افزایش سطح YKL{0}} اما نه سطح پروتئین واکنشی C در بیماران مبتلا به آلزایمرⅡ

2. مواد و روشها

2.1. اهداکنندگان انسانی

در مجموع 123 نفر در این مطالعه وارد شدند: (1) افراد مسن بدون زوال عقل بدون هیچ گونه شواهدی از بیماری عصبی (کنترل سالم) طبقه بندی شده به عنوان گروه کنترل (n=37). (2) MCI ناشی از AD (MCI) بیماران (n=22); (3) بیماران مبتلا به AD پراکنده خفیف/متوسط-شدید احتمالی (n=34)؛ (4) بیماران PD (n=30). شرکت کنندگان در مطالعه از کلینیک حافظه (شاهد، افراد MCI و AD) و واحد اختلالات حرکتی (شرکت کنندگان PD) بیمارستان دانشگاه 12 دی اکتبر (مادرید، اسپانیا) ثبت نام کردند. مشخصات دموگرافیک و بالینی آزمودنی در جدول 1 فهرست شده است.

همه شرکت‌کنندگان با استفاده از معیارهای تشخیصی تعیین‌شده در افرادی که دارای MCI یا زوال عقل احتمالی AD بودند طبقه‌بندی شدند [43-45]. تشخیص بر اساس ارزیابی دقیق بالینی، ارزیابی عصب روانشناختی و تصویربرداری عصبی (MRI) بود. اختلال عملکردی از طریق امتیاز بالینی دمانس (CDR) اندازه گیری شد [46].

برای درمان بیماری پارکینسون و بیماری آلزایمر برای درمان tcm کلیک کنید

بیماران PD بر اساس معیارهای تشخیصی بالینی انجمن اختلال حرکتی (MDS) [47] تشخیص داده شدند و همه معیارها برای PD بالینی ایجاد شده برآورده شدند. بیماران PD به شکایات شناختی مراجعه نکردند و علائم زوال عقل را نشان ندادند. گروه کنترل شامل افراد 50 ساله یا بالاتر از نظر شناختی سالم، بدون علائم بالینی اختلال شناختی و سابقه بیماری عصبی یا روانپزشکی بود.

معیارهای خروج برای هر شرکت‌کننده، بیماری عروق مغزی قابل‌توجه و شواهدی مبنی بر هرگونه بیماری عصبی، روانپزشکی، دارویی یا پزشکی غیرعصبی بود که می‌تواند بر عملکرد شناختی یا حرکتی تأثیر بگذارد. تایید مطالعه از کمیته اخلاق پژوهشی بیمارستان دانشگاه 12 دی اکتبر به دست آمد و همه شرکت کنندگان رضایت آگاهانه کتبی ارائه کردند.

2.2. نمونه مایع

نمونه‌های CSF جمع‌آوری‌شده از همه افراد (از جمله بیماران سالم و افراد MCI، AD، و PD) جمع‌آوری شد و طبق روش‌های استاندارد شده توسط سوراخ کمری در لوله‌های پلی پروپیلن استریل 15 میلی‌لیتری پردازش شد. سپس نمونه ها با سرعت 3{5}}00 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مقدار کمی از مایع رویی در دمای -80 درجه سانتیگراد در لوله های برودتی 0.5 میلی لیتری پلی پروپیلن با کوکتل بازدارنده پروتئاز (روش، بازل، سوئیس) ذخیره شد.

نمونه خون از طریق سوراخ کردن ورید آنتوکبیتال از بیماران و افراد سالم گرفته شد. پلاسما از خون کامل جمع‌آوری‌شده در لوله‌های EDTA{1}Na با حجم ۷ میلی‌لیتر جدا شد. خون کامل با سرعت 2000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. سپس سوپرناتانت ها در لوله های برودتی پلی پروپیلن با کوکتل بازدارنده پروتئاز (روش، بازل، سوئیس) جمع آوری و در دمای -80 درجه سانتیگراد ذخیره شدند.

2.3. نمونه های بافت

بافت قشر اوربیتوفرونتال مغز پس از مرگ از اهداکنندگان مغز با تشخیص AD و افراد کنترل به دست آمد. نمونه های منجمد توسط موسسه آسیب شناسی عصبی Brain Bank IDIBELL-Hospital Universitari de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat، اسپانیا) عرضه شد. رضایت آزمودنی بر اساس اعلامیه هلسینکی و تاییدیه کمیته اخلاق پژوهشی موسسه مسئول انجام شد.

برای همه موارد، رضایت آگاهانه کتبی در دسترس بود. آزمودنی ها بر اساس تشخیص پس از مرگ AD با توجه به آسیب شناسی درهم تنیده نوروفیبریلاری و پلاک های A [48] انتخاب شدند. موارد AD تغییرات نوروپاتولوژیک بالای AD را نشان دادند (مرحله Braak V/VI و نمره پلاک عصبی متوسط ​​تا مکرر). شرکت کنندگان کنترل افرادی با/بدون علائم عصبی یا درجه پایین تغییرات نوروپاتولوژیک AD در نظر گرفته شدند. در مجموع 24 نمونه در AD و شاهد طبقه بندی شدند که در جدول 2 ارائه شده است.

2.4. خالص سازی DNA و ژنوتیپ آپولیپوپروتئین E (APOE).

DNA ژنومی از خون محیطی با استفاده از کیت QIAmp DNA Blood Mini (Qiagen، Hilden، آلمان)، طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. پلی‌مورفیسم‌های APOE C112R و R158C برای شناسایی آلل‌های ε2، ε3 و ε4 APOE با استفاده از کیت ابزار LightCycler 480 II (Roche Diagnostics، بازل، سوئیس) به دنبال دستورالعمل‌های سازنده شناسایی شدند.

2.5. آنالیز پروتئین

غلظت CSF و پلاسما نشانگرهای زیست التهابی عصبی (YKL{0}} و CRP) با استفاده از کیت های الایزا (Human Chitinase {{1}) مانند 1 Quantikine ELISA (DC3L10)، R&D؛ Human CRP Quantikine ELISA (DCRP {5}})، تحقیق و توسعه) طبق دستورالعمل سازنده. سطح پروتئین YKL{6}} و GFAP مغز نیز با وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. بافت قشر اوربیتوفرونتال مغز پس از مرگ از اهداکنندگان مغز با تشخیص AD و افراد کنترل به دست آمد.

به طور خلاصه، نمونه‌های قشر اوربیتوفرونتال مغز انسان در بافر لیز (5{4}} میلی‌مولار Tris/HCl بافر، pH 7.4 حاوی 2 میلی‌مولار EDTA، 0.2 درصد Nonidet P{6}}، 1 میلی‌مولار PMSF، پروتئاز، انکوبه و همگن شدند. و کوکتل‌های بازدارنده فسفاتاز؛ Roche، بازل، سوئیس) و به مدت 10 دقیقه در 14، 000 دور در دقیقه با دمای 4 ◦C سانتریفیوژ شدند. مواد رویی بازیابی و در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. محتوای پروتئین با استفاده از روش BCA (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) تعیین شد. مقادیر مساوی از پروتئین (20 میکروگرم برای YKL{14}} و 5 میکروگرم برای GFAP) با بافر نمونه Laemmli همراه با مرکاپتواتانول مخلوط شد، به مدت 5 دقیقه تا دمای 95 درجه سانتیگراد گرم شد، با 10 درصد ژل NuPAGE Bis-Tris حل شد. Thermo Fisher Scientific، MA، ایالات متحده آمریکا)، و بر روی غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) (Millipore، MA، ایالات متحده آمریکا) منتقل شد.

پس از آن، غشاها مسدود شده و یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند: یک آنتی بادی مونوکلونال نوترکیب خرگوش ضد YKL-40 (ab255297, 1:500, Abcam) و یک آنتی بادی مونوکلونال ضد GFAP موش (G3893, 1). :0000، سیگما آلدریچ). سپس غشاها به مدت 1 ساعت با آنتی بادی‌های ثانویه کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی (HRP) انکوبه شدند (G{12}}، 1:5000، Thermo Fisher Scientific، MA، USA؛ ab97023، 1:40000، Abcam).

بارگیری پروتئین با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال HRP کونژوگه علیه توبولین (ab4{10}}742, 1:5000، Abcam) برای YKL-40 یا در برابر -اکتین (A1978، Sigma Aldrich) برای تشخیص GFAP کنترل شد. کمپلکس های ایمنی توسط یک معرف شیمی لومینسانس افزایش یافته (ECL Clarity؛ Bio-Rad، CA، USA) آشکار شدند. کمی سازی چگالی سنجی با نرم افزار Image Studio Lite 5.0 (Li-COR Biosciences, NE, USA) انجام شد. باندهای پروتئینی به کنترل بارگذاری نرمال شدند و به عنوان درصدی از گروه کنترل بیان شدند

2.6. تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری و نمودارها با استفاده از نرم افزار Stata/IC (Stata 16.1, StataCorp LLC, College Station, TX, USA) و Prism (نرم افزار GraphPad نسخه 8.00, La Jolla, CA, USA) انجام شد. پس از ارزیابی نرمال بودن توزیع، تفاوت‌ها در سطح CSF و YKL{4}} و CRP پلاسما بین گروه‌ها با استفاده از آزمون رتبه‌بندی ناپارامتری Kruskal-Wallis مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقدار p برای مقایسه های زوجی با تصحیح بونفرونی نمایش داده می شود. یک مدل رگرسیون خطی توصیفی چندگانه برای محاسبه متغیرهای مخدوش کننده (سن، جنس، و APOE ε4) در تجزیه و تحلیل ارتباط CSF YKL{7}} انجام شد.

تأثیر متقابل متغیرهای مداخله گر با تشخیص بالینی از مدل حذف شد (اهمیت برای کل مجموعه تعاملات: p > 0.10). ضریب رگرسیون به صورت "b" نمایش داده می شود. تفاوت در توزیع جنسی، سن شرکت‌کنندگان، سن شروع، و سال‌های پس از شروع بیماری بین گروه‌ها با آزمون‌های مجذور کای پیرسون و آنالیز واریانس، در صورت لزوم مورد ارزیابی قرار گرفت.

ارتباط بین نشانگرهای زیستی و ویژگی‌های دموگرافیک با آزمون‌های همبستگی پیرسون، آزمون‌های تی دانشجویی، و آزمون‌های U Mann-Whitney مورد بررسی قرار گرفت. یک آزمون روند ناپارامتریک (آزمون روند Jonckheere) برای ارزیابی وجود یک روند در زمانی که نمایش مقوله‌های ترتیبی را نشان داد، انجام شد. منحنی‌های ROC پس از مدل‌سازی وجود یا عدم وجود یک تشخیص بالینی داده‌شده با تحلیل لجستیک رگرسیون ساخته شدند.

سطوح بیان YKL{{0}} و GFAP وسترن بلات به کنترل بارگیری مربوطه خود (-توبولین و -اکتین) نرمال شد و با میانگین نسبت کنترل با آزمون ناپارامتریک Mann-Whitney U مقایسه شد. در نمودارها، سطوح CSF و YKL{3}} و CRP پلاسما به عنوان محدوده متوسط ​​و بین چارکی نشان داده شده است. بیان مغز YKL{4}} به عنوان میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) نشان داده می شود. در تمام موارد، معنی‌داری آماری 05/0p< تعیین شد.

مکانیسم سیستانچ بیماری آلزایمر و پارکینسون را درمان می کند

سیستانچ گیاهی است که به طور سنتی در طب چینی برای درمان انواع بیماری ها از جمله اختلالات عصبی مانند بیماری آلزایمر (AD) و بیماری پارکینسون (PD) استفاده می شود. سیستانچ حاوی چندین ترکیب فعال زیستی از جمله گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید و گلیکوزیدهای ایریدوئید است که دارای اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و محافظت کننده عصبی هستند. این ترکیبات به محافظت از سلول های عصبی در برابر آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد و فرآیندهای التهابی کمک می کنند، که اعتقاد بر این است که به توسعه و پیشرفت AD و PD کمک می کند.

علاوه بر این، سیستانچ سطح برخی از انتقال دهنده های عصبی را در مغز افزایش می دهد، از جمله دوپامین و استیل کولین، که برای عملکرد طبیعی مغز مهم هستند. با افزایش این سطوح انتقال دهنده عصبی، سیستانچ ممکن است به بهبود عملکرد شناختی و کاهش علائم AD و PD کمک کند.

به طور کلی، مکانیسم های سیستانچ در درمان AD و PD شامل اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و محافظت کننده عصبی و همچنین توانایی آن در افزایش سطوح انتقال دهنده های عصبی در مغز است.

ادامه دارد...

ویکتور آنتونیو بلانکو-پالمرو 1،2،3، †، مارکوس روبیو-فرناندز 1،2، †، دزیره آنتکورا 1،2، آلبرتو ویارخو-گالنده 1،2،3، خوزه آنتونیو مولینا 1،2،3، ایسیدرور 1،4،5،6، فرناندو بارتولوم 1،2،* و اوا کارو 1،2،*

1 مرکز شبکه ای برای تحقیقات زیست پزشکی در بیماری های عصبی (CIBERNED)، 28031 مادرید، اسپانیا. victorb1989@gmail.com (VAB-P.)؛ marcosrubio.imas12@h12o.es (MR-F.)؛ eeara@yahoo.es (DA); avgalende@yahoo.es (AV-G.); cvillaiza@telefonica.net (JAM); 8082{12}} (IF)

2 گروه بیماری های عصبی، موسسه تحقیقاتی بیمارستان 12 de Octubre (imas12)، 28041 مادرید، اسپانیا

3 بیمارستان خدمات مغز و اعصاب Universitario 12 de Octubre, 28041 Madrid, Spain

4 موسسه تحقیقاتی بیومدیکال بلویت (IDIBELL)، Hospitalet de Llobregat، E08907 بارسلونا، اسپانیا

5 گروه آسیب شناسی و درمان تجربی، دانشگاه بارسلونا، E08900 بارسلونا، اسپانیا 6 موسسه علوم اعصاب، دانشگاه بارسلونا، E08000 بارسلون، اسپانیا * مکاتبه: fbartolome.imas12@h12o.es (FB); carroeva@h12o.es (EC)؛ تلفن: به علاوه 34-913908765 (FB & EC); فکس: به علاوه 34-913908544 (FB & EC)