به واکنش 170 میلی‌لیتری اضافه شد. مخلوط در یک میکروپلیت 96-چاهی (کورنینگ، ایالات متحده). نسبت 1 میلی‌مولار محلول L-تیروزین یا L-DOPA، 50 میلی‌مولار بافر پتاسیم فسفات (PH 6.5) و آب مقطر 10:10:9 بود. مخلوط حاصل از واکنش در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. پس از آن، مقدار دوپاکروم تولید شده در هر چاه با آنالیز اسپکتروفتومتری در طول موج 492 نانومتر (OD492) با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان اندازه‌گیری شد. میزان مهار تیروزیناز (درصد) به صورت (1 Abssample/Abscontrol) 100 درصد محاسبه شد. درجه بازداری نمونه به صورت غلظت مورد نیاز برای مهار 50 درصدی (IC50) بیان شد.

2.3.2. تجزیه و تحلیل جنبشی آنزیم با تیروزیناز

برای تعیین مکانیسم‌های جنبشی مهار، از دو روش سینتیک مکمل استفاده شد: Lineweaver–Burk و Dixonplots [37-39]. با استفاده از نمودارهای Lineweaver-Burk (پلات‌های متقابل دوگانه)، نوع مهار BID3 با استفاده از غلظت‌های مختلف L-DOPA ({5}}.125، 0.25، 0.5، و 1) تعیین شد. میلی‌مولار)، به عنوان سوبسترا، در غیاب و حضور غلظت‌های مختلف BID3 (1، 2، و 4 lM). یک نمودار دیکسون (تک نمودار متقابل) مهار فورتیروزیناز در حضور غلظت‌های مختلف L-DOPA ({17}}.125، 0.25، 0.5، و 1 میلی‌مولار) به دست آمد. ). غلظت BID3 1، 2 و 4 میلی مولار بود. روش‌های آنزیمی متشکل از روش‌های سنجش تیروزیناز توصیف‌شده قبلی بودند. ثابت مهار (Ki) از تفسیر نمودارهای دیکسون تعیین شد.

2.3.3. شبیه سازی اتصال مولکولی تیروزیناز

برای تعیین ساختار کمپلکس آنزیم-بازدارنده و اطمینان از صحت، تکرارپذیری و قابلیت اطمینان نتایج docking، از نرم افزار AutoDock4.2 استفاده کردیم. برای مطالعات دیکینگ، ساختارهای کریستالی هدف پروتئین تیروزیناز قارچ از همترازی توالی پروتئین (بانک داده پروتئین (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40] به دست آمد. شبیه سازی های اتصال خودکار انجام شد. بین تیروزیناز و کوجیک اسید، فتالیک اسید، سینامیک اسید، یا BID3. برای روش اتصال: تبدیل 2 بعدی به ساختارهای 3 بعدی، بارهای محاسبه شده و افزودن اتم های هیدروژن با استفاده از برنامه ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41] LigandScout 4.1.5 برای پیش‌بینی برهمکنش‌های احتمالی بین لیگاندها و تیروزیناز و شناسایی فارماکوفورها استفاده شد.

2.3.4. کشت سلولی و سنجش زنده ماندن سلولی

سلول‌های ملانوم B16F10 موش از بانک خط سلولی کره (KCLB، سئول، کره) خریداری شدند و در DMEM حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد استرپتومایسین کشت شدند و سپس در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و با 5 درصد CO2 اتمسفر مرطوب شدند. تجزیه و تحلیل زنده ماندن سلولی همانطور که قبلا توضیح داده شد [42] انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌ها با تراکم 1104 سلول در چاهک در یک 96-چاه به مدت 24 ساعت کاشته شدند. در روز بعد، سلول ها در معرض غلظت های مختلف BID3 قرار گرفتند و به ترتیب 24 یا 48 ساعت انکوبه شدند. سپس 10 میلی لیتر محلول EZ-Cytox به هر چاهک اضافه شد و سلول ها به مدت 2 تا 4 ساعت انکوبه شدند. میزان جذب با استفاده از ELISA در طول موج 450 نانومتر تعیین شد. هر سنجش در سه تکرار انجام شد.

2.3.5. سنجش محتوای ملانین

محتوای ملانین همانطور که قبلاً توضیح داده شد تعیین شد [43]. سلول های ملانوما B16F10 (2105 سلول در چاه) در 6-صفحه های کشت چاه کاشته شدند. برای تعیین اثر بازدارندگی BID3 بر ملانوژنز، محیط تازه با محیط حاوی BID3 (1، 5 و 10 lM) یا کوجیک اسید (10 میلی مولار) به عنوان کنترل مثبت به مدت 1 ساعت جایگزین شد و سپس با a-MSH (5 lM) تحریک شد. ) و IBMX (200 میلی مولار) به مدت 48 ساعت. پس از دو بار شستشو با PBS، سلول ها با انکوباسیون در تریپسین/EDTA جدا شدند و گلوله ها در 100 میلی لیتر NaOH 1 N حل شدند و سپس در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 1 دست انکوبه شدند تا ملانین حل شود. محتویات ملانین با اندازه گیری جذب در طول موج 405 نانومتر با استفاده از ELISA reader (TECAN، Sunrise، اتریش) تعیین شد. محتوای ملانین با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد: (نمونه/شاهد) - 100 درصد. همه اندازه‌گیری‌ها در سه تکرار انجام شد.

2.3.6. فعالیت تیروزیناز سلولی

فعالیت تیروزیناز سلولی همانطور که قبلاً توضیح داده شد، با تغییرات جزئی ارزیابی شد [44،45]. به طور خلاصه، 2 105/سلول در 6-ظروف چاه آبکاری شدند و یک شبه انکوبه شدند. سلول ها به مدت 1 ساعت در معرض غلظت های مختلف BID3 (1، 5 و 10 میلی مولار) اورکوجیک اسید (10 میلی مولار) قرار گرفتند و متعاقباً با a-MSH (5 میلی مولار) و IBMX (200 میلی مولار) به مدت 48 ساعت تحریک شدند. پس از دو بار شستشو با PBS، سلول ها با 100 میلی لیتر محلول لیز حاوی 50 میلی مولار بافر فسفات (pH 6.5)، 0.1 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF) و 1 درصد Triton X{22}} لیز شدند و در دمای 80 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه منجمد شدند. لیزها ذوب شدند و در 12،{26}} دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. سپس، مایع رویی (80 میلی لیتر) با 2 میلی گرم در میلی لیتر L-DOPA (20 میلی لیتر) در یک صفحه چاهی ترکیب شد. . پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه، چگالی نوری در 492 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (TECAN، سالزبورگ، اتریش) اندازه گیری شد. غلظت پروتئین با استفاده از یک معرف سنجش پروتئین BCA با استفاده از BCA به عنوان استاندارد تعیین شد (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

فواید عصاره سیستانچ: تیروزیناز را مهار می کند.

2.3.7. تحلیل آماری

همه داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) ارائه می شوند. داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) برای تعیین تفاوت بین تیمارها و به دنبال آن آزمون posthoc بونفرونی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقدار p < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

3. نتایج و بحث

3.1. علم شیمی

مشتقات (E)-benzylidene-1-indanones (BID1-13) طبق طرح کلی 1 سنتز شدند. در این مطالعه حاضر، سیزده (E){5}benzylidene-1-مشتقات ایندانون سنتز شدند و آنها خواص مهاری تیروزیناز مورد بررسی قرار گرفت. مشتقات هدف (E)-2-بنزیلیدن-1-مشتقات ایندانون با استفاده از شرایط اسیدی (1 M HCl در اسید استیک) سنتز شدند. مشتقات ایندانون با بازده 32.8-99.1 درصد. به نظر می‌رسد که فقط ایزومرهای الکترونیکی 2-بنزیلیدین-1-ایندانون‌ها به دلیل سویه A معروف به سویه آللیک 1،3- تولید شده‌اند. سویه A (sterichindrance) بین حلقه فنیل و گروه کربونیل در ایزومر Z ظاهراً بزرگتر از بین حلقه فنیل و گروه متیلن در ایزومر E است. ساختار ترکیبات مصنوعی توسط 1H و 13C NMR و طیف‌سنجی جرمی همانطور که در بخش تجربی توضیح داده شد تأیید شد (شکل‌های S1–S38). به‌ویژه، شیفت شیمیایی پروتون الفینی در ایزومر E از 2- محافظت می‌شود. بنزیلیدین به دلیل اثر ناهمسانگرد گروه کربونیل است و در مقایسه با ایزومر Z (بیش از 7 پی پی ام) به نظر می رسد.<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">

طرح 1. سنتز (E)-2-بنزیلیدین-1-ایندانون ها.

3.2. خواص مهاری ترکیبات تیروزیناز

پتانسیل بازدارندگی تیروزیناز مشتقات (E)-benzylidene-1-ایندانون ها با استفاده از قارچ تیروزیناز مورد بررسی قرار گرفت. مایکوفنولات (L-تیروزین) و دی فنل ها (L-DOPA) به عنوان سوبسترا برای این آزمایش ها استفاده شدند [35]. واکنش‌های آنزیمی با مهارکننده‌های تیروزیناز، سوبسترا و آزمایش انجام شد. همه ترکیبات آزمایش‌شده یک مهار وابسته به غلظت را نشان دادند. مقادیر IC50 مشتقات (E)-benzylidene-1-ایندانون در جدول 1 نشان داده شده است.

در هر دو بستر L-تیروزین و L-DOPA، BID3 فعالیت مهاری قوی با مقادیر IC50 0 نشان داد.{{1{15}}}}34 ± 0.{{ 27}}224 میلی‌مولار و 0 ± 1.39. 00004 میلی‌مولار، در مقایسه با اسید کوجیک کنترل مثبت، که دارای مقادیر IC50 به ترتیب 0.20 ± 13.77 میلی‌مولار و 0.93 ± 33.14 میلی‌مولار بود. (شکل 1A). علاوه بر این، BID6 فعالیت قوی نسبت به L-تیروزین و L-DOPA با مقادیر IC50 به ترتیب mM 0.91 ± 5.00 و 2.79 ± 53.11 میلی مولار نشان داد. BID1 مهار قابل توجهی در برابر تیروزیناز از طریق مسیرهای L-تیروزین و L-DOPA نشان داد، با مقادیر IC50 به ترتیب 3.71 ± 39.74 میلی مولار و 5.39 ± 130.0 میلی مولار. BID4 و BID11 فعالیت مهاری متوسط ​​​​تیروزیناز را نشان دادند. سایر مشتقات غیرفعال بودند. به همین ترتیب، BID2 فعالیت قابل توجهی نسبت به L-تیروزین و L-DOPA نشان داد، با مقادیر IC50 3.03 ± 41.27 میلی مولار و 2.62 ± 52.93 میلی مولار. اثر در غلظت 200 میلی متر [47].

مطابق با یافته‌های مطالعات رابطه ساختار-فعالیت (SAR)، مشتقات حاوی (E)-benzylidene{2}}ایندانون جایگزین روی حلقه فنیل به طور قابل توجهی بر مهار پتانسیل تیروزیناز تأثیر گذاشتند. BID3 که تیروزیناز را با بالاترین قدرت مهار می‌کند، دارای یک گروه هیدروکسی در حضور یک گروه هیدروکسی است و فعالیت تیروزیناز را تا حد زیادی مهار می‌کند (BID1 vsBID3). این نتایج نشان می‌دهد که گروه 2،{9}دی هیدروکسی (نیمه رزورسینول) در ساختار حلقه فنیل ممکن است مسئول مهار افزایش یافته تیروزیناز باشد. جالب توجه است، در یک مطالعه قبلی بر روی مهارکننده‌های بالقوه تیروزیناز مصنوعی، نشان دادیم که جایگزینی 2،{11}دی هیدروکسی به‌شدت فعالیت تیروزیناز را مهار می‌کند [48،49]. علاوه بر این، داده‌های SAR ما همچنین نشان داد که معرفی یک گروه 3-هیدروکسی در حضور یک گروه هیدروکسی بر مهار تیروزیناز تأثیر می‌گذارد. این پدیده‌ها با این یافته‌ها نشان داده شدند که یک حلقه 4-متوکسی{17}هیدروکسی فنیل، فعالیت مهاری علیه تیروزیناز را افزایش می‌دهد، در حالی که معرفی یک گروه 3،{19}}دی هیدروکسی (بخش کاتکول) باعث کاهش فعالیت مهاری تیروزیناز می‌شود. BID2 در مقابل BID6) [35]. این نتایج نشان می دهد که گروه 3-هیدروکسی-4-متوکسی نیز مسئول فعالیت مهاری چهل تیروزیناز است. با این وجود، در مطالعه حاضر، BID9 و BID11 که حاوی 2،{28}}دی متوکسی فنیل یا 3،{30}}دی متوکسی فنیل گروه‌ها هستند، فعالیت مهاری تیروزیناز متوسطی را نشان دادند. بر اساس مقادیر IC50 از طریق مسیر L-تیروزین و L-DOPA، BID3 قوی ترین فعالیت مهاری تیروزیناز را نشان داد، بنابراین، ما مکانیسم زیربنایی این اثر مهاری را بیشتر مطالعه کردیم. راداکریشنان و همکاران (2015) [20] گزارش کردند که مهارکننده‌های تیروزیناز قوی (Z)-benzylidene{38}}ایندانون جایگزین هیدروکسیل شده است. اگرچه مطالعات قبلی نشان داده است که مشتقات (Z)-بنزیلیدین{41}}ایندانون جایگزین هیدروکسیل دارای فعالیت ضد تیروزیناز هستند، تا آنجا که ما می دانیم، هیچ گزارشی مبنی بر مهار تیروزیناز توسط (E)-benzylidene وجود ندارد{44} مشتقات ایندانون با استفاده از آزمایشات مبتنی بر سلول

جدول 1. پتانسیل مهاری قارچ تیروزیناز جایگزین 2،3-دی هیدرو-1H-inden-1-یک (1-ایندانون) شبیه چالکون

مشتقات (BID1-13).

شکل 1. مهار وابسته به غلظت فعالیت تیروزیناز قارچ توسط BID3 و اسید کوجیک (کنترل مثبت) (n=3).

3.3. تجزیه و تحلیل جنبشی آنزیمی مهار تیروزیناز

از آنجایی که BID3 قوی‌ترین بازدارنده بود، مکانیسم اثر مهاری آن را بیشتر مطالعه کردیم. در تلاشی برای توضیح نحوه مهار آنزیم، آنالیزهای سینتیکی در غلظت‌های مختلف L-DOPA و غلظت‌های مختلف BID3 انجام شد. نمودارهای Dixon و Lineweaver-Burk با استفاده از داده‌های به‌دست‌آمده از مطالعات سینتیکی به منظور تأیید الگوی بازداری ترسیم شدند و ثابت‌های بازداری (Ki) با تفسیر نمودارهای دیکسون تعیین شدند (شکل 2A و B). غلظت L-DOPA به صورت زیر نشان داده می شود: 1، 2، 4 میلی مولار. محل تقاطع در سمت چپ قرار دارد، که نشان دهنده مهار نوع مخلوط در برابر تیروزیناز با مقدار Ki برابر با 2.4 میلی مولار است (شکل 2B). مقدار Ki نشان دهنده غلظت های مورد نیاز برای تشکیل یک مجتمع آنزیم-بازدارنده است، بنابراین یک مهار کننده با مقدار Ki پایین تر نشان دهنده فعالیت بیشتر مهار تیروزیناز است.

اتصال مولکولی در طول سالیان متمادی به بینش های مهمی در مورد کشف دارو کمک کرده است. با این حال، روش‌های داکینگ با هدف شناسایی موقعیت‌های صحیح لیگاندها در پاکت اتصال پروتئین و پیش‌بینی میل ترکیبی بین لیگاند و پروتئین است. به عبارت دیگر، Docking فرآیندی را توصیف می کند که از طریق آن دو مولکول در یک فضای سه بعدی با هم قرار می گیرند. برای تعیین اینکه آیا BID3 به محل فعال تیروزیناز متصل می شود، تجزیه و تحلیل مولکولی برای شناسایی موقعیت های اتصال احتمالی BID3 در ساختار کریستالی تیروزیناز قارچ (PDB ID: 2Y9X) انجام شد (شکل 3A). این نتایج با استفاده از AutoDock4.2 محاسبه شد. برنامه پایدارترین موقعیت اتصال با کمترین امتیاز [50] بود. اخیرا حسنی و همکاران. [47] گزارش کردند که اسید سینامیک و اسید فتالیک مهارکننده های تیروزیناز حالت مخلوط هستند. بنابراین، کمک، اسید سینامیک و اسید فتالیک برای اعتبارسنجی نتایج اتصال استفاده شد [51]. مدل‌های اتصال مولکولی BID3 و اسید کوجیک (بازدارنده نوع رقابتی شناخته شده) در محل کاتالیزوری تیروزیناز در شکل 3B نشان داده شده است [52]. ]. کمپلکس مهارکننده تیروزیناز-BID3 انرژی اتصال 6.28 کیلوکالری بر مول شامل دو پیوند هیدروژنی با باقیمانده ASN260 و MET280 تیروزیناز ارائه می‌کند و برهمکنش‌های آبگریز بین BID3 و باقی‌مانده‌های تیروزیناز مشاهده شد که به‌ترتیب محل VAL248، VAL248، و PHEAL2 را تثبیت کردند. قارچ تیروزیناز (جدول 2 و شکل 3E و H). علاوه بر این، مدل های اتصال مولکولی BID3، فتالیک اسید (بازدارنده آلوستریک 1)، و اسید سینامیک (بازدارنده آلوستریک 2) در دو محل آلوستریک در شکل 3C و 3D نشان داده شده است. اسید فتالیک و اسید سینامیک به ترتیب به عنوان لیگاندهای مرجع در سایت های آلوستریک 1 و 2 استفاده شدند [47،51]. همانطور که در شکل 3F و I نشان داده شده است، BID3 و اسید فتالیک پیوند هیدروژنی دون را با باقیمانده TRY140 تیروزیناز، و سه باقیمانده برهمکنش آبگریز با LEU24، PHE147، و ILE148 تیروزیناز در محل آلوستریک اسید و سینامیک مربوطه نشان دادند. در سایت آلوستریک 2 تیروزیناز شامل پیوندهای هیدروژنی بین ASP312 و LYS376 تیروزیناز بود، در حالی که THR308 به صورت آبگریز در سایت آلوستریک 2 برهمکنش داشت (شکل 3G و J). علاوه بر این، BID{51}}تیروزیناز باندینگ برای اعمال انرژی اتصال در هر دو سایت آلوستریک تیروزیناز (به ترتیب 4.38 و 5.68 کیلوکالری در مول)، که نشان دهنده میل اتصال بالا با هر دو محل آلوستریک است، یافت شد. بر اساس مطالعات آنزیمکینتیک، BID3 یک مهار نوع مختلط اعمال کرد، قابلیت اتصال BID3 با هر دو سایت کاتالیزوری و دو سایت آلوستریک، مهار نوع مخلوط آن از تیروزیناز را تایید کرد.

شکل 2. نمودارهای Lineweaver-Burk (A) و Dixon (B) برای مهار تیروزیناز قارچ توسط BID3 با استفاده از L-DOPA به عنوان بستر.

3.4. فعالیت بیولوژیکی

برای بهره‌برداری از اثرات ضد تیروزیناز BID3 در مدل کشت سلولی، اثرات سیتوتوکسیک آن را روی سلول‌های B16F10 بررسی کردیم. سلول ها با غلظت های مختلف BID3 (1-20 میلی مولار) به مدت 48 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و با استفاده از روش EZ-Cytox ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که BID3 هیچ اثر سیتوتوکسیک قابل توجهی در ملانومسل های B16F10 تا 20 میلی مولار نداشت (شکل 4A و B). بنابراین، آزمایش‌های بعدی با استفاده از BID3 تا 20 میلی‌مولار انجام شد.

جدول 2 مکان های اتصال و امتیازات اتصال BID3 در تیروزیناز قارچ (PDB ID: 2Y9X) همانطور که با استفاده از برنامه AutoDock4.2 تعیین شد.

ملانوژنز توسط یک آبشار آنزیمی تیروزیناز تنظیم می شود. به همین دلیل، چندین ترکیب سفیدکننده پوست برای کاهش فعالیت تیروزیناز ایجاد شده است. اسید کوجیک، یک مهارکننده تیروزیناز، به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد [53]. بنابراین، برای بررسی اثرات BID3 بر هایپرپیگمانتاسیون ناشی از افزایش cAMP، سلول‌های B16F1{13}} با a-MSH و IBMX در حضور BID3 تیمار شدند (1، 5، و 2{{2{22}}}}). mM) برای 48 ساعت، و محتوای ملانین و فعالیت سلول تیروزیناز تعیین شد (شکل 4C و D). درمان با a-MSH و IBMX باعث افزایش قابل توجهی (P <0.001#) در="" محتویات="" ملانین="" (شکل="" 4c)="" و="" فعالیت="" تیروزیناز="" سلولی="" (شکل="" 4d)="" در="" سلول="" های="" b16f10="" در="" مقایسه="" با="" کنترل="" درمان="" نشده="" شد.="" با="" این="" حال،="" تیمار="" bid3="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" (p=""><0.01**؛ p=""><0.001***) و="" کاهش="" وابسته="" به="" غلظت="" محتویات="" ملانین="" و="" فعالیت="" تیروزیناز="" سلولی="" سلولهای="" b16f10="" در="" مقایسه="" با="" سلولهای="" تیمار="" شده="" با="" a-msh="" یا="" ibmx،="" نشان="" می="" دهد="" که="" کاهش="" ملانین="" سلولی="" ممکن="" است="" به="" دلیل="" مهار="" فعالیت="" تیروزیناز="" باشد.="" .="" بنابراین،="" این="" یافته‌ها="" به="" وضوح="" نشان="" می‌دهند="" که="" bid3="" بدون="" ایجاد="" سمیت="" سلولی،="" اثرات="" ضد="" ملانوژنی="" را="" در="" مهار="" فعالیت="" تیروزیناز="" و="" سنتز="" ملانین="" در="" سلول‌های="" b16f10="" اعمال="">

ایندانون یکی از ساختارهای ممتاز شیمی دارویی است و به طور کلی با انواع ترکیبات دارویی فعال مرتبط است [54]. بخش ایندانون در انواع محصولات طبیعی فعال فیزیولوژیکی وجود دارد. با توجه به این موضوع، Okpekonet al.، [55] یک ترکیب جدید 1-ایندانون را گزارش کرد که از ریشه های Uvaria جدا شده است. این ترکیب اولین 1-مشتق ایندانون است که از گیاهان جدا شده است. ناگل و همکاران، [56] گزارش کردند که ایندان-آلدئید متیله جدید از مارینسیانوباکتریوم به عنوان یک تنظیم کننده رگزایی تومور جدا شده است. به همین ترتیب، از آنجایی که هسته ایندانون اهمیت بیولوژیکی دارد، محققان چندین سال گذشته بر توسعه آنالوگ های ایندانون فعال دارویی به عنوان عوامل درمانی متمرکز شده اند. تنوع ساختاری 1-ایندانون‌ها بر انواع پاسخ‌های بیولوژیکی دلالت دارد و این ترکیبات ممکن است در کشاورزی و پزشکی به کار روند. 62]، عوامل ضد میکروبی [63،64]، و عوامل ضد ویروسی [65،66]. با توجه به پتانسیل کاربرد گسترده، 1-ایندانون ها اشیاء جالبی برای تحقیقات بیشتر بودند و طراحی کلاس های جدید برای سنتز آنها مطلوب است.

cistanche tubolosa: ضد پیری

4. نتیجه گیری

برای شناسایی مهارکننده‌های قوی تیروزیناز، ما سیزده مشتق (E)-benzylidene-1-ایندانون را طراحی و سنتز کردیم. در میان این ترکیبات، (E)-2-(2,4-dihydroxy-benzylidene){ {6}}، 3-دی هیدرو-1H-in{10}}(BID3) به شدت فعالیت تیروزیناز را مهار کرد (IC{12}}.034 و 1.39 میلی‌مولار، برای L-تیروزین و L-DOPA، به ترتیب)، که بهتر از ترکیب مرجع، اسید کوجیک (IC{18}}.77.7 میلی‌مولار و 33.14 میلی‌مولار) بود. رابطه ساختار-فعالیت نشان داد که حضور گروه دی هیدروکسیل در 2 و موقعیت {24}(E)-benzylidene{26}}ایندانون باعث بهبود اسکلت در برابر تیروزیناز شد. حالت مهار آنزیمی آنزیم، تعیین شده توسط نمودارهای Lineweaver-Burk و Dixon، نشان داد که BID3 یک بازدارنده از نوع مخلوط است. مطالعات اتصال مولکولی نشان می‌دهد که اتصال در محل فعال و در مکان‌های آلوستریک مکانیسم‌های مهمی برای فعالیت مهاری تیروزیناز هستند. بر اساس این نتایج، به نظر می رسید BID3 یک مهارکننده قوی تیروزیناز برای درمان اختلالات پوستی مانند هایپرپیگمانتاسیون باشد.

فواید سیستانچ بیابانی: تشکیل ملانین را مهار می کند