متابولیسم In Vitro و In Vivo عصاره Cistanche Tubulosa در موش های صحرایی افسردگی غیرقابل پیش بینی ناشی از استرس طبیعی و مزمن

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

یانگ لی و همکاران

چکیده

Cistanche tubulosa، یکی از گونه‌های Cistanches Herba، اخیراً تایید شده است که با بازگرداندن هموستاز میکروبیوتای روده، اثر ضد افسردگی در موش‌های صحرایی استرس غیرقابل پیش‌بینی مزمن (CUS) دارد. در این مقاله، هدف ما بررسی مشخصات متابولیک C. tubulosa در موش‌های مدل افسردگی طبیعی و ناشی از CUS در شرایط in vitro و in vivo است. با استفاده از UPLC-Q-TOF-MS، متابولیسم گوارشی در شرایط آزمایشگاهیعصاره سیستانچ توبولوزا(CTE) در هر دو موش نرمال و CUS مورد بررسی قرار گرفت. در همان زمان، متابولیسم in vivo CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در موش‌های سالم و افسرده نیز ادرار و مدفوع موش‌ها بررسی شد. در مجموع 20 و 26 متابولیت به ترتیب از متابولیسم in vitro و in vivometabolism در موش‌های سالم و CUS مشخص شد. CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به آگلیکون ها و محصولات تخریب گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید (PhGs) و گلیکوزیدهای ایریدوئید چه توسط میکروبیوتای روده طبیعی یا افسرده موش در شرایط آزمایشگاهی متابولیزه شد. متابولیت های فاز دوم آگلیکون ها و محصولات تخریب PhGs و گلیکوزیدهای ایریدوئید متابولیت های اصلی در ادرار و مدفوع موش بودند. علاوه بر این، قابلیت متابولیک برای تولید گلیکوزیدها و آگلیکون‌های ثانویه در میکروبیوتای روده موش‌های صحرایی افسرده بسیار ضعیف‌تر از میکروبیوتای روده موش‌های صحرایی نرمال بود که به هیدرولازهای گلیکوزیدی اختلال تولید شده توسط میکروبیوتای روده در موش‌های مبتلا به CUS نسبت داده شد. نتایج این مطالعه پایه و اساس درک فرآیند متابولیک و مکانیسم درمانی خاصیت ضد افسردگی CTE را ایجاد کرد.

کلید واژه ها: Cistanche tubulosa, افسردگی متابولیسم, In vitro, In vivo, میکروبیوتای روده

1. مقدمه

Cistanches Herba رسماً به عنوان ساقه آبدار خشک شده Cistanche deserticola (YC Ma) و C. tubulosa (Schrenk) ثبت شده است که برای درمان کمبود کلیه، ناتوانی جنسی، ناباروری زنان، مرض لوکوره، متروراژی فراوان و یبوست پیری استفاده می شود. مطالعات فارماکولوژیک مدرن نشان داده است که Cistanches Herba دارای فعالیت های بیولوژیکی مختلفی مانند ضد تخریب عصبی، تنظیم ایمنی و ضد التهاب است [2،3]. تحقیقات قبلی ما آن را تأیید کرده استعصاره سیستانچ توبولوزا(CTE) که از 6/48 درصد گلیکوزیدهای فنیل تانوئیدی (PhGs)، 9/6 درصد گلیکوزیدهای ایریدوئید و 0/2 درصد کل ساکاریدها تشکیل شده است، می تواند به طور قابل توجهی علائم افسردگی ناشی از استرس مزمن غیرقابل پیش بینی (CUS) را کاهش دهد. بازگرداندن هموستاز میکروبیوتای روده [4]. مطالعات اخیر نشان می دهد که تغییرات در ترکیب میکروبیوتای روده با ایجاد و پیشرفت افسردگی مرتبط است [5،6]. فراوانی نسبی جنس های میکروبی به طور قابل توجهی در موش های مدل افسردگی CUS در مقایسه با گروه کنترل عادی مختل شد [7]. در بیماران افسرده، تنوع و غنای میکروبیوتای روده نیز به طور قابل توجهی تغییر کرده است [8]. علاوه بر این، ترکیبات مختلفی از جمله گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی (PhGs) و گلیکوزیدهای ایریدوئید به عنوان ترکیبات اصلی Cistanches Herba [2،3] در نظر گرفته شدند که به راحتی به گلیکوزیدها و آگلیکون‌های ثانویه خود متابولیزه می‌شوند، از جمله هیدروکسی تیروزول (HT), 3,{15}hydroxethylphendi. گلیکوزید، اسید ژنیپوزیدیک دی گلیکوزیله، و غیره توسط میکروبیوتای روده انسان. این متابولیت ها راحت تر از طریق روده جذب می شوند و فعالیت بیولوژیکی مطابق با جزء اولیه انجام می دهند[9-11]. بنابراین، ما معتقدیم که در طول وقوع و توسعه افسردگی، اختلال در ساختار میکرو فلور روده به طور اجتناب‌ناپذیری بر متابولیسم داروهای خوراکی سنتی چینی (TCMs) در دستگاه گوارش تأثیر می‌گذارد، علاوه بر آن بر وضعیت فیزیولوژیکی میزبان تأثیر می‌گذارد. بیشتر داده‌های متابولیک موجود Cistanches Herba از مطالعات متابولیک روی حیوانات سالم می‌آید[12-15]. بنابراین، بررسی مشخصات متابولیک CTE از اهمیت بالینی بیشتری برخوردار است(عصاره سیستانچ توبولوزا)در وضعیت پاتولوژیک در روشن کردن اجزای زیست فعال آن و درک مکانیسم عمل برای اثر ضد افسردگی آن.

در مطالعه حاضر، هدف ما مشخص کردن پروفایل های متابولیک CTE است(عصاره سیستانچ توبولوزا)در موش‌های مدل افسردگی سالم و ناشی از CUS توسط طیف‌سنجی جرمی زمان پرواز کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق‌العاده (UPLC-Q-TOF-MS). شیره معده، مایع روده و میکروبیوتای موش های سالم و افسرده پاتولوژیک برای شبیه سازی فرآیند متابولیک CTE استفاده شده است.(عصاره سیستانچ توبولوزا)در دستگاه گوارش در شرایط آزمایشگاهی، به طور مستقل و متوالی. متابولیت های in vivo نیز پس از تجویز خوراکی CTE مشخص می شوند(عصاره سیستانچ توبولوزا)در موش های معمولی و CUS. این مطالعه بینش جدیدی در مورد متابولیسم و ​​متابولیت های فعال CTE ارائه می دهد(عصاره سیستانچ توبولوزا)برای افسردگی

2. مواد و روش ها

2.1. مواد

ساقه های خشک C. tubulosa از شهرستان Hetian (سین کیانگ، چین) جمع آوری شد. نمونه‌های کوپن توسط پروفسور شیائوبو لی تأیید شد و در هرباریوم دانشکده داروسازی، دانشگاه جیائو تونگ شانگهای (شانگهای، چین) سپرده شد. روش استخراج همانطور که در نشریه قبلی ما مشخص شد استفاده شد [4]. راعصاره سیستانچ توبولوزانمونه ها (CTE) در دمای 4 درجه نگهداری شدند و قبل از استفاده مجدداً با آب استریل حل شدند. محلول های آب استریل CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)سپس نمونه از طریق غشای 0.22 میکرومتر فیلتر شد و فیلترها در لوله‌های استریل جمع‌آوری شدند.

Echinacoside توسط آزمایشگاه دکتر Pengfei Tu، دانشگاه پکن (پکن، چین) ارائه شد. Acteoside، isoacteoside، 2'-acetylakteoside، و cistanoside A از Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (چنگدو، چین) خریداری شدند. هیدروکسی تیروزول، کافئیک اسید، 3،{3}}دی هیدروکسی بنزن پروپیونیک اسید، 3-هیدروکسی فنیل پروپیونیک اسید، و 3-فنیل پروپیونیک اسید از علاءالدین IndustrialInc خریداری شد. (شانگهای، چین). خلوص هر جزء با HPLC-UV بیش از 95 درصد تعیین شد. استونیتریل با درجه HPLC از Merck (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. آب دیونیزه شده از آب مقطر با استفاده از سیستم تصفیه آب Milli-Q (Millipor, Bedford, MA, USA) تهیه شد. سایر معرف ها و مواد شیمیایی مورد استفاده از درجه آنالیتیکی برخوردار بودند.

2.2. آزمایشات روی حیوانات

موش‌های نر نژاد Sprague-Dawley (20 ± 200 گرم) از شرکت فناوری حیوانات آزمایشگاهی رودخانه حیاتی پکن (پکن، چین) تهیه و در مرکز حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه جیائوتنگ شانگهای (شانگهای، چین) نگهداری شدند. حیوانات در دمای اتاق کنترل شده گروهی-خانه دار (2±25 درجه، رطوبت نسبی 10±55 درصد) با چرخه نور تا تاریکی 12:12 ساعت بودند. موش‌ها به مدت 1 هفته اجازه دسترسی آزاد به غذا و آب موش‌های آزمایشگاهی معمولی داشتند. امکانات و پروتکل های حیوانات توسط کمیته اخلاق حیوانات دانشگاه شانگهای جیائو تونگ (شانگهای، چین) تایید شد.

پس از یک هفته سازگاری، 12 موش ساده به طور تصادفی به دو گروه (n=6)، گروه کنترل و گروه استرس غیرقابل پیش بینی مزمن (CUS) تقسیم شدند. موش‌های CUS مانند گزارش قبلی ما [4] ساخته شدند که تحت فشارهای مختلف قرار گرفتند: نویز سفید (100 دسی‌بل) به مدت 1 ساعت، روشنایی استروبوسکوپی با شدت کم در طول شب (120 فلاش در دقیقه)، محرومیت از آب برای 24 ساعت، خالی بودن بطری های آب به مدت 1 ساعت (بعد از محرومیت از آب)، محرومیت از غذا به مدت 24 ساعت، محدودیت فیزیکی (2-1 ساعت)، شنای اجباری (5 دقیقه)، قفس کثیف به مدت 24 ساعت (200 میلی لیتر آب در 100 گرم بستر خاک اره)، نیشگون گرفتن دم ( 1 دقیقه)، شوک به مدت 30 دقیقه، شیب 45 درجه قفس به مدت 24 ساعت، و روشنایی یک شبه (12 ساعت). عوامل استرس زا به مدت 4 هفته به طور مداوم و تصادفی اعمال شدند، ترتیب دقیق در جدول S1 توضیح داده شده است. پس از 4 هفته استرس، آزمایش ترجیح ساکارز، آزمایش میدان باز، و آزمایش تغذیه سرکوب شده به روشی که قبلا توضیح داده شد انجام شد [4]. طرح کلی CUS و آزمون رفتاری در شکل S1 نشان داده شده است. پس از آزمایش های رفتاری، حداقل 4 مدفوع از هر موش گرفته شد و در لوله های مخروطی استریل برای تجزیه و تحلیل آزمایشگاهی CTE قرار داده شد.(عصاره سیستانچ توبولوزا)متابولیسم

2.3. متابولیسم گوارشی CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط موش نرمال و CUS در شرایط آزمایشگاهی

2.3.1. متابولیسم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در شیره های شبیه سازی شده معده و روده

پنجاه میلی گرم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به ترتیب به 10 میلی لیتر آب معده و آب روده شبیه سازی شده اضافه شدند. سپس CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت در شیره معده و 6 ساعت در شیره روده انکوبه شد. مخلوط کشت شده (1 میلی لیتر) با 3 میلی لیتر n-بوتانول اشباع شده با آب بلافاصله در 0 و 4 ساعت در شیره معده و در 0 و 6 ساعت در آب روده خاموش شد. روش پردازش نمونه مورد استفاده همانطور که قبلاً توضیح داده شد [9] بود.

2.3.2. متابولیسم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی

نمونه‌های مدفوع تازه موش‌های صحرایی نرمال و CUS ابتدا با 25 برابر حجم براث GAM مخلوط و هموژنیزه شدند. رسوبات با فیلتراسیون از طریق سه قطعه گاز حذف شدند. سپس سوسپانسیون در دمای 37 درجه در یک انکوباتور بی هوازی که در آن هوا با مخلوط گاز (H{2}} درصد، CO{3}} درصد، N2 85 درصد) جایگزین شد، انکوبه شد. 50 میلی گرم CTE به طور جداگانه به 5 میلی لیتر سوسپانسیون مدفوع معمولی و CUS موش اضافه شد و سوسپانسیون در دمای 37 درجه به مدت 48 ساعت انکوبه شد. مخلوط کشت شده با n بوتانول اشباع شده از آب در زمان های 0، 12، 24 و 48 ساعت حذف و استخراج شد. روش پردازش نمونه قبلاً شرح داده شده بود [9].

2.3.3. متابولیسم متوالی CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط آب معده، آب روده، میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی

در مرحله اول، 100 میلی گرم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به 1{{10}} میلی‌لیتر آب معده شبیه‌سازی شده اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت انکوبه شد. کل واکنش با 3 برابر حجم n-بوتانول اشباع شده از آب خاموش شد و در 3{25}}00 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس مایع رویی در زیر جریان نیتروژن تبخیر شد. گاز در 37 درجه . در مرحله دوم، باقیمانده مجدداً در 0.4 میلی لیتر آب استریل حل شد، به 8 میلی لیتر آب روده شبیه سازی شده اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 6 ساعت انکوبه شد. نمونه با شیره معده به همین ترتیب آماده شد. در نهایت، باقیمانده در 0.3 میلی لیتر آب استریل مجدد حل شد، به ترتیب به 6 میلی لیتر سوسپانسیون مدفوع معمولی و CUS موش اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 48 ساعت در انکوباتور بی هوازی انکوبه شد. یک میلی لیتر از واکنش با 3 میلی لیتر n-بوتانول اشباع شده با آب بلافاصله در 0 و 4 ساعت در شیره معده، در 0 و 6 ساعت در آب روده، و در 0، 12، 24 و 48 ساعت در میکروبیوتای روده موش خاموش شد. . نمونه به طور یکسان CTE پردازش شد(عصاره سیستانچ توبولوزا)در شیره معده شبیه سازی شده

2.4. متابولیسم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط موش نرمال و CUS در داخل بدن

سپس هر موش در دو گروه در یک قفس متابولیک جداگانه قرار داده شد. پس از روزه داری یک شبه که فقط اجازه دسترسی آزاد به آب را می داد، همه موش ها به صورت خوراکی با 2 میلی لیتر آب از طریق لوله معده تجویز شدند. نمونه‌های خالی ادرار و مدفوع از همه موش‌ها از 0 ساعت تا ۱۲ ساعت جمع‌آوری شد. علاوه بر این، CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)(4{1}}0 میلی گرم/کیلوگرم) با گاواژ تجویز شد. نمونه ادرار و مدفوع از ساعت صفر تا 24 ساعت جمع آوری شد. تمام نمونه های ادرار و مدفوع بلافاصله در دمای 80- درجه نگهداری شدند.

نمونه‌های ادرار و مدفوع از موش‌های صحرایی طبیعی و CUS قبلاً شرح داده شده بود [12]. تمام نمونه های به دست آمده توسط UPLC-Q-TOF-MS آنالیز شدند.

2.5. روش تحلیلی

UPLC بر روی سیستم Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) با ستون ACQUITY UPLC BEH C18 (100 میلی‌متر × ۲.۱ میلی‌متر شناسه، ۱.۷ میکرومتر، Waters Corp.) انجام شد. ، ایالات متحده آمریکا) با شستشوی گرادیان با استفاده از {{10}}.1 درصد استونیتریل اسید فرمیک (A) و 0}.1 درصد اسید فرمیک در آب (B) با سرعت جریان 0.4 میلی لیتر در دقیقه . نمایه گرادیان: 0-5 دقیقه (A: 5-20 درصد)، 5-7.5 دقیقه (A: 20-30 درصد)، 7.5-10 دقیقه (A: 30-70 درصد)، 10-11 دقیقه (A : 70-100 درصد)، و به مدت 1.5 دقیقه نگه داشته شد. گرادیان در 0.5 دقیقه به 5 درصد بازیافت شد و برای اجرای بعدی به مدت 2.5 دقیقه نگه داشت. حجم تزریق 3 میکرولیتر بود. دمای کوره ستونی روی 35 درجه تنظیم شد.

طیف سنجی جرمی با استفاده از طیف سنج جرمی Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA) انجام شد. یونیزاسیون در حالت الکترواسپری منفی (ESI-) انجام شد. پارامترهای MS به شرح زیر بود: ولتاژ مویرگی، −2.0 kV; ولتاژ مخروطی، 20 V; منبع درجه حرارت، 120 درجه ; دمای تخلیه، 500 درجه ; جریان گاز مخروطی و تخلیه به ترتیب 50 و 1000 لیتر در ساعت. برای اندازه گیری دقیق، لوسین-انکفالین به عنوان جرم قفل برای تولید یون [M-H]- استفاده شد (m/z 554.2615). یک آزمایش MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) در دو تابع اسکن به شرح زیر انجام شد: تابع 1 (انرژی کم): m/z 50-1000، زمان اسکن 0.25 ثانیه، تأخیر بین اسکن 0.02 ثانیه، انرژی برخورد 6 eV. عملکرد 2 (انرژی بالا): m/z50-1000، زمان اسکن 0.25 ثانیه، تأخیر بین اسکن 0.02 ثانیه، رمپ انرژی برخورد 20-45 eV.

2.6. پردازش داده ها

داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) برای شناسایی متابولیت‌ها در داده‌های خام دقیق جمع‌آوری‌شده از طریق MSE پردازش شدند. ترکیبات بر اساس جرم دقیق، قطعات در طیف سنجی جرمی با انرژی بالا شناسایی شدند. آستانه شدت به عنوان تعداد 100.0 تنظیم شد. شناسایی هدف، تحمل تطابق قطعه، و سایر پارامترها به طور خودکار تنظیم شدند.

3. نتایج

3.1. تغییرات رفتاری در موش های صحرایی افسردگی ناشی از CUS

موش‌های مبتلا به علائم افسردگی ناشی از CUS توسط تست‌های رفتاری از جمله تست ترجیح ساکارز، تست میدان باز، و تست تغذیه سرکوب‌شده جدید مورد ارزیابی قرار گرفتند. آزمون تی دانشجویی نشان داد که ترجیح ساکارز در آزمون ترجیحی ساکارز (001/0p<)، کل="" مسافت="" طی="" شده="" در="" آزمون="" میدان="" باز=""><) و="" تأخیر="" خوردن="" در="" آزمون="" تغذیه="" سرکوب="" شده="" با="" تازگی=""><) به="" طور="" معنی="" داری="" وجود="" دارد.="" در="" مقایسه="" با="" گروه="" کنترل="" پس="" از="" {9}}="" هفته="" درمان="" cus="" (شکل="" 1).="" این="" یافته="" ها="" نشان="" داد="" که="" مدل="" استرس="" مزمن="" غیرقابل="" پیش="" بینی="" با="" موفقیت="" توسعه="" یافته="">

3.2. خصوصیات ترکیبات شیمیایی CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)

تجزیه و تحلیل جامع از اجزای نمونه اولیه CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط UPLC-Q-TOF-MS انجام شد. در مجموع، 27 مؤلفه از CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)شناسایی و به طور آزمایشی مشخص شد، از جمله 20 PhGs، 5 گلیکوزید iridoids و iridoid، و 2 الیگوساکارید. اطلاعات دقیق شامل زمان ماند، یون های قطعه دقیق MS و MS/MS در اطلاعات پشتیبان (جدول S2) فهرست شده است تا بینشی در مورد ساختار این ترکیبات شیمیایی ارائه دهد. یون کروماتوگرافی کل UPLC-Q-TOF-MS (TIC) CTE در شکل S2 نشان داده شده است.

3.3. متابولیسم گوارشی CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط موش نرمال و CUS در شرایط آزمایشگاهی

در این مطالعه متابولیت های بالقوه CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط موش های طبیعی و CUSrats در شرایط آزمایشگاهی از TIC ها شناسایی و با ترکیبی از ترکیبات عنصری و طیف جرمی قطعه MS/MS پس از مقایسه آنها با نمونه های شاهد شناسایی شدند. تمام متابولیت های CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در شیره های شبیه سازی شده معده و روده، میکروبیوتای روده ای نرمال و CUS موش صحرایی در جدول 1 فهرست شده است.

3.3.1. متابولیسم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در شیره های شبیه سازی شده معده و روده

هفت متابولیت CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در شیره معده شبیه سازی شده به طور آزمایشی با جرم دقیق و اطلاعات قطعه MSE شناسایی شد: M1 (m/z315.1074، C14H20O8، 1.66 دقیقه)، M4 (m/z 459.1501، C20H28O12،2.36 دقیقه)، M5 (m/z315.1074، M5 (m/z315.105. 2.60 دقیقه)، M7 (m/z179.0338، C9H8O4، 2.85 دقیقه)، M12 (m/z 785.2481، C35H46O20،4.77 دقیقه)، M16 (m/z 827.2580، C37H48O23، و C37H48O23، M12) 0.1968، C29H36O15، 5.81 دقیقه). گلیکوزیلاسیون، هیدروکسیلاسیون، هیدروژن زدایی و ایزومریزاسیون به عنوان مسیرهای متابولیکی اصلی برای CTE در شیره معده در نظر گرفته شد. M4 و M5 دارای وزن مولکولی 2 Da و 16 Da کمتر از جزء نمونه اولیه خود، decaffeoylacteoside بودند، و بنابراین به ترتیب به عنوان محصولات دهیدروژنه و دهیدروکسیله آن شناسایی شدند. M12 به عنوان ایزومر اکیناکوزید شناسایی شد که همان یون های اکیناکوزید را در m/z 623.2178، 477.1601، 315.1055، 161.0237 تولید می کند.

متابولیت های مشابه پس از CTE شناسایی شد(عصاره سیستانچ توبولوزا)جوجه کشی در آب روده قابل توجه است که گروه کافئویل در موقعیت C{0}} در PhGs به آسانی توسط آنزیم های گوارشی در آب روده متابولیزه شد تا متابولیت های دکافیل و اسید کافئیک آن را تولید کند.

3.3.2. متابولیسم CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی

در مجموع 20 متابولیت زیستی تبدیل شده از CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در میکروبیوتای معمولی روده صغیره شناسایی و شناسایی شد (شکل 2). از نتایج، مشاهده شد که PhGها به آگلیکون هیدروکسی تیروزول (HT) M2 (m/z 153.0550، C8H10O3، 1.78 دقیقه)، و اسید کافئیک (CA) M7 (m/z 179.0338، C9H8O5، و سپس 2) تجزیه شدند. به M3 (m/z 163.0390، C9H8O3، 2.02 دقیقه)، M6 (m/z181.0501، C9H10O4، 2.76 دقیقه)، M10 (m/z 195.0655، C10H12O4، و 5.15 Mz. C9H10O3، 4.36 دقیقه) از طریق هیدروکسیلاسیون، احیا و متیلاسیون. علاوه بر این، مسیرهای متابولیک مرکزی که متابولیت‌های مستقیم ترکیبات اولیه PhG را از CTE در میکروبیوتای روده موش‌های صحرایی طبیعی تولید می‌کنند عبارتند از احیا، متوکسیلاسیون، دگلیکوزیلاسیون، کافئویل، هیدروژن زدایی و ایزومریزاسیون.

پس از انکوباسیون در میکروبیوتای روده موش با افسردگی ناشی از CUS، CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)از طریق مسیرهای متابولیکی مشابه موش‌های معمولی به 20 متابولیت تبدیل شد.

3.3.3. متابولیسم متوالی CTE توسط شیره معده، آب روده، میکروبیوتای روده طبیعی و CUS موش صحرایی

پس از انکوباسیون متوالی در شیره معده، شیره روده، میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی، CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به 14 متابولیت متابولیزه شد (شامل 8 با آب معده، 7 با آب روده، 11 با نرمال، و 10 با میکروبیوتای روده موش CUS). در این میان، M2(HT) و M11 ({7}}هیدروکسی فنیل پروپیونیک اسید، 3-HPP) متابولیت های نهایی PhG ها پس از انکوباسیون متوالی CTE بودند.(عصاره سیستانچ توبولوزا)در شیره معده، شیره روده و میکروبیوتای روده. تفاوت معنی داری در متابولیت ها بین موش طبیعی و CUS وجود نداشت.

M8، M9، M14، M17، M19، و M20 تنها در متابولیسم مستقل CTE توسط میکروبیوتای روده موش طبیعی و CUS شناسایی شدند. این متابولیت ها عمدتاً واسطه های متابولیکی بودند که در مطالعه متابولیسم متوالی CTE به طور کامل به متابولیت های نهایی متابولیزه شده بودند و بنابراین تشخیص آنها دشوار است.

3.3.4. تفاوت بین نرخ متابولیک CTE توسط میکروبیوتای طبیعی و CUS رتین روده

برای روشن کردن تفاوت بین نرخ متابولیک CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)با میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی، محتوای نسبی 27 ترکیب اولیه و 20 متابولیت پس از انکوباسیون با شیره معده، آب روده، میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی به طور جداگانه و متوالی تعیین شد (جدول S3 و S4). نتایج نشان داد که اگرچه بین CTE تفاوت معناداری وجود ندارد(عصاره سیستانچ توبولوزا)متابولیت های موش های نرمال و افسرده، تفاوت معنی داری در میزان متابولیک آنها مشاهده شد. به عنوان مثال، C2 و C5 به عنوان اسید 8-اپیلوگانیک یا ایزومر آن شناسایی شدند. آنها به طور کامل در نمونه های معمولی در طی 12 ساعت انکوباسیون متابولیزه شدند. با این حال، در میکروبیوتای روده موش صحرایی افسرده، پس از 48 ساعت انکوباسیون کاملا متابولیزه شدند. واضح بود که سرعت متابولیسم در موش‌های معمولی سریع‌تر از موش‌های CUS بود. نتایج مشابهی از C18 (ایزوآکتئوزید) کشف شد. علاوه بر این، قابل توجه است که مساحت پیک M12 (ایزومریزاسیون اکیناکوزید) و M16 (ایزومریزاسیون توبولوزید A) در نمونه‌های معمولی بسیار بیشتر از نمونه‌های CUS بود که نشان می‌دهد واکنش ایزومریزاسیون CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در میکروبیوتاتان روده معمولی موش صحرایی در میکروبیوتای روده موش افسردگی شیوع بیشتری داشت.

3.4. متابولیسم CTE توسط موش طبیعی و CUS در داخل بدن

با مقایسه نمونه های بیولوژیکی گروه تیمار شده با CTE با نمونه های بیولوژیکی خالی، در مجموع 26 متابولیت (ترکیب 1-26) CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)موش های غیر طبیعی و CUS شناسایی شدند (جدول 2). کروماتوگرام های معمولی UPLC نمونه های ادرار موش طبیعی و CUS در شکل 3 ارائه شده است.

3.4.1. شناسایی متابولیت های CTE در راتورین نرمال و CUS

در مجموع 18 متابولیت in vivo CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در نمونه های ادرار موش طبیعی به طور آزمایشی شناسایی شد. متابولیت های تخریب PhG ها شامل HT و CA و سولفاته شدن بیشتر آنها (ترکیب 1، 2، 3، 5، 8 و 16)، متیلاسیون (6، 21، 22، و 24) و متوکسیلاسیون (13 و 14) متابولیت ها بودند. متابولیت های اصلی در ادرار موش طبیعی گلیکوزیدهای ایریدوئید به آسانی از طریق دگلیکوزیلاسیون به آگلیکون (23، 25 و 26) متابولیزه شدند. قابل توجه است که هیچ جزء اولیه در نمونه ادرار موشهای صحرایی طبیعی تشخیص داده نشد.

در نمونه ادرار موش افسردگی 22 متابولیت CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)شناسایی و مشخص شدند. یک ترکیب اولیه، 8-اسید اپیلوگانیک، در ادرار پاتولوژیک موش تشخیص داده شد. سایر متابولیت‌ها مطابق با متابولیت‌های موجود در ادرار نرمال موش‌ها بودند، از جمله متابولیت‌های سولفاته (1، 2، 3، 8، 10، و 16)، متابولیت‌های متیله (6، 11، 19، و 22)، متابولیت‌های متوکسیله (13 و 14). HT و CA، و تآگلیکون گلیکوزیدهای ایریدوئید (25 و 26).

3.4.2. خصوصیات متابولیت های CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در ratfeces معمولی و CUS

در این مطالعه، تنها یک متابولیت (ترکیب 20، 3-HPP) از CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در مدفوع طبیعی موش شناسایی شد. اکثر PhGها ابتدا به CA تجزیه شدند و در نتیجه متابولیت میکروبی اصلی خود، 3-HPP، متابولیسم بیشتری را متحمل شدند. در نمونه مدفوع موش CUS، 3 متابولیت به طور آزمایشی مشخص شد، از جمله 3-HPP سولفاته (ترکیب 16) و HT سولفاته (ترکیبات 2 و 3).

3.4.3. تفاوت بین متابولیت های in vivo CTE در موش های طبیعی و CUS

پس از تجویز خوراکی CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)متابولیت های in vivo تفاوت های آشکاری را در موش های مدل سالم و افسردگی نشان دادند. 21 متابولیت (ترکیب 1-3، 5، 6، 8-14، 16، 17، و 19-26) در هر دو نمونه موش سالم و CUS شناسایی شد. ترکیب 23 (اسید deglycosylatedgeniposidic) فقط در نمونه های موش سالم شناسایی شد، در حالی که ترکیبات 4 (HT)، 7 ({14}}epiloganic اسید)، 15 (3، 4-دی هیدروکسی بنزن پروپیونیک اسید)، و 18 ({{{{ 19}}کونژوگاسیون HPP glucuronide) فقط در نمونه‌های موش مدل CUS شناسایی شد. به طور خلاصه، ترکیبات نمونه اولیه تنها در موش‌های CUS شناسایی شدند، در حالی که، متابولیت‌های فاز II در موش‌های معمولی کشف شدند.

4. بحث

در این مطالعه، سه مدل انکوباسیون آزمایشگاهی شامل شیره معده، آب روده، میکروبیوتای روده معمولی و CUS موش صحرایی به طور مستقل و متوالی برای بررسی مشخصات متابولیک گوارشی CTE مورد استفاده قرار گرفت.(عصاره سیستانچ توبولوزا)درونکشتگاهی. مشخص شد که PhGsand گلیکوزیدهای ایریدوئید در CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به آسانی به گلیکوزیدها و آگلیکون های ثانویه خود توسط میکروبیوتای روده افسردگی موش صحرایی ناشی از CUS متابولیزه شدند. پس از آن، متابولیسم in vivo CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در موش‌های معمولی و CUS نیز تایید شد. مسیرهای متابولیک پیشنهادی برای CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)در موشهای صحرایی سالم و افسردگی ناشی از CUS در شکل 4 نشان داده شده است. PhGها مانند اکیناکوزید و اکتئوزید به HT و CA متابولیزه شدند و CA تحت متابولیسم بیشتر به متابولیت میکروبی اصلی خود، 3-HPP قرار گرفت. سپس HT، CA و {3}HPP به متابولیت های سولفاته، متیله و متوکسیله خود متابولیزه شدند. گلیکوزیدهای ایریدوئید شامل اسید جنیپوزیدیک، کانکانوزید A و کانکانوزید N از طریق دگلیکوزیلاسیون به آگلیکون های خود متابولیزه شدند. این بیشتر نشان داد که PhGs و گلیکوزیدهای iridoid در CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به آسانی به گلیکوزیدها و آگلیکون های ثانویه در موش های صحرایی CUS متابولیزه شدند. این متابولیت ها معمولاً جذب روده ای و فراهمی زیستی بهتری برای جذب بیشتر در خون برای اعمال فعالیت بیولوژیکی نشان می دهند [16-18]. شایان ذکر است که ایزومریزاسیون برای PhG ها در دستگاه گوارش رایج بود، متابولیت های مربوطه پس از مقایسه با زمان ماند UPLC ترکیبات نمونه اولیه آنها بر اساس پروفایل گرادیان UPLC ایده آل بهینه شده شناسایی شدند.

اسید کافئیک محصول تخریب اولیه CTE بود(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط میکروبیوتای روده پاتولوژیک افسردگی موش صحرایی. نشریات قبلی گزارش کردند که اسید کافئیک در آزمایش شنای اجباری در موش اثرات ضد افسردگی مانند ایجاد می کند. سطح mRNA فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF) در قشر پیشانی و سطح mRNA TrkB در آمیگدال به طور قابل توجهی پس از آزمایش شنای اجباری کاهش یافت، و کاهش قبلی به طور قابل توجهی توسط کافئیک اسید مهار شد [19]. هیدروکسی تیروزول آگلیکون PhGs بود. که از نوروژنز و عملکرد شناختی با جلوگیری از کاهش تنش ناشی از استرس پروتئین عصبی BDNF محافظت می کند [20]. بنابراین، توجه بیشتر به برخی از متابولیت‌های فعال زیستی (یعنی HT و CA) که توسط میکروبیوتای روده پس از تجویز خوراکی تبدیل می‌شوند، ضروری است.

علاوه بر این، یافته‌های حاضر شواهدی را ارائه می‌دهند که در میکروبیوتای روده‌ای افسردگی، توانایی متابولیک برای تولید گلیکوزیدها و آگلیکون‌های ثانویه به طور قابل‌توجهی ضعیف‌تر از میکروبیوتای روده غیرطبیعی موش صحرایی بود. دلیل آن احتمالاً به تغییرات ساختاری ناشی از افسردگی در میکروبیوتای روده نسبت داده می شود که منجر به کاهش فعالیت آنزیم های متابولیک تولید شده توسط میکروبیوتای روده می شود [21]. جالب توجه است، یک مطالعه قبلی نشان داد که فیلوم Bacteroidetes فراوان‌ترین ژن‌های گلیکوزید هیدرولاز و پلی ساکارید لیاز را برای هیدرولیز گلیکوزید و جداسازی کربوهیدرات‌های پیچیده با مکانیسم حذف کدگذاری می‌کند [22]. به طور خاص، Bacteroides spp. از جمله B. caccae، B. dorei، B. finegoldii، B. fragilis، B. intestinalis، B. ovatus، B. thetaiotaomicron، B. uniformis، و B. xylanisolvens تعداد کل غالب ژن‌های کدکننده GHs و PLs را نشان داد. Parabacteroides distasonis نیز دارای همین ویژگی ها است [22]. مطالعات قبلی ما تأیید کرد که تحریک استرس مزمن غیرقابل پیش‌بینی روزانه باعث کاهش فراوانی نسبی گونه‌های باکتریوئیدها، پاراباکتروئیدها، بوتریسیموناس و ویسلا می‌شود، در حالی که رومینوکوکوس و دینوکوکوس را در موش‌ها افزایش می‌دهد [4]. قابل توجه است که Bacteroides و Parabacteroides دو گونه میکروبی فراوان بودند که تقریباً 20 درصد فراوانی نسبی را در موش‌های معمولی تشکیل می‌دادند. پس از درمان CUS، فراوانی نسبی باکتریوئیدها و پاراباکتروئیدها در موش‌های مدل افسرده به شدت به حدود 5 درصد کاهش یافت. بنابراین، این امر ناگزیر منجر به کاهش تعداد کل آنزیم‌های GH و PL در موش‌های صحرایی CUS می‌شود و واکنش گلیکوزیله شده توسط میکروبیوتای روده‌ای افسردگی CUS پس از تجویز خوراکی CTE را مختل می‌کند.(عصاره سیستانچ توبولوزا)در موش های مدل

5. نتیجه گیری

در مطالعه حاضر، تکنیک UPLC-Q-TOF-MS ایجاد و برای غربالگری و شناسایی متابولیت‌هایعصاره لوله سیستانچدر موشهای صحرایی طبیعی و افسردگی CUS در شرایط in vitro و in vivo. نتایج نشان داد که CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)توسط میکروبیوتای روده سالم و افسرده به آگلیکون ها و محصولات تخریب PhGs و گلیکوزیدهای ایریدوئید متابولیزه شد. پس از تجویز خوراکی CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)متابولیت های فاز II آگلیکون ها و محصولات تخریب PhGs و iridoidglycosides عمدتاً در ادرار موش یافت شد. توانایی متابولیک برای تولید گلیکوزیدها و آگلیکون‌های ثانویه در میکروبیوتای روده‌ای افسرده بسیار ضعیف‌تر از میکروبیوتای روده موش‌های معمولی بود که به گلیکوزیدهیدرولازهای اختلال تولید شده توسط میکروبیوتای روده در موش‌های افسرده CUS نسبت داده شد. توسعه CTE(عصاره سیستانچ توبولوزا)به عنوان یک داروی ضد افسردگی بالقوه

قدردانی

این کار توسط کمک های مالی از برنامه ملی تحقیق و توسعه کلیدی چین (2017YFC1702400) پشتیبانی شد.

پیوست A. داده های تکمیلی

داده‌های تکمیلی این مقاله را می‌توانید به صورت آنلاین در HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728 پیدا کنید.

از: متابولیسم in vitro و in vivo ازعصاره سیستانچ توبولوزادر موشهای صحرایی افسرده ناشی از استرس غیرقابل پیش بینی طبیعی و مزمن توسطیانگ لی و همکاران

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

منابع

[1] کمیسیون فارماکوپه چین، داروسازی جمهوری خلق چین، ویرایش 2015، انتشارات علوم پزشکی چین، پکن، چین، 2015، ص. 135 قسمت اول.
[2] Y. Jiang، P.-F. Tu, تجزیه و تحلیل ترکیبات شیمیایی در گونه Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu، X. Fan، X. Wang، X. Gao، Cistanches Herba: مروری بر خواص شیمی، فارماکولوژی و فارماکوکینتیک آن، J. Ethnopharmacol. (2017)، https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li، Y. Peng، P. Ma، H. Yang، H. Xiong، M. Wang، C. Peng، P. Tu، X. Li، اثرات ضد افسردگی مانندعصاره سیستانچ توبولوزابر روی موش‌های با استرس مزمن غیرقابل پیش‌بینی از طریق بازسازی هموستاز میکروبیوتای روده، جلو. داروسازی (2018)، https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster، MV Neufeld، محور روده-مغز: چگونه میکروبیوم بر اضطراب و افسردگی تأثیر می گذارد، Trends Neurosci. 36 (2013) 305-312.
[6] E. Sherwin، TG Dinan، JF Cryan، تحولات اخیر در درک نقش میکروبیوتای روده در سلامت و بیماری مغز، Ann. آکادمی نیویورک علمی 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng، H. Jia، Z. Chao، Y. Yong، Z. Yang، M. Yang، Z. Zou، تغییرات در میکروبیوتای روده و فنوتیپ متابولیک مدفوع مرتبط با افسردگی توسط توالی ژن 16S rRNA و LC/ متابولومیکس مبتنی بر ام اس، جی فارم. بیومد. مقعدی 138 (2017) 231-239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: microbiota روده مرتبط با افسردگی را القا می کند. تغییرات عصبی رفتاری در موش صحرایی، J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109-118.
[9] L. Yang، P. Ying، M. Wang، P. Tu، X. Li، متابولیسم گوارشی انسان عصاره آب Cistanches Herba در شرایط آزمایشگاهی: توضیح مشخصات متابولیک بر اساس شناسایی متابولیت جامع در شیره معده، روده آب میوه، باکتری های روده انسان، و میکروزوم های روده، J. Agric. مواد شیمیایی مواد غذایی 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li، G. Zhou، S. Xing، P. Tu، X. Li، شناسایی متابولیت‌های اکیناکوزید تولید شده توسط باکتری‌های روده انسان با استفاده از کروماتوگرافی مایع فوق‌العاده / طیف‌سنجی جرمی زمان پرواز چهارقطبی، J. کشاورزی مواد شیمیایی مواد غذایی 63 (2015) 6764-6771.
[11] Y. Li، G. Zhou، Y. Peng، P. Tu، X. Li، غربالگری و شناسایی سه متابولیت گلیکوزید فنیل اتانوئید معمولی از Cistanches Herba توسط باکتری های روده انسان با استفاده از UPLC/Q-TOF-MS، J. فارم. بیومد. مقعدی 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang، P. Ying، M. Wang، G. Zhou، Y. Zhang، X. Li، غربالگری سریع و شناسایی تفاوت‌های بین متابولیت‌های Cistanche deserticola و عصاره آبی C. tubulosa در موش‌ها توسط UPLC- Q-TOF-MS تجزیه و تحلیل تشخیص الگوی ترکیبی، J. Pharm. بیومد. مقعدی 131 (2016) 364-372.
[13] C. Q، P. Y، B. X، Z. W، C. L، L. X، به طور سیستماتیک متابولیت های اکیناکوزید و آکتئوزید را از Cistanche tubulosa در پلاسما، صفرا، ادرار و مدفوع موش مشخص می کنند. UPLC-ESI-Q-TOF-MS، Biomed. کروماتوگر. 30 (2016) 1406-1415.
[14] Y. Wang، H. Hao، G. Wang، P. Tu، Y. Jiang، Y. Liang، L. Dai، H. Yang، L. Lai، C. Zheng، رویکردی برای شناسایی متابولیت های متوالی از یک گلیکوزید فنیل اتانوئید معمولی، اکیناکوزید، بر اساس کروماتوگرافی مایع - زمان تله یونی
تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی پرواز، Talanta 80 (2009) 572-580.
[15] C. Jia، H. Shi، W. Jin، K. Zhang، Y. Jiang، M. Zhao، P. Tu، متابولیسم اکیناکوزید، یک آنتی اکسیدان خوب، در موش: جداسازی و شناسایی متابولیت های صفراوی آن، متاب دارو. دور ریختن 37 (2009) 431-438.
[16] J. Xu، HB Chen، SL Li، درک مکانیسم‌های مولکولی تعامل بین داروهای گیاهی و میکروبیوتای روده، Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu، J. Yang، F. Du، X. Gao، X. Ma، Y. Huang، F. Xu، W. Niu، F. Wang، Y. Mao، جذب و دفع جین سنوزیدها پس از خوراکی تجویز عصاره Panax notoginseng به موش های صحرایی، دارو متاب. دور ریختن 37 (2009) 2290-2298.
[18] JM Laparra، Y. Sanz، S. Schaffer، F. Visioli، تعاملات میکروبیوتای روده با اجزای غذایی کاربردی و مواد مغذی، Pharmacol. Res. 61 (2010) 219-225.
[19] H. Takeda، M. Tsuji، T. Yamada، J. Masuya، K. Matsushita، M. Tahara، M. Iimori، T. Matsumiya، اسید کافئیک کاهش بیان mRNA BDNF قشر ناشی از قرار گرفتن در معرض اجباری را کاهش می دهد. استرس شنا در موش، یورو. J. Pharmacol. 534 (2006) 115-121.
[20] A. Zheng، L. Hao، C. Ke، X. Jie، Z. Xuan، L. Yuan، C. Cong، J. Liu، Z. Feng، تجویز هیدروکسی تیروزول مادر، نوروژنز و عملکرد شناختی را در افراد دارای استرس قبل از تولد بهبود می بخشد. فرزندان، J. Nutr. بیوشیمی. 26 (2015) 190-199.
[21] H. Li، J. He، W. Jia، تأثیر میکروبیوتای روده بر متابولیسم و ​​سمیت دارو، نظر کارشناس. دارو متاب. سموم 12 (2016) 31.
[22] KA El، F. Armougom، JI Gordon، D. Raoult، B. Henrissat، فراوانی و تنوع آنزیم‌های فعال کربوهیدرات در میکروبیوتای روده انسان، Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497-504.